张与凝胶大小一致的PVDF膜，浸泡于甲醇中30秒后备用。同时，将凝胶转 移用滤纸、纤维垫及转子于转移缓冲液中完全浸透。按如下顺序组装转移装置：阳极一纤维 垫一3张3M滤纸一PVDF膜一凝胶一3张3M滤纸一纤维垫一阴极，确定排出气泡后封闭转 移装置，放入转移槽中并在槽中放置冰盒降温，以300毫安室温转移1~2小时。
[0097] d.免疫反应
[0098] 转膜结束后，取出PVDF膜并作标记，放入TBS-T洗涤10分钟，然后放入适量TBS-T 溶解的5%脱脂奶粉中，室温封闭1小时。
[0099] 将封闭好的PVDF膜，加入稀释的一抗（DHFR，1:1000。GAPDH，1:10000) 4°C震荡过 夜。杂交结束后，用TBS-T洗膜3次，每次洗10分钟，然后加入以1:10000比例稀释的二抗， 室温下避光杂交1小时。杂交结束后，用TBS-T洗膜3次，每次洗10分钟。最后用Odyssey Infrared Imaging System 扫膜，获取图像。
[0100] 结果显示，与HT29MTX S相比，HT29MTX耐药细胞中DHFR蛋白表达水平随着MTX耐 药浓度升高而增加（图3)。
[0101] 综上所述，我们选取具有双微体扩增结构并且DHFR高表达的HT291(T4m 〇l/L MTX 耐药细胞系作为后续研宄对象，并命名为HT29MTX DMs。
[0102] 4. BRCAl蛋白的表达分析
[0103] 应用 Western Blotting 方法检测 BRCAl 蛋白在 HT29MTX S 及 HT29MTX DMs 中的 表达变化。
[0104] 由于BRCAl为周期相关蛋白，在细胞周期各个时相的表达量有所差异，因此在提 取细胞之前，先用无血清培养基培养24小时，对细胞进行同步化处理，使95%以上的细胞 处于G/G。期后，提取细胞总蛋白、Western Blotting具体实验步骤同前。一抗稀释比例 (BRCA1，1:50 ;GAPDH，1:10000)。
[0105] 与 HT29MTX S 相比，HT29MTX DMs 中 BRCAl 过表达（图 4)。
[0106] 5.稳定干扰BRCAl的HT29含DMs的MTX克隆的建立
[0107] a.细胞转染分组
[0108] 细胞转染分两组进行：第一组转染质粒CSHCTR00U购自复能公司），用于转染对 照组；第二组转染质粒HSH017715-⑶6(购自复能公司），用于转染BRCAl干扰克隆组。
[0109] b.确定HT29含DMs的MTX耐药细胞对嘌呤霉素的敏感性
[0110] 取状态良好的HT29含DMs的MTX耐药细胞，制备成单细胞悬液，计数种板，六孔板 每孔种3 X IO5个细胞，种六个孔。第二天，待细胞贴壁后，换新鲜培养基，每孔加入终浓度 分别为 〇· I μ g/mL、0. 2 μ g/mL、0. 3 μ g/mL、0. 4 μ g/mL、0. 5 μ g/mL、0. 6 μ g/mL 的嗓呤霉素， 连续培养7天，观察到，嘌呤霉素浓度为0. 6 μ g/mL时HT2910_4mol/L MTX耐药细胞恰好全 部死亡，故选此浓度作为稳定转染时的药物筛选浓度。
[0111] c.稳定转染
[0112] 将处于对数生长期的HT29含DMs的MTX耐药细胞接种于6孔板中，每孔细胞 3 X IO5个。待细胞长至70 %~80 %时，进行转染。第一步配制溶液①：IOyL Lipo2000加 入到240 μ L Opti-MEM培养基中，室温静置15分钟。第二步配制溶液②：8 μ L (4ng)质粒 加入到242 yL Opti-MEM培养基中。第三步将溶液②加入到溶液①中，缓缓混匀，室温放置 20分钟。同时，将6孔板中的细胞用Opti-MEM培养基清洗两遍，再加入I. 5mL0pti-MEM培 养基。最后将混合液逐滴加入细胞中，培养在37°C，5% 0)2培养箱中。培养5~6h后，更 换含血清的DMEM高糖培养基。
[0113] d.转染细胞及克隆筛选
[0114] 培养24小时后，加入嘌呤霉素。在培养过程中，大部分细胞皱缩死亡，只有少数细 胞存活，换液，继续培养。最后，存活细胞开始增殖并逐渐形成单克隆。
[0115] 当形成的克隆达到肉眼可见大小的时候，进行克隆挑取。将HT29含DMs的MTX耐 药细胞对照组克隆命名为sh-control，干扰组克隆命名为sh-BRCAl。
[0116] 6.检测BRCAl蛋白表达情况鉴定稳定干扰克隆的干扰效果
[0117] 将细胞进行同步化处理后提取细胞总蛋白，应用Western Blotting方法检测 BRCAl在sh-control及sh-BRCAl中的表达情况。同步化方法和Western Blotting具体实 验条件及步骤同前。
[0118] HT29含DMs的MTX耐药细胞的BRCAl干扰效果如图5所示，干扰克隆中BRCAl的 表达量明显低于对照组，证明所挑选的克隆为有效克隆。
[0119] 7.稳定干扰BRCAl对DSBs的产生及细胞功能的影响
[0120] (1)应用Western Blot检测γ H2AX在稳定干扰BRCAl的克隆组及对照组中的表 达量，以确定干扰BRCAl对DSBs的产生的影响
[0121] 取生长旺盛的稳定干扰BRCAl的克隆细胞及对照组细胞，并提取总蛋白。依据前 述方法进行Western Blot，以检测γΗ2ΑΧ的表达量。抗体稀释比例1:1000。
[0122] 在ΗΤ29含DMs的MTX耐药细胞中，稳定干扰BRCAl后，细胞内γΗ2ΑΧ的表达量明 显增加（图6)。即干扰BRCAl后细胞内的DSB大量累积，说明细胞中DSB修复通路功能障 碍。
[0123] (2)MTT法检测干扰BRCAl对细胞耐药性的影响
[0124] 通过MTT法检测药物半致死浓度并计算细胞耐药指数，分析干扰BRCAl对MTX耐 药细胞的MTX药物敏感性的影响。
[0125] 收集对数生长期的细胞，稀释到适宜细胞浓度的单细胞悬液，以每孔约4500个细 胞的密度接种到96孔板，并加浓度梯度连续的ΜΤΧ。培养96小时后读数，吸出培养基，小心 用PBS冲洗一遍后每孔加入100 μ L新鲜培养基，并加入20 μ L5mg/mL的MTT溶液，继续培 养4小时后终止培养。小心吸出孔内培养液，每孔加150 μ L DMS0,将96孔板置于摇床上低 速摇10分钟以上直至沉淀完全溶解。在酶标仪OD 492nm处测量各孔吸光值。
[0126] 计算每个浓度吸光值的平均值。
[0127] 根据对照孔（未加药）计算MTX对细胞的生长抑制率，根据各个浓度对细胞的生 长抑制率计算得出MTX对细胞的药物半致死浓度。
[0128] 在 HT29 含 DMs 的 MTX 耐药细胞中，与 sh-control 相比，MTX 对 sh-BRCAl 的 IC5tl 值降低了 2. 58倍，即降低BRCAl的表达导致HT29含DMs的MTX耐药细胞对MTX的药物敏 感性升高（表2)。
[0129] 表2 HT29含DMs的MTX耐药细胞对照及稳定干扰BRCAl克隆对MTX的IC5tl值
[0130]
[0131] 8.稳定干扰BRCAl对DSB修复通路产生的影响
[0132] (1)利用western blot法和免疫荧光法检测HR通路中关键修复因子的表达，以确 定干扰BRCAl后对HR通路造成的影响。
[0133] 细胞进行同步化处理后，于有血清培养基中释放20小时，提取总蛋白进行 western blot，以检测HR通路关键因子MRE11，RAD50和NBS 1的表达量。抗体稀释比例如 下：MRE11，1:100 ;RAD50,1:200 ;NBS 1，1:1000 ;GAPDH，1:10000。
[0134] 与sh-control相比，sh-BRCAl中MREll的表达量明显减少，RAD50的表达量未发 生明显变化，而NBSl的表达量有所增加（图7)。有文献报道，由MREll、NBSl和RAD50组 成的MRN复合体具有对DNA损伤双链的剪切功能，MREll在复合体中起着最为主要的附着 DNA的作用。当其表达降低时，会导致MRN复合体因无法附着DNA而失去功能。由此可见， 干扰BRCAl会严重影响MRN复合体的功能。
[0135] 细胞进行同步化处理后，于有血清培养基中释放20小时后，分别提取总蛋白与核 蛋白。提取核蛋白具体方法是，收取5 X IO5个生长良好的细胞沉淀，用PBS缓冲液重悬并以 1000转/分钟离心后，弃去上清。加入400 μ L试剂盒的缓冲液A将细胞重悬，置于冰上15 分钟。加入25 μ L 10 %的ΝΡ-40剧烈震荡15秒，并以13000转/分钟离心1分钟。吸取上 清，加入50 μ L的缓冲液C。冰上静置30分钟后剧烈震荡15秒。再以12000转/分钟4°C 离心10分钟后，提取上清，即为核蛋白。利用western blot检测HR通路标志性功能单位 RAD51的总蛋白及核内蛋白表达情况。抗体稀释比例如下：RAD51，1 :50 ;GAPDH，1:10000。
[0136] 与sh-control相比，sh-BRCAl中RAD51的总蛋白表达量升高，而核蛋白表达量却 明显降低（图7)。这说明，BRCAl能够影响RAD51入核，进而影响其在HR通路中发挥作用。
[0137] 将IO5个细胞接种于铺好盖玻片的六孔板中，待其贴壁后，换成无血清培养基同步 化培养24小时。利用免疫荧光方法检测RAD51灶点数目情况。
[0138] 与sh-contr