基因多态性分型方法

专利名称：基因多态性分型方法
技术领域：
本发明涉及对所关心基因中的碱基置换、插入突变或缺失突变进行检测的方法和适用于基因分型方法的试剂盒。
背景技术：
已知相同物种生物个体的基因组中所含的遗传密码各不相同，核苷酸序列也存在着差异，这被称为多态性。缺失或插入1-10个核苷酸的情况、所含特定核苷酸序列被复制的情况和类似情况均被认为是多态性。所含单个核苷酸被另一核苷酸替代的情况被称为单核苷酸多态性(SNP)。
检测SNP的常规手段通常被分为基于杂交的手段、基于引物延伸的手段和利用酶的底物特异性的手段。
碱基置换的存在是根据杂交方法，基于探针与核酸样品的杂交而得以检测。根据该方法，有必要确定探针和杂交条件，使杂交受单核苷酸差异影响。因而难以建立具有高度可重现性的检测体系。
利用循环探针反应检测突变的方法(见例如，美国专利No.5,660,988)是常规方法的一个实例。利用TaqMan法检测突变的方法(见例如，美国专利No.5,210,015和No.5,487,972)是常规方法的另一个实例。其它实例如下基于采用特定引物进行的引物延伸反应检测碱基置换的方法，其中该引物的3’末端退火至存在待检测碱基置换的核苷酸部分(见例如，美国专利No.5,137,806)；基于采用特定引物进行的引物延伸反应检测碱基置换的方法，其中该引物中的待检测碱基置换位点位于从3’末端开始的第二个核苷酸上(见例如，WO 01/42498)；和通过区分已整合进入特定引物中的核苷酸，确定所关心位点上突变的存在和该位点上的核苷酸的方法，其中该引物的3’末端退火至特定核苷酸上，该核苷酸的3’侧与存在待检测碱基置换的核苷酸相邻。此外，还已知利用DNA连接酶的方法。根据该方法，碱基置换是基于与相邻探针连接的存在而得以检测，探针的末端部分与存在待检测核苷酸置换的核苷酸部分对应。进一步的实例还包括利用特定酶的方法，该酶具有识别并裂解双链核酸中特定结构的活性，如invader法(见例如，美国专利No.5,846,717)。
上述方法具有如下问题无法用于检测痕量目标核酸；需在严格的温度/时间条件下进行；需严格控制退火至目标核酸；并需要具有检测所需特殊属性的酶。
于是，链置换型核酸扩增法，如ICAN法(见例如WO 00/56877和WO 02/16639)被开发为等温条件下扩增目标核酸的方法。此外，UCAN法(见例如WO 02/64833)被开发为利用DNA-RNA-DNA型嵌合寡核苷酸对遗传多态性分型的方法。
发明目标本发明的主要目标是提供一种采用痕量核酸样品准确并高度可重现性地检测碱基置换突变(如SNP)、插入突变或缺失突变的手段，并提供一种利用该手段对遗传多态性分型的方法。
发明概述为解决上述问题，需要一种可准确检测基因中的多种多态性，如碱基置换(如SNP)、插入突变或缺失突变，并可获得强信号形式的结果的方法。
本发明者制备了一种核苷酸。该核苷酸可退火至存在待检测碱基置换的目标核酸上。如果该核苷酸处于完整状态，则在DNA聚合酶作用下从该核苷酸3’末端开始的DNA延伸反应不启动。核酸酶对该核苷酸的裂解受该核苷酸退火所至模板链的核苷酸序列影响。于是，本发明者建立了一种可通过利用上述核苷酸与特定探针的组合，准确并高灵敏性地检测目标核酸中的遗传多态性的方法，其中该探针可用于特异性地检测目标核酸。本发明者进一步建立了一种可通过利用嵌合寡核苷酸引物、链置换型DNA聚合酶、RNase H和特定探针的组合，准确并高灵敏性地检测遗传多态性的方法，其中该探针可特异性地检测目标核酸。从而完善了本发明。
本发明的第一个方面涉及对人类细胞色素基因中的特定核苷酸，即CYP 2C19基因中的G636A或CYP 1A1基因中的T6235C的遗传多态性分型的方法，该方法包括(1)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种核苷酸和RNase H混合，制备反应混合物，其中(a)该核苷酸的3’末端经过修饰，因而在DNA聚合酶作用下不会发生从该未端开始的延伸；和(b)该核苷酸具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有人类细胞色素基因中的特定核苷酸；并(2)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以延伸含有一个任意长度区域的核酸，该区域含有人类细胞色素基因中的特定核苷酸。
根据第一个方面，可优选采用具有核苷酸序列SEQ ID NO14、15、21或22或与之互补的核苷酸序列的核苷酸作为本发明核苷酸。可进一步采用具有核苷酸序列SEQ ID NO16或23的引物。
第一个方面的方法可包括检测步骤(2)所延伸核酸的步骤，该检测采用可于严格条件下与该核酸杂交的探针。例如，该步骤中可采用具有核苷酸序列SEQ ID NO20或24或与之互补的核苷酸序列的探针。
本发明的第二个方面涉及一种试剂盒，适用于第一个方面对人类细胞色素基因中的遗传多态性分型的方法，且包含具有核苷酸序列SEQID NO14、15、21或22或与之互补的核苷酸序列的核苷酸。
第二个方面的试剂盒可进一步包含具有核苷酸序列SEQ ID NO16或23的引物和/或具有核苷酸序列SEQ ID NO20或24或与之互补的核苷酸序列的探针。
本发明的第三个方面涉及对人类谷胱苷肽S-转移酶基因中的多态性分型的方法，该方法包括(a)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNase H混合，制备反应混合物，其中引物是嵌合寡核苷酸引物，与模板核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中的至少一种物质，核糖核苷酸位于该引物3’末端或3’末端侧；并(b)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以扩增目标核酸。
根据第三个方面，人类谷胱苷肽S-转移醇基因的实例是GSTM1基因或GSTT1基因。可优选采用具有核苷酸序列SEQ ID NO6、7、8、29、30或31或与之互补的核苷酸序列的核苷酸作为嵌合寡核苷酸引物。
第三个方面的方法可进一步包括检测步骤(b)中所扩增核酸的步骤，该检测采用可于严格条件下与该核酸杂交的探针。例如，该步骤中可采用具有核苷酸序列SEQ ID NO9或32或与之互补的核苷酸序列的探针。
本发明的第四个方面涉及一种试剂盒，适用于第三个方面对人类谷胱苷肽S-转移酶基因中的遗传多态性分型的方法，且包含具有核苷酸序列SEQ ID NO6、7、8、29、30或31或与之互补的核苷酸序列的核苷酸。
第四个方面的试剂盒可进一步包含具有核苷酸序列SEQ ID NO9或32或与之互补的核苷酸序列的探针。
本发明的第五个方面涉及对人类醛脱氢酶基因中的特定核苷酸，即ALDH2基因中的Glu487Lys的遗传多态性分型的方法，该方法包括(1)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种核苷酸和RNase H混合，制备反应混合物，其中(a)该核苷酸的3’末端经过修饰，因而在DNA聚合酶作用下不会发生从该末端开始的延伸；和(b)该核苷酸具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有人类醛脱氢酶基因中的特定核苷酸；并(2)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以延伸含有一个任意长度区域的核酸，该区域含有人类醛脱氢酶基因中的特定核苷酸。
根据第五个方面，可优选采用具有核苷酸序列SEQ ID NO25或26或与之互补的核苷酸序列的核苷酸作为本发明核苷酸。可进一步采用具有核苷酸序列SEQ ID NO27的引物。
第五个方面的方法可包括检测步骤(2)中所延伸核酸的步骤，该检测采用可于严格条件下与该核酸杂交的探针。例如，该步骤中可采用具有核苷酸序列SEQ ID NO28或与之互补的核苷酸序列的探针。
本发明的第六个方面涉及一种试剂盒，适用于第五个方面对人类醛脱氢酶基因中的遗传多态性分型的方法，且包含具有核苷酸序列SEQID NO25或26或与之互补的核苷酸序列的核苷酸。
第六个方面的试剂盒可进一步包含具有核苷酸序列SEQ ID NO27的引物和/或具有核苷酸序列SEQ ID NO28或与之互补的核苷酸序列的探针。
本发明的第七个方面涉及遗传多态性分型方法，其中多个目标核酸是平行检测的，该方法包括(1)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种核苷酸和RNase H混合，制备反应混合物，其中(a)所述核苷酸的3’末端均经过修饰，因而在DNA聚合酶作用下不会发生从该末端开始的延伸；和(b)所述核苷酸均具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有多个目标核酸中的特定核苷酸；并(2)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以延伸均含有一个任意长度区域的核酸，该区域含有上述特定核苷酸。
本发明的第八个方面涉及遗传多态性分型方法，其中多个目标核酸是平行检测的，该方法包括(a)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种引物和RNase H混合，制备反应混合物，其中引物均为嵌合寡核苷酸引物，与模板核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中的至少一种物质，核糖核苷酸位于该引物3’末端或3’末端侧；并(b)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以扩增目标核酸。
本发明的第九个方面涉及遗传多态性分型方法，其中多个目标核酸是平行检测的，该方法包括(A)根据包括以下步骤的方法检测至少一个目标核酸(1)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种核苷酸和RNase H混合，制备反应混合物，其中(a)该核苷酸的3’末端经过修饰，因而在DNA聚合酶作用下不会发生从该末端开始的延伸；和(b)该核苷酸具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有多个目标核酸中的特定核苷酸；并(2)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以延伸含有一个任意长度区域的核酸，该区域含有上述特定核苷酸；和(B)根据包括以下步骤的方法检测与(A)中的目标核酸不同的目标核酸(a)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少引物和RNase H混合，制备反应混合物，其中引物为嵌合寡核苷酸引物，与模板核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中的至少一种物质，核糖核苷酸位于该引物3’末端或3’末端侧；并(b)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以扩增目标核酸。
根据第七-第九个方面，目标核酸中的至少一个可作为内标核酸。采用选自具有核苷酸序列SEQ ID NOS35-42的引物中的至少两种引物可测定内标核酸。采用具有核苷酸序列SEQ ID NO43或44或与之互补的核苷酸序列的探针可进一步测定内标核酸。
本发明的第十个方面涉及一种试剂盒，适用于第七-第九个方面的遗传多态性分型方法。
第十个方面的试剂盒可包含选自具有核苷酸序列SEQ ID NOS35-42的引物中的至少两种引物。可进一步包含具有核苷酸序列SEQ IDNO43或44或与之互补的核苷酸序列的探针。
附图简述

图1为照片，显示了根据本发明检测方法检测人类基因中的缺失突变的结果。
图2为照片，显示了根据本发明检测方法检测人类基因中的缺失突变的结果。
图3为图解，显示了根据本发明检测方法检测人类基因中的缺失突变的结果。
图4为照片，显示了根据本发明检测碱基置换的方法检测人类基因中的碱基置换的结果。
图5为图解，显示了根据本发明检测碱基置换的方法检测人类基因中的碱基置换的结果。
图6为照片，显示了根据本发明检测碱基置换的方法检测人类基因中的碱基置换的结果。
图7为图解，显示了根据本发明检测碱基置换的方法检测人类基因中的碱基置换的结果。
图8为图解，显示了根据本发明检测碱基置换的方法检测人类基因中的碱基置换的结果。
图9为照片，显示了根据本发明检测方法检测人类基因中的缺失突变的结果。
图10为照片，显示了根据本发明检测方法检测人类基因中的缺失突变的结果。
图11为图解，显示了根据本发明检测方法检测人类基因中的缺失突变的结果。
图12为图解，显示了根据本发明检测方法检测人类β-珠蛋白基因的结果。
图13为图解，显示了根据本发明检测方法检测人类β-珠蛋白基因的结果。
图14为图解，显示了根据本发明检测方法检测人类β-珠蛋白基因的结果。
图15为图解，显示了根据本发明检测方法检测人类基因中的缺失突变的结果。
图16为图解，显示了根据本发明检测方法检测人类基因中的缺失突变的结果。
图17为图解，显示了根据本发明检测方法检测人类基因中的缺失突变的结果。
图18为图解，显示了根据本发明检测方法检测人类基因中的缺失突变的结果。
图19为图解，显示了根据本发明检测方法对人类遗传多态性分型的结果。
图20为图解，显示了根据本发明检测方法检测人类基因中的缺失突变的结果。
发明详述此处所用的“遗传多态性”指一个相同物种生物群体中的个体之间基因的核苷酸序列差异。构成遗传多态性的核苷酸序列差异不限定于某一特定形式。包括下述多种类型，如“碱基置换”、“缺失突变”和“插入突变”。遗传信息差异也被称为变异。
此处所用的“碱基置换”指核酸中特定位点上的一个核苷酸被另一个核苷酸替代。根据本发明，对“碱基置换”中的置换核苷酸数量无特定限制。可置换一个或多个核苷酸。在一个核苷酸序列中观察到的单个核苷酸置换被称为“单核苷酸多态性(SNP)”。本发明的“碱基置换”也包括被人工导入核酸的碱基置换。
此处所用的“缺失突变”指核酸中特定位点上的一部分核苷酸序列缺失。缺失的核苷酸序列可由单个核苷酸或多个核苷酸组成。核苷酸序列的缺失可发生在核酸中特定位点的多个点上。“缺失突变”包括基因中特定区域(如外显子和/或内含子区域)的缺失和整个基因的缺失。本发明的“缺失突变”也包括被人工导入核酸的核苷酸序列缺失。
此处所用的“插入突变”指核苷酸序列被插入核酸中的特定位点。插入的核苷酸序列可由单个核苷酸或多个核苷酸组成，并可为任意链长度。核苷酸序列的插入可发生在核酸中特定位点上的多个点上。本发明的“插入突变”也包括被人工导入核酸中的核苷酸序列插入。
本发明适用于检测基因组多态性或变异，尤其是基因中的碱基置换(如SNP)，或者检测基因中特定位点上的插入突变和/或缺失突变。
在本发明的遗传多态性分型方法中，可采用单链或双链核酸(RNA或DNA)作为含有待分型基因的核酸(目标核酸)。根据所采用的核酸酶，可能难以将RNA作为目标核酸应用。该情况中，可通过以RNA为模板制备cDNA，并以cDNA为目标核酸检测RNA中的碱基置换。
根据本发明，可采用含目标核酸的样品进行分型反应。
可能含有目标核酸的任何样品，如细胞、组织(活组织检查样品等)、全血、血清、脑脊液、精液、唾液、痰、尿、粪便、毛发和细胞培养物均可被采用，无特定限制。尽管不意欲对本发明构成限制，优选将测试样品适当加工后，应用于本发明方法，例如，在将其转化为可进行DNA聚合酶反应的形式之后。该加工包括裂解细胞以及从样品中提取并纯化核酸。
下文详细描述了本发明。
本发明的遗传多态性分型方法是(I)基于检测目标核酸的核苷酸序列与退火于其上的核苷酸之间错配的存在的方法；或(II)基于采用一对引物所扩增片段的链长度，或通过确定扩增是否发生，判断目标核酸中核苷酸序列的缺失和/或插入的方法。根据待确定的多态性类型可选择合适的方法。
(1)本发明对目标核酸中的遗传多态性分型的方法(I)本发明的遗传多态性分型方法(I)包括(A)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种核苷酸和RNase H混合，制备反应混合物，其中(a)该核苷酸的3’末端经过修饰，因而在DNA聚合酶作用下不会发生从该末端开始的延伸；和(b)该核苷酸具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有特定核苷酸，其多态性可能存在于待进行多态性分型的基因中；并(B)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以延伸含有一个任意长度区域的核酸，该区域含有上述特定核苷酸。
根据本发明的分型方法可任选地进一步结合采用可扩增目标核酸的引物。
本发明的检测方法可任选地包括检测步骤(B)中所延伸核酸的步骤，该步骤采用可于严格条件下与延伸核酸杂交的探针。
根据本发明的遗传多态性分型方法，碱基置换的存在是基于所采用核苷酸的裂解的存在和裂解之后的DNA延伸反应的存在确定的。对确定方法无特定限制，并可利用已知的核酸分析技术。确定DNA延伸反应存在的方法实例包括利用凝胶电泳(琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)或毛细管电泳分离以证实所生成的延伸产物的方法；和利用质谱分析法测定延伸产物长度增加的方法。测定整合进入延伸产物中的核苷酸的方法例证了另一种实施方案。该方法中，从具有合适标记并被整合进入大分子延伸产物中的核苷酸三磷酸的量，可获知与所合成的延伸产物量相关的信息。所生成的延伸产物量可在，例如通过酸沉淀或凝胶电泳，从未反应的核苷酸中分离出该产物之后测定。此外，可采用通过酶促手段检测DNA延伸反应所生成的焦磷酸的方法。
根据本发明的分型方法，所关心的目标核酸的扩增是重复延伸反应的结果。利用已知的核酸扩增反应可进一步扩增上述延伸产物。该实施方案有助于对碱基置换的高灵敏度检测。
可采用多种核酸扩增方法作为核酸扩增反应，无特定限制，这些方法均采用序列与模板核酸互补的引物。例如，可采用已知的扩增方法，如聚合酶链反应(PCR，美国专利Nos.4,68 3,195、4,683,202和4,800,159)、链置换扩增(SDA，JP-B 7-114718)、自动维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA，日本专利No.2650159)、转录介导的扩增(TMA)，以及等温并由嵌合引物启动的核酸扩增(ICAN，WO 00/56877和WO 02/16639)。目标核酸中的遗传多态性可通过以本发明核苷酸为引物，合成与该方法中的模板DNA链互补的DNA而得以分型。
如果利用上述核酸扩增方法实施本发明的遗传多态性分型方法，则该方法所采用的引物中至少有一种引物是本发明核苷酸，且反应体系包括适合该核苷酸的核酸酶。
根据上述利用核酸扩增反应对遗传多态性分型的方法，可基于反应所生成的特定扩增产物确定碱基置换的存在。尽管不意欲对本发明构成限制，例如，可采用凝胶电泳、利用序列与扩增产物互补的探针进行的杂交、利用荧光标记的核苷酸进行的荧光偏振法、循环探针反应法等方法以生成扩增产物。另外，也可利用适合相应基因扩增法的检测反应。
如果采用本发明检测方法分析基因组水平的碱基置换，便可能降低反应体系的体积，并可能结合采用可提高整合程度的手段以分析大量核苷酸序列。微芯片、微毛细管电泳(CE)芯片或纳米芯片例证了上述体系。
任何核酸扩增反应均可应用在上述体系中，只要采用该反应扩增所关心的DNA片段即可。尽管不意欲对本发明构成限制，例如，可优选采用可于等温条件下扩增核酸的方法，如ICAN法。与这种方法的结合可简化体系，并且其应用对上述整合体系而言非常优选。此外，利用本发明的技术可构建更为高度整合的体系。本发明方法中可结合采用PCR法。
根据本发明，具有标记的上述核苷酸有助于证实DNA延伸反应的存在，并对本发明的遗传多态性分型方法有用。该情况中，延伸反应的存在可通过采用适合上述标记的方法检测本发明核苷酸所衍生的标记物质而得以证实。
例如，如果采用附着荧光物质的本发明核苷酸，且该标记附着在充当引物的部分上，便可利用荧光检测延伸产物。如果标记附着在核苷酸中从3’至核酸酶裂解位点这一部分，则延伸反应的存在可基于3’片段从目标核酸的解离而得以检测，该片段转化为较小分子是DNA聚合酶等的5’→3’外切核酸酶活性作用的结果。荧光偏振法被优选应用于涉及荧光标记的核苷酸分子量改变的实施方案。
如果采用通过附着荧光物质和可猝灭该荧光物质所发射荧光，使其不发射荧光的物质而得以标记的本发明核苷酸，则延伸反应启动的同时发射荧光。因而可以非常容易地对遗传多态性分型。
在上述相应实施方案中，通过利用特定位置上含有腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)以及可区分的不同标记的核苷酸，可同时获知与碱基置换的存在以及所置换碱基的类型相关的信息，其中上述特定位置与待检测碱基置换的位点对应。
利用本发明方法，可能在进行检测的同时区分包括人类在内的高等动物中的下列三种类型两个染色体均不存在碱基置换的纯合子(纯合型)；两个染色体均存在碱基置换的纯合子(纯合型)；和仅有一个染色体存在碱基置换的杂合子(杂合型)。因此，本发明方法也适用于检测上述等位基因中的碱基置换。
本发明方法所采用的核苷酸具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有目标核酸中存在待检测碱基置换的位点。如核苷酸为完整状态，则其对DNA聚合酶作用的DNA延伸而言无法发挥引物功能，仅当其被核酸酶裂解后才可发挥引物功能。对核苷酸的长度无特定限制，只要其具有上述特性即可。根据本发明，寡核苷酸和多核苷酸均可被采用。通常，采用含有8-50个核苷酸，优选10-40个核苷酸，更为优选12-30个核苷酸的寡核苷酸作为本发明核苷酸。
本发明核苷酸通常是含有脱氧核糖核苷酸的寡核苷酸。也可任选地含有核糖核苷酸，或核苷酸的类似物或衍生物(修饰)。例如，可采用以诸如肌苷或7-脱氮鸟嘌呤的碱基为其碱基部分的核苷酸类似物，或含有核糖衍生物的核苷酸类似物作为核苷酸类似物。修饰核苷酸的实例包括磷酸基团所连氧原子被硫原子替代的(α-S)核苷酸，和附着标记化合物的核苷酸。此外，本发明核苷酸可含有肽核酸(PNA)(Nature，365566-568(1993))。尽管不意欲对本发明构成限制，核苷酸类似物或衍生物被优选整合在不影响所采用核酸酶作用的位点。将核苷酸类似物整合进本发明核苷酸可有效抑制核苷酸本身高级结构的形成，并可使核苷酸稳定退火至目标核酸。因此，只要保留可应用于本发明遗传多态性分型方法的核苷酸功能，该核苷酸可包括核苷酸类似物和/或修饰核苷酸。分型特异性可通过将修饰核苷酸包括在本发明核苷酸中，和/或通过适当调节反应温度而得以提高。
对目标核酸中特定核苷酸上的多态性分型而言，本发明所采用的核苷酸具有下列特性(A)该核苷酸的3’末端经过修饰，因而在DNA聚合酶作用下不会发生从该末端开始的延伸；(B)该核苷酸具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有目标核酸中的特定碱基；和(C)该核苷酸含有特定序列，其中如果在由该核苷酸与目标核酸所组成的复合体中，该核苷酸中的特定核苷酸与其对应的核苷酸(即与特定核苷酸之间形成氢键的核苷酸)之间存在错配(或者如果不存在错配)，则该核苷酸不被核酸酶裂解，而如果该核苷酸中的特定核苷酸与其对应的核苷酸之间不存在错配(或者如果存在错配)，则本发明核苷酸可被核酸酶裂解，从而生成新的3’末端。
核苷酸经由核酸酶裂解的5’部分片段仍然可退火至目标核酸。由于羟基基团位于核苷酸5’部分片段3’末端上核糖或脱氧核糖的3位，DNA可在DNA聚合酶的作用下从该末端开始延伸。因此，如果核苷酸含有可被核酸酶裂解的核苷酸序列，便可作为引物的前体发挥作用。
如上所述，本发明核苷酸的3’末端经过修饰，因而不能应用在采用DNA聚合酶进行的DNA延伸反应中。对修饰途径无特定限制，只要可实现上述目的即可。其实例包括在3’末端添加双脱氧核苷酸、核糖3位上羟基基团被修饰的核苷酸，或其修饰因空间位阻干扰了DNA聚合酶作用下的延伸的核苷酸。烷基化或其它已知修饰方法均可被利用作为修饰核苷酸核糖3位上羟基基团的方法。例如，可通过氨烷基化作用阻止DNA延伸反应。
本发明核苷酸具有可于所用条件下退火至特定区域的核苷酸序列，该区域位于存在待研究多态性的目标核酸中。本发明核苷酸具有与目标核酸基本互补的序列，并且只要不干扰对所关心核苷酸上的置换的检测，便无需具有与目标核酸完全互补的核苷酸序列。
当核苷酸退火至目标核酸上，并于合适核酸酶和合适DNA聚合酶的存在条件下温育时，其裂解受目标核酸中碱基置换的存在影响，即双链核酸中错配位点的存在是本发明核苷酸退火至目标核酸时形成的。以目标核酸为模板的DNA延伸仅当本发明核苷酸被裂解后生成新的3’末端时才发生。因此，根据DNA延伸的存在，可获知与错配或碱基置换的存在相关的信息。
根据本发明，制备核苷酸使得如果存在待检测碱基置换时产生错配是可能的，制备本发明核苷酸使得如果存在碱基置换时不产生错配也是可能的。此外，可同时获知与碱基置换的存在和所置换核苷酸类型相关的信息，方法如下制备并使用四种类型的核苷酸，分别在与所关心核苷酸对应的位置上含有四种类型核苷酸中的一种；继而验证导致延伸的引物中所含的核苷酸类型。
如上所述，本发明所用核苷酸经核酸酶裂解后转化为可延伸DNA的引物。该核苷酸5’至核酸酶裂解位点的部分发挥了可延伸DNA的引物功能。对核酸酶无特定限制，只要其根据本发明核苷酸退火至目标核酸所形成双链核酸中的错配情况裂解(或不裂解)本发明核苷酸即可。其实例包括核糖核酸酶H、限制酶和错配特异性核酸酶。
核糖核酸酶H(RNase H)是可识别由DNA与RNA组成的双链核酸，并选择性地裂解RNA链的酶。通过将核糖核苷酸定位在本发明核苷酸中与存在待检测置换的核苷酸对应的位点上，可制备仅当不存在错配时才可被核糖核酸酶H裂解的本发明核苷酸。
对根据本发明采用的核糖核酸酶无特定限制，只要其具有识别特定双链核酸，并选择性地裂解其核糖核苷酸部分的活性即可，其中该双链核酸由含有核糖核苷酸和与之互补的DNA的本发明核苷酸组成。可优选核糖核酸酶H作为该酶。例如，可采用热坚芽孢杆菌(Bacilluscaldotenax)，激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)，Pyrococcushorikoshii，Thermococcus litoralis，海栖热袍菌(Thermotogamaritima)，闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)或詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannashi)来源的核糖核酸酶H。
限制酶是可识别DNA中特定核苷酸序列(含4-8个核苷酸)，并于该序列内或周边位置裂解的酶。如果存在待检测置换的核苷酸部分与限制酶识别序列重叠，可采用经制备包括了该序列的本发明核苷酸用于检测碱基置换。如果在本发明核苷酸与目标核酸之间产生错配，则限制酶的裂解不发生。基于该结果可获得与碱基置换的存在相关的信息。如果采用该本发明核苷酸，有必要使目标核酸不易受限制酶裂解的影响。通过例如，利用与所采用限制酶对应的修饰性甲基化酶使特定核苷酸甲基化，便可赋予限制酶以抗性，其中该限制酶对目标核酸具有特异性。
可采用与上述两种类型核酸酶不同，并可识别和裂解目标核酸与本发明核苷酸之间的错配的酶。这类酶可采用Mut H等。
根据本发明所用的核苷酸经核酸酶裂解，生成新的3’末端，随后从该末端开始启动DNA延伸。对该步骤中所采用的DNA聚合酶无特定限制，只要其可根据模板DNA的序列，从引物的3’末端开始延伸DNA即可。其实例包括大肠杆菌DNA聚合酶I、克列诺片段、T7 DNA聚合酶、杆菌属噬热菌来源的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶、Bca DNA聚合酶)、栖热菌属细菌来源的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶等)和噬热古细菌来源的α型DNA聚合酶(Pfu DNA聚合酶等)。
如果本发明核苷酸与基因扩增反应结合应用，则应选择并采用适合该基因扩增反应的DNA聚合酶。
根据本发明，尽管当本发明核苷酸经核酸酶裂解所生成的3’部分片段较短时可能从目标核酸释放，但只要其足够长，仍然可保持退火至目标核酸上。如果采用具有链置换活性的DNA聚合酶，则在采用该DNA聚合酶的DNA延伸中，上述片段将与目标核酸解离。如果采用具有5’→3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，则上述片段被该DNA聚合酶降解。
尽管不意欲对本发明构成限制，例如，在以核糖核酸酶H为核酸酶的情况中，可采用具有下述通式所示结构的寡核苷酸作为本发明核苷酸通式5’-dNa-Nb-dNc-N’-3’(dN脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；N未修饰的核糖核苷酸和/或修饰核糖核苷酸；N’经修饰后在DNA聚合酶作用下不发生延伸的核苷酸；其中dNa中的某些dNs可由Ns替代)。
通式中Nb所示部分含有与待进行遗传多态性分型的核苷酸对应的核苷酸。此外，本发明核苷酸可含有核苷酸类似物或衍生物(修饰核苷酸)，只要不破坏本发明核苷酸的功能即可。
尽管不意欲对本发明构成限制，例如，通式中的a为5或5以上的整数，优选为6或6以上，更为优选8或8以上的整数。b为1或1以上的整数。例如，b为1-15，优选1-10，更为优选1-7，最为优选1-5。c可以为0或1或1以上的整数，优选0-5，更为优选0-3。
典型的本发明核苷酸由该通式表示，其中N’为修饰的脱氧核糖核苷酸，a＝8、b＝1-3、c＝0-3。a、b和c的数值可调节，以使本发明核苷酸可应用在本发明方法中。
通过适当标记本发明核苷酸，有助于检测因核酸酶裂解或裂解后DNA延伸反应所生成的产物(延伸产物)而从本发明核苷酸释放的3’部分片段，也可方便地证实遗传多态性的存在。
对标记本发明核苷酸的方法无特定限制。例如，可采用放射性同位素(32P等)、染料、荧光物质、发光物质、多种配体(生物素、洋地黄毒苷等)和酶。来自标记的本发明核苷酸的产物的存在可利用适合该标记的检测方法而得以证实。无法直接检测的配体可结合具有可检测标记的配体结合物质一起应用。例如，通过采用配体-标记的本发明核苷酸与酶标记的抗配体抗体结合获得的产物，并扩增信号，可高灵敏度地检测目标核酸。
荧光标记的本发明核苷酸的实施方案实例包括由荧光物质和一种特定物质共同标记的本发明核苷酸，该特定物质具有猝灭与之间隔合适距离的荧光物质所发射荧光的作用。该引物如为完整状态便不发射荧光。不过，如其经过核酸酶裂解，且该荧光物质与猝灭物质相隔一段距离，便可发射荧光。由于该核苷酸发射荧光的同时启动DNA延伸反应，因此可通过直接观测反应期间的反应混合物对遗传多态性分型。
根据本发明方法，模板核酸可任选地预先经过物理、化学或酶促变性。对变性方法无特定限制，可优选采用任何方法。其实例包括下列热变性(于90℃或90℃以上热处理模板核酸溶液)；碱变性(在碱溶液中处理)；和酶处理(采用解旋酶、RecA等酶处理)。
适用于本发明遗传多态性分型方法的基因实例包括人类细胞色素基因(如CYP 2C19基因中的G636A或CYP 1A1基因中的T6235C)和人类醛脱氢酶基因(如ALDH2基因中的Glu487Lys)。
根据本发明的遗传多态性分型方法，分型可在检测内部对照核酸的同时进行或单独进行。内部对照可用于检测本发明方法中的假阴性。内部对照可能与用于延伸所关心基因并获得延伸产物的引物相同，也可能与该引物不同。内部对照可能是测试样品中最初含有的基因。尽管不意欲对本发明构成限制，例如，可优选采用β-珠蛋白基因等。可选地，添加有人工制备可发挥内部对照功能的核酸的测试样品也适用于本发明方法。采用与对所关心遗传多态性分型的相同方法可检测该内部对照。
(2)适用于本发明遗传多态性分型方法(I)的试剂盒本发明提供了适用于上述本发明遗传多态性分型方法(I)的试剂盒。一种实施方案中，试剂盒含有可应用于本发明方法的本发明核苷酸。尽管不意欲对本发明核苷酸构成限制，例如，优选用具有核苷酸序列SEQ ID NO14、15、21和/或22的本发明核苷酸对人类细胞色素基因中的遗传多态性分型，和优选用具有核苷酸序列SEQ ID NO25和/或26的本发明核苷酸对人类醛脱氢酶基因中的遗传多态性分型。试剂盒可含有一组本发明核苷酸，每一核苷酸均含有四种类型核苷酸中的一种，可将其用于同时测定碱基置换的存在和所置换核苷酸的类型。可被优选用于对人类细胞色素基因分型的本发明核苷酸组实例包括，但不仅限于，具有核苷酸序列SEQ ID NOS14和15的本发明核苷酸组；具有核苷酸序列SEQ ID NOS21和22的本发明核苷酸组；具有核苷酸序列SEQ ID NOS14-16的本发明核苷酸组和引物；以及具有核苷酸序列SEQ ID NOS21-23的本发明核苷酸组和引物。可优选采用具有核苷酸序列SEQ ID NOS25和26的本发明核苷酸组，或具有核苷酸序列SEQ ID NOS25-27的本发明核苷酸组和引物，对人类醛脱氢酶基因分型。试剂盒可含有特异性检测探针，该探针具有核苷酸序列SEQ ID NO20或24，并可用于鉴定人类细胞色素基因中的碱基置换，或者具有核苷酸序列SEQ ID NO28，并可用于鉴定人类醛脱氢酶基因中的碱基置换。此外，试剂盒可含有适合本发明核苷酸的核酸酶、DNA聚合酶，DNA聚合酶(dNTP)的底物和适合反应的缓冲剂等。可选的，试剂盒可含有用于检测引物延伸产物的试剂。含有用于制备核酸扩增法所需反应混合物的试剂的试剂盒可被优选作为结合了核酸扩增方法并可对遗传多态性分型的试剂盒。
本发明试剂盒可含有用于检测内部对照的引物或探针。另外，试剂盒可含有将被添加进测试样品中的内部对照核酸。引物和探针的实例包括但不仅限于，可用于扩增β-珠蛋白，并具有选自核苷酸序列SEQID NOS35-42的核苷酸序列的引物，和可用于检测β-珠蛋白，并具有核苷酸序列SEQ ID NO43或44或与之互补的核苷酸序列的探针。
(3)本发明对目标核酸中的遗传多态性分型的方法(II)本发明的遗传多态性分型方法包括(a)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNase H混合，制备反应混合物，其中引物是嵌合寡核苷酸引物，与模板核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中的至少一种物质，核糖核苷酸位于该引物3’末端或3’末端侧；并(b)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以扩增目标核酸。
任选地，该分型方法可包括检测步骤(b)中所扩增核酸的步骤，该步骤采用可于严格条件下与该核酸杂交的探针。
本发明方法所用的嵌合寡核苷酸引物是具有与模板核酸的一部分核苷酸序列基本互补的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。该引物可促成DNA链在所采用条件下的延伸。此外，核糖核苷酸位于该嵌合寡核苷酸引物的3’末端或3’末端侧。
本发明方法所用的嵌合寡核苷酸引物可含有一个或多个修饰核糖核苷酸。此处所用的核糖核苷酸可能是未修饰核糖核苷酸和/或修饰核糖核苷酸，可位于嵌合寡核苷酸引物3’末端或3’末端侧，并可被内切核酸酶识别并裂解。该核糖核苷酸包括上述未修饰核糖核苷酸和修饰核糖核苷酸。未修饰核糖核苷酸、修饰核糖核苷酸或其组合均可用于本发明的嵌合寡核苷酸引物，只要其不破坏该引物功能即可。修饰核糖核苷酸的实例包括但不仅限于，磷酸基团结合的氧原子被硫原子替代的(α-S)核糖核苷酸，以及核糖2位上的羟基基团被甲氧基替代的核糖核苷酸。含修饰核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物可通过采用，例如(α-S)核糖核苷三磷酸制备，其制备方法采用美国专利No.5,003,097所描述的硫化反应试剂(Glen Research)，或2-OMe-RNA-CE亚磷酰胺试剂(Glen Research)。
根据本发明，可应用于扩增方法的嵌合寡核苷酸引物可被设计为含有特定修饰核糖核苷酸，该修饰核糖核苷酸可赋予其对内切核酸酶裂解的抗性。该引物的用处在于可在扩增反应步骤期间利用内切核酸酶控制裂解位点。
根据扩增后DNA片段的期望形式(单链或双链)，本发明方法可采用一或两种嵌合寡核苷酸引物。具体而言，当期望单链DNA时，采用一种嵌合寡核苷酸引物，期望双链DNA时，则采用两种引物。
对本发明所用嵌合寡核苷酸引物的长度无特定限制，只要该引物的3’末端或3’末端侧含有核糖核苷酸，并可应用于ICAN法中即可。
例如，可采用的嵌合寡核苷酸引物长度为大约6-大约100个核苷酸，优选大约10-大约50个核苷酸，更为优选大约12-大约40个核苷酸。嵌合寡核苷酸的核苷酸序列与模板核酸基本互补，从而在所采用反应条件下退火至该模板核酸是优选的。该引物的3’末端或3’末端侧含有内切核酸酶识别的序列，该引物应用在下述步骤中。
例如，具有下列通式所示结构的寡核苷酸可作为引物应用在本发明的DNA合成方法中，并不对本发明构成限制通式5’-dNa-Nb-dNc-3’(dN脱氧核糖核苷酸和/或核苷酸类似物；N未修饰的核糖核苷酸和/或修饰核糖核苷酸，其中dNa中的某些dNs可由Ns替代，3’末端的核苷酸可经过修饰，从而在DNA聚合酶作用下不发生由该末端开始的延伸)。
尽管不意欲对本发明构成限制，例如，通式中的a为5或5以上的整数，优选6或6以上，更为优选8或8以上的整数。b为1或1以上的整数。例如，b为1-15，优选1-10，更为优选1-7，最为优选1-5。c可为0或1或1以上的整数，优选0-5，更为优选0-3。
尽管不意欲对本发明构成限制，根据本发明所采用的嵌合寡核苷酸引物实例包括上述通式所示引物，其中a＝8；和b＝1和c＝0；b＝2和c＝0；b＝3-5和c＝0；或b＝1-3和c＝0-3。a、b和c的数值可调节，使该嵌合寡核苷酸引物可应用于本发明方法。
此外，本发明方法所用的嵌合寡核苷酸引物可含有核苷酸类似物或其它物质。即本发明嵌合寡核苷酸引物可含有一种或多种核苷酸类似物，只要该引物的特定功能不被破坏即可，即在DNA聚合酶作用下实现从3’末端开始聚合延伸反应的功能。多种类型的核苷酸类似物可组合应用。可采用的核苷酸类似物实例包括但不仅限于，脱氧肌苷核苷酸、脱氧尿嘧啶核苷酸、含修饰碱基，如7-脱氮鸟嘌呤的脱氧核糖核苷酸类似物，含核糖衍生物的核苷酸类似物等。此外，本发明所采用嵌合寡核苷酸引物可含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或具有多种修饰，如添加标记化合物的核苷酸类似物，只要保留上述功能即可。
将核苷酸类似物整合进引物中可有效抑制引物本身高级结构的形成，并使其与模板的退火形成物稳定。出于相同目的，可将核糖核苷酸整合进引物中。尽管不意欲对本发明构成限制，为避免非特异性内切核酸酶(RNase)消化引物，可优选采用修饰核糖核苷酸，如(α-S)核糖核苷酸。
利用已知方法或商业可提供的核酸合成仪，可合成嵌合寡核苷酸引物，使其含期望的核苷酸序列。
本发明方法的步骤(a)中，如果以RNA为模板，可在一个步骤中进行逆转录反应和核酸扩增反应。尽管不意欲对本发明构成限制，例如，可优选采用AMV RTase、MMLV RTase或RAV-2 RTase与Bca DNA聚合酶的组合作为逆转录酶与链置换型DNA聚合酶的组合。
根据本发明方法，待扩增目标核酸的链长度并不限定为某一特定长度。例如，对目标核酸的灵敏检测而言，200bp或更短的区域，优选150bp或更短的区域有效。对本发明嵌合寡核苷酸引物进行设计，使其待扩增链具有上述长度，可高灵敏度地对遗传多态性分型。
另外，在本发明的检测方法中，通过采用含缓冲组分N-二羟乙基甘氨酸、Tricine、HEPES、磷酸盐或tris的反应缓冲剂，和含亚精胺或丙亚胺的退火溶液，甚至可以从痕量核酸样品中以较高灵敏度检测出目标核酸。该情况中，可采用的内切核酸酶和DNA聚合酶并不限于特定某一种。例如，优选大肠杆菌、火球菌属细菌或古生球菌属细菌来源RNase H与BcaBEST DNA聚合酶(Takara Bio)的组合。内切核酸酶和DNA聚合酶的优选组合被认为可根据酶的类型变化。该情况中，以检测灵敏度的提高或扩增产物的量为指标，可调节缓冲剂的组成与所添加酶的量。
根据本发明，扩增目标核酸期间，可掺入dUTP作为底物。因此，如果以dUTP为底物，便可能通过利用尿嘧啶N-糖苷酶(UNG)降解扩增产物而避免扩增产物遗留污染所引起的假阳性。
根据本发明的基因分型方法，通过测定步骤(a)和(b)中扩增产物的生成或其链长度，可判断插入突变和/或缺失突变的存在。通过选择嵌合寡核苷酸引物在待分型基因中的位置，可根据扩增产物的存在或其链长度进行上述判断。
检测核酸的已知方法可应用在上述检测步骤中。这些方法的实例包括通过电泳检测特定大小的反应产物，和通过与探针杂交进行检测。此外，可优选采用结合了磁珠的检测方法或类似方法。扩增目标核酸时所生成的焦磷酸可被转化为不溶物质，例如，镁盐可使反应混合物浑浊，可测定其浊度。荧光物质，如溴化乙锭通常被应用在电泳检测中。与探针的杂交可结合电泳检测。该探针可标记有放射性同位素或非放射性物质，如生物素或荧光物质。此外，在步骤(b)中采用标记核苷酸有助于检测掺入该标记核苷酸的扩增产物，或者增强利用该标记检测所需的信号。荧光偏振法、荧光共振能量转移(FRET)、非荧光共振能量转移(Non-FRET)、电极与导电物质沉积结合应用的方法等也可应用于检测。通过构建合适的检测系统，可自动或定量地检测目标核酸。另外，可优选采用通过混合色谱法进行的裸眼检测。
在特定可导致猝灭状态的间隔位置上标记有两种或多种荧光物质的核糖核苷酸(RNA)探针或由核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸组成的嵌合寡核苷酸探针均可应用在本发明检测方法中。例如，适用于FRET的一对标记，即6-羧基荧光素(6-FAM)和N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)的组合，或适用于Non-FRET的一对标记，即6-羧基荧光素(6-FAM)和4-(4’-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)的组合均可被优选采用作为标记探针的荧光物质。
本发明采用的探针不限于特定某一种，只要其可于正常杂交条件下，与本发明核酸扩增法所扩增的目标核酸杂交即可。鉴于对扩增产物的特异性检测，探针优选地在例如，本领域技术人员已知的严格条件下杂交。该严格杂交条件在例如，T.Maniatis等人(编辑的)Molecular CloningA Laboratory Manual 2nd ed.，1989，Cold SpringHarbor Laboratory中有所描述。具体而言，该严格条件指在低于所用探针Tm大约25℃的温度下，在含有0.5％SDS、5×Denhardt’s(0.1％牛血清白蛋白(BSA)、0.1％聚乙烯吡咯烷酮、0.1％Ficoll 400)和100μg/ml鲑鱼精子DNA的6×SSC(1×SSC0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠、pH7.0)中温育4小时至过夜。具有上述标记的探针可被采用作为有助于检测目标核酸的探针。
根据本发明，等温条件下扩增核酸的方法无需利用诸如热循环仪的设备。本发明扩增方法所用的引物数量可以是一种或两种，少于常规方法所用的引物数量。因为PCR所用的试剂，如dNTPs等可应用于本发明方法，因而与常规方法相比，本发明方法降低了操作成本。因此，该方法可优选地应用在，例如，常规进行检测的遗传试验领域。与PCR相比，本发明方法可在较短时间内提供较多量的扩增产物。因此，该方法可作为一种方便、快速且高灵敏度方法用于检测基因。
通过缩减反应体系体积，并如上述结合采用可提高整合程度的手段，可将本发明的插入突变和/或缺失突变分型方法转化为高效分析系统。
也根据本发明方法，模板核酸可如上文(1)所述，任选地预先经过物理、化学或酶促变性。
本发明遗传多态性分型方法的对象的实例包括，但不仅限于人类谷胱苷肽-S-转移酶基因(例如，GSTM1基因或GSTT1基因)中的缺失突变。根据本发明检测方法，在缺失突变区域中可能含有成对嵌合寡核苷酸引物中的一种或两种均含有。也根据本发明的遗传多态性分型方法，如上文遗传多态性分型方法(1)中所描述的，分型可与对内部对照核酸的检测同时进行，或独立进行。
(4)适用于本发明遗传多态性分型方法(II)的试剂盒本发明提供了适用于遗传多态性分型方法(II)的试剂盒。一种实施方案中，试剂盒含有可应用于本发明方法的嵌合寡核苷酸引物。尽管对引物不构成特定限制，例如，优选具有核苷酸序列SEQ ID NOS6-8和29-31的引物，用于检测人类谷胱苷肽-S-转移酶基因中的缺失突变。该试剂盒可含有用于特异性检测的探针，可被用于鉴定插入突变和/或缺失突变。尽管不意欲对本发明构成限制，例如，优选采用具有核苷酸序列SEQ ID NOS9和32的核苷酸作为上述探针。此外，该试剂盒可含有适合上述核苷酸的核酸酶、DNA聚合酶、该DNA聚合酶(dNTPs)的底物、适合反应进行的缓冲剂等。该试剂盒可含有用于检测引物延伸产物的试剂。含有用于制备核酸扩增方法所需反应混合物的试剂的试剂盒是优选的结合了该扩增方法并可对遗传多态性分型的试剂盒。
本发明的试剂盒与适用于遗传多态性分型方法(2)的试剂盒一样，可含有用于检测内部对照的引物和探针。
(5)对多个目标核酸中遗传多态性分型的方法和适用于本发明该方法的试剂盒下文例证了本发明对多个目标核酸中遗传多态性分型的方法的一种实施方案一种遗传多态性分型方法，其中多个目标核酸是平行检测的，该方法包括(1)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种核苷酸和RNase H混合，制备反应混合物，其中(a)所述核苷酸的3’末端均经过修饰，因而在DNA聚合酶作用下不会发生从该末端开始的延伸；和(b)所述核苷酸均具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有多个目标核酸中的特定核苷酸；并(2)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以延伸均含有一个任意长度区域的核酸，该区域含有上述特定核苷酸。
下文例证了另一种实施方案一种遗传多态性分型方法，其中多个目标核酸是平行检测的，该方法包括(a)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种引物和RNase H混合，制备反应混合物，其中引物均为嵌合寡核苷酸引物，与模板核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中的至少一种物质，核糖核苷酸位于该引物3’末端或3’末端侧；并(b)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以扩增目标核酸。
下文例证了另一种实施方案一种遗传多态性分型方法，其中多个目标核酸是平行检测的，该方法包括(A)根据包括以下步骤的方法检测至少一个目标核酸(1)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种核苷酸和RNase H混合，制备反应混合物，其中(a)该核苷酸的3’末端经过修饰，因而在DNA聚合酶作用下不会发生从该末端开始的延伸；和(b)该核苷酸具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有多个目标核酸中的特定核苷酸；并(2)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以延伸含有一个任意长度区域的核酸，该区域含有上述特定核苷酸；和(B)根据包括以下步骤的方法检测与(A)中目标核酸不同的目标核酸(a)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNase H混合，制备反应混合物，其中引物为嵌合寡核苷酸引物，与模板核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中的至少一种物质，核糖核苷酸位于该引物3’末端或3’末端侧；并(b)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以扩增目标核酸。
根据本发明对多个目标核酸中的遗传多态性分型的方法，对目标核酸无特定限制。换言之，可作为遗传多态性分型对象的任何基因均可被优选采用。目标核酸中遗传多态性的组合可以是多种类型，如“碱基置换”、“缺失突变”和“插入突变”的相同或不同遗传多态性的任意组合。目标核酸中遗传多态性的组合实例包括，但不仅限于，选自人类细胞色素基因CYP 2C19和CYP 1A1、人类谷胱苷肽-S-转移酶基因GSTM1和GSTT1、人类醛脱氢酶基因ALDH2中的遗传多态性组合。
例如，上文(1)-(4)中所描述的引物或探针均可被优选采用作为检测遗传多态性的引物或探针。
根据本发明方法，目标核酸的组合可以是具有上述至少一种遗传多态性类型的基因与另一种无多态性基因的组合。对无多态性基因无特定限制。此外，根据本发明进行检测时，可结合采用内部对照核酸。
具体而言，多个目标核酸中的至少一个可以是内部对照核酸。尽管不意欲对本发明构成限制，例如，可优选采用β-珠蛋白基因作为内部对照核酸。尽管不意欲对本发明构成限制，例如，可采用选自具有核苷酸序列SEQ ID NOS35-42的引物中的至少两种引物作为用于检测β-珠蛋白基因的引物。此外，该检测可利用具有核苷酸序列SEQ IDNO43或44或与之互补的核苷酸序列的探针进行。根据本发明的分型方法，所关心的目标核酸的扩增是重复延伸反应的结果。利用已知的核酸扩增反应可进一步扩增该延伸产物。
此外，适用于本发明方法的试剂盒可含有用于检测多个目标核酸的本发明核苷酸或引物。该试剂盒可含有用于检测根据本发明方法所获扩增产物的探针。
例如，如果多个目标核酸中至少有一个目标核酸是内部对照核酸，即β-珠蛋白基因，该试剂盒可含有选自具有核苷酸序列SEQ IDNOS35-42的引物中的至少两种引物，并可含有具有核苷酸序列SEQ IDNO43或44或与之互补的核苷酸的探针。
本发明方法可用于检测碱基置换、插入突变和缺失突变。被试基因的实例包括，但不仅限于，碱基置换，如人类细胞色素基因中的碱基置换、CYP 2C19基因中的G636A(m2)或CYP 1C1基因中的T6235C，或醛脱氢酶2(ALDH2)基因中的Glu487Lys，和谷胱苷肽-S-转移酶基因GSTM1或GSTT1中的缺失突变。本发明方法可适当用于检测上述基因。此外，本发明方法可作为基因分型方法应用。
实施例下述实施例进一步详细例证了本发明，但对本发明范畴不构成限制。
参考实施例1闪烁古生球菌来源的RNase HII基因的克隆(1)闪烁古生球菌来源基因组DNA的制备将收集自8ml培养物的闪烁古生球菌细胞(购自DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；DSM4139)悬浮于添加有25％蔗糖、50mM Tris-HCl(pH8.0)、20μl 0.5M EDTA和10μl 10mg/ml溶菌酶氯化物(Nacalai Tesque)水溶液的100μl溶液中。该混合物于20℃反应1小时。反应结束后，将含有150mM NaCl、1mM EDTA和20mM Tris-HCl(pH8.0)、10μl 20mg/ml蛋白酶K(TakaraBio)和50μl 10％十二烷基硫酸钠水溶液的800μl混合物添加至反应混合物中。37℃温育该混合物1小时。反应结束后，对该混合物进行苯酚-氯仿提取、乙醇沉淀和风干，随后将其溶解在50μl TE中，获得基因组DNA溶液。
(2)RNase HII基因的克隆闪烁古生球菌的完整基因组序列已公开[Klenk，H.P.et al.，Nature，390364-370(1997)]。编码RNase HII同源物的一个基因(AF0621)是已知的(SEQ ID NO1，http//www.tigr.org/tdb/CMR/btm/htmls/SplashPage.htlm)。
引物AfuNde(SEQ ID NO2)和AfuBam(SEQ ID NO3)是在AF0621基因(SEQ ID NO1)的序列基础上合成的。
以参考实施例1-(1)中制备的30ng闪烁古生球菌基因组DNA为模板，以20pmol AfuNde和20pmol AfuBam为引物，在100μl体积中进行PCR。根据所附操作方法，将Pyrobest DNA聚合酶(Takara Bio)作为用于PCR的DNA聚合酶。PCR进行步骤如下40个循环的94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟。采用NdeI和BamHI(均获自Takara Bio)消化大约0.6kb长的扩增DNA片段。将获得的DNA片段插入在质粒载体pTV119Nd(pTV119N中的NcoI位点被转换为NdeI位点的质粒)中的NdeI位点与BamHI位点之间，获得质粒pAFU204。
(3)含RNase HII基因的DNA片段的核苷酸序列测定根据双脱氧法测定已插入参考实施例1-(2)中所获pAFU204中的DNA片段的核苷酸序列。
对已测定核苷酸序列的分析显示了一个估计可能编码RNase HII的可读框。该可读框的核苷酸序列如SEQ ID NO4所示。由该核苷酸序列推导的RNase HII的氨基酸序列如SEQ ID NO5所示。
由质粒pAFU204转化的大肠杆菌JM109被指定并表示为大肠杆菌JM109/pAFU204，于2001年2月22日保藏于国际专利生物保藏机构独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，AIST TsukubaCentral 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken305-8566，日本，保藏号为FERM P-18221和FERM BP-7691(转交国际保藏的日期2001年8月2日)。
(4)已纯化RNase HII制剂的制备大肠杆菌JM109由参考实施例1-(2)中所获的pAFU204转化而得。将得到的含有pAFU204的大肠杆菌接种至含100μg/ml氨苄青霉素的2升LB培养基中，37℃振荡培养16小时。培养结束后，将通过离心收集的细胞悬浮于37.1ml超声处理缓冲液[50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、2mM苯甲基磺酰氟]中，并进行超声处理。12000rpm离心经超声处理的悬液10分钟，获得上清液，于70℃加热15分钟。随后再次12000rpm离心10分钟，收集上清液。从而获得40.3ml的加热上清液。
将该加热过的上清液上样在经由缓冲液A[50mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA]平衡过的RESOURSE Q柱(Amersham PharmaciaBiotech)中，并利用FPLC系统(Amersham Pharmacia Biotech)进行色谱分析。结果RNase HII从RESOURSE Q柱中流出。
将流出的RNase HII馏分上样在经由缓冲液A平衡过的RESOURSE S柱(Amersham Pharmacia Biotech)中，并利用FPLC系统(AmershamPharmacia Biotech)进行色谱分析。结果RNase HII从RESOURSE S柱中流出。
采用含50mM NaCl的2升缓冲液B(50mM Tris-HCl(pH7.0)，1mMEDTA)透析40.0ml上述流出的RNase HII馏分2小时，进行三轮。将40.2ml已透析的酶溶液上样在经由含50mM NaCl的缓冲液B平衡过的HiTrap-肝素柱(Amersham Pharmacia Biotech)中，并利用FPLC系统进行50-550mM NaCl的线性梯度洗脱。结果采用大约240mM NaCl洗脱获得了含RNase HII的馏分。
通过利用Centricon-10(Amicon)超滤浓缩7.8ml的RNase HII馏分。从大约600μl浓缩液中分出4份，上样在经由含100mM NaCl和0.1mM EDTA的50mM Tris-HCl(pH7.0)平衡过的Superose 6凝胶过滤柱(Amersham Pharmacia Biotech)中，并采用相同缓冲液洗脱。结果在对应分子量30.0千道尔顿的位置处洗脱出RNase HII。该分子量与单体形式的RNase HII对应。
采用如上述方法洗脱的RNase HII作为Afu RNase HII制剂。
利用上述获得的Afu RNase HII制剂，如下所述测定酶活性。结果观测到Afu RNase HII制剂具有RNase H活性。
(5)已纯化RNase H的活性测定(a)所用试剂溶液的制备用于测定活性的反应混合物将下列物质以所示终浓度溶解于无菌水中40mM Tris-HCl(pH7.7，37℃)、4mM氯化镁、1mM DTT、0.003％BSA、4％甘油和24μM聚(dT)。
聚[8-3H]腺苷酸溶液将370kBq聚[8-3H]腺苷酸溶液溶解于200μl无菌水中。
聚腺苷酸溶液利用无菌超纯水将聚腺苷酸浓度稀释为3mM。
酶稀释液将下列物质以所示终浓度溶解于无菌水中25mMTris-HCl(pH7.5，37℃)、5mM 2-巯基乙醇、0.5mM EDTA(pH7.5，37℃)、30mM氯化钠和50％甘油。
热变性小牛胸腺DNA的制备将200mg小牛胸腺DNA悬浮，并使其在100ml TE缓冲液中膨胀。根据在UV260nm处测定的吸光度，利用无菌超纯水将上述溶液的浓度稀释为1mg/ml。100℃加热稀释液10分钟，并随后于冰浴中将其迅速冷却。
(b)测定活性的方法将7μl聚[8-3H]腺苷酸溶液加入985μl反应混合物中，用于测定上文(a)中制备的活性。37℃温育混合物10分钟。将8μl聚腺苷酸加入该混合物中，使其最终浓度达24μM。于37℃进一步温育混合物5分钟。从而制备了1000μl聚[8-3H]rA-聚-dT反应混合物。
随后于30℃温育200μl反应混合物5分钟。将1μl经适当系列稀释的酶溶液加入上述反应混合物中。随时间从该反应混合物中每次取出50μl样品，用于随后进行的测定。将从添加酶到取样的时间段定义为Y，以分钟为单位。通过添加1μl酶稀释液以替代酶溶液，制备50μl用于测定总CPM或空白的反应混合物。将100μl 100mM焦磷酸钠、50μl热变性小牛胸腺DNA溶液和300μl 10％三氯乙酸(300μl超纯水用于测定总CPM)加入样品中。0℃温育混合物5分钟，随后10000rpm离心10分钟。离心后，将所获250μl上清液装入小瓶中。加入10ml Aquasol-2(NEN Life Science Products)。在液体闪烁计数器中测定CPM。
(c)单位计算根据下列方程式计算各酶的单位值。
单位/毫升＝{(测定的CPM-空白CPM)×1.2*×20×1000×稀释率}×200(微升)/(总CPM×Y(分钟)×50(微升)×9**)1.2*每50μl总CPM所含聚[8-3H]rA-聚-dT的纳摩尔量。
9**相关系数。
下述实施例中，耐热RNase H单位值的计算方法如下。
将1mg聚(rA)或聚(dT)(均获自Amersham Pharmacia Biotech)溶解于含1mM EDTA的1m l40mM Tris-HCl(pH7.7)中，制备聚(rA)溶液和聚(dT)溶液。
随后将聚(rA)溶液(终浓度为20μg/ml)和聚(dT)溶液(终浓度为30μg/ml)加入含4mM MgCl2、1mM DTT、0.003％BSA和4％甘油的40mM Tris-HCl(pH7.7)中。混合物于37℃反应10分钟后，冷却至4℃，制备获得聚(rA)-聚(dT)溶液。将1μl经适当稀释的酶溶液加入100μl聚(rA)-聚(dT)溶液中。混合物于40℃反应10分钟。加入10μl 0.5M EDTA终止反应。随后测定260nm处的吸光度。作为对照，将10μl 0.5M EDTA加入反应混合物中，由此获得的混合物于40℃反应10分钟，并测定其吸光度。从EDTA存在条件下反应所对应的吸光度减去对照的吸光度，获得一个值(吸光度差值)。进而根据该吸光度差值测定通过酶促反应从聚(rA)-聚(dT)杂合物中释放的核苷酸浓度。将一个单位的RNase H定义为可提高10分钟内释放1nmol核糖核苷酸所对应的A260的酶量，根据下列方程式计算单位＝[吸光度差值×反应体积(毫升)]/0.0152×(110/100)×稀释率实施例1(1)基因组DNA的制备获得7位人类健康供体的知情同意后，收集获得7份10ml血液。利用Dr.GenTLE(血液用)(Takara Bio.)从100μl上述每份血液中制备基因组DNA。所获基因组DNA溶液的浓度如下测试样品1182ng/μl测试样品2150ng/μl测试样品3156ng/μl测试样品4204ng/μl测试样品5105ng/μl测试样品6172ng/μl测试样品7253ng/μl(2)引物和探针的合成设计可用于ICAN反应检测，并于3’末端均含3个RNA残基的寡核苷酸引物，并基于人类谷胱苷肽-S-转移酶M1(GSTM1)基因的核苷酸序列(GenBank编号X51451)合成。具体而言，合成寡核苷酸引物GS-F(SEQ ID NO6)和GS-R(SEQ ID NO7)。寡核苷酸GS-F是有义引物，寡核苷酸GS-R是反义引物。合成寡核苷酸引物GS-R-bio(SEQID NO8)，其中GS-R的5’末端被生物素化。采用GS-R和GS-R-bio以9∶1的比例混合而成的混合物(下文称作GS-R-mix)进行反应。此外，合成寡核苷酸探针GS-D(SEQ ID NO9)，其5’末端经过FITC修饰，并可通过ELISA应用于ICAN反应扩增产物的检测。GS-D为有义探针。合成用于制备ELISA阳性对照的寡核苷酸引物GS-Epc-F(SEQ IDNO10)和寡核苷酸引物GS-Epc-R(SEQ ID NO11)，前者在利用ELISA检测ICAN反应扩增产物的基础上，充当了显色标准，后者的5’末端则被生物素化。寡核苷酸GS-Epc-F为有义引物，寡核苷酸GS-Epc-R为反义引物。对这些引物进行设计，使ELISA阳性对照略短于ICAN扩增产物。
另一方面，设计并合成用于PCR的寡核苷酸引物。具体而言，合成寡核苷酸引物GS-PCR-F(SEQ ID NO12)和GS-PCR-R(SEQ ID NO13)。寡核苷酸GS-PCR-F为有义引物，寡核苷酸GS-PCR-R为反义引物。
(3)利用ICAN反应对GSTM1基因的检测在Thermal Cycler Personal(Takara Bio)中，98℃加热总体积为5μl的反应混合物2分钟，该混合物含有分别为50pmol的合成寡核苷酸引物GS-F和GS-R-mix、1μl 0.05％丙亚胺水溶液和1μl于(1)中制备的其中一份测试样品基因组DNA溶液，随后于58℃使引物退火至模板。将20μl含有0.625mM dNTP混合物、40mM Hepes-KOH缓冲剂(pH7.8)、125mM乙酸钾、5mM乙酸镁、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲亚砜、13.8U Afu RNase HII、5.5U BcaBest DNA聚合酶(Takara Bio)和无菌水的混合物加入上述经过加热的混合物中，使最终体积为25μl。58℃温育反应混合物1小时。反应结束后，从各反应混合物中分别取出5μl，上样在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果仅当采用测试样品5和7来源的基因组DNA时，才观测到GSTM1基因来源的扩增产物。从而证实这些测试样品含有GSTM1基因。结果如图1所示。图1所示为ICAN反应产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1、2、3、4、5、6和7分别代表测试样品1、2、3、4、5、6和7。
另一方面，GSTM1基因是通过采用分别为1μl的相同测试样品基因组DNA溶液进行PCR而得以检测。采用引物GS-PCR-F(SEQ ID NO12)和GS-PCR-R(SEQ ID NO13)进行PCR，并将反应混合物上样在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果仅当采用测试样品5和7来源的基因组DNA时，才观测到GSTM1基因来源的扩增产物。结果如图2所示。图2所示为PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1、2、3、4、5、6和7分别代表测试样品1、2、3、4、5、6和7。如上所述，利用ICAN法所获结果与利用PCR法所获结果一致。
(4)利用ELISA法对ICAN扩增产物的检测1.ELISA阳性对照的制备采用上述实施例1-(2)中合成的引物GS-Epc-F和GS-Epc-R，并以前髓细胞的细胞系HL-60来源的200ng基因组DNA为模板进行PCR。基于其在下述ELISA中的应用适当稀释扩增产物，使其吸光度约为1.DNA浓度为340amol/μl。
2.利用ELISA法进行的检测分别从上述实施例1-(3)所获各反应产物中取5μl，连同5μl ELISA阳性对照溶液一起加入抗生物素蛋白板(Labsystems)的孔内，其中孔内已加入50μl杂交缓冲液(5×SSC、1％ Triton-X100、1％ BSA)。室温反应15分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液(25mMTris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05％ Tween 20)洗涤各孔一次。向各孔加入50μl 0.02N NaOH溶液。室温反应3分钟后，加入100μl含5pmol GS-D探针的杂交缓冲液。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，并采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔两次。向各孔内加入100μl含POD标记的抗-FITC抗体的杂交缓冲液。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔四次。向各孔内加入100μl TMB溶液(BioFX Laboratories)。室温反应10分钟后，按照添加TMB溶液的顺序向孔内加入100μl 1N硫酸。利用读板仪测定各孔于450nm处的吸光度。将ELISA阳性对照的数值定义为截断值。可获得较高吸光度数值的测试样品被确定为GSTM1基因阳性。
测定结果是来源自测试样品5和7的基因组DNA的ICAN反应产物为GSTM1基因阳性。该结果与利用电泳测定所获结果相似。结果如图3所示。图3为显示了ELISA结果的图解。水平轴上的数字1、2、3、4、5、6和7代表测试样品1、2、3、4、5、6和7。数字8代表阳性对照。纵轴显示450nm处的吸光度。
实施例2(1)人类CYP2C19(636)的等位基因特异性检测对确定人类CYP2C19中第636个核苷酸上的等位基因是遗传纯合子还是杂合子(纯合型或杂合型)的检测方法进行检验。
获得知情同意后，从每位健康个体(样品1-6)获得200μl全血，并利用Dr.GenTLETM(Takara Bio)从上述全血中制备基因组DNA。在Thermal Cycler Personal(Takara Bio)中，98℃加热总体积为5μl的反应混合物2分钟，该混合物含有160ng作为模板的已制备基因组DNA、作为有义引物以用于特异性检测636G(SEQ ID NO14)或636A(SEQ ID NO15)的等位基因的合成寡核苷酸和作为反义引物的合成寡核苷酸(SEQ ID NO16)各50pmol、1μl 0.05％丙亚胺水溶液，随后于53℃使引物退火至模板上。将20μl含0.625mM dNTP混合物、40mM Hepes-KOH缓冲剂(pH7.8)、125mM乙酸钾、5mM乙酸镁、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲亚砜、11U Afu RNase HII、5.5UBcaBest DNA聚合酶和无菌水的混合物加入上述经过加热的混合物中，使最终体积为25μl。53℃温育反应混合物1小时。反应结束后，从各反应混合物中分别取出5μl，上样在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图4A-F所示。图4A-F所示为电泳图谱，显示了以提取自血液样品1-6的基因组DNA为模板进行分型的结果。泳道1和2显示了分别以SEQ ID NO14(用于检测636G)和SEQ ID NO15(用于检测636A)所示核苷酸为本发明核苷酸所获的结果。基于图4A-F所示的扩增产物图谱，相应血液样品中，位于CYP2C19中第636个核苷酸上的等位基因被分型为1G/A、2G/G、3G/A、4G/G、5G/G和6G/G。
另一方面，以相同基因组DNA为模板，并采用SEQ ID NO17和18所示引物进行PCR。采用BamHI处理所获的PCR扩增产物，并将反应混合物上样在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，通过PCR-RFLP法分型。结果如图4G所示。图4G所示为电泳图谱，显示了以制备自血液样品1-6的基因组DNA为模板，通过PCR-RFLP法分型的结果。泳道1-6分别显示了以提取自血液样品1-6的基因组DNA为模板所获的结果。基于图4G所示电泳结果(即以制备自相应血液样品的DNA为模板所获PCR扩增产物的消化模式)，位于CYP2C19中第636个核苷酸上的等位基因被分型为1G/A、2G/G、3G/A、4G/G、5G/G和6G/G。该结果与上述结果一致。
(2)利用ELISA对人类CYP2C19(636)的等位基因特异性检测根据上述实施例2-(1)所描述方法，采用如实施例2-(1)所示制备自HL-60(G/G)的160ng基因组DNA，或制备自血液样品1(G/A)的150ng基因组DNA，或制备自血液样品4(G/G)的230ng基因组DNA作为模板，并以本发明核苷酸为引物用于特异性检测636G(SEQ ID NO14)或636A(SEQ ID NO15)的等位基因，并以括号内所述引物(1％该引物的5’末端标记有生物素)为反义引物(SEQ ID NO19)，进行SNP分型反应。分别从各分型反应产物中取2.5μl，加入抗生物素蛋白板(Labsystems)的孔内，孔内已加入50μl杂交缓冲液(5×SSC、1％ Triton-X100、1％BSA)。室温反应15分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液(25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05％Tween 20)洗涤各孔一次。向各孔加入50μl 0.017N NaOH溶液。室温反应3分钟后，加入100μl含2.5pmol DNA探针(SEQ ID NO20)的杂交缓冲液，该探针的5’末端标记有FITC。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，并采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔两次。向各孔内加入100μl含POD标记的抗-FITC抗体的杂交缓冲液。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔四次。向各孔内加入100μl TMB溶液(BioFX Laboratories)。室温反应10分钟后，按照添加TMB溶液的顺序向孔内加入100μl 1N硫酸。利用读板仪测定各孔于450nm处的吸光度。结果如图5所示。图5中，■和□分别显示了采用SEQ ID NO14和15所示用于特异性检测636G和636A的等位基因的本发明核苷酸进行分型反应的结果。水平轴上的数字1、2和3分别表示对HL-60、血液样品1和血液样品4分型的结果。数字4代表阳性对照。如图5所示，当定义ELISA阳性对照的数值为截断值时，可对相应样品的CYP2C19中第636个核苷酸上的等位基因分型，所获结果与这些基因组DNA的等位基因一致。
实施例3
对人类CYP1A1 3’-侧翼区中的SmaI多态性(T6235C)进行分型。
合成SEQ ID NO21和22所示的核苷酸，将其作为引物用于特异性检测人类CYP1A1等位基因，该等位基因在第6235个核苷酸上含C和T。以该核苷酸为反义引物，并以SEQ ID NO23所示引物(1％该引物的5’末端被生物素化)为有义引物，进行下述反应。在ThermalCycler Personal(Takara Bio)中，98℃加热总体积为5μl的反应混合物2分钟，该混合物含有分别为50pmol的合成寡核苷酸引物(有义和反义引物)、1μl 0.05％丙亚胺水溶液和100ng的一种基因组DNA，该基因组DNA中第6325个核苷酸上的CYP1A1等位基因已经由PCR-RFLP被证实为(C/C)和(T/T)，随后于53℃使引物退火至模板。将20μl含0.625mM dNTP混合物、40mM Hepes-KOH缓冲剂(pH7.8)、125mM乙酸钾、5mM乙酸镁、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲亚砜、14U AfuRNase HII、5.5U BcaBest DNA聚合酶(Takara Bio)和无菌水的混合物加入上述经过加热的混合物中，使最终体积为25μl。60℃温育反应混合物1小时。反应结束后，从各反应混合物中分别取出5μl，上样在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果如图6所示。在图6所示电泳图谱中，泳道1、2、5和6显示了采用SEQ ID NO21所示核苷酸所获的结果，泳道3、4、7和8显示了采用SEQ ID NO22所示核苷酸所获的结果。泳道1-4显示了以第6235个核苷酸上的CYP1A1等位基因已被证实为(C/C)的基因组DNA为模板所获的结果，泳道5-8显示了以第6235个核苷酸上的CYP1A1等位基因已被证实为(T/T)的基因组DNA为模板所获的结果。基于上述结果，证实利用本发明核苷酸可进行等位基因特异性检测。
采用ELISA检测反应产物。分别从各反应产物中取5μl，加入抗生物素蛋白板(Labsystems)的孔内，孔内已加入50μl杂交缓冲液(5×SSC、1％ Triton-X100、1％ BSA)。室温反应15分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液(25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mMNaCl、0.05％Tween 20)洗涤各孔一次。向各孔加入50μl 0.017N NaOH溶液。室温反应3分钟后，加入100μl含5pmol DNA探针(SEQ ID NO24)的杂交缓冲液，该探针的5’末端标记有FITC。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，并采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔两次。向各孔内加入100μl含POD标记的抗-FITC抗体的杂交缓冲液。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔四次。向各孔内加入100μl TMB溶液(BioFX Laboratories)。室温反应10分钟后，按照添加TMB溶液的顺序向孔内加入100μl 1N硫酸。利用读板仪测定各孔于450nm处的吸光度。结果如图7所示。在图7所示结果当中，泳道1、2、5和6显示了采用SEQ ID NO21所示核苷酸所获的结果，泳道3、4、7和8显示了采用SEQ ID NO22所示核苷酸所获的结果。泳道1-4显示了以第6235个核苷酸上的CYP1A1等位基因已被证实为(C/C)的基因组DNA为模板所获的结果，泳道5-8显示了以第6235个核苷酸上的CYP1A1等位基因已被证实为(T/T)的基因组DNA为模板所获的结果。如图7所示，当定义450nm处的吸光度数值1为截断值时，可进行分型，所获结果与这些基因组DNA的等位基因一致。
实施例4对人类ALDH2(醛脱氢酶2)中的单核苷酸多态性(外显子，487Glu→Lys)进行分型。
合成具有核苷酸序列SEQ ID NO25和26的核苷酸，将其作为引物用于特异性检测人类ALDH2的外显子12中含G和A的单核苷酸多态性等位基因。以一种本发明核苷酸为反义引物，并以括号内所述引物(0.5％该引物的5’末端被生物素化)为有义引物(SEQ ID NO27)，进行下述反应。在Themal Cycler Personal(Takara Bio)中，98℃加热总体积为5μl的反应混合物2分钟，该混合物含有分别为50pmol的合成寡核苷酸引物(有义和反义引物)、1μl 0.05％丙亚胺水溶液和100ng的一种基因组DNA，该基因组DNA中，ALDH2的外显子12中的单核苷酸多态性等位基因已被证实为(G/G)、(A/A)和(G/A)，随后于54℃使引物退火至模板。将20μl含0.625mM dNTP混合物、40mMHepes-KOH缓冲剂(pH7.8)、125mM乙酸钾、5mM乙酸镁、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲亚砜、14U Afu RNase HII、5.5U BcaBest DNA聚合酶(Takara Bio)和无菌水的混合物加入上述经过加热的混合物中，使最终体积为25μl。54℃温育反应混合物1小时。对所获反应产物进行ELISA检测。分别从各反应产物中取5μl，加入抗生物素蛋白板(Labsystems)的孔内，孔内已加入50μl杂交缓冲液(5×SSC、1％Triton-X100、1％ BSA)。室温反应15分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液(25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05％Tween20)洗涤各孔一次。向各孔加入50μl 0.02N NaOH溶液。室温反应3分钟后，加入100μl含5pmol DNA探针(SEQ ID NO28)的杂交缓冲液，该探针的5’末端标记有FITC。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，并采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔两次。向各孔内加入100μl含POD标记的抗-FITC抗体的杂交缓冲液。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔四次。向各孔内加入100μl TMB溶液(BioFX Laboratories)。室温反应10分钟后，按照添加TMB溶液的顺序向孔内加入100μl 1N硫酸。利用读板仪测定各孔于450nm处的吸光度。结果如图8所示。图8为显示了ELISA结果的图解。纵轴显示基于ELISA的吸光度。水平轴显示样品编号。水平轴上的数字1、3和5表示采用具有核苷酸序列SEQ ID NO25的核苷酸检测ALDH2的外显子12中含G的单核苷酸多态性(用于检测活性类型)所获的结果，数字2、4和6表示采用具有核苷酸序列SEQ IDNO26的核苷酸检测ALDH2的外显子12中含A的单核苷酸多态性(用于检测失活类型)所获的结果。泳道1和2显示了以ALDH2的外显子12中单核苷酸多态性已被证实为(G/G)的基因组DNA为模板所获的结果，泳道3和4显示了以ALDH2的外显子12中的单核苷酸多态性已被证实为(G/A)的基因组DNA为模板所获的结果，泳道5和6显示了以ALDH2的外显子12中的单核苷酸多态性已被证实为(A/A)的基因组DNA为模板所获的结果。如图8所示，当定义450nm处的吸光度数值1为截断值时，可进行分型，所获结果与这些基因组DNA的等位基因一致。从而证实利用本发明方法可准确检测人类醛脱氢酶2的多态性。
实施例5(1)引物与探针的合成基于人类谷胱苷肽-S-转移酶T1(GSTT1)基因(GenBank编号AB057594)的核苷酸序列，设计并合成3’末端均含3个RNA残基，并可用于通过ICAN反应进行检测的寡核苷酸引物。具体而言，合成寡核苷酸引物GST1-F(SEQ ID NO29)和GST1-R(SEQ ID NO30)。寡核苷酸GST1-F为有义引物，寡核苷酸GST1-R为反义引物。合成寡核苷酸引物GST1-F-bio(SEQ ID NO31)，其中GST1-F的5’末端被生物素化。将GST1-F和GST1-F-bio以491的比例混合所获混合物(下文称作GST1-F-mix)用于反应。此外，合成寡核苷酸探针GST1-D(SEQ ID NO32)，其5’末端修饰有FITC，并可用于通过ELISA检测ICAN反应扩增产物。GST1-D为反义探针。
另一方面，设计并合成用于PCR的寡核苷酸引物。具体而言，合成寡核苷酸引物GST1-PCR-F(SEQ ID NO33)和GST1-PCR-R(SEQ IDNO34)。寡核苷酸GST1-PCR-F为有义引物，寡核苷酸GST1-PCR-R为反义引物。
(2)利用ICAN反应对GSTT1基因的检测在Thermal Cycler Personal(Takara Bio)中，98℃加热总体积为5μl的反应混合物2分钟，该混合物含有分别为50pmol的合成寡核苷酸引物GST1-F-mix和GST1-R、1μl 0.05％丙亚胺水溶液，和1μl实施例1-(1)所制备的其中一种测试样品基因组DNA溶液，随后于58℃使引物退火至模板。将20μl含0.625mM dNTP混合物、40mMHepes-KOH缓冲剂(pH7.8)、125mM乙酸钾、5mM乙酸镁、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲亚砜、13.8U Afu RNase HII(Takara Bio)、5.5U BcaBest DNA聚合酶(Takara Bio)和无菌水的混合物加入上述经过加热的混合物中，使最终体积为25μl。58℃温育反应混合物1小时。反应结束后，分别从各反应产物中取5μl，上样在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果当采用测试样品1、2、4、5和6来源的基因组DNA时，观测到GSTT1基因来源的扩增产物。从而证实这些测试样品含GSTT1基因。结果如图9所示。图9显示了ICAN反应产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1、2、3、4、5、6和7分别代表测试样品1、2、3、4、5、6和7。
另一方面，通过采用1μl各上述相同测试样品基因组DNA溶液进行PCR检测GSTT1基因。采用引物GST1-PCR-F和GST1-PCR-R进行PCR，将其反应混合物上样在3.0％琼脂糖凝胶上进行电泳。结果当采用测试样品1、2、4、5和6来源的基因组DNA时，观测到GSTT1基因来源的扩增产物。结果如图10所示。图10显示了PCR反应产物的琼脂糖凝胶电泳图谱。泳道1、2、3、4、5、6和7分别代表测试样品1、2、3、4、5、6和7。如上所述，采用ICAN法所获结果与采用PCR法所获结果一致。
(3)采用ELISA法对ICAN扩增产物的检测分别从上述实施例5-(2)所获各反应产物中取5μl，加入抗生物素蛋白板(Labsystems)的孔内，孔内已加入50μl杂交缓冲液(5×SSC、1％ Triton-X100、1％ BSA)。室温反应15分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液(25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mMNaCl、0.05％ Tween 20)洗涤各孔一次。向各孔加入50μl 0.D2N NaOH溶液。室温反应3分钟后，加入100μl含5pmol GST1-D探针的杂交缓冲液。室温反应15分钟后，弃去反应混合物，并采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔两次。向各孔内加入100μl含POD标记的抗-FITC抗体的杂交缓冲液。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔四次。向各孔内加入100μl TMB溶液(BioFXLaboratories)。室温反应10分钟后，按照添加TMB溶液的顺序向孔内加入100μl 1N硫酸。利用读板仪测定各孔于450nm处的吸光度。吸光度为2或2以上的测试样品被确定为GSTT1基因阳性。
结果是测试样品1、2、4、5和6的基因组DNA来源的ICAN反应产物被确定为GSTT1基因阳性。该结果与电泳测定结果相似。该结果如图11所示。图11为显示了ELISA结果的图解。水平轴显示测试样品编号。纵轴显示450nm处的吸光度。
实施例6(1)引物与探针的合成对基于本发明对人类基因分型所采用的内部阳性对照进行检验。如下构建用于内部对照的ICAN引物。
基于人类β-珠蛋白基因(GenBank编号AF007546)的核苷酸序列设计并合成用于ICAN反应的寡核苷酸引物，该引物的3’末端均含3个RNA残基。具体而言，合成寡核苷酸引物βG-F1(SEQ ID NO35)、βG-R1(SEQ ID NO36)、βG-F2(SEQ ID NO37)和βG-R2(SEQ ID NO38)和βG-R3(SEQ ID NO39)。寡核苷酸引物βG-F1和βG-F2为有义引物，寡核苷酸引物βG-R1、βG-R2和βG-R3为反义引物。合成寡核苷酸引物βG-F1-Bio(SEQ ID NO40)、βG-R2-Bio(SEQ ID NO41)和βG-R3-Bio(SEQ ID NO42)，其中βG-F1、βG-R2和βG-R3的5’末端被生物素化。将βG-F1和βG-F1-Bio、βG-R2和βG-R2-Bio，以及βG-R3和βG-R3-Bio以49∶1的比例混合所获的混合物(下文分别称作βG-F1-mix、βG-R2-mix和βG-R3-mix)用于反应。此外，合成寡核苷酸探针βG-D1(SEQ ID NO43)和βG-D2(SEQ ID NO44)，这两种探针的5’末端均修饰有FITC，并均用于通过ELISA检测ICAN反应产物。
(2)利用ICAN对β-珠蛋白的检测采用βG-F1-mix和βG-R1(引物组1)、βG-F2和βG-R2-mix(引物组2)或βG-F2和βG-R3-mix(引物组3)的组合作为用于ICAN反应的引物组合进行下述反应。在Thermal Cycler Personal(TakaraBio)中，98℃加热总体积为5μl的反应混合物2分钟，该混合物含有分别为50pmol的合成寡核苷酸引物、1μl 0.05％丙亚胺水溶液和100ng、10ng、1ng或0ng的HL-60基因组DNA，随后于56℃使引物退火至模板。将20μl含0.625mM dNTP混合物、40mM Hepes-KOH缓冲剂(pH7.8)、125mM乙酸钾、5mM乙酸镁、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲亚砜、13.8U Afu RNase HII、5.5U BcaBest DNA聚合酶(TakaraBio)和无菌水的混合物加入上述经过加热的混合物中，使最终体积为25μl。56℃温育反应混合物1小时。
反应结束后，分别从各反应产物中取5μl，加入抗生物素蛋白板(Labsystems)的孔内，孔内已加入50μl杂交缓冲液(5×SSC、1％Triton-X100、1％ BSA)。室温反应15分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液(25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05％ Tween20)洗涤各孔一次。向各孔加入50μl 0.02N NaOH溶液。室温反应3分钟后，加入100μl含5pmol βG-D1(在引物组1的情况中)或βG-D2(在引物组2或3的情况中)的杂交缓冲液。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，并采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔两次。向各孔内加入100μl含POD标记的抗-FITC抗体的杂交缓冲液。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔四次。
洗涤结束后，向各孔内加入100μl TMB溶液(BioFXLaboratories)。室温反应10分钟后，按照添加TMB溶液的顺序向孔内加入100μl 1N硫酸。利用读板仪测定各孔于450nm处的吸光度。结果如图12-14所示。图12、13和14显示了分别采用引物组1、2和3的ELISA结果。水平轴显示HL-60基因组DNA的浓度。纵轴显示450nm处的吸光度。
如图12-14所示，利用引物组1、2和3中的任意一种均可从HL-60基因组DNA中检测出β-珠蛋白基因。
(3)多重ICAN反应以上述(2)中检验的β-珠蛋白基因为内部阳性对照，通过多重ICAN反应对GSTM1和GSTT1进行遗传分型反应。反应步骤如下。
具体而言，采用实施例1所述GS-F和GS-R-mix为寡核苷酸引物，用于GSTM1分型反应，并采用实施例5所述GST1-F-mix和GST1-R为寡核苷酸引物，用于GSTT1分型反应。在Thermal Cycler Personal(Takara Bio)中，98℃加热总体积为5μl的反应混合物2分钟，该混合物含有分别为25pmol的分型所用引物和检测β-珠蛋白基因所用引物组1或2，1μl 0.05％丙亚胺水溶液和100ng测试样品来源的基因组DNA(测试样品1GSTM1和GSTT1均未缺失；测试样品2GSTM1和GSTT1均缺失)，随后于56℃使引物退火至模板。将20μl含0.625mMdNTP混合物、40mM Hepes-KOH缓冲剂(pH7.8)、125mM乙酸钾、5mM乙酸镁、0.0125％牛血清白蛋白、1.25％二甲亚砜、13.8U Afu RNase HII、5.5U BcaBest DNA聚合酶(Takara Bio)和无菌水的混合物加入上述经过加热的混合物中，使最终体积为25μl。56℃温育反应混合物1小时。
反应结束后，分别从各反应产物中取5μl，加入抗生物素蛋白板(Labsystems)的孔内，孔内已加入50μl杂交缓冲液(5×SSC、1％Triton-X100、1％ BSA)。室温反应15分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液(25mM Tris-HCl(pH7.5)、150mM NaCl、0.05％ Tween20)洗涤各孔一次。向各孔加入50μl 0.02N Na0H溶液。室温反应3分钟后，加入100μl含5pmol GS-D(在检测GSTM1的情况中)、GST1-D(在检测GSTT1的情况中)、βG-D1(在引物组1的情况中)或βG-D2(在引物组2的情况中)的杂交缓冲液。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，并采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔两次。
洗涤结束后，向各孔内加入100μl含POD标记的抗-FITC抗体的杂交缓冲液。室温反应20分钟后，弃去反应混合物，采用360μl洗涤缓冲液洗涤各孔四次。向各孔内加入100μl TMB溶液(BioFXLaboratories)。室温反应10分钟后，按照添加TMB溶液的顺序向孔内加入100μl 1N硫酸。利用读板仪测定各孔于450nm处的吸光度。
结果如图15、16、17和18所示。图15和16分别显示了采用检测β-珠蛋白基因所用引物组1和2进行GSTM1分型的结果。图17和18分别显示了采用检测β-珠蛋白基因所用引物组1和2进行GSTT1分型的结果。这些图中，水平轴显示测试样品编号。纵轴显示450nm处的吸光度。图15和16中，实心柱表示GSTM1分型结果，阴影柱表示检测β-珠蛋白基因的结果。同样，图17和18中，实心柱表示GSTT1分型结果，阴影柱表示检测β-珠蛋白基因的结果。
如图15-18所示，证实通过以β-珠蛋白基因为内部阳性对照进行多重ICAN反应，对GSTM1和GSTT1进行遗传分型反应是可能的。
实施例7构建适用于本发明方法的试剂盒。并对通过结合碱变性进行ICAN和/或UCAN对人类遗传多态性分型的方法进行检验。
(1)用于对ALDH2基因中多态性分型的试剂盒的构建和利用该试剂盒进行的分型对ALDH2中单核苷酸多态性分型的反应如下进行。首先，制备下列试剂(用于16个反应)。
试剂10.1M Hepes溶液(80μl)，含核苷酸序列SEQ ID NO25的核苷酸，和核苷酸序列SEQ ID NO27的嵌合寡核苷酸引物(0.5％该引物的5’末端被生物素化)各50μl；试剂20.1M Hepes溶液(80μl)，含核苷酸序列SEQ ID NO26的本发明核苷酸，和核苷酸序列SEQ ID NO27的嵌合寡核苷酸引物(0.5％该引物的5’末端被生物素化)各50μl；试剂3含32mM Hepes-KOH缓冲液(pH7.8)、100mM KOAc、4mMMg(OAc)2、2.5mM dNTP混合物、0.05％牛血清白蛋白、2.8U/μl Afu RNaseHII和1.1U/μl BcaBest DNA聚合酶(Takara Bio)的溶液(80μl)；以及试剂4含14mM Hepes-KOH缓冲液(pH7.8)、200mM KOAc、8mMMg(OAc)2和2.5％二甲亚砜的溶液(160μl)。
利用上述试剂进行下述操作。具体而言，将等体积的0.1N NaOH加入含40ng/μl基因组DNA的溶液，该基因组中，ALDH2的外显子12中单核苷酸多态性等位基因已被证实为(G/G)、(G/A)或(A/A)。室温下放置该混合物5分钟，获得样品溶液。将5μl样品溶液加入5μl试剂1或2中。进一步加入5μl试剂3和10μl试剂4，混合后获得15μl反应混合物。54℃温育混合物1小时。根据实施例4所述方法检测所获的反应产物。结果如图19所示。
图19为显示了利用本发明试剂盒检测人类ALDH2中遗传多态性的ELISA结果的图解。水平轴显示样品编号。纵轴显示450nm处的吸光度。该图中，泳道1、3和5显示了采用SEQ ID NO25所示核苷酸所获的结果，泳道2、4和6显示了采用SEQ ID NO26所示核苷酸所获的结果。泳道1和2显示了以ALDH2基因的外显子12中单核苷酸多态性已被证实为(G/G)的基因组DNA为模板所获的结果；泳道3和4显示了以ALDH2基因的外显子12中单核苷酸多态性已被证实为(G/A)的基因组DNA为模板所获的结果；泳道5和6显示了以ALDH2基因的外显子12中单核苷酸多态性已被证实为(A/A)的基因组DNA为模板所获的结果。如图19所示，当定义450nm处吸光度数值1为截断值时，可进行分型，所获结果与这些基因组DNA的等位基因一致。从而证实本发明试剂盒可应用于遗传多态性分型方法。另外，也证实碱变性可被结合应用在本发明方法中。
(2)用于对GSTM1中缺失多态性分型的试剂盒的构建和利用该试剂盒进行的分型对GSTM1中缺失多态性分型的反应如下进行。首先，制备下列试剂(用于32个反应)。
试剂10.1M Hepes溶液(160μl)，含实施例1所述寡核苷酸引物GS-F和GS-R-mix，各25μM，以及实施例6-(2)所述用于检测β-珠蛋白基因的引物组1中的寡核苷酸引物，各25μM；试剂2含32mM Hepes-KOH缓冲液(pH7.8)、100mM KOAc、4mMMg(OAc)2、2.5mM dNTP混合物、0.05％牛血清白蛋白、2.8U/μl Afu RNaseHII和1.1U/μl BcaBest DNA聚合酶(Takara Bio)的溶液(160μl)；以及试剂3含14mM Hepes-KOH缓冲液(pH7.8)、200mM KOAc、8mMMg(OAc)2和2.5％二甲亚砜的溶液(320μl)。
利用上述试剂进行下述操作。具体而言，将等体积的0.1N NaOH加入含40ng/μl来源自测试样品(测试样品1无GSTM1缺失；测试样品2有GSTM1缺失)的基因组DNA的溶液中。室温下放置混合物5分钟，获得样品溶液。将5μl样品溶液加入5μl试剂1中。通过加入5μl试剂2和10μl试剂3，混合后获得15μl反应混合物。56℃温育混合物1小时。根据实施例6-(3)所述方法检测最终所获得的反应产物。结果如图20所示。
图20为显示了利用本发明试剂盒检测人类GSTM1中遗传多态性的ELISA结果的图解。水平轴显示样品编号。纵轴显示450nm处的吸光度。图中的实心柱表示检测GSTM1的结果，阴影柱表示检测β-珠蛋白的结果。如图20所示，通过在上述条件下以β-珠蛋白基因为内部阳性对照进行多重ICAN反应，是可能对GSTM1进行遗传分型的。从而证实本发明试剂盒可应用于遗传多态性分型方法。另外，也证实即使采用独特的待检测被试者也可结合采用碱变性。
(3)用于对GSTT1中缺失多态性分型的试剂盒的构建和利用该试剂盒进行的分型以类似上述(2)的手段检验GSTT1的检测。具体而言，除采用实施例5所述寡核苷酸引物GST1-F-mix和GST1-R外，所制备试剂的组成与上文(2)所述组成相同。当利用这些试剂根据上述方法对GSTM1分型时，可实现分型。从而证实本发明试剂盒可应用于遗传多态性分型方法。另外，也证实碱变性可被结合应用于任何情况。
工业实用性上述本发明核苷酸和采用本发明核苷酸检测碱基置换、插入突变或缺失突变的方法均有助于检测天然存在或人工导入的碱基置换、插入突变或缺失突变。
根据本发明，可方便地检测目标核酸中碱基置换、插入突变或缺失突变的存在，并具有可重现性。本发明方法可容易地结合已知核酸扩增方法，并可用于高灵敏度地检测碱基置换、插入突变或缺失突变。通过进一步结合利用具有合适序列的本发明核苷酸，是可能获得与碱基置换、插入突变或缺失突变的存在以及置换、插入或缺失的类型相关的信息的。
本发明可用于检测或鉴定生物体内基因组DNA中产生的碱基置换、插入突变或缺失突变，如多态性或变异(如SNP)，本发明在基因组药物发现或基因组治疗(如筛选人类疾病基因或分析药物敏感性)领域中也同样有用。
序列表文字SEQ ID NO2PCR引物AfuNde，用于从闪烁古生球菌克隆编码具有RNaseHII活性的多肽的基因SEQ ID NO3PCR引物AfuBam，用于从闪烁古生球菌克隆编码具有RNaseHII活性的多肽的基因SEQ ID NO6用于扩增人类GSTM1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸20-22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO7用于扩增人类GSTM1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸21-23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO8用于扩增人类GSTM1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸21-23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”SEQ ID NO9用于检测人类GSTM1基因的一部分的寡核苷酸探针。“5’末端标记有FITC”SEQ ID NO10经设计用于扩增人类GSTM1基因的一部分的PCR引物SEQ ID NO11经设计用于扩增人类GSTM1基因的一部分的PCR引物SEQ ID NO12经设计用于扩增人类GSTM1基因的一部分的PCR引物SEQ ID NO13经设计用于扩增人类GSTM1基因的一部分的PCR引物SEQ ID NO14用于检测人类CYP2C19基因上的核苷酸置换的嵌合寡核苷酸。“核苷酸13-15为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且3’末端核苷酸的3’-OH基团受氨基己基保护”SEQ ID NO15用于检测人类CYP2C19基因上的核苷酸置换的嵌合寡核苷酸。“核苷酸13-15为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且3’末端核苷酸的3’-OH基团受氨基己基保护”SEQ ID NO16用于扩增人类CYP2C19基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO17。经设计用于扩增人类CYP2C19基因的一部分的PCR引物SEQ ID NO18经设计用于扩增人类CYP2C19基因的一部分的PCR引物SEQ ID NO19用于扩增人类CYP2C19基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”SEQ ID NO20用于检测人类CYP2C19基因的一部分的寡核苷酸探针。“5’末端标记有FITC”SEQ ID NO21用于检测人类CYP1A1基因上的核苷酸置换的嵌合寡核苷酸。“核苷酸13-15为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且3’末端核苷酸的3’-OH基团受氨基己基保护”SEQ ID NO22用于检测人类CYP1A1基因上的核苷酸置换的嵌合寡核苷酸。“核苷酸13-15为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且3’末端核苷酸的3’-OH基团受氨基己基保护”SEQ ID NO23用于扩增人类CYP1A1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”SEQ ID NO24用于检测人类CYP1A1基因的一部分的寡核苷酸探针。“5’末端标记有FITC”SEQ ID NO25用于检测人类ALDH2基因上的核苷酸置换的嵌合寡核苷酸。“核苷酸16-18为核糖核苷酸，核苷酸20为肌苷-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且3’末端核苷酸的3’-OH基团受氨基己基保护”SEQ ID NO26用于检测人类ALDH2基因上的核苷酸置换的嵌合寡核苷酸。“核苷酸16-18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且3’末端核苷酸的3’-OH基团受氨基己基保护”SEQ ID NO27用于扩增人类ALDH2基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸16-18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”SEQ ID NO28用于检测人类ALDH2基因的一部分的寡核苷酸探针。“5’末端标记有FITC”SEQ ID NO29用于扩增人类GSTT1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO30用于扩增人类GSTT1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO31用于扩增人类GSTT1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”SEQ ID NO32用于检测人类GSTT1基因的一部分的寡核苷酸探针。“5’末端标记有FITC”SEQ ID NO33经设计用于扩增人类GSTT1基因的一部分的PCR引物SEQ ID NO34经设计用于扩增人类GSTT1基因的一部分的PCR引物SEQ ID NO35用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO36用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸20-22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO37用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸21-23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO38用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸21-23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO39用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸20-22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”SEQ ID NO40用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”SEQ ID NO41用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸21-23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”SEQ ID NO42用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸20-22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”SEQ ID NO43用于检测人类β-珠蛋白基因的一部分的寡核苷酸引物。“5’末端标记有FITC”SEQ ID NO44用于检测人类β-珠蛋白基因的一部分的寡核苷酸引物。“5’末端标记有FITC”
序列表<110>TAKARA BIO INC.
<120>遗传多态性分型方法<130>663837<150>JP 2002-158853<151>2002-05-31<150>JP 2002-204143<151>2002-07-12<150>JP 2002-211813<151>2002-07-19<150>JP 2002-310862<151>2002-10-25<150>JP 2002-335830<151>2002-11-19<160>44<210>1<211>626<212>DNA<213>闪烁古生球菌<400>1atgaaggcag gcatcgatga ggctggaaag ggctgcgtca tcggcccact ggttgttgca 60ggagtggctt gcagcgatga ggataggctg agaaagcttg gtgtgaaaga ctccaaaaag 120ctaagtcagg ggaggagaga ggaactagcc gaggaaataa ggaaaatctg cagaacggag 180gttttgaaag tttctcccga aaatctcgac gaaaggatgg ctgctaaaac cataaacgag 240attttgaagg agtgctacgc tgaaataatt ctcaggctga agccggaaat tgcttatgtt 300gacagtcctg atgtgattcc cgagagactt tcgagggagc ttgaggagat tacggggttg 360agagttgtgg ccgagcacaa ggcggacgag aagtatcccc tggtagctgc ggcttcaatc 420atcgcaaagg tggaaaggga gcgggagatt gagaggctga aagaaaaatt cggggatttc 480ggcagcggct atgcgagcga tccgaggaca agagaagtgc tgaaggagtg gatagcttca 540ggcagaattc cgagctgcgt gagaatgcgc tggaagacgg tgtcaaatct gaggcagaag 600acgcttgacg atttctaaac gaaacc 626
<210>2<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物AfuNde，用于从闪烁古生球菌克隆编码具有RNase HII活性的多肽的基因<400>2aagctgggtt tcatatgaag gcaggcatcg30<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物AfuBam，用于从闪烁古生球菌克隆编码具有RNase HII活性的多肽的基因<400>3tggtaataac ggatccgttt agaaatcgtc30<210>4<211>638<212>DNA<213>闪烁古生球菌<400>4catatgaagg caggcatcga tgaggctgga aagggctgcg tcatcggccc actggttgtt 60gcaggagtgg cttgcagcga tgaggatagg ctgagaaagc ttggtgtgaa agactccaaa 120aagctaagtc aggggaggag agaggaacta gccgaggaaa taaggaaaat ctgcagaacg 180gaggttttga aagtttctcc cgaaaatctc gacgaaagga tggctgctaa aaccataaac 240gagattttga aggagtgcta cgctgaaata attctcaggc tgaagccgga aattgcttat 300gttgacagtc ctgatgtgat tcccgagaga ctttcgaggg agcttgagga gattacgggg 360ttgagagttg tggccgagca caaggcggac gagaagtatc ccctggtagc tgcggcttca 420atcatcgcaa aggtggaaag ggagcgggag attgagaggc tgaaagaaaa attcggggat 480ttcggcagcg gctatgcgag cgatccgagg acaagagaag tgctgaagga gtggatagct 540tcaggcagaa ttccgagctg cgtgagaatg cgctggaaga cggtgtcaaa tctgaggcag 600aagacgcttg acgatttcta aacggatccc cgggtacc 638
<210>5<211>205<212>PRT<213>闪烁古生球菌<400>5Met Lys Ala Gly Ile Asp Glu Ala Gly Lys Gly Cys Val Ile Gly1 5 10 15Pro Leu Val Val Ala Gly Val Ala Cys Ser Asp Glu Asp Arg Leu20 25 30Arg Lys Leu Gly Val Lys Asp Ser Lys Lys Leu Ser Gln Gly Arg35 40 45Arg Glu Glu Leu Ala Glu Glu Ile Arg Lys Ile Cys Arg Thr Glu50 55 60Val Leu Lys Val Ser Pro Glu Asn Leu Asp Glu Arg Met Ala Ala65 70 75Lys Thr Ile Asn Glu Ile Leu Lys Glu Cys Tyr Ala Glu Ile Ile80 85 90Leu Arg Leu Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Val Asp Ser Pro Asp Val95 100 105Ile Pro Glu Arg Leu Ser Arg Glu Leu Glu Glu Ile Thr Gly Leu110 115 120Arg Val Val Ala Glu His Lys Ala Asp Glu Lys Tyr Pro Leu Val125 130 135Ala Ala Ala Ser Ile Ile Ala Lys Val Glu Arg Glu Arg Glu Ile140 145 150Glu Arg Leu Lys Glu Lys Phe Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Ala155 160 165Ser Asp Pro Arg Thr Arg Glu Val Leu Lys Glu Trp Ile Ala Ser170 175 180Gly Arg Ile Pro Ser Cys Val Arg Met Arg Trp Lys Thr Val Ser185 190 195Asn Leu Arg Gln Lys Thr Leu Asp Asp Phe200 205<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类GSTM1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸20-22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”
<400>6gagtctgtgt tttgtgggtg gc 22<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类GSTM1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸21-23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>7cagatcatgc ccagctgcat aug 23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类GSTM1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸21-23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”<400>8cagatcatgc ccagctgcat aug 23<210>9<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类GSTM1基因的一部分的寡核苷酸探针。“5’末端标记有FITC”<400>9agacagaaga ggaga 15<210>10
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>经设计用于扩增人类GSTM1基因的一部分的PCR引物<400>10gtggcaggtg gggagacaga20<210>11<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>经设计用于扩增人类GSTM1基因的一部分的PCR引物<400>11tgtccatggt ctggttctcc20<210>12<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>经设计用于扩增人类GSTM1基因的一部分的PCR引物<400>12ctgccctact tgattgatgg g 21<210>13<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>经设计用于扩增人类GSTM1基因的一部分的PCR引物<400>13
ctggattgta gcagatcatg c21<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类CYP2C19基因上的核苷酸置换的嵌合寡核苷酸。“核苷酸13-15为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且3’末端核苷酸的3’-OH基团受氨基己基保护”<400>14gtaagcaccc ccuggatc18<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类CYP2C19基因上的核苷酸置换的嵌合寡核苷酸。“核苷酸13-15为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且3’末端核苷酸的3’-OH基团受氨基己基保护”<400>15gtaagcaccc ccugaatc18<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类CYP2C19基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>16ttggtcaata tagaatttug g21<210>17<211>22
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>经设计用于扩增人类CYP2C19基因的一部分的PCR引物<400>17tattatctgt taactaatat ga22<210>18<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>经设计用于扩增人类CYP2C19基因的一部分的PCR引物<400>18acttcagggc ttggtcaata 20<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类CYP2C19基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”<400>19ttggtcaata tagaatttug g 21<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类CYP2C19基因的一部分的寡核苷酸探针。“5’末端标记有FITC”<400>20
caagtttttt gcttcctgag 20<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类CYP1A1基因上的核苷酸置换的嵌合寡核苷酸。“核苷酸13-15为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且3’末端核苷酸的3’-OH基团受氨基己基保护”<400>21aatcgtgtga gcccggga18<210>22<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类CYP1A1基因上的核苷酸置换的嵌合寡核苷酸。“核苷酸13-15为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且3’末端核苷酸的3’-OH基团受氨基己基保护”<400>22atcgtgtgag cccaggag18<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类CYP1A1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”<400>23agactctatt ttttgagaca g21<210>24<211>17
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类CYP1A1基因的一部分的寡核苷酸探针。“5’末端标记有FITC”<400>24tggaggttac agtgaaa17<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类ALDH2基因上的核苷酸置换的嵌合寡核苷酸。“核苷酸16-18为核糖核苷酸，核苷酸20为肌苷-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且3’末端核苷酸的3’-OH基团受氨基己基保护”<220>
<221>修饰碱基<222>20<223>i<400>25ctcacagttt tcactucagn g 21<210>26<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类ALDH2基因上的核苷酸置换的嵌合寡核苷酸。“核苷酸16-18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且3’末端核苷酸的3’-OH基团受氨基己基保护”<400>26actcacagtt ttcacuuuag t 21<210>27<211>18<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类ALDH2基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸16-18为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”<400>27tcaccctttg gtggcuac18<210>28<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类ALDH2基因的一部分的寡核苷酸探针。“5’末端标记有FITC”<400>28tgcagcccgt actc14<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类GSTT1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>29accctgcagt tgctcgagga c21<210>30<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类GSTT1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”
<400>30cgtgatggct acgaggtcag c21<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类GSTT1基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”<400>31accctgcagt tgctcgagga c21<210>32<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类GSTT1基因的一部分的寡核苷酸探针。“5’末端标记有FITC”<400>32aaggagatgt gagga 15<210>33<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>经设计用于扩增人类GSTT1基因的一部分的PCR引物<400>33ttccttactg gtcctcacat ctc 23<210>34<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>经设计用于扩增人类GSTT1基因的一部分的PCR引物。
<400>34tcaccggatc atggccagca20<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>35ggtggtctac ccttggaccc a 21<210>36<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸20-22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>36gccttcacct tagggttgcc ca 22<210>37<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸21-23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”
<400>37cttggaccca gaggttcttt gag23<210>38<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸21-23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>38ctttcttgcc atgagccttc acc23<210>39<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸20-22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸”<400>39gccatgagcc ttcaccttag gg 22<210>40<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸19-21为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”<400>40ggtggtctac ccttggaccc a 21<210>41
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸21-23为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”<400>41ctttcttgcc atgagccttc acc23<210>42<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于扩增人类β-珠蛋白基因的一部分的嵌合寡核苷酸引物。“核苷酸20-22为核糖核苷酸-其它核苷酸为脱氧核糖核苷酸，且5’末端标记有生物素”<400>42gccatgagcc ttcaccttag gg 22<210>43<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类β-珠蛋白基因的一部分的寡核苷酸引物。“5’末端标记有FITC”<400>43taacagcatc aggag 15<210>44<211>13<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于检测人类β-珠蛋白基因的一部分的寡核苷酸引物。“5’末端标记有FITC”
<400>44tcctttgggg atc 1权利要求
1.一种对人类细胞色素基因中的特定核苷酸，即CYP 2C19基因中的G636A或CYP 1A1基因中的T6235C的遗传多态性分型的方法，该方法包括(1)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种核苷酸和RNase H混合，制备反应混合物，其中(a)该核苷酸的3’末端经过修饰，因而在DNA聚合酶作用下不会发生从该末端开始的延伸；和(b)该核苷酸具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有人类细胞色素基因中的特定核苷酸；并(2)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以延伸含有一个任意长度区域的核酸，该区域含有人类细胞色素基因中的特定核苷酸。
2.根据权利要求1的方法，其中该核苷酸具有核苷酸序列SEQ IDNO14、15、21或22或与之互补的核苷酸序列。
3.根据权利要求1的方法，其中进一步采用具有核苷酸序列SEQ IDNO16或23的引物。
4.根据权利要求1的方法，进一步包括检测步骤(2)中所延伸核酸的步骤，该检测采用可于严格条件下与该核酸杂交的探针。
5.根据权利要求4的方法，其中探针具有核苷酸序列SEQ ID NO20或24或与之互补的核苷酸序列。
6.一种用于对人类细胞色素基因中遗传多态性分型的试剂盒，该试剂盒应用于权利要求1所定义对人类细胞色素基因中的遗传多态性分型的方法，并包含具有核苷酸序列SEQ ID NO14、15、21或22或与之互补的核苷酸序列的核苷酸。
7.根据权利要求6的试剂盒，进一步包含具有核苷酸序列SEQ IDNO16或23的引物。
8.根据权利要求7的试剂盒，进一步包含具有核苷酸序列SEQ IDNO20或24或与之互补的核苷酸序列的探针。
9.一种对人类谷胱苷肽-S-转移酶基因中的多态性分型的方法，该方法包括(a)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNase H混合，制备反应混合物，其中引物为嵌合寡核苷酸引物，与模板核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中的至少一种物质，核糖核苷酸位于该引物3’末端或3’末端侧；并(b)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以扩增目标核酸。
10.根据权利要求9的方法，其中人类谷胱苷肽S-转移酶基因是GSTM1基因或GSTT1基因。
11.根据权利要求9的方法，其中引物是具有核苷酸序列SEQ IDNO6、7、8、29、30或31或与之互补的核苷酸序列的嵌合寡核苷酸引物。
12.根据权利要求9的方法，进一步包括检测步骤(b)中所扩增核酸的步骤，该检测采用可于严格条件下与该核酸杂交的探针。
13.根据权利要求12的方法，其中探针具有核苷酸序列SEQ ID NO9或32或与之互补的核苷酸序列。
14.一种用于对人类谷胱苷肽-S-转移酶基因中的遗传多态性分型的试剂盒，该试剂盒应用于权利要求9所定义对人类谷胱苷肽S-转移酶基因中的多态性分型的方法，并包含具有核苷酸序列SEQ ID NO6、7、8、29、30或31的嵌合寡核苷酸引物。
15.根据权利要求14的试剂盒，进一步包含具有核苷酸序列SEQ IDNO9或32或与之互补的核苷酸序列的探针。
16.一种对人类醛脱氢酶基因中的特定核苷酸，即ALDH2基因中的Glu487Lys的遗传多态性分型的方法，该方法包括(1)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种核苷酸和RNase H混合，制备反应混合物，其中(a)该核苷酸的3’末端经过修饰，因而在DNA聚合酶作用下不会发生从该末端开始的延伸；和(b)该核苷酸具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有人类醛脱氢酶基因中的特定核苷酸；并(2)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以延伸含有一个任意长度区域的核酸，该区域含有人类醛脱氢酶基因中的特定核苷酸。
17.根据权利要求16的方法，其中该核苷酸具有核苷酸序列SEQ IDNO25或26或与之互补的核苷酸序列。
18.根据权利要求16的方法，其中进一步采用具有核苷酸序列SEQID NO27的引物。
19.根据权利要求16的方法，进一步包括检测步骤(2)中所延伸核酸的步骤，该检测采用可于严格条件下与该核酸杂交的探针。
20.根据权利要求19的方法，其中探针具有核苷酸序列SEQ ID NO28或与之互补的核苷酸序列。
21.一种用于对人类醛脱氢酶基因中的遗传多态性分型的试剂盒，该试剂盒应用于权利要求16所定义对人类醛脱氢酶基因中的遗传多态性分型的方法，并且包含具有核苷酸序列SEQ ID NO25或26或与之互补的核苷酸序列的核苷酸。
22.根据权利要求21的试剂盒，进一步包含具有核苷酸序列SEQ IDNO27的引物。
23.根据权利要求21的试剂盒，进一步包含具有核苷酸序列SEQ IDNO28或与之互补的核苷酸序列的探针。
24.一种遗传多态性分型方法，其中多个目标核酸是平行检测的，该方法包括(1)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种核苷酸和RNase H混合，制备反应混合物，其中(a)每种所述核苷酸的3’末端均经过修饰，因而在DNA聚合酶作用下不会发生从该末端开始的延伸；和(b)每种所述核苷酸均具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有多个目标核酸中的特定核苷酸；并(2)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以延伸均含有一个任意长度区域的核酸，该区域含有上述特定核苷酸。
25.一种遗传多态性分型方法，其中多个目标核酸是平行检测的，该方法包括(a)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少两种引物和RNase H混合，制备反应混合物，其中引物均为嵌合寡核苷酸引物，与模板核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中的至少一种物质，核糖核苷酸位于该引物3’末端或3’末端侧；并(b)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以扩增目标核酸。
26.一种遗传多态性分型方法，其中多个目标核酸是平行检测的，该方法包括(A)根据包括以下步骤的方法检测至少一个目标核酸(1)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种核苷酸和RNase H混合，制备反应混合物，其中(a)该核苷酸的3’末端经过修饰，因而在DNA聚合酶作用下不会发生从该末端开始的延伸；和(b)该核苷酸具有可退火至特定区域的核苷酸序列，该区域含有多个目标核酸中的特定核苷酸；并(2)温育该反应混合物一段时间，该时间足够生成反应产物，以延伸含有一个任意长度区域的核酸，该区域含有上述特定核苷酸；和(B)根据包括以下步骤的方法检测与(A)中的目标核酸不同的目标核酸(a)将模板核酸、脱氧核糖核苷三磷酸、具有链置换活性的DNA聚合酶、至少一种引物和RNase H混合，制备反应混合物，其中引物为嵌合寡核苷酸引物，与模板核酸的核苷酸序列基本互补，并含有核糖核苷酸以及选自脱氧核糖核苷酸和核苷酸类似物中的至少一种物质，核糖核苷酸位于该引物3’末端或3’末端侧；并(b)温育该反应混合物一段时间，充分生成反应产物，以扩增目标核酸。
27.根据权利要求24-26中的任意一项的方法，其中至少一个目标核酸是内标核酸。
28.根据权利要求27的方法，其中内标核酸是采用选自具有核苷酸序列SEQ ID NOS35-42的引物中的至少两种引物测定的。
29.根据权利要求28的方法，其中内标核酸是采用具有核苷酸序列SEQ ID NO43或44或与之互补的核苷酸序列的探针测定的。
30.一种用于权利要求24-26所定义的遗传多态性分型方法的试剂盒。
31.根据权利要求30的试剂盒，包含选自具有核苷酸序列SEQ IDNOS35-42的引物中的至少两种引物。
32.根据权利要求31的试剂盒，进一步包含具有核苷酸序列SEQ IDNO43或44或与之互补的核苷酸序列的探针。
全文摘要
采用痕量核酸样品检测碱基置换突变(例如SNP)、插入突变或缺失突变的准确且高度可重现性的手段，和利用该手段对基因多态性分型的方法。
文档编号C12Q1/68GK1671841SQ0381813
公开日2005年9月21日 申请日期2003年5月30日 优先权日2002年5月31日
发明者小林英二, 榎龙嗣, 田边雅茂, 上田木绵, 奥田真治, 佐川裕章, 加藤郁之进 申请人:宝生物工程株式会社