积，说明细胞中DSB修复 通路功能障碍。
[0028] ⑵MTT法检测干扰BRCAl对细胞耐药性的影响。通过MTT法检测药物半数抑制浓 度（IC 5tl)并计算细胞耐药指数，分析干扰BRCAl对耐药细胞的MTX药物敏感性的影响。与 sh-control相比，MTX对sh-BRCAl的IC5tl降低了 2. 58倍，即稳定干扰BRCAl的表达导致 HT29含DMs的耐药细胞对MTX的药物敏感性升高。
[0029] 8.稳定干扰BRCAl对DSB修复通路产生的影响
[0030] (1)细胞进行同步化处理后，利用western blot法检测HR通路中关键修复因子的 表达，确定干扰BRCAl后对HR通路造成的影响。与sh-control相比，sh-BRCAl中MREll的 表达量明显减少，RAD50的表达量未发生明显变化，NBSl的表达量有所增加。而在MRN复合 体中，MREll的主要作用是识别、结合损伤DNA末端，随后募集RAD50和NBSl组成复合体。 因此，MREll的表达减少直接影响MRN复合体的功能。在提取的细胞总蛋白中RAD51的表达 量升高，而核蛋白中RAD51的表达量却明显降低，这说明，BRCAl能够通过抑制RAD51入核来 抑制其功能，进而影响HR通路的修复。利用免疫荧光方法对RAD51在核内形成灶点情况进 行了检测。与sh-control相比，sh-BRCAl中RAD51灶点数明显减少，证明稳定干扰BRCAl 能够影响RAD51灶点的形成。由此可见，干扰BRCAl能够严重影响HR通路的功能。
[0031] (2)细胞进行同步化处理后，利用western blot法检测NHEJ通路中关键分子的表 达情况，确定干扰BRCAl后对NHEJ修复通路造成的影响。与sh-control相比，sh-BRCAl中 Ku70、DNA-PKcs、XRCC4和Ligase4的表达量明显升高，证明干扰BRCAl导致NHEJ通路的功 能增强。
[0032] 9.稳定干扰BRCAl对细胞周期的影响
[0033] (1)流式细胞术检测同步化处理后的sh-control及sh-BRCAl，反映干扰BRCAl对 细胞周期进程的影响。在G 1期和S期，sh-BRCAl与sh-control的细胞分布比例无显著差 异，而在G2其月，sh-BRCAl的细胞分布却明显少于sh-control，因此，干扰BRCAl可导致细胞 周期G 2期缩短，使细胞周期进程加快。
[0034] (2)细胞在无血清培养基中进行同步化处理后，分别在有血清培养基中释放不同 时间，并利用western blot检测G2/M期检查点相关蛋白cyclinB，⑶Kl的表达情况，确定 BRCAl对周期检查点功能的影响。在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCAl后，随释放 时间的增加，cyclinB和⑶Kl的表达量显著增加，表明干扰BRCAl 使^/M期检查点功能缺 失，细胞周期由G2期加快进入M期。
[0035] 10.稳定干扰BRCAl对微核外排的影响
[0036] 将sh-control和sh-BRCAl进行同步化处理后，取得释放24小时的中期核型标 本，FISH检测微核外排DHFR情况，确定干扰BRCAl后细胞是否因细胞G 2/M期进程加快而 改变微核外排的情况。当sh-control和sh-BRCAl释放24小时后，sh-BRCAl的微核形成 数量要显著高于sh-control，而sh-BRCAl外排的含有DHFR基因的微核数量也显著高于 sh-control，由此可知，在HT29含DMs的MTX耐药细胞中，干扰BRCAl可导致细胞M期的微 核形成率增加，导致含有DHFR的微核外排量增加。
[0037] 11.稳定干扰BRCAl对基因扩增及其相应蛋白表达情况的影响
[0038] (1)对sh-control和sh-BRCAl进行同步化后，以其DNA为模板，应用Real-time PCR技术分析干扰BRCAl对DHFR基因扩增程度的影响。β -ACTIN作为内参对照基因。在 sh-BRCAl中，DHFR的基因扩增程度显著降低。
[0039] (2) sh-control和sh-BRCAl中期核型标本制备，FISH检测干扰BRCAl对DHFR基 因扩增形式的影响，并进一步验证Real-time PCR结果。与sh-control相比，sh-BRCAl含 有DHFR的双微体的数目显著降低。
[0040] (3)以 sh-control 和 sh-BRCAl 的 DNA 为模板，应用 Real-time PCR 技术分析干 扰BRCAl对5号染色体上与DHFR基因位于同一扩增子上其它基因扩增程度的影响。根据 实验室前期aCGH芯片结果可知：MSH3基因同DHFR基因一样，位于DMs和HSRs扩增子上； CCNH、GLRX和CAST等基因位于HSRs扩增子上；RADl和PLK2基因既不位于DMs也不位于 HSRs扩增子上，在细胞耐药过程中不发生扩增，为该实验的阴性对照。Real-time PCR结果 显示，与sh-control相比，sh-BRCAl中MSH3基因扩增程度明显降低，而其他基因扩增程度 均无明显变化。因此，干扰BRCAl仅影响DMs形式而不影响HSRs形式的基因扩增。
[0041] (4)提取细胞总蛋白，应用 Western Blotting 方法检测 sh-BRCAl 及 sh-control 中DHFR蛋白的表达情况。HT29含DMs的MTX耐药细胞中，与sh-control相比，sh-BRCAl 中DHFR蛋白表达水平明显降低。
[0042] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
[0043] 本发明为MTX作为主要治疗药物且易产生耐药性的恶性肿瘤的生物治疗提供新 的靶向性治疗方案，为有效地对抗MTX耐药提供了科学的依据。针对MTX耐药且DHFR基因 高度扩增的恶性肿瘤细胞，特异性地抑制HR通路及细胞周期调控关键分子BRCA1，能够降 低基因扩增程度、减少细胞内的DMs，从而逆转肿瘤耐药，提高肿瘤治疗的效率。更重要的 是，这种基因扩增去除机制可能适用于多种不同药物引起的以基因扩增为基础的耐药，本 发明对于深入了解化疗耐药的本质以及寻找个体化治疗的耐药靶点都有非常积极的意义。
【附图说明】
[0044] 图1是HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增程度变化的实时定量PCR柱状 图；
[0045] 图2是HT29MTX敏感及耐药细胞中DHFR基因扩增形式变化的荧光原位杂交 图，其中，A.HT29MTX S，B.HT291(T7mol/L MTX，C.HT291(T6mol/L，D.HT291(T5mol/L MTX， E. HT291(T4mol/L MTX ;
[0046] 图3是ΗΤ29ΜΤΧ敏感及耐药细胞中DHFR蛋白表达水平变化的Western Blotting 图，其中，A.HT29MTX S，B.HT291(T7mol/L MTX，C.HT291(T6mol/L，D.HT291(T5mol/L MTX， E. HT291(T4mol/L MTX ;
[0047] 图4是BRCAl在HT29MTX敏感及HT29含DMs的MTX耐药细胞中的表达情况的 Western Blotting 图；
[0048] 图5是鉴定HT29含DMs的MTX耐药细胞稳定干扰克隆的干扰效果的Western Blotting 图；
[0049] 图6是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCAl导致γ H2AX表达增多的 Western Blotting 图；
[0050] 图7是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCAl使HR通路功能减弱的Western Blotting 图；
[0051] 图8是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCAl使HR通路关键分子RAD51在 细胞核内的表达量减少的免疫荧光图；
[0052] 图9是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCAl使NHEJ通路功能代偿性增加 的 Western Blotting 图；
[0053] 图10是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCAl使细胞周期调节因子异常表 达的 Western Blotting 图；
[0054] 图11是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCAl使细胞内DHFR基因扩增量 下降的实时定量PCR柱状图；
[0055] 图12是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCAl使细胞内DHFR基因扩增量 下降的荧光原位杂交图及统计图；
[0056] 图13是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCAl对5号染色体同一扩增子内 其他基因扩增程度影响的实时定量PCR柱状图；
[0057] 图14是在HT29含DMs的MTX耐药细胞中干扰BRCAl使细胞内DHFR表达量下降 的 Western Blotting 图。
【具体实施方式】
[0058] 下面通过实验并结合实例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅 用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[0059] 试验材料：人结肠癌细胞系HT29购自上海细胞库；BAC克隆：RPl 1-90A9和 RP11-91I22。
[0060] 试验试剂：氨甲蝶呤、DMS0、秋水仙胺、NP-40等试剂均为市售。
[0061] 试验例1
[0062] 1.细胞培养
[0063] 将人结肠癌细胞系HT29用浓度梯度递增的MTX进行连续培养，筛选出一系列 HT29MTX耐药细胞，并根据其对MTX的耐受程度命名为HT291(T7mol/L MTX