一种制备高机械强度的三组分荧光水凝胶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种制备高机械强度的三组分荧光水凝 胶的方法。
【背景技术】
[0002] 分子自组装是一种新颖的材料的制备方法，利用分子间的非共价作用如氢键、范 德华力、静电力、疏水作用力、JI -31堆积作用等形成具有特定排列顺序的分子聚集体，从而 可以得到具有新奇功能和特性的自组装材料如纳米管、纳米纤维、纳米微囊、纳米缎带。这 些材料在分子器件、化学生物传感器、生物医药等方面具有十分重要的应用前景。
[0003] 作为生命体的基本构筑单元，氨基酸以其良好的生物兼容性和生物可降解性，以 及其潜在的可开发性引起了人们的关注。氨基酸可以一种或多种氨基酸按照一定的排列顺 序通过肽键结合成多肽。由于多肽链段上氨基酸残基具有不同的化学结构，多肽可以利用 其肽键间氢键作用以及氨基酸残基之间的氢键作用、静电作用、疏水性作用以及π-π堆 积作用等有效实现分子自组装。氨基酸也可以以共价键与有机分子结合以有机-氨基酸共 价化合物的形式作为自组装聚集体的构筑单元，这样可以将氨基酸与有机分子的性质有机 的融合，从而呈现出氨基酸和有机分子所不具备的新的性质。
[0004] 氨基酸无论是缩聚成多肽还是与有机分子接合形成构筑单元，得到的纳米材料大 部分都具有良好的生物兼容性。这使得此类生物材料在药物缓释，生物传感器，生物医药以 及细胞培养方面均具有良好的应用前景。
[0005] 然而目前利用自组装方法制备多组分(大于2种组分）功能性材料存在一定困难， 原因在于自组装的不可控性与自组装材料的低机械性能。探索一种制备多组分较高机械强 度的多功能水凝胶，具有重要意义。
【发明内容】
[0006] ( 1)要解决的技术问题 本发明为了克服小分子凝胶机械强度小的缺点，本发明解决的技术问题是提供一种机 械强度高，荧光性强又兼具良好生物兼容性的三组分水凝胶的制备方法。
[0007] (2)技术方案 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种制备高机械强度的三组分荧光水凝胶的方 法，包括以下工序： 1) 设计分子结构并合成出凝胶因子； 2) 筛选适当的条件以制备凝胶； 3) 对此凝胶进行形貌、结构及性能的表征； 4) 测试凝胶对不同刺激物的响应性，探索其应用价值。
[0008] 在所述工序1)中设计分子结构包括如下步骤： a)本专利用氨基酸衍生物Ν，Ν'-二谷氨酸-茈四甲酸二酰亚胺作为主体分子，由于 此分子为平面共轭结构，能在分子与分子之间形成较强的π -31堆积作用，同时在溶液状 态下也具有较强的荧光；然而，若仅有单组份主体分子自组装得到的材料功能较少，应用范 围不广；为了弥补以上所述的欠缺，我们尝试加入客体分子核黄素与三聚氰胺加强或增加 材料的功能的多样性，核黄素别名维生素 B2,是人体不可缺少的一种营养素，同时也是一种 药物，三聚氰胺则具有独特的分子结构，适当条件下容易与核黄素形成三重氢键，可以增加 凝胶的机械强度；以水为溶剂，超声处理0. 1-1. O小时，客体分子核黄素与三聚氰胺通过三 重氢键结合，主体分子再与客体分子核黄素形成氢键，主体分子与主体分子发生JT-JT堆 积，如此循环便形成凝胶； 在所述工序1)中合成出凝胶因子包括如下步骤： a )将I. 0 mmol 3, 4, 9, 10-花四甲酸二酐，1. 5-2. 5 mmol谷氨酸和2. 0 g咪挫加入圆 底烧瓶中，在氮气保护下加热6 h，并控制反应温度在120-128?，形成热溶液； b )然后往该热的溶液中倒入25 ml的已制得的无水乙醇，回流6 h，将其静置过夜。 然后将该产物用旋转蒸发仪旋干，加入I mol/L HCl使之酸化，过滤，得沉淀物，烘干，得深 紫红色固体N，Ν' -二谷氨酸-茈四甲酸二酰亚胺0. 51-0. 60 g，产率为78-92% ; 在所述工序2)中，制备方法包括如下步骤： a )称取0.01 mmol N，Ν'-二谷氨酸-茈四甲酸二酰亚胺，0.005-0. 02 mmol核黄 素和0.001-0. 02 mmol三聚氰胺于带塞透明试管，加入1-3 ml蒸馏水； b )迅速剧烈震荡，而后放入超声仪中超声一小时，使该混合物先溶解，再继续超声， 使之发生胶凝化，得到凝胶体系； 在所述工序3)中，操作方法包括如下步骤： a )以水为溶剂，用工序2)的方法将此凝胶配制成浓度为KT5 mol/L溶液，LS55荧 光光谱仪测定其发射信号； b )以水为溶剂，用工序2)的方法将此凝胶配制成浓度为5 X KT3 -KT4 mol/L溶液， 再将溶液滴于粘在导电胶上的硅片上，自然干燥，并于FEI QUANTA 450型扫描电子显微镜 上获得其组装形貌图，加速电压为15. 0 kV ; c )将上述b)中浓度为10_4 mol/L溶液滴于玻璃培养皿中，干燥后于OLYMPUS公司 生产的FV 1000型共聚焦激光扫描显微镜下成像，以488 nm为激发波长，得到共聚焦激光 扫描显微镜图； d )将新制备的浓度为5 X KT3-KT2 mol/L水凝胶于HAAKE RheoStress 6000型流变 仪中加以测试，观察弹性模量和粘性模量的变化，探索两模量之间的关系； 工序3)中该凝胶生物兼容性测定方法如下： a )将赫拉细胞置于含10% FBS的DMEM培养基的96孔细胞培养板中，密度为IO5个 细胞每个孔，培养过夜； b)培养后的细胞用PBS溶液洗涤后的在含不同浓度凝胶稀释成的溶液（10，20， 50，100 μ mol/L)的培养液中培养24 h; c )将b )中细胞用PBS溶液洗涤后，加入噻唑蓝在37°C下孵育4 h ; d )处理后于SpectraMax M5中在490 nm处测定吸光度； e )将结果换算和作图则得到细胞存活率。按以下公式计算细胞的存活率： 细胞存活率（％)=(实验组吸光度值/对照组吸光度值）Xioo 实验结果由三组平行实验数据求平均值和标准偏差得到； 在所述工序4)中测试凝胶对不同刺激物的响应性包括如下步骤： a )以水为溶剂，用工序2)的方法制成浓度为KT3 mol/L凝胶； b )向该凝胶中加入乙酸，pH=l. 0-4. 0的HCl溶液，pH=l. 0-3. 0的NaCl溶液或0. 1-1 mol/L NaOH溶液，观察现象； 工序4)中凝胶的应用操作步骤如下： a )以PBS缓冲液为溶剂，配置浓度分别为0，6.0,12. 0，15. 0，18. 0，24. 0 μ g/mL 的核黄素，在444 nm处测定其吸收值，得到标准曲线； b )以水为溶剂，用工序2)的方法制成三份体积为I. 0 mL浓度为KT2 mol/L凝胶； c )将凝胶转移到100 mL锥形瓶中，缓慢加入100.0 mL PBS缓冲液，于水浴下进行药 物核黄素的缓释，开始计时；每2 h取一次样，稀释后于UV-2700中在444 nm处测定其吸 收值，得到释放浓度； 优选地，在所述工序1)中合成出凝胶因子步骤a)中反应最佳温度为120°C ;优选地， Ν，Ν' -二酪氨酸-茈四甲酸二酰亚胺的合成方法同所述工序1)中凝胶因子的合成； 优选地，在所述工序2)中，制备方法中步骤a)中最佳方案为称取Ν，Ν'-二谷氨酸-茈 四甲酸二酰亚胺0.01 mmol，核黄素为0.02 mmol和0.01 mmol三聚氰胺于带塞透明试管， 加入2 mL蒸馏水； 优选地，在所述工序3)中步骤b)中最佳浓度为10_4 mol/L; 优选地，在所述工序3)中步骤d)中最佳浓度为5X 10_3 mol/L ; 优选地，在所述工序3)中步骤d)中凝胶制备过程中超声时间需保持一小时。
[0009] 优选地，在所述工序4)中测试凝胶对不同刺激物的响应性步骤b)中HCl溶液的 最佳pH为1. 0, NaCl溶液的最佳pH为1. 0, NaOH溶液的最佳浓度为I mol/L。
[0010] 优选地，在工序4)中凝胶的应用操作步骤c)中最佳缓释温度为37°C。
[0011] 通过设计合成主体分子Ν，Ν' -二谷氨酸-茈四甲酸二酰亚胺，引入核黄素和三聚 氰胺客体分子，通过自组装的方法，得到了机械强度高，荧光性强又兼具良好生物兼容性的 三组分水凝胶。
[0012] 利用荧光光谱仪测定荧光发射光谱，利用激光共聚焦显微镜测试凝胶荧光成像， 利用扫描电子显微镜测试凝胶的组装形貌，实现了通过自组装方法制备机械强度高，荧光 性强又兼具良好生物兼容性的三组份水凝胶的方法。
[0013] (3)有益效果 (a)本发明通过设计合成氨基酸衍生物Ν，Ν' -二谷氨酸-茈四甲酸二酰亚胺为主体 分子，引入药物核黄素和三聚氰胺作为客体分子，通过自组装方法制备了机械强度高，荧光 性强又兼具良好生物兼容性的三组分水凝胶。
[0014] (b)目前为止，三组分凝胶非常罕见，还没有高机械强度的三组分荧光水凝胶的制 备方法，所以此三组分水凝胶非常具有新颖性和创造性。
[0015] (C)本发明中此三组分水凝胶是载药凝胶，同时载入的药物核黄素是形成凝胶必 不可少的成份，且在缓释过程中能将客体分子核黄素缓释出来，这种情况在载药凝胶方面 比较罕见，高机械强度的三组分荧光水凝胶的制备方法还，因此具有新颖性和创造性。