专利名称：增强植物提取物营养价值的方法
技术领域：
本发明涉及通过抑制植物提取物内源蛋白质成分的降解来增强植物提取物营养价值的方法。该方法使用植物的遗传改变减少蛋白酶介导的内源蛋白质的降解。
背景技术：
植物是公认的营养成分的优秀来源，用于人类健康和动物饲料。提高用于动物饲料的植物饲料作物的营养价值的方法已有文献记载并且一些方法在下面的段落中描述。
提高饲料植物的营养价值的一种方法是优化它们的氨基酸平衡。这可以通过向这些植物中导入编码高甲硫氨酸含量的蛋白质的基因，该基因由强组成型启动子或者叶子启动子驱动。为了显著改变豆类饲料的氨基酸平衡，外源蛋白质应该含有约15-25％的S-氨基酸，并且组成总叶蛋白的5-10％。为了实现这些水平的蛋白质积累，必须确保该基因的转录和翻译的最大水平和该蛋白质的稳定性。
大多数关于营养提高的共同努力集中于种子蛋白质。因为玉米和其他谷类作物不容易转化，针对种子蛋白质修饰的大多数工作包括试验转基因烟草中被修饰的谷醇溶蛋白的稳定性。还分析了转基因烟草和矮牵牛花种子中含有赖氨酸的α玉米醇溶蛋白的合成(Williamson等，1988)。发现正常的和被修饰的蛋白质都具有非常短的半衰期。
增加植物中特定氨基酸库的一种方法是导入编码植物中氨基酸生物合成途径中关键调节酶的细菌基因。一种编码天冬氨酸激酶的细菌基因对于赖氨酸和苏氨酸的反馈抑制脱敏化，该细菌基因被融合到β云扁豆蛋白基因启动子并导入到烟草中。转基因烟草的种子显示出游离苏氨酸和甲硫氨酸的增加的水平(Galili，1995，Plant Cell.7899-906)。
尽管已经开发了提高植物中氨基酸含量的方法，但是对饲料作物蛋白质质量的提高进行了很少的努力。例如，Schoeder等，(199，Aust.J.PlantPhysiol.18495-505)向苜蓿中导入鸡卵清蛋白基因(cDNA)，其被CaMV 35S启动子驱动。然而，该转基因苜蓿植物叶子中显示出非常低的蛋白质积累水平(0.005％)。还没有确定可以解释转基因苜蓿叶子中该蛋白质的如此低丰度的原因，但是该观察表明在植物中导入外源高价值蛋白可能因为低水平表达而不一定是提高植物营养价值的适当方法。
植物提取物的营养价值部分依赖于其内源蛋白质的质量。对于植物中产生的重组蛋白，稳定内源蛋白的产率与它们在植物中积累过程中和在植物提取物的加工过程中的蛋白质的稳定性密切相关。
有价值的蛋白质生产的低产率的一个原因是可以降解蛋白质的内源性蛋白酶的蛋白水解活性。已知植物细胞具有一些特异性差的蛋白酶。在微酸性pH范围内具活性的叶子液泡蛋白酶尤其可显著地改变许多蛋白质的稳定性并减少植物提取物的营养价值。
实际上，在从植物生产营养性提取物时两个关键步骤中植物蛋白酶可以降解内源性蛋白质。降解可以1)植物内发生，在蛋白质积累过程中，和2)植物外发生，在植物提取物加工过程中细胞破碎的时候。后者可能具有主要的重要性，因为在该步骤中，细胞破碎从植物的所有部分和细胞隔室释放一群蛋白酶。从植物叶子产生营养性提取物的基本过程通常以碎裂植物生物量和将所得浆液压缩产生绿色汁液开始。绿色汁液通常含有包括蛋白酶的各种蛋白质和绿色色素物质。如果在含有高水平的蛋白质的植物加工中和之后这些水平相对较低，那么该加工是没有用的。本发明集中于防止植物提取物加工过程中细胞破碎时发生植物外蛋白质水解。
对于植物蛋白酶和它们的抑制剂之间的相互作用知之甚少，然而，没有可获得的含有低蛋白质水解表型的植物品系。克服植物中蛋白质水解问题的一个实际方法是使用适宜的导向信号将重组蛋白质靶向细胞器和因此它们在特定的亚细胞隔室中积累。因为该策略需要修饰最初的蛋白质序列，所以其不适用于内源性蛋白。
降低植物提取物中蛋白质水解水平的另一方法是切割后“冷却”(冰冻)植物材料。收获时存在内源性蛋白质水解的相当大的危险(Michaud和Asselin，1995，J.ChromatographyA698263-279)。在苜蓿沉淀的收获和制备过程中，例如，植物细胞被破碎然后将各种化合物释放到介质中，这些化合物包括蛋白酶，其可以改变内源性有价值蛋白质的完整性。
该降解问题也可以通过将低分子量蛋白酶抑制剂包含在提取缓冲液中来解决(Michaud，1998，Anal.Chimica Acta372173-185)。然而，尽管该策略在小规模生产水平中有用，但是其不适于工业规模，也不适于食品和饲料市场，其中蛋白质被大量生产。
从现有技术中知道植物中重组蛋白酶抑制剂的表达可负面地影响转基因植物的正常发育，因为蛋白酶参与各种代谢事件。在现有技术中还知道重组蛋白酶抑制剂可以被插入到植物中以改变植物的代谢从而得到期望的农艺学特征。此外，在文献中还建议植物中外源蛋白酶抑制剂的积累可以受到内源性蛋白酶的蛋白水解活性的危害。抑制剂还可以在植物中大量积累，但是在提取时可被内源性蛋白酶降解，如以前对OC-1半胱氨酸蛋白酶抑制剂所陈述的(Michaud等，2000，in Michaud Ed.，Austin TX，pp.195-200)。
考虑到植物是对内源性蛋白酶的蛋白水解高度敏感的营养性蛋白质的优秀来源，非常期望开发在食物生产过程中保存植物和植物提取物的蛋白质含量，并且不改变植物的正常新陈代谢或发育的有效方法。
发明内容
本发明的一个目的是提供增加植物或其部分的营养价值而不显著改变植物或其部分的自然生理的方法，该方法包括使用植物或植物提取物的植物细胞被破碎时从植物或植物提取物释放的抑制剂中和对至少一种内源性蛋白的至少一种植物蛋白水解降解的活性或作用。该部分可以是所述植物的提取物或浓缩物。可以理解根据需要中和可以是部分或全部的。
在提取物或浓缩物制备过程中所述植物或植物部分的加工过程中，或者在该植物或植物部分的吞咽或消化过程中，所述植物细胞被破坏。
此外，可以通过遗传改变植物导致完全或部分抑制细胞破碎发生时特定地与内源性蛋白降解相关的至少一种蛋白水解反应，得到对蛋白水解降解的中和。
植物蛋白酶不是在植物的生长过程中被抑制以便保持该植物生长过程中所述植物蛋白酶的活性和该植物的自然生理。
本发明的方法允许在人或动物中吞咽或消化过程中内源性蛋白质的稳定性增加预定的时间。例如，被动物吞咽或消化的植物部分的降解和细胞破碎仅当该部分到达胃或者肠时才可以完成，以便将具有更高营养效果的完整蛋白质或肽传递到该系统。
可以实施该方法以中和蛋白酶，所述蛋白酶选自半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和多特异性的广谱蛋白酶。
优选地，通过遗传学方法用含有可操作地与一种因子或肽连接的启动子的表达盒转化植物，该因子或肽导致细胞被裂解或破坏时蛋白水解降解的中和条件。例如，该中和因子可以连接到前导肽、信号肽或锚定肽或者将蛋白酶抑制剂导向或者锚定到细胞部分或者胞外隔室的蛋白质，从而保护内源性蛋白在植物提取物的加工过程中免受植物蛋白酶的活性影响。可以选择细胞部分或胞外隔室以便在植物提取物的加工过程中细胞破碎时但不是在植物生长过程中保护内源蛋白免受植物蛋白酶的活性，以便在植物生长过程中保持植物蛋白酶的活性。例如，细胞部分可以是选自线粒体、叶绿体、存储液泡、内质网、细胞溶胶的细胞器。
根据本发明的另一方面，可以使用蛋白酶抑制剂实施该方法，所述蛋白酶抑制剂选自抗体或其片段、有意义mRNA或反义mRNA、转录抑制剂或其调节剂、翻译抑制剂或其调节剂、前导肽或信号肽抑制剂、蛋白酶活性的代谢获得抑制剂、蛋白酶特异性蛋白酶，和导致所述蛋白酶分离到细胞器或细胞隔室的亲和肽蛋白酶。表达盒可以包括表达载体，其中编码序列被组成型、两极的或诱导型启动子调节。表达载体也可以含有诱导型启动子，其是组织特异性启动子、时间特异性启动子或伤口诱导型启动子。
优选地，本发明方法在其上实施的植物或植物细胞来自苜蓿或马铃薯。
本发明的一个目的是提供在植物、植物组织、植物部分、植物细胞或植物提取物的加工过程中细胞破碎时通过防止内源蛋白降解增加植物提取物的营养价值的方法。
本发明的另一个目的是提供一种方法，其中在细胞被破碎、裂解、吞咽或消化时通过中和蛋白酶介导的所述内源蛋白的蛋白水解在植物或植物细胞中实现对内源蛋白降解的抑制。
本主题发明还涉及能够表达高水平稳定蛋白质的植物和植物组织，该稳定蛋白质例如但不限于，作为植物细胞中的蛋白体被局部化。
本发明的另一个目的是提供一种方法，其中蛋白水解的中和包括遗传改变蛋白酶的功能性能，所述蛋白酶包括苜蓿和马铃薯蛋白酶。
本发明的另一个目的是提供细胞破碎时保持植物内源蛋白产率的植物或植物细胞。本领域技术人员还将认识到，当植物被例如，碾磨，或者在植物提取物或植物浓缩物的制备过程中时可以发生细胞破碎。当植物或植物细胞在食用过程中被咀嚼或吞咽时也会发生细胞破碎。这通过抑制蛋白酶介导的所述内源蛋白质的蛋白水解进行。优选地，植物包括Medicagosativa(苜蓿)和马铃薯。
为了本发明的目的，定义下面的术语。
术语“内源蛋白质”包括植物或植物细胞天然产生的蛋白质。
如此处所用的术语“启动子”或“启动子区”或“转录调节序列”指通常在编码区的上游(5’)发现的DNA序列，其通过提供RNA聚合酶识别位点和/或在正确位点启动转录必需的其他因子控制信使RNA(mRNA)的产生而控制编码序列的表达。如此处所预期的，启动子或启动子区包括通过连接到各种调节序列、随机或受控诱变，和加入或复制增强子序列衍生的各种启动子。此处公开的启动子区，和其生物学功能等价物负责当基因序列作为适当的重组载体导入宿主时驱动基因序列在它们的控制下转录，如通过其产生mRNA的能力所证明的。
如此处所用的表达“植物细胞”或“植物部分”旨在表示或包括小植株、原生质体、愈伤组织、根、块茎、繁殖体、种子、幼苗、花粉、任何其他植物组织。
术语“蛋白酶”旨在表示将多肽直接或间接降解成更小的肽、片段或氨基酸，或者导致目的蛋白质稳定性损失的形式的酶。
附图简述
图1阐明了粗提物中，pH 4.5和pH 7.5时内源性蛋白酶降解苜蓿(A)或马铃薯(B)叶蛋白的时程。
图2阐明了通过通常浓度的丝氨酸型PIs(A)或半胱氨酸型PIs(B)抑制苜蓿(品种Saranak)叶子蛋白酶对核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy-FL的降解。
图3阐明了通过通常浓度的丝氨酸型PIs(A)或天冬氨酸和半胱氨酸型PIs(B)抑制马铃薯(品种Kennebec)叶子蛋白酶对核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy-FL的降解。
图4阐明了在表达低(+)、高(++)或非常高(+++)水平的cdi mRNA的转基因马铃薯植物中测量的rubiscase活性。
实施本发明的方式本发明提供了通过在将要用于动物饲料加工或者用于农业、工业和药物的植物中表达蛋白酶抑制剂增加植物提取物的内源蛋白质含量的方法。
本发明提出了通过以遗传学方法导入所选蛋白酶抑制剂以防止内源植物蛋白质的蛋白水解以提高饲料作物蛋白质的新方法。
此外，本发明涉及生产植物品系的方法，该植物品系通过遗传学方法改变以在植物提取物的加工过程中细胞破碎时抑制至少一种蛋白酶以保持目标内源蛋白的完整性。
在本发明的一个方面中，选择特异表达和处理蛋白酶抑制剂的策略以不负面影响转基因植物的代谢或发育。
在本发明的一个实施方案中，蛋白酶抑制剂可以靶向到与所靶向蛋白酶的天然定位不同的亚细胞隔室，以便保持植物生长中该蛋白酶的重要活性，和在植物提取物加工过程中细胞破碎时促进内源蛋白的保护。
也可以通过抑制目标植物中蛋白酶的产生或合成来实现本发明。
备选地，通过调节转录或翻译机制以防止蛋白酶得到其活性或活性潜能，可以进行植物或植物组织中蛋白酶活性的抑制。
在本发明的另一个优选的实施方案中，选择特异表达和靶向蛋白酶抑制剂的策略以不明显影响或保持植物的代谢和发育。这里应该理解在细胞裂解时抑制蛋白酶对目标蛋白质的活性或作用的条件中植物或植物细胞的正常生理优选不受影响。例如，但不限于，被基因修饰导致其中的蛋白酶抑制的植物将以与未修饰植物相同的速度生长。另一方面，蛋白质合成也不受导致植物或植物细胞中该蛋白酶抑制的条件的影响。
根据本发明，提供了植物细胞被破碎或裂解时，将提供导致蛋白酶的作用或活性被部分或完全抑制的条件的方法。优选地，该方法利用了蛋白酶抑制剂，并使用序列遗传改造植物或植物细胞，以保护这些植物或植物细胞中产生的内源蛋白免于蛋白酶的活性。抑制根据本发明的蛋白酶活性的另一条件是抑制剂直接结合目标蛋白质以避免蛋白酶接近切割位点，例如，直接结合蛋白酶以阻碍其作用或活性。
备选地，可以在改变蛋白酶自身的专一性或者细胞裂解过程中导致蛋白酶对目标营养蛋白的专一性改变的条件下进行根据本发明的蛋白酶抑制。该蛋白酶的专一性改变将优选地不影响其在植物或植物细胞中天然存在的活性。
根据本发明，提供了通过增强植物或植物提取物蛋白质含量提高它们的营养价值的方法。更具体地，通过防止植物蛋白酶催化的内源蛋白的降解提高营养价值。
本发明的一个实施方案是提供增加植物的饲料质量的方法，该方法包括将植物或植物组织用编码至少一种蛋白酶抑制剂，或者在细胞被破碎或裂解时将导致中和蛋白酶的作用或活性的条件的蛋白酶的多核苷酸分子转化。
在本发明的另一个实施方案中，提供了增加植物或植物细胞中内源营养蛋白的回收产率的方法，该方法包括得到表达一种或多种抑制剂的植物或植物细胞的步骤，该抑制剂靶向参与内源蛋白质降解的内源植物蛋白酶。
广义上，该方法可由以下各项组成a)靶向特定亚细胞隔室中的蛋白酶抑制剂或b)将两种蛋白酶抑制剂靶向到分开的亚细胞隔室中或c)靶向相同亚细胞隔室中的两种蛋白酶抑制剂。两种以上的蛋白酶抑制剂也可以在一种或几种亚细胞隔室中表达。亚细胞隔室可选自细胞溶胶、内质网、细胞外隔室、线粒体、叶绿体、质外体和存储液泡。
蛋白酶抑制剂的靶向策略的选择是关键的，因为其可通过改变内源蛋白酶的重要功能显著影响转基因植物的代谢或发育。例如，豌豆球蛋白(vicillin)，其是通过使用保留信号在苜蓿细胞的内质网中表达的液泡蛋白(Wandelt等，1992，Plant J.2181-192)。
在现有技术中描述了将外源蛋白质靶向线粒体和叶绿体的其他实例以及植物中外源蛋白的液泡靶向的实例(Di Sansebastiano等，1998，Plant J.15449-457)。
从蛋白质除去靶向肽可导致胞液蛋白，增加到外源蛋白质的分泌肽将促进该蛋白质的分泌。外源蛋白质的天然分泌肽可通过植物分泌机器正确地加工。
根据一个实施方案，使用植物或植物细胞可以进行本发明，该植物或植物细胞含有编码可操作地连接到启动子的抑制剂的DNA序列并且该序列任选含有靶向肽融合，该靶向肽将抑制剂定位于植物或植物细胞的特定亚细胞或细胞外隔室中。
备选地，可以在通过两种分离的植物的杂交(cross-over)得到的植物或植物细胞中实现，这两种植物都含有可操作地连接到特定启动子的特定蛋白酶抑制剂并且该蛋白酶抑制剂任选地含有特定靶向肽的融合以将该抑制剂定位于植物或植物细胞的特定亚细胞或细胞外隔室中。
编码强蛋白酶抑制剂的基因可导入植物的基因组中以减少植物中蛋白水解活性，这对于用于动物饲料的植物内源蛋白质含量的增加是理想的。可以在苜蓿或马铃薯中重组产生的蛋白酶抑制剂的实例包括但不限于抑制植物的半胱氨酸蛋白酶的植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂OC1、OCII和TMC-8和抑制植物的丝氨酸蛋白酶的人丝氨酸蛋白酶抑制剂α-1-抗-胰凝乳蛋白酶(AACT)。可以在马铃薯植株中表达的蛋白酶抑制剂的一个实例是抑制植物天冬氨酸蛋白酶的天冬氨酸型蛋白酶抑制剂(CD-I)。
本发明也可以使用其他类型的蛋白酶抑制剂，它们可选自但不限于，对蛋白酶或蛋白酶前肽特异的抗体或抗体片段。
根据本发明的另一方面，可以在转基因植物中产生阻止蛋白酶正常活性的对该蛋白酶特异的抗体或其片段。该抑制方法依赖于抗体结合其植物细胞中抗原的能力。所以，需要该植物能够产生抗体或其片段，并且这可以通过用产生完全的和活性抗体所需的一种或多种转基因遗传转化该植物实现。在转基因植物中可以表达不同抗体，这些抗体包括免疫球蛋白(IgG、IgA和IgM)、单链抗体片段(ScFv)、片段抗原结合结构域(Fab)，和重链可变结构域。
在本发明另一方面，抗体或其片段可以靶向到与被靶向蛋白的天然定位不同的亚细胞隔室以便在植物的生长过程中保存该蛋白酶的重要活性，并在提取和植物食物生产时促进对内源蛋白的保护。在本发明的一个特定实施方案中，通过产生基因修饰的植物或植物细胞部分或完全防止蛋白水解。在植物收获、植物储存，或甚至人或动物的吞咽或消化的整个过程中，在基因修饰的植物或产生的植物细胞中可特别允许蛋白质降解受蛋白酶抑制。
如此处所阐明的，为了实施本发明方法，植物可以被基因修饰以表达至少一种重组蛋白酶抑制剂，该抑制剂基本上针对丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。
本发明的另一个实施方案中，两种蛋白酶抑制剂基因可以共同插入到植物基因组中、与此处描述的相同或不同的亚细胞隔室中。
可以使用不同策略改造植物。例如，可以通过，非限制地，将蛋白酶抑制剂编码基因插入到植物的基因组中进行工程化。
此外，本发明可以通过使用组成型或诱导型启动子控制蛋白酶抑制剂的表达进行。例如，通过收获前加入诱导剂可以仅在收获时诱导抑制剂的表达。表达一种或几种蛋白酶抑制剂的植物可以与表达一种或多种蛋白酶抑制剂的植物杂交。
本发明的一个实施方案提出了使用各种启动子控制蛋白酶抑制剂的表达。可以用于所提出的方法中的启动子为，但不限于组成型的、诱导型的、病毒的、合成的、发育-特异的、组织-特异的、时间上被调节的、空间上被调节的，和空间-时间上被调节的。
可用于实施本发明的启动子可以应答外源诱导剂的存在或不存在而被诱导，从而能够在与蛋白质相同的时间表达抑制剂，从而在整个生产过程中减少了所述蛋白质被植物蛋白酶降解。可以根据本发明使用的诱导型启动子可选自，但不限于伤口-诱导型启动子、营养-诱导型启动子、冷-诱导型启动子。例如，但不限制，本发明诱导型启动子可以包括来自Medicacosativa(苜蓿)基因组的亚硝酸盐还原酶启动子(WO 01/25454)。也可以使用重金属-诱导型启动子，如35S CaMV-驱动的启动子，已知存在Cd2+时该启动子控制烟草中β-葡糖醛酸糖苷酶的表达(Brandle等，1993，Genome36255-260)。诱导型启动子的另一个实例是低温诱导型启动子，其天然地控制拟南芥(Arabidopsis thaliana)的cor15a基因的表达(Dordrecht，1994，PlantMol.Biol.24701-713)。
根据本发明的一个实施方案，设计表达载体，其将被插入到植物或植物细胞中以抑制蛋白酶活性，该表达载体可以含有编码两种蛋白酶抑制剂的两条DNA序列。这两条DNA序列通常可以通过唯一的两极启动子可操作地连接。
根据本发明，可以使用不同转化方法将蛋白酶抑制剂基因插入各种植物的基因组中。这包括微粒轰击、组织电穿孔、微注射、使用聚乙二醇(PEG)将DNA直接转移到原生质体中和碳化硅“晶须(whisker)”方法。所有这些方法都可以从现有技术中知道。
本发明范围中预期的植物包括饲料作物植物，包括，例如，苜蓿、三叶草、玉米青贮、高梁和其他豆科作物，这些植物被转化而表达本发明的蛋白。
本发明范围内还预期的为用于人或动物消费的植物，它们已经被转化而表达蛋白质或RNA，所述蛋白质或RNA增强植物的蛋白质质量以提高营养。
可用于实施本发明的一种植物是苜蓿Medicago sativa。苜蓿被认为是世界上最重要的种植性饲料作物并且由于其广泛生长而被称为“饲料作物皇后”，具有维生素和矿物质的完美平衡，高产，是生物氮固定的优秀来源，并且其作为良好的蜜蜂花蜜来源。已经针对饲料质量和植物性能对苜蓿育种多年。
通过应用本发明可以适当地保持具有高营养价值的饲料植物、植物组织或植物提取物的不同蛋白质的稳定性和完整性。例如，但不限制，核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶是赋予植物适当的高营养价值的蛋白质之一。
实施例通过参考下面的实施例将更容易理解本发明，这些实施例用于阐明本发明而不是限制本发明的范围。
实施例1马铃薯和苜蓿叶子提取物中蛋白质的降解和保护为了建立鉴定植物提取物中靶蛋白酶和选择有效抗这些蛋白酶的抑制剂的基本原理，使用植物中最丰富的蛋白质核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶)作为底物监测苜蓿和马铃薯叶组织中蛋白水解活性。
图1阐明了苜蓿(A)和马铃薯(B)叶子提取物中内源蛋白质的命运，表明在低pH提取后它们有限的稳定性。叶样品(来自顶点的第一到第四片叶子)在液氮中研磨。在10mM β-巯基乙醇的存在下在50mM Tris-HCl(pH7.5)或0.1M柠檬酸盐-磷酸盐(pH 4.5)中提取蛋白质(1∶3 w/v)。可溶性蛋白质提取物在4℃搅拌10分钟，并以18000g离心10分钟。回收上清液并用Bradford’s方法(Bradford，1976，Anal Biochem.72248-254)确定蛋白质浓度。将Tris-HCl缓冲液中的蛋白质调节到1mg/ml的终浓度，而柠檬酸盐-磷酸盐中的蛋白质调节到0.5mg/ml的终浓度。通过25℃温育提取物进行蛋白水解分析。反应开始后在不同时间吸取70μl等分试样，立即与30μl变性电泳缓冲液(200mM Tris-HCl pH 8.8，10％(v/v)β-巯基乙醇，2％(w/v)SDS，10％(v/v)甘油)混合，并在95℃加热5分钟。然后将7μg变性蛋白加到标准10％SDS-PAGE凝胶上并通过考马斯染色。图1表明仅仅几小时后，例如，大的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的52kDa亚单位(箭头)的显著部分在pH 4.0和pH 7.5下被内源蛋白酶降解。
为了监控诊断性PIs和植物重组PIs对马铃薯叶子和苜蓿提取物的蛋白酶活性的影响，通过荧光分析法确定针对核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的总蛋白酶活性(称为rubiscase活性)，使用偶联琥珀酰酯荧光团，BodipyFL，SE(Molecular Probes，OR，USA)的核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶作为底物。按照供应商的使用说明进行核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶与BodipyFL，SE的偶联。植物组织在液氮中磨碎并在含有2mM MgCl2，1mM DTT和1％(w/v)PVPP的100mM Hepes(pH 7.5)缓冲液中提取(1∶3 w/v)。可溶的提取物在4℃以12000rpm离心15分钟。除去上清液并将其在用由50mMHepes(pH 7.5)(中性反应缓冲液)或0.15M乙酸钾(pH 5.5)(酸性反应缓冲液)组成的反应缓冲液预平衡的Sephadex G-25柱上透析。将50μl植物提取物在20℃下与5μL反应缓冲液(对照)、5μL DMSO、5μL甲醇、5μlSBTI(1mg/ml)、5μL BBTI(1mg/ml)、5μL抑肽酶(1mM)、5μLα-1抗胰蛋白酶(1mg/ml)、5μLα-1抗胰凝乳蛋白酶(1mg/ml)、5μL抑凝乳蛋白酶素(6mM)、5μL TPCK(20mg/ml)、5μL TLCK(20mg/ml)、5μLPMC8、5μL E-64(100mM)、5μL抑胃肽(1mM)、5μL GST-CCII或5μL GST-CDI预温育20分钟。所有诊断性PIs都获自Sigma-Aldrich(St-Louis，USA)。GST-CDI和GST-CCII作为重组蛋白质在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达并在亲和谷胱甘肽柱上纯化(Brunelle等，1999，Arch.Insect Biochem.Physiol.4288-98)。在30℃用核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy-FL作为底物进行荧光测定分析。将2μg核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy-FL加入到反应缓冲液中并用中性(用DMSO、甲醇、SBTI、BBTI、抑肽酶、抗胰蛋白酶、抗胰凝乳蛋白酶、抑凝乳蛋白酶素、PMSF、TPCK、TLCK分析)或酸性(用PMC8、E-64、抑胃肽、GST-CCII、GST-CDI分析)反应缓冲液使体积达到100μl。使用Fluostar Polastar Galaxy荧光计(BMG LabTechnologies)在5000秒内测量荧光强度100次，激发和发射滤光器分别为485nm和520nm。蛋白酶活性(以每秒荧光单位表达)相应于发射曲线的斜率。如在图2(苜蓿)和3(马铃薯)中所示的，当加入诊断性蛋白酶抑制剂时苜蓿和马铃薯叶子蛋白酶对核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的水解被显著延迟，指出一些蛋白酶组可作为如下策略开发的有趣目标，这些策略旨在通过抑制植物内源蛋白酶保护内源营养性蛋白完整性。这些数据还表明一种蛋白酶(或者蛋白酶组)的抑制足够保护粗提物中的蛋白质的显著部分，尽管介质中存在其他(不敏感的)蛋白酶。胰凝乳蛋白酶的抑制剂(TPCK，抑凝乳蛋白酶素，α1-抗胰凝乳蛋白酶)、胰蛋白酶抑制剂(TLCK，α1-抗胰蛋白酶)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CCII)和天冬氨酸蛋白酶抑制剂(抑胃肽)尤其显示出有趣的保护效果，导致rubiscase活性率减少约15-40％。
实施例II马铃薯中组织蛋白酶D蛋白酶的异位表达对内源蛋白(例如核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶)稳定性的影响为了评定植物中重组蛋白酶抑制剂的异位表达对提取时内源蛋白酶活性的影响(ex vitro)，将来自马铃薯的一种组织蛋白酶D抑制剂—马铃薯CDI(Werner等1993，Plant Physiol.1031473)整合到表达载体中并稳定表达到马铃薯(品种Kennebec)中表达，马铃薯CDI处于花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子(CD系)的控制下。编码马铃薯CDI的DNA序列从表达载体pGEX-3X/CDI(Brunelle等1999，Arch.Insect Biochem.Physiol.4288-98)通过BamHI和EcoRI消化分离，并亚克隆到商业载体pCambia 2300(CAMBIA，Canberra，澳大利亚)的BamHI和EcoRI克隆位点之间。CaMV35S启动子从商业性质粒pBI-121(Clontech，Palo Alto，CA)使用BamHI/SalI处理分离，然后连接到含有cdi转基因的pCambia构建体的BamHI和SalI克隆位点之间。还通过整合无启动子的cdi转基因设计了表达选择标记新霉素磷酸转移酶(NPTii)但是无CDI的转基因对照(SPCD系)。马铃薯的Axenically生长的小植株(Solanum tuberosum L.品种Kennebec)用作基因转化的来源材料。小植株在补加0.8％(w/v)琼脂(Difco，Detroit，MI)和3％(w/v)蔗糖的MS增殖培养基(Murashige和Skoog 1962，Physiol.Plant15473-497)上保持，该培养基被置于22℃，光强度为60μmol.m-2.s-1的组织培养室中，通过冷荧光灯提供16小时/天的光周期。直径约10mm的叶盘用如Wenzler等(1989，Plant Sci.6379-85)描述的细菌载体根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)进行遗传转化，只是用头孢噻肟代替羧苄青霉素作为根癌农杆菌生长对照。将再生的根转移到含有卡那霉素和头孢噻肟的选择培养基上，用于根再生和小植株繁殖。为了驯化，将小植株生长室中14天，处于24℃/21℃白天/黑夜温度周期、12-h L:D光周期、200μmol m-2.s-1光强度和60％的相对湿度下，之后转移到标准生长条件下的温室中。根据Edwards等(1991，Nuc.Acids Res.191349)，使用从约30cm马铃薯植株的第4、5和6片叶子(从顶端)提取的DNA，通过PCR证实卡那霉素抗性植株中nptii(标记)转基因的整合。如Logemann等(1987，AnalBiochem.16316-20)所描述的，使用从nptii转基因阳性植株的第4、5和6片叶子提取的总RNA，通过RT-PCR和northern印迹监控转基因品系中cdi转基因的表达。
为了监控马铃薯中CDI的异位表达对内源蛋白酶活性的影响，使用核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy-FL作为底物(见上面)，通过荧光测定法确定抗核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的总蛋白酶活性。在0.15M乙酸钾(pH5.5)(1∶3 w/v)中从对照(SPCD品系)或表达cdi(CD品系)的转基因马铃薯植株的叶子(从顶端的第四片叶子)提取可溶性蛋白质。将50μl可溶蛋白质提取物在30℃存在20mM L-半胱氨酸下与2μg核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy(100μl提取缓冲液中)温育。如图4中所示，与对照相比，从表达高水平重组cdi mRNA的转基因品系(例如，克隆21A)提取的叶蛋白对核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶-Bodipy-FL的降解被显著降低(Fisher′s LSD检验(p＜0.05)。更精确地，与没有CDI的转基因对照(SP4、SP7和SP12)相比，在分析条件下rubiscase活性的抑制率达到约40％，清楚地表明CDI-表达品系的抗核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶降低的“蛋白水解能力”。
将CDI隔离到马铃薯叶细胞的细胞质中不显著影响转基因体(transgenics)的生长和发育，表明假定的目标天冬氨酸蛋白酶在体内不被抑制剂显著地或者负影响。另一方面，图4中给出的数据表明在收获、匀浆和/或提取步骤中，马铃薯重组CDI可以快速抑制内源蛋白酶对蛋白质的水解，导致大部分叶蛋白核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶的显著保护。
实施例III苜蓿中通过蛋白酶抑制剂的异位表达保护内源蛋白质如上所描述的，苜蓿叶细胞含有大量特异性差的蛋白酶，它们在提取过程中释放到介质中。类似地，Wandelt和同事(1992，Plant J.2181-192)证明蚕豆球蛋白——蚕豆(Vicia faba)的一种液泡种子储存蛋白质——当指导其通常积累于液泡中的肽信号线路受损时，在苜蓿叶细胞中大量积累，清楚地表明该植物的液泡蛋白酶对叶子中表达的异源蛋白质的稳定性的潜在负影响。现在通常认为植物叶细胞中非特异性蛋白水解活性的一个重要来源在酸性到弱酸性pH范围内有活性的蛋白酶的原因，这些蛋白酶通常属于蛋白水解酶的半胱氨酸和天冬氨酸类(Callis，1995，Plant Cell7845-857)。从我们上面给出的数据可明显发现不同类型的蛋白酶——例如抑凝乳蛋白酶素-敏感蛋白酶——也可以对有用的内源蛋白质具有重要影响(见图2)。由于通常在细胞隔室而不是细胞质中发现特异性差的蛋白酶，所以具有抗这些蛋白酶活性的PIs(例如α1-抗凝乳蛋白酶和CCII)可以在叶细胞的细胞质隔室中表达而不在体内负面地干扰植物蛋白酶，但是然后在回收过程中细胞破碎后易于抗这些相同的酶。
实践中，可以使用的策略包括开发表达适当PI的饲料植物(例如苜蓿)的转基因品系，然后使用该品系产生收获后，通过保护内源蛋白质免受内源蛋白酶的影响而保存更高蛋白质含量的动物饲料。
尽管结合其特定实施方案描述了本发明，但是应该理解本发明能够进一步修改并且该申请旨在覆盖通常按照本发明的原理对本发明的任何变化、应用，和改变，这些变化、应用和改变包括在本发明所属领域内的公知或习惯实践内可以得到的与本公开的背离，和可以应用于此前提出的基本特征，并且如在所附权利要求书的范围内给出的。
权利要求
1.增加植物或其部分的营养价值且包括不显著改变所述植物或其部分的自然生理的方法，该方法包括用植物细胞被破碎时从所述植物或植物提取物释放的抑制剂中和至少一种植物蛋白水解降解对至少一种内源蛋白质的活性或作用。
2.权利要求1的方法，其中所述部分是所述植物的提取物或浓缩物。
3.权利要求1的方法，其中所述中和是部分或完全的。
4.权利要求1的方法，其中所述植物细胞在提取物或浓缩物的制备过程中所述植物或植物部分的加工过程中，或者所述植物或植物部分的吞咽或消化过程中被破碎。
5.权利要求1的方法，其中通过遗传改变所述植物而导致当细胞破碎发生时完全或部分抑制至少一种特异参与内源蛋白质降解的蛋白水解反应的条件来获得所述蛋白水解降解的中和。
6.权利要求5的方法，其中所述蛋白水解反应通过蛋白酶进行。
7.权利要求6的方法，其中在所述植物或植物提取物的所述加工过程中所述细胞破碎发生时而不是在所述植物的生长过程中所述植物蛋白酶被抑制，以便保持生长过程中所述植物蛋白酶的活性和该植物的自然生理。
8.权利要求1的方法，该方法将在人或动物的吞咽或消化过程中所述内源蛋白质的稳定性增加预定的时间。
9.权利要求1的方法，其中所述中和在选自以下各项的蛋白酶上进行半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶，和多特异性的广谱蛋白酶。
10.权利要求1的方法，其中所述植物用含有与一种因子或肽可操作地连接的启动子的表达盒转化，所述因子或肽导致所述蛋白水解降解的中和。
11.权利要求10的方法，其包括将所述因子连接到前导肽、信号肽或锚定肽或将所述蛋白酶抑制剂导向或者锚定到细胞部分或者胞外隔室的蛋白质，从而保护所述内源性蛋白在所述植物提取物的加工过程中免受植物蛋白酶的活性影响。
12.权利要求10的方法，其中所述因子是蛋白酶抑制剂。
13.权利要求11的方法，其中选择所述细胞部分或细胞外隔室以在所述植物提取物加工过程中细胞破碎时但不是该植物的生长过程中保护所述内源蛋白免受植物蛋白酶的活性影响，以便在该植物的生长过程中保持所述植物蛋白酶的活性。
14.权利要求13的方法，其中所述细胞部分是选自线粒体、叶绿体、储存液泡、内质网和细胞溶胶的细胞器。
15.权利要求12的方法，其中所述蛋白酶抑制剂选自由以下各项组成的组抗体或其片段、有意义mRNA或反义mRNA、转录抑制剂或其调节剂、翻译抑制剂或其调节剂、前导肽或信号肽抑制剂、蛋白酶活性的代谢获得抑制剂、蛋白酶特异性蛋白酶，和导致所述蛋白酶分离到细胞器或细胞隔室的亲和肽蛋白酶。
16.权利要求1的方法，其中所述植物是苜蓿或马铃薯。
17.权利要求10的方法，其中所述表达盒含有表达载体，其中编码序列被组成型、两极的或诱导型启动子调节。
18.权利要求17的方法，其中所述诱导型启动子是组织-特异性启动子、时间-特异性启动子或伤口诱导型启动子。
全文摘要
本发明涉及增加从植物细胞或植物回收的内源蛋白质的稳定性的方法。通过中和粗提物中的蛋白水解，尤其通过使用表达重组蛋白酶抑制剂或者活性改变的特定目标蛋白酶的通过遗传学改变的植物细胞或植物进行内源蛋白质的内源蛋白完整性的保持。
文档编号C12N9/50GK1671849SQ03818266
公开日2005年9月21日 申请日期2003年7月29日 优先权日2002年7月29日
发明者D·米肖, D·里瓦拉, R·安格诺, S·特雷庞尼, L-P·韦齐纳, F·布吕内勒 申请人:拉瓦勒大学