一种定量检测土壤中青枯菌的方法及其检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物定量检测技术领域，具体涉及一种定量检测土壤中青枯菌的方 法及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 青枯病是世界上危害较大、分布较广、造成损失相当严重的植物病害之一，广泛 流行于热带、亚热带以及暖温带地区，对包括草本、灌木和乔木在内的50多科200多种植 物造成危害，包括烟草（Nicotiana tabacum)、芝麻（Sesamum indicum)、花生（Arachis hypogaea)、大豆（Glycine max)、萝卜（Raph-anus sativus)等多种农作物以及一些贵重药 材和花丼植物，严重危害一些农作物的产量，其中马铃薯、番茄、烟草等茄科作物受害最为 严重。已被多个国家列为植物病害检疫对象。由于青枯病为细菌性土传病害，防治比较困 难，利用抗性品种是最为经济有效的手段。因此，建立简单快速的青枯病抗性鉴定方法是快 速筛选青枯病抗病品种的首要任务。目前对于烟草青枯病菌的防治方法主要从以下两个方 面进行：一是幼苗移植前了解大田土壤中Ralstonia solanacearum存活情况；另一方面是 在生长过程中，适时了解土壤中烟草青枯病菌数量，预测土壤中致病菌数量变化趋势，及时 指导大田生产。
[0003] 目前在病原微生物定量检测方面主要有平板菌落计数法、MPN计数法，免疫学上的 方法和以PCR等分子手段为基础的分子生物学上的方法。其中传统检测方法具有很高的权 威性，但是在操作上具有耗时耗力麻烦等缺点，而且用于土壤中病原微生物的定量检测具 有一定的复杂性和操作上的难度；随着现代分子生物学方法的发展，PCR技术因其快速准 确而被广泛应用于食品中病原微生物的定性检测中，但是PCR方法不能够很好地区分死菌 和活菌，而且在定量检测中也显得不足，这就造成结果上的不准确。
【发明内容】
[0004] 发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种定量检测土壤 中青枯菌的方法，以实现提供方便、高效、快速的检测出土壤中的青枯菌，并有效提高检测 的灵敏度。本发明的另一目的是提供一种上述方法使用的检测试剂盒。
[0005] 技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
[0006] -种定量检测土壤中青枯菌的方法，包括以下步骤：
[0007] (1)取土壤，用无菌水稀释成5个稀释度，分别取5个稀释度的稀释样品lmL，控温 30°C，用SMSA发酵培养基，摇床震荡培养24h，得增菌液；
[0008] ⑵取2 μ L上清液作为PCR扩增模板，进行PCR反应，引物序列为：
[0009] Pl :5, -CGGTTTTCGCCGCTGATTTCG-3，，
[0010] Ρ2 :5, -CTTCTTCCGCTTCTTCATCGCACT-3,；
[0011] (3)同时扩增PCR产物、阳性对照和阴性对照，然后进行2 %琼脂糖凝胶电泳，然后 染色成像，与阳性对照比较，在146bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者 为阴性结果。
[0012] (4)统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算青枯菌个数；计算公式：活菌数/每 克土 =菌数近似值X数量指标第一位数的稀释度/ 土壤干重百分比。
[0013] 步骤⑴中，稀释成5个稀释度的具体操作为：取IOg 土壤加至90mL水中，震荡 摇匀30min，之后取ImL 土壤悬液加至9mL生理盐水，作为l(T2g/mL，再依次进行系列稀释至 10 3g/mL、10 4g/mL 和 10 5g/mL〇
[0014] 步骤⑵中，PCR反应体系：：在25yL反应体系中，10XPCR缓冲液2.5yL， 20mmol/L Mg2+2. 5 μ L，2. 5mmol/L dNTP 2. 5 μ L，2. 0 μ mol/L 引物 0· 5 μ L，2U/ μ L Taq DNA 聚合酶0. 3 μ L，补水至25 μ L。
[0015] 步骤⑵中，PCR反应条件为：94°C预变性7min，94°C变性30s，56°C退火30s，72°C 延伸30s，共35个循环；最后72°C延伸5min。
[0016] 步骤（3)中，电泳条件为：先以60V电压出孔，再以100V电压电泳30min。
[0017] -种定量检测土壤中青枯菌的试剂盒，包括试剂供量为1次反应及以上的试剂I 和试剂II ;
[0018] 试剂I :用于增菌培养青枯菌的选择性培养基，成分为SMSA增菌液，配方为：SMSA 培养基（semi-selectivemedium, South Africa):胰蛋白腺10g，甘油5mL，酷蛋白氨基酸 lg，琼脂15g，蒸饱水1L。培养基冷却至50°C时每250mL加入：1%的多粘菌素 B 2. 5mL，l% 的结晶紫125μπι，1%的四氮唑盐1.25mL，l%的钎菌肽625 μπι，0· 1%的青霉素125yrn， 1 %的氯霉素125 μ m，1 %的放线菌酮2. 5mL ;
[0019] 试剂II :用于MPN-PCR计数法中阳性管数确认的青枯菌PCR反应体系，试剂供量 为 1 次反应及以上，试剂包括：l〇XPCR缓冲液、20mmol/L Mg2+、2. 5mmol/L dNTP、2. 0μL?〇1/ L上游引物、2.0 μ mol/L下游引物、2U/μ L Taq DNA聚合酶和双蒸水；其中，上游引物为Pl 引物，序列为：5'-CGGTTTTCGCCGCTGATTTCG-3'，下游引物为 Ρ2 引物，序列为：5'-CTTCTTCCG CTTCTTCATCGCACT-3'。
[0020] 本发明的定量检测土壤中青枯菌的方法，采用MPN结合PCR的方法来定量检测土 壤中的病原微生物，是一种MPN-PCR定量检测病原微生物方法。在建立MPN-PCR定量检测 病原微生物方法之前，首先进行了一个实验来探索MPN计数法及MPN-PCR计数法和平板菌 落计数法之间是否存在一个相关性。众所周知，MPN计数法是一种利用数学统计的方法对 样品中的活菌数量进行估计，得到的是一个近似值或者估计值；MPN-PCR计数法是在MPN计 数法的基础上，通过PCR对样品中的菌数进行估计；平板菌落计数法是一种最常规的活菌 定量计数法，它具有一定的准确性和权威性。对同一样品进行了 MPN计数法及MPN-PCR计 数方法与平板菌落计数法进行了回归分析，建立了两者之间的定量关系，使MPN-PCR计数 法具有与平板菌落计数法一样的准确性，从而为病原微生物，甚至功能微生物的定量计数 提供更为准确的结果。
[0021] 有益效果：与现有的病原微生物定量检测方法相比，本发明的定量检测土壤中青 枯菌具有的突出优点包括：利用了 PCR方法快速准确的优势，取代了传统MPN方法中阳性结 果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤，同时采用选择性培养目的病原菌和特异性引物来提高 检测效率。本发明的检测试剂盒和检测方法具有灵敏度高、稳定性好、特异性强的优点，而 且操作简单，不需要提取DNA。具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效益。
【附图说明】
[0022] 图1是MPN计数法与平板菌落计数法计数结果对数值的相关性曲线图；
[0023] 图2是MPN-PCR计数法与平板菌落计数法计数结果对数值的相关性曲线图；
[0024] 图3是KT7稀释度加入灭菌土壤中培养一天后扩增法扩增青枯菌hrpB基因电泳 图；图中，M为DL-2000 DNA Marker，CK为阴性对照；泳道1为KT1浓度梯度土壤稀释液样 品，泳道2为KT2浓度梯度土壤稀释液样品，泳道3是KT 3浓度梯度土壤稀释液样品，泳道 4是KT4浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；
[0025] 图4是KT4稀释度加入灭菌土壤中培养一天后扩增法扩增青枯菌hrpB基因电泳 图；图中，M为DL-2000 DNA Marker，CK为阴性对照；泳道4为10_4浓度梯度土壤稀释液样 品，泳道5为KT5浓度梯度土壤稀释液样品，泳道6是KT 6浓度梯度土壤稀释液样品，泳道 7是KT7浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；
[0026] 图5是原培养物加入灭菌土壤中培养一天后扩增法扩增青枯菌hrpB基因电泳图； M为DL-2000 DNA Marker，CK为阴性对照；泳道8为10_8浓度梯度土壤稀释液样品，泳道9 为1〇_9浓度梯度土壤稀释液样品，泳道10是10 _1(1浓度梯度土壤稀释液样品，泳道11是10 _n 浓度梯度土壤稀释液样品，每个样品5个重复；
[0027] 图6是青枯菌hrpB引物扩增结果的电泳图；图中，M为D