癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备
【专利摘要】本发明公开了一种癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备的方法。利用蜡打印技术制备纸芯片，在荧光层工作区域生长金纳米棒和多孔银及适配体，进而进行癌细胞的捕获，利用多枝链杂交技术实现信号分子的放大，从而实现癌细胞的精确测量，将制备好的纸芯片折叠，在反应区域滴加显色溶液，从而实现癌细胞的可视化的预测定。随后加入多糖抑制剂，从而实现细胞表面多糖的动态表征。
【专利说明】
癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备
技术领域
[0001]本发明涉及低成本、易于携带、可视化的癌细胞及细胞表面多糖分析检测技术领域，更具体的说是一种能够检测癌细胞及细胞表面多糖的荧光/比色双模式传感器制备，本发明还涉及采用了多枝杂交链信号放大技术。【背景技术】
[0002]近年来，癌症已经成了人类的头号杀手，极大地威胁着人类健康，癌细胞的转移和扩散是癌症致命的重要原因，因此及早检测和及时治疗是克服癌症的根本方法。多糖是细胞表面的重要结构，多糖通过与蛋白或脂质共价作用高密度的分布在细胞膜表面和内部。 细胞表面糖蛋白的动态变化与细胞的转移、分化密切相关，因此对细胞表面多糖的检测具有重要意义。目前，很多方法(如高效液相色谱、质谱、核磁共振等)被应用于多糖的分析，但是这些方法的破坏性很强，使活细胞表面多糖表达的动态表征不可行。此外，这些方法费时，需要复杂的样品前处理和昂贵的仪器。而微流控纸基分析设备可视化的比色检测与荧光检测的联合实现了低成本、易于携带、可视化的初检及精确测定的完美结合。
[0003]为了提高癌细胞及多糖检测的灵敏度，我们采用了多枝杂交链反应，与传统的杂交链反应不同，多枝杂交链反应可以产生多支臂的长的产物，它可以吸附更多的信号分子从而实现有效的信号放大。同时为了提高癌细胞及多糖比色检测的灵敏度，采用贵金属复合纳米材料作为模拟酶，因其比表面积大、生物相容性好，催化性能高等优点，在科学技术领域引起了巨大的关注。生长有这种贵金属复合纳米材料的纸芯片，不仅增加了纸芯片的比表面积，而且有效降低了纸的背景荧光。更由于不同组分之间的协同和电子效应使其催化性能大大的提高，因而广泛应用于各种类型的生物传感器中。采用量子点作为荧光生物探针，由于其独特的物理和化学性质，如生物相容性好，易制备，宽的激发光谱，抗光漂白， 窄的、对称的、可调的发射光谱，使得量子点用于标记生物材料，比使用有机荧光染料具有更好的荧光特性。用量子点补充或部分取代有机荧光标记材料，将可以开创超灵敏、高稳定的以及长发光寿命的生物分析检测技术。鉴于以上优点，量子点必将成为最有前途的荧光标记物，因而量子点替代荧光染料作为荧光标记物大大提高了活细胞表面多糖的检测的可行性。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种长有金纳米棒和多孔银的纸芯片及铂铜纳米链和氧化石墨烯量子点修饰的多枝杂交链信号放大技术实现荧光/比色双模式传感器的制备方法， 用于癌细胞及癌细胞表面多糖的快速、灵敏检测。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明是通过一种长有金纳米棒和多孔银的纸芯片及铂铜纳米链和氧化石墨烯量子点修饰的多枝杂交链信号放大技术来实现的，其特征是包括以下步骤:(1)设计纸芯片荧光层和比色层的疏水蜡打印区域和亲水工作区域(附图1);(2)在a荧光层的工作区域生长金纳米棒和多孔银层；(3)将适配体链固定在步骤(2)所得的纸芯片的工作区域，随后采用牛血清白蛋白封闭活性位点，最后适配体链捕获癌细胞；(4)将钼铜(PtCu)纳米链和石墨稀量子点(GQDs)修饰的多枝杂交链固定在步骤(3)所得的纸芯片的工作区域；(5)如附图2所示，将步骤(4)所得的纸芯片折叠，在13比色层的工作区域滴加显色底物、 pH为4?6的缓冲溶液和过氧化氢，进行比色预测定；(6)精确荧光测定:将步骤(4)所得的纸芯片放入荧光设备中，在激发波长360 nm和发射波长460 nm下进行焚光测定；(7)在步骤(4)所得的纸芯片工作区域滴加10~30 yL多糖抑制剂衣霉素；(8)将步骤(7)所得的纸芯片用于细胞表面糖基的测定，重复步骤(5)和步骤(6)。[00〇6] 本发明所设计焚光/比色双模式纸芯片图案用Adobe illustrator CS4软件设计纸芯片的疏水蜡打印图案，所用纸芯片的纸为色谱纸。
[0007]本发明所述荧光层的工作区域生长金纳米棒和多孔银层的步骤为:(1)合成金种子:量取160 mL的二次水置于三口烧瓶中，加热到90 °C，随后加入1.6 mL氯金酸，水浴加热到96 °C，反应1 min，立即加入5.6 mL 1%梓檬酸钠，并搅拌15 min至溶液变为酒红色;取20 yL的金种子滴加到荧光层的工作区域，在室温下放置45 min;(2)合成金纳米棒和多孔银层:取20.0 yL的1%氯金酸和新鲜制备的200 mM盐酸羟胺滴加到已经有金种子的工作区域，室温下生长10 min;随后将新鲜制备的20.0 yL 24 mM硝酸银和200 mM抗坏血酸滴加到上述已长有金纳米棒的纸上，室温下生长10 min;最后，用水彻底清洗，室温下干燥30 min，制得纸芯片上金纳米棒和多孔银层。
[0008]本发明所述的将适配体链固定在步骤(2)所得的纸芯片的工作区域，随后采用牛血清白蛋白封闭活性位点，最后适配体链捕获癌细胞的步骤为:将20 yL适配体固定在金纳米棒和多孔银修饰过的纸芯片工作区域上，随后加入20 y L牛血清白蛋白以封闭活性位点，最后加入20 yL不同浓度的癌细胞。
[0009]本发明所述的将PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链固定在步骤(3)所得的纸芯片的工作区域，步骤为:(1) 合成PtCu纳米链:将1 mL磷酸三丁脂、18 mg六水氯化镍及22 mL二次水加入到 100 mL三口烧瓶中，摇匀后超声15 min，在氮气保护下，边强烈搅拌边滴加5 mL新鲜制备的2 mg ml/1硼氢化钠，随后立即加入10 mL 6 mM六氯铂酸钾和氯化铜的混合液，将上述溶液超声30 min，之后在60 °C水浴锅中水浴加热2 h，最后用乙醇和水洗，干燥即可得PtCu 纳米链；(2)合成GQDs:称取2 g柠檬酸放于5 mL烧杯中，加热到180 °C，溶液颜色变为橙色，调节pH到中性，即可得到GQDs;(3)PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链:1-伴刀豆球蛋白(1-Con A)和Hl-GQDs用琥珀酰亚胺耦合的方法得到；将1-Con A、Hl-GQDs和H2用PTC-200加热到95 °C保持10 min，并在30 s 内冷却到4 〇C，随后，100 yL 1-Con A 加到 1 mL Hl-GQDs 和 H2 (1:1) 中，37 °C反应过夜;最后，向上述溶液中加入1 mL PtCu纳米链，反应15 min，离心，将得到的产物分散在缓冲溶液中；(4)固定PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链:将20 yL PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链固定在修饰过的纸芯片工作区域。[0〇1〇]本发明所述的显色底物为3，_3,5，_5-四甲基联苯胺，邻苯二胺，2,2-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。
[0011]本发明所述的pH为4?6的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液， Tris盐酸缓冲溶液。[〇〇12]本发明所述细胞表面糖基比色预测定步骤，分别滴加显色底物、pH为4?6的缓冲溶液和过氧化氢，进行样品的测定，绘制灰度与癌细胞浓度的标准曲线，实现癌细胞的可视化预检，随后固定细胞浓度不变，改变衣霉素的浓度，绘制灰度与糖基抑制剂衣霉素浓度的关系，实现癌细胞表面多糖的可视化预检。
[0013]本发明所述细胞表面糖基荧光测定步骤，将纸芯片放入荧光皿中，进行样品的测定，绘制荧光强度与癌细胞浓度的标准曲线，实现癌细胞的精确检测，随后固定细胞浓度不变，改变衣霉素的浓度，绘制荧光强度与糖基抑制剂衣霉素浓度的关系，实现癌细胞表面多糖的精确检测。
[0014]本发明的有益效果(1)金纳米棒和多孔银层的使用，增大了比表面积及有效减少纸的背景荧光，提高了检测的灵敏度。
[0015](2)多枝杂交链的采用，有效实现了荧光和比色信号的放大，使信号得到了大幅度的提尚。
[0016](3)用量子点代替荧光染料，比使用有机荧光分子具有更好的荧光特性，并开创超灵敏、高稳定的以及长发光寿命的生物分析检测技术。
[0017](4)通过比色/荧光双模式生物传感器的联用，实现了癌细胞及细胞表面多糖的可视化的比色初检及进行精确的荧光测量。【附图说明】
[0018]图1:纸芯片a荧光层和比色层的疏水蜡打印图案；图2:纸芯片的尺寸及各层功能;纸芯片的折叠方式。【具体实施方式】
[0019]实施例1荧光/比色双模式纸芯片在MCF-7细胞中的应用:(1)在计算机上设计纸芯片荧光层和比色层的疏水蜡打印区域和亲水工作区域，将图案打印在A4尺寸色谱纸；(2)在步骤(1)所得纸芯片荧光层的工作区域生长金纳米棒和多孔银层:量取160 mL的二次水置于三口烧瓶中，加热到90 °C，随后加入1.6 mL氯金酸，水浴加热到96 °C，反应1 min，立即加入5.6 mL 1%梓檬酸钠，并搅拌15 min至溶液变为酒红色;取20 yL的金种子滴加到荧光层的工作区域，在室温下放置45 min;取20.0 yL的1%氯金酸和新鲜制备的200 mM盐酸羟胺滴加到已经有金种子的纸上，在室温下生长10 min;随后将新鲜制备的20.0 yL 24 mM硝酸银和200 mM抗坏血酸滴加到上述已长有金纳米棒的纸孔中，在室温下生长10 min;最后，用水彻底清洗，并在室温下干燥 30 min；(3)将适配体固定在步骤(2)所得的纸芯片的工作区域，将20 yL适配体固定在金纳米棒和多孔银层修饰过的纸芯片工作区域上，随后加入20 yL牛血清白蛋白以封闭活性位点，最后加入20 yL—系列不同浓度的MCF-7细胞；(4)PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链固定在步骤(3)所得的纸芯片的工作区域，合成PtCu纳米链:将1 mL磷酸三丁脂、18 mg六水氯化镍及22 mL二次水加入到100 mL三口烧瓶中，摇勾后超声15 min，在氮气保护下，边强烈搅拌边滴加5 mL新鲜制备的2 mg ml/1 硼氢化钠，随后立即加入10 mL 6 mM六氯铂酸钾和氯化铜的混合液，将上述溶液超声30 min，之后在60 °C水浴锅中水浴加热2 h，最后用乙醇和水洗，干燥即可得PtCu纳米链；合成GQDs:称取2 g柠檬酸放于5 mL烧杯中，加热到180 °C，溶液颜色变为橙色，调节pH 到中性，即可得至IjGQDs;PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链:1-Con A和Hl-GQDs用琥珀酰亚胺耦合的方法得到；将1-Con A、Hl-GQDs和H2用PTC-200加热到95 〇C保持10 min，并在30 s内冷却至丨J4 °C，随后，100 yL 1-Con A加到1 mL Hl-GQDs和H2 (1:1)中，37 °C反应过夜;最后， 向上述溶液中加入1 mL PtCu纳米链，反应15 min，离心，将得到的产物分散在磷酸盐缓冲溶液中；固定PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链:将20 yL PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链固定在修饰过的纸芯片工作区域；(5)将纸芯片放入荧光皿中，进行样品的测定，绘制荧光强度与癌细胞浓度的标准曲线，实现MCF-7细胞的精确检测，将纸芯片折叠，分别滴加30 yL 3，_3，5，_5-四甲基联苯胺、pH 为4醋酸-醋酸钠缓冲液和过氧化氢，进行样品的测定，绘制灰度与癌细胞浓度的标准曲线， 实现MCF-7细胞的可视化预检。
[0020] 实施例2荧光/比色双模式纸芯片在MCF-7细胞表面多糖检测中的应用:(1)在计算机上设计纸芯片荧光层和比色层的疏水蜡打印区域和亲水工作区域，将图案打印在A4尺寸色谱纸；(2)在步骤(1)所得纸芯片荧光层的工作区域生长金纳米棒和多孔银层:量取160 mL的二次水置于三口烧瓶中，加热到90 °C，随后加入1.6 mL氯金酸，水浴加热到96 °C，反应1 min，立即加入5.6 mL 1%梓檬酸钠，并搅拌15 min至溶液变为酒红色;取20 yL的金种子滴加到荧光层的工作区域，在室温下放置45 min;取20.0 yL的1%氯金酸和新鲜制备的200 mM盐酸羟胺滴加到已经有金种子的纸上，在室温下生长10 min;随后将新鲜制备的20.0 yL 24 mM硝酸银和200 mM抗坏血酸滴加到上述已长有金纳米棒的纸孔中，在室温下生长10 min;最后，用水彻底清洗，并在室温下干燥 30 min；(3)将适配体固定在步骤(2)所得的纸芯片的工作区域，将20 yL适配体固定在经金纳米棒和多孔银层修饰过的纸芯片工作区域上，随后加入20 yL牛血清白蛋白以封闭活性位点，最后加入20 yL固定浓度(106 cells/mL)的MCF-7细胞；(4)PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链固定在步骤(3)所得的纸芯片的工作区域，合成PtCu纳米链:将1 mL磷酸三丁脂、18 mg六水氯化镍及22 mL二次水加入到100 mL三口烧瓶中，摇勾后超声15 min，在氮气保护下，边强烈搅拌边滴加5 mL新鲜制备的2 mg ml/1 硼氢化钠，随后立即加入10 mL 6 mM六氯铂酸钾和氯化铜的混合液，将上述溶液超声30 min，之后在60 °C水浴锅中水浴加热2 h，最后用乙醇和水洗，干燥即可得PtCu纳米链；合成GQDs:称取2 g柠檬酸放于5 mL烧杯中，加热到180 °C，溶液颜色变为橙色，调节pH 到中性，即可得至IjGQDs;PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链:1-Con A和Hl-GQDs用琥珀酰亚胺耦合的方法得到；将1-Con A、Hl-GQDs和H2用PTC-200加热到95 〇C保持10 min，并在30 s内冷却至丨J4 °C，随后，100 yL 1-Con A加到1 mL Hl-GQDs和H2 (1:1)中，37 °C反应过夜;最后， 向上述溶液中加入1 mL PtCu纳米链，反应15 min，离心，将得到的产物分散在磷酸盐缓冲溶液中；固定PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链:将20 yL PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链固定在修饰过的纸芯片工作区域；(5)滴加不同浓度的20 yL糖链抑制剂衣霉素；(6)将纸芯片放入荧光皿中，进行样品的测定，绘制荧光强度与糖链抑制剂衣霉素浓度的关系，实现MCF-7细胞表面多糖的精确检测，将纸芯片折叠，分别滴加30 yL 3，_3，5，_5-四甲基联苯胺、pH为4醋酸-醋酸钠缓冲液和过氧化氢，进行样品的测定，绘制灰度与糖基抑制剂衣霉素浓度的关系，实现MCF-7细胞表面多糖的可视化预检。
【主权项】
1.癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备，其特征是包括以下步 骤:1.1设计纸芯片荧光层和比色层的疏水蜡打印区域和亲水工作区域；1.2在a荧光层的工作区域生长金纳米棒和多孔银层；1.3将适配体链固定在步骤1.2所得的纸芯片的工作区域，随后采用牛血清白蛋白封闭 活性位点，最后适配体链捕获癌细胞；1.4将铂铜(PtCu)纳米链和石墨烯量子点(GQDs)修饰的多枝杂交链固定在步骤1.3所 得的纸芯片的工作区域；1.5如附图2所示，将步骤1.4所得的纸芯片折叠，在13比色层的工作区域分别滴加显色 底物、pH为4?6的缓冲溶液和过氧化氢，进行比色预测定；1.6精确荧光测定:再将步骤1.4所得的纸芯片放入荧光设备中，在激发波长360 nm和 发射波长460 nm下进行焚光测定；1.7在步骤1.4所得的纸芯片工作区域滴加10~30 yL多糖抑制剂衣霉素；1.8将步骤1.7所得的纸芯片用于细胞表面糖基的测定，重复步骤1.5和步骤1.6。2.根据权利要求书1所述癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备， 其特征在于，用Adobe illustrator CS4软件来设计纸芯片的疏水錯打印图案和亲水工作 区域图案，所用纸芯片的纸为色谱纸。3.根据权利要求书1所述癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备， 其特征在于，在a荧光层的工作区域生长金纳米棒和多孔银层，具体步骤如下:首先合成金种子:量取160 mL的二次水置于三口烧瓶中，加热到90 〇C，随后加入1.6 mL氯金酸，水浴加热到96 °C，反应1 min，立即加入5.6 mL 1%梓檬酸钠，并搅拌15 min至 溶液变为酒红色;取20 yL的金种子滴加到荧光层的工作区域，在室温下放置45 min;合成金纳米棒和多孔银层:取20.0 yL的1%氯金酸和新鲜制备的200 mM盐酸羟胺滴 加到已经有金种子的纸上，在室温下生长10 min;随后将新鲜制备的20.0 yL 24 mM硝酸银 和200 mM抗坏血酸滴加到上述已长有金纳米棒的纸孔中，在室温下生长10 min;最后，用水 彻底清洗，并在室温下干燥30 min。4.根据权利要求书1所述癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备， 其特征在于，所述的将适配体固定在步骤1.2所得的纸芯片的工作区域，随后采用牛血清白 蛋白封闭活性位点，最后适配体链捕获癌细胞，具体制备步骤如下:将20 yL适配体固定在金纳米棒和多孔银修饰过的纸芯片工作区域上，随后加入20 yL 牛血清白蛋白以封闭活性位点，最后加入20 y L不同浓度的癌细胞。5.根据权利要求书1所述癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备， 其特征在于，所述的将PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链固定在步骤1.3所得的纸芯片 的工作区域，具体制备工艺如下:首先合成PtCu纳米链:将1 mL磷酸三丁脂、18 mg六水氯化镍及22 mL二次水加入到 100 mL三口烧瓶中，摇匀后超声15 min，在氮气保护下，边强烈搅拌边滴加5 mL新鲜制备 的2 mg ml/1硼氢化钠，随后立即加入10 mL 6 mM六氯铂酸钾和氯化铜的混合液，将上述溶 液超声30 min，之后在60 °C水浴锅中水浴加热2 h，最后用乙醇和水洗，干燥即可得PtCu 纳米链；合成GQDs:称取2 g柠檬酸放于5 mL烧杯中，加热到180 °C，溶液颜色变为橙色，调节pH 到中性，即可得至IjGQDs;PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链:1-伴刀豆球蛋白(Con A)和Hl-GQDs用琥珀酰 亚胺耦合的方法得到;将1-Con A、Hl-GQDs和H2用PTC-200加热到95 °C保持10 min， 并在30 s 内冷却到4 〇C，随后，100 yL 1-Con A 加到 1 mL Hl-GQDs 和 H2 (1:1)中，37 0 C反应过夜;最后，向上述溶液中加入1 mL PtCu纳米链，反应15 min，离心，将得到的产物 分散在缓冲溶液中；固定PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝杂交链:将20 yL PtCu纳米链和GQDs修饰的多枝 杂交链固定在修饰过的纸芯片工作区域。6.根据权利要求书1所述癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备， 其特征在于，所述的显色底物为3，_3，5，_5-四甲基联苯胺，邻苯二胺，2，2-连氮基-双-(3-乙 基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。7.根据权利要求书1所述癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备， 其特征在于，pH为4?6的缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液，磷酸盐缓冲溶液，Tri s盐酸缓冲 溶液。8.根据权利要求书1所述癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备， 其特征在于，样品的比色预测定步骤，分别滴加显色底物、pH为4?6的缓冲溶液和过氧化氢， 进行样品的测定，绘制灰度与癌细胞浓度的标准曲线，实现癌细胞的可视化预检，随后固定 细胞浓度不变，改变衣霉素的浓度，绘制灰度与糖链抑制剂衣霉素浓度的关系，实现癌细胞 表面多糖的可视化预检。9.根据权利要求书1所述癌细胞及细胞表面多糖检测荧光/比色双模式纸芯片的制备， 其特征在于，样品的荧光测定步骤，将纸芯片放入荧光皿中，进行样品的测定，绘制荧光强 度与癌细胞浓度的标准曲线，实现癌细胞的精确检测，随后固定细胞浓度不变，改变衣霉素 的浓度，绘制荧光强度与糖链抑制剂衣霉素浓度的关系，实现癌细胞表面多糖的精确检测。
【文档编号】G01N21/64GK106092982SQ201610384836
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月2日 公开号201610384836.5, CN 106092982 A, CN 106092982A, CN 201610384836, CN-A-106092982, CN106092982 A, CN106092982A, CN201610384836, CN201610384836.5
【发明人】葛慎光, 梁琳琳, 于京华, 李丽, 兰飞飞, 任娜, 刘海云, 张彦, 颜梅
【申请人】济南大学