专利名称：一种白介素－4突变基因il－4－13及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因重组技术，具体地说是一种白介素-4(IL-4)突变基因IL-4(13D)及其制备和应用(该突变基因和细胞毒素的融合基因IL-4(13D)-PE38KDEL)。
背景技术：
IL-4是激活的T细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞分泌的一种细胞因子。人类成熟的IL-4是一条由129个氨基酸构成的多肽链，分子量为1.4kDa(Yokota，T.，Otsuka，T.，Mosmann，T.，Banchereau，J.，DeFrance，T.，Isolation and characterization of a human interleukin cDNAclone，homologous to mouse B-cell stimulatory factor 1，thatexpresses B-cell-and T-cell-stimulating activities.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1986，83(16)，5894-5898)。
研究表明，IL-4受体(IL-4R)在许多肿瘤细胞的表面表达量很高，而在正常组织细胞表面，IL-4表达量很少或没有，利用这一区别，可以将IL-4R作为肿瘤治疗的靶子，将IL-4和细胞毒素分子连接得到融合基因。其中，IL-4可以引导整个免疫毒素分子到达IL-4R的部位，经一系列作用后，毒素分子可进入细胞内部，发挥杀伤作用。
IL-4R有三种存在方式。I型IL-4R由两条肽链组成，IL-4Rα和IL-2Rγ，主要存在于T、B淋巴细胞、单核细胞、血癌细胞表面。II型IL-4R由IL-4Rα和IL-13Rα1组成，存在于大多数实体瘤细胞表面，如神经胶质瘤、胸腺瘤、爱滋病相关的卡波西肉瘤、头颈癌、肾细胞瘤等。III型IL-4R由IL-4Rα、IL-2Rγ和IL-13Rα1共同组成，主要存在于B淋巴细胞、单核细胞表面。
细胞毒素是指超抗原(如葡萄球菌肠毒素A)，核糖体延伸因子-2抑制剂(如绿脓杆菌外毒素A(PEA)，白喉毒素DT，蓖麻毒素等)及其突变体。绿脓杆菌外毒素A(PEA)为单链蛋白，全长为613个氨基酸，目前有多种形式的突变体。
最近几年用于抗肿瘤的导向药物的研究，有IL-4和绿脓杆菌外毒素A的融合蛋白，用于治疗一些实体瘤，如括神经胶质瘤、乳腺癌和卡波西肉瘤(Raj K.Puri，Development of a RecombinantInterlekin-4-Pseudomonas Exotoxin for Therapy Glioblastoma.Toxicologic Pathology.vol.27.no.1.pp.53-57，1999)；IL-4和白喉杆菌毒素的融合蛋白也有报道(Daniel A.Vallera，Ni Jin，James M.R.Baldrica.et.al.Retrovital Immunotoxin Gene Therapy of Acutemelogenous leukemia in Mice Using Cytotoxic T Cells Transduced withan Interleukin 4/Diphtheria Toxin Gene.Cancer Research.60，976-984，February15，2000)尽管如此，该类免疫毒素对正常组织仍有一定毒副作用，这主要是因为少量的IL-4仍有可能与正常组织结合，因此，进一步提高IL-4对肿瘤细胞的亲和力和选择性是解决这一问题的关键所在。
发明内容
本发明的目的是提供一种亲和力高、选择性强的白介素-4突变基因IL-4(13D)及其制备和应用；IL-4(13D)是一种新的突变基因，其表达可用于抗肿瘤靶向药物。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种IL-4突变基因IL-4(13D)，具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列。
白介素-4突变基因IL-4(13D)的制备，以人的IL-4基因为模板，通过两轮overlap PCR进行基因重组和点突变。第一轮PCR反应扩增出相当于天然人IL-4分子成熟蛋白38～129-GGNGG-1～37(其中GGNGG为-Gly-Gly-Asn-Gly-Gly-)；第二轮PCR反应在相当于天然人IL-4分子成熟蛋白第13位氨基酸处引入一个点突变(13Thr→Asp)。
白介素-4突变基因IL-4(13D)常用于和细胞毒素连接获得融合基因；细胞毒素是指超抗原(如葡萄球菌肠毒素A)，核糖体延伸因子-2抑制剂(如绿脓杆菌外毒素A(PEA)，白喉毒素DT，蓖麻毒素等)，及其突变体。根据细胞毒素的性质，白介素-4突变体可位于融合基因的N端或者C端。
一种绿脓杆菌外毒素A突变基因PE38KDEL，具有序列表SEQ ID NO2中碱基序列。
白介素-4突变基因IL-4(13D)和绿脓杆菌外毒素A突变基因的融合基因IL-4(13D)-PE38KDEL，具有序列表SEQ ID NO3中碱基序列；其制备是以IL-4(13D)和PE38KDEL突变基因为基础，通过连接物5′AGCTCACATATGGCCGAG 3′制得融合基因；IL-4基因在融合基因的5′端，PEA基因在融合基因的3′端，即IL-4的C端通过肽连接物与PEA的N端相连接；Linker相对应的肽为SSHMAE，-Ser-Ser-His-Met-Ala-Glu-。
本发明具有如下优点1.白介素-4突变基因IL-4(13D)为人工制备的一种新基因，属首次制得的基因，该基因与其它分子组成融合基因后不影响本身的IL-4的活性位点发挥作用。
2.IL-4(13D)-PE38KDEL为人工制备的一种新的融合基因，属首次制得的基因，该基因的表达可用于抗肿瘤靶向药物的研究。
3.IL-4(13D)-PE38KDEL表达的融合蛋白与IL-4R的亲和力高，可用于杀伤表面含有IL-4R的肿瘤细胞的研究。
4.应用本发明，可进一步提供直接用于生产融合蛋白IL-4(13D)-PE38KDEL的工程菌株。
5.本发明提供了一种制备IL-4(13D)和细胞毒素的融合基因的方法，据此方法可以制得几种新的与IL-4R亲和力高的IL-4(13D)和细胞毒素的融合基因，该基因可以杀伤表面含有IL-4R的肿瘤细胞。
图1为白介素-4突变基因IL-4(13D)测序图。
图2为白介素-4突变基因IL-4(13D)和绿脓杆菌外毒素A融合基因IL-4(13D)-PE38KDEL在大肠杆菌种表达电泳图其中1为中分子量蛋白标准，2为对照，3为本发明实例工程菌，A为诱导带。
具体实施例方式
实施例1一种白介素-4突变基因IL-4(13D)，具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列ATGGACACAA CTGAGAAGGA AACCTTCTGC AGGGCTGCGA CTGTGCTCCG GCAGTTCTAC 60AGCCACCATG AGAAGGACAC TCGCTGCCTG GGTGCGACTG CACAGCAGTT CCACAGGCAC120AAGCAGCTGA TCCGATTCCT GAAACGGCTC GACAGGAACC TCTGGGGCCT GGCGGGCTTG180AATTCCTGTC CTGTGAAGGA AGCCAACCAG AGTACGTTGG AAAACTTCTT GGAAAGGCTA240AAGACGATCA TGAGAGAGAA ATATTCAAAG TGTTCGTCCG GAGGTAACGG CGGTCACAAG300TGCGATATCA CCTTACAGGA GATCATCAAA GATTTGAACA GCCTCACAGA GCAGAAGACT360CTGTGCACCG AGTTGACCGT AACAGACATC TTTGCTGCCT CCAAG405(1)SEQ ID NO1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度405碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源白介素-4(human interleukin 4)(2)IL-4突变基因IL-4(13D)的制备以人的IL-4基因为模板，通过两轮overlap PCR进行基因重组和点突变(参考文献Kadowaki H，kadowaSci T，Wondisford FE et al.Use ofpolymerase chain reaction catalysed by Taq DNA polymerse forsite-specific mutagenesis.Gene，1989，76161-166.Vallette F，MegeE，Reiss A.Construction of mutant and chimeric genes using thepolymerase chain reaction.Nucleic Acids Res，1989，17723-733.)。
第一轮overlap PCR，以天然的人IL-4基因为模板，通过3个PCR反应进行IL-4基因重组。
第1个PCR反应采用引物a和b扩增出相当于天然IL-4成熟蛋白基因5′端开始的氨基酸1～37IL-4F a5′TGTTCGTCCGGAGGTAACGGCGGTCACAAGTGCGATATCAC 3′IL-4R b5′CTCAGTTGAGCTCTTGGAGGCAGCAAAGATGTCTGT 3′第2个PCR反应采用引物c和d扩增出相当于天然人IL-4成熟蛋白基因5′端开始的氨基酸38～129IL-4F c5′TGCTGCCGCCATGGACACAACTGAGAAGGAAACC 3′IL-4R d5′CTTGTGACCGCCGTTACCTCCGGACGAACACTTTGAATATTTCT 3′将上述两个PCR反应产物混合、变性、退火后，加入Taq酶反应补成双链DNA，此双链DNA相当于天然人IL-4分子成熟蛋白38～129-GGNGG-1～37；以此双链DNA为模板，用引物b、c进行第3个PCR扩增出IL-4重组体；第一轮PCR条件IL-4ab段第一阶段94℃，5分钟；第二阶段94℃，1分钟；60.0℃，45秒；72℃，20秒；共30个循环；第三阶段72℃，5分钟。
IL-4cd段第一阶段94℃，5分钟；第二阶段94℃，1分钟；63.0℃，45秒；72℃，20秒；共30个循环；第三阶段72℃，5分钟。
cpIL-4第一阶段94℃，5分钟；第二阶段94℃，1分钟；61.5℃，45秒；72℃，20秒；共30个循环；第三阶段72℃，5分钟。
第二轮overlap PCR，以第一轮PCR产物IL-4基因重组体为模板，通过3个PCR反应进行IL-4点突变，此点突变位置相当于天然IL-4成熟蛋白基因5′端开始的第13个氨基酸。
第1个PCR反应采用引物e和f，扩增出IL-4基因重组体5′端开始的氨基酸到相当于天然IL-4成熟蛋白基因5′端开始的第13个氨基酸IL-4F e5′TCCCGGCCGCCATGGACACA 3′Nco I酶切位点IL-4R f5′GTTCAAATCTTTGATGATCTCCTG 3′第2个PCR反应采用引物g和h，扩增出相当于天然IL-4成熟蛋白基因5′端开始的第13个氨基酸到IL-4基因重组体3′端的氨基酸IL-4F g5′CATCAAAGATTTGAACAGCCTCACA 3′IL-4R h5′GCGTTGGGAGCTCTTGGAGGCA 3′Sac I酶切位点将上述两个PCR反应产物混合、变性、退火后，加入Taq酶反应补成双链DNA，此双链DNA所表达蛋白在相当于天然人IL-4分子成熟蛋白第13位氨基酸处含有一个点突变，由Thr突变为Asp；以此双链DNA为模板，用引物e、h进行第3个PCR扩增出IL-4突变体(13Thr→Asp)，即IL-4突变基因IL-4(13D)。
第二轮PCR条件cpIL-4(13D)前第一阶段94℃，5分钟；第二阶段94℃，1分钟；55.3℃，45秒；72℃，20秒；共30个循环；第三阶段72℃，5分钟。
cpIL-4(13D)前第一阶段94℃，5分钟；第二阶段94℃，1分钟；53.5℃，45秒；72℃，20秒；共30个循环；第三阶段72℃，5分钟。
cpIL-4(13D)总第一阶段94℃，5分钟；第二阶段94℃，1分钟；59.2℃，45秒；72℃，20秒；共30个循环；第三阶段72℃，5分钟。
用Nco I和Sac I进行双酶切胶回收PCR产物，与同样双酶切的pGEM-T载体用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α，得到的重组质粒命名为pGEM-IL-4(13D)，该质粒含有IL-4突变基因IL-4(13D)。感受态细胞的制备，CaCl2转化方法，质粒DNA的提取鉴定参考《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯，科学出版社1998年版。
将转化子接种于5ml液体培养基(含50μg/ml Amp)，培养13小时后，离心，收集菌体，送至上海博亚生物工程公司进行测序；对转化子的测序结果表明，重组质粒pGEM-IL-4(13D)含有405bp的IL-4突变基因，其碱基序列与设计一致。
实施例2一种白介素-4突变基因IL-4(13D)和绿脓杆菌外毒素A的融合基因IL-4(13D)-PE38KDEL，具有序列表SEQ ID NO3中碱基序列ATGGACACAA CTGAGAAGGA AACCTTCTGC AGGGCTGCGA CTGTGCTCCG GCAGTTCTAC 60AGCCACCATG AGAAGGACAC TCGCTGCCTG GGTGCGACTG CACAGCAGTT CCACAGGCAC120AAGCAGCTGA TCCGATTCCT GAAACGGCTC GACAGGAACC TCTGGGGCCT GGCGGGCTTG180AATTCCTGTC CTGTGAAGGA AGCCAACCAG AGTACGTTGG AAAACTTCTT GGAAAGGCTA240
AAGACGATCA TGAGAGAGAA ATATTCAAAG TGTTCGTCCG GAGGTAACGG CGGTCACAAG 300TGCGATATCA CCTTACAGGA GATCATCAAA GATTTGAACA GCCTCACAGA GCAGAAGACT 360CTGTGCACCG AGTTGACCGT AACAGACATC TTTGCTGCCT CCAAGAGCTC ACATATGGCC 420GAGGGCGGCA GCCTGGCCGC GCTGACCGCG CACCAGGCTT GCCACCTGCC GCTGGAGACT 480TTCACCCGTC ATCGCCAGCC GCGCGGCTGG GAACAACTGG AGCAGTGCGG CTATCCGGTG 540CAGCGGCTGG TCGCCCTCTA CCTGGCGGCG CGGCTGTCGT GGAACCAGGT CGACCAGGTG 600ATCCGCAACG CCCTGGCCAG CCCCGGCAGC GGCGGCGACC TGGGCGAAGC GATCCGCGAG 660CAGCCGGAGC AGGCCCGTCT GGCCCTGACC CTGGCCGCCG CCGAGAGCGA GCGCTTCGTC 720CGGCAGGGCA CCGGCAACGA CGAGGCCGGC GCGGCCAACG CGGGCCCGGC GGACAGCGGC 780GACGCCCTGC TGGAGCGCAA CTATCCCACT GGCGCGGAGT TCCTCGGCGA CGGCGGCGAC 840GTCAGCTTCA GCACCCGCGG CACGCAGAAC TGGACGGTGG AGCGGCTGCT CCAGGCGCAC 900CGCCAACTGG AGGAGCGCGG CTATGTGTTC GTCGGCTACC ACGGCACCTT CCTCGAAGCG 960GCGCAAAGCA TCGTCTTCGG CGGGGTGCGC GCGCGCAGCC AGGACCTCGA CGCGATCTGG1020CGCGGTTTCT ATATCGCCGG CGATCCGGCG CTGGCCTACG GCTACGCCCA GGACCAGGAA1080CCCGACGCAC GCGGCCGGAT CCGCAACGGT GCCCTGCTGC GGGTCTATGT GCCGCGCTCG1140AGCCTGCCGG GCTTCTACCG CACCAGCCTG ACCCTGGCCG CGCCGGAGGC GGCGGGCGAG1200GTCGAACGGC TGATCGGCCA TCCGCTGCCG CTGCGCCTGG ACGCCATCAC CGGCCCCGAG1260GAGGAAGGCG GGCGCCTGGA GACCATTCTC GGCTGGCCGC TGGCCGAGCG CACCGTGGTG1320ATTCCCTCGG CGATCCCCAC CGACCCGCGC AACGTCGGCG GCGACCTCGA CCCGTCCAGC1380ATCCCCGACA AGGAACAGGC GATCAGCGCC CTGCCGGACT ACGCTAGCCA GCCCGGCAAA1440CCGCCGAAAG ATGAACTG 1458(1)SEQ ID NO3的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度1458碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源白介素-4(human interleukin 4)，绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)(2)融合基因IL-4(13D)-PE38KDEL的制备采用酶切连接的方法构建IL-4(13D)-PE38KDEL融合基因。
用Sac I和Nco I双酶切重组质粒pGEM-IL-4(13D)，胶回收得到IL-4突变基因IL-4(13D)；用Sac I和HindIII双酶切质粒pMD-PE38KDEL(含绿脓杆菌外毒素A突变基因PE38KDEL)，得到绿脓杆菌外毒素A突变体(PE38KDEL)；用Nco I和HindIII双酶切质粒的大肠杆菌质粒pET-32a(+)，胶回收双酶切质粒。
将上述三种双酶切的胶回收产物用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化感受态细胞E.coli DH5α，筛选得到的重组质粒命名为pET32-IL-4(13D)-PE38KDEL，该重组质粒含有IL-4(13D)-PE38KDEL融合基因。感受态细胞的制备，CaCl2转化方法，质粒DNA的提取鉴定参考《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，E.F.费里奇，T.曼尼阿蒂斯，科学出版社1998年版。
其中，此融合基因中，绿脓杆菌外毒素A突变基因PE38KDEL具有序列表SEQID NO2(参见序列表)中碱基序列(Chaudhary VK，Jinno Y，et al.Pseudomonas exotoxin contains a specific sequence at the carboxylterminus that is required for cytotoxicity.Proc Natl Acad Sci U SA.1990.Jan；87(1)308-12.Seetharam S，Chaudhary VK，et al.Increased cytotoxic activity of Pseudomonas exotoxin and twochimeric toxins ending in KDEL.J Biol Chem.1991 Sep15；266(26)17376-81.Brinkmann U，Pai LH，et al.B3(Fv)-PE38KDEL，a single-chain immunotoxin that causes complete regression of a humancarcinoma in mice.Proc Natl Acad Sci U S A.1991 Oct1；88(19)8616-20.)。
绿脓杆菌外毒素A突变基因PE38KDEL碱基序列GGCGGCAGCC TGGCCGCGCT GACCGCGCAC CAGGCTTGCC ACCTGCCGCT GGAGACTTTC 60ACCCGTCATC GCCAGCCGCG CGGCTGGGAA CAACTGGAGC AGTGCGGCTA TCCGGTGCAG120CGGCTGGTCG CCCTCTACCT GGCGGCGCGG CTGTCGTGGA ACCAGGTCGA CCAGGTGATC180CGCAACGCCC TGGCCAGCCC CGGCAGCGGC GGCGACCTGG GCGAAGCGAT CCGCGAGCAG240CCGGAGCAGG CCCGTCTGGC CCTGACCCTG GCCGCCGCCG AGAGCGAGCG CTTCGTCCGG300CAGGGCACCG GCAACGACGA GGCCGGCGCG GCCAACGCGG GCCCGGCGGA CAGCGGCGAC360GCCCTGCTGG AGCGCAACTA TCCCACTGGC GCGGAGTTCC TCGGCGACGG CGGCGACGTC420AGCTTCAGCA CCCGCGGCAC GCAGAACTGG ACGGTGGAGC GGCTGCTCCA GGCGCACCGC480CAACTGGAGG AGCGCGGCTA TGTGTTCGTC GGCTACCACG GCACCTTCCT CGAAGCGGCG540CAAAGCATCG TCTTCGGCGG GGTGCGCGCG CGCAGCCAGG ACCTCGACGC GATCTGGCGC600GGTTTCTATA TCGCCGGCGA TCCGGCGCTG GCCTACGGCT ACGCCCAGGA CCAGGAACCC660GACGCACGCG GCCGGATCCG CAACGGTGCC CTGCTGCGGG TCTATGTGCC GCGCTCGAGC720CTGCCGGGCT TCTACCGCAC CAGCCTGACC CTGGCCGCGC CGGAGGCGGC GGGCGAGGTC780GAACGGCTGA TCGGCCATCC GCTGCCGCTG CGCCTGGACG CCATCACCGG CCCCGAGGAG840GAAGGCGGGC GCCTGGAGAC CATTCTCGGC TGGCCGCTGG CCGAGCGCAC CGTGGTGATT900CCCTCGGCGA TCCCCACCGA CCCGCGCAAC GTCGGCGGCG ACCTCGACCC GTCCAGCATC960CCCGACAAGG AACAGGCGAT CAGCGCCCTG CCGGACTACG CTAGCCAGCC CGGCAAACCG 1020CCGAAAGATG AACTG1035(a)序列特征*长度1035碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源绿脓杆菌外毒素A(Pseudomonas exotoxin A)(3)构建表达IL-4(13D)-PE38A融合基因的工程菌提取质粒pET32-IL-4(13D)-PE38A，转化E.coliAD494(DE3)，挑取转化子，接种于LB液体培养基，提取转化子的质粒，用Nco I和HindIII对质粒双酶切，产生约1400bp的DNA片段，证实了该转化子是所要的工程菌。
取AD494(DE3)工程菌单菌落接种于LB培养基，37℃过夜培养；次日，以1％接种量转接于新鲜LB培养基；当OD600达到0.6～0.8时，加入1.0mmol/L的IPTG诱导，于37℃表达4小时；1ml发酵液的菌体离心，悬于1倍SDS样品加样液，沸水浴煮10分钟，12000g离心2分钟，取15μl进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，结果用紫外凝胶成像系统检测蛋白的表达。
结果在工程菌的细胞全蛋白电泳谱中有一明显表达带，见图2，分子量约64000dalton(由于pET-32a(+)载体表达蛋白N端含有一个硫氧还蛋白，此硫氧还蛋白分子量为11000dalton，故得到的融合蛋白分子量为约为64000dalton)；紫外凝胶成像系统扫描显示此表达蛋白占菌体总蛋白的30％。
SEQUENCE LISTING<110>中国科学院沈阳应用生态研究所<120>一种白介素-4突变基因IL-4-13及其制备和应用<130>
<160>3<170>PatentIn vetsion 3.1<210>1<211>405<212>DNA<213>人〔Homo sapiens〕<220>
<221>misc-difference<222>(1)..(405)<223>
<400>1atggacacaa ctgagaagga aaccttctgc agggctgcga ctgtgctccg gcagttctac 60agccaccatg agaaggacac tcgctgcctg ggtgcgactg cacagcagtt ccacaggcac120aagcagctga tccgattcct gaaacggctc gacaggaacc tctggggcct ggcgggcttg180aattcctgtc ctgtgaagga agccaaccag agtacgttgg aaaacttctt ggaaaggcta240aagacgatca tgagagagaa atattcaaag tgttcgtccg gaggtaacgg cggtcacaag300tgcgatatca ccttacagga gatcatcaaa gatttgaaca gcctcacaga gcagaagact360ctgtgcaccg agttgaccgt aacagacatc tttgctgcct ccaag405<210>2<211>1035<212>DNA<213>绿脓杆菌〔Pseudomonas aeruginosa〕<220>
<221>misc-difference<222>(1)..(1035)<223>
ggcggcagcc tggccgcgct gaccgcgcac caggcttgcc acctgccgct ggagactttc 60acccgtcatc gccagccgcg cggctgggaa caactggagc agtgcggcta tccggtgcag120cggctggtcg ccctctacct ggcggcgcgg ctgtcgtgga accaggtcga ccaggtgatc180cgcaacgccc tggccagccc cggcagcggc ggcgacctgg gcgaagcgat ccgcgagcag240ccggagcagg cccgtctggc cctgaccctg gccgccgccg agagcgagcg cttcgtccgg300cagggcaccg gcaacgacga ggccggcgcg gccaacgcgg gcccggcgga cagcggcgac360gccctgctgg agcgcaacta tcccactggc gcggagttcc tcggcgacgg cggcgacgtc420agcttcagca cccgcggcac gcagaactgg acggtggagc ggctgctcca ggcgcaccgc480caactggagg agcgcggcta tgtgttcgtc ggctaccacg gcaccttcct cgaagcggcg540caaagcatcg tcttcggcgg ggtgcgcgcg cgcagccagg acctcgacgc gatctggcgc600ggtttctata tcgccggcga tccggcgctg gcctacggct acgcccagga ccaggaaccc660gacgcacgcg gccggatccg caacggtgcc ctgctgcggg tctatgtgcc gcgctcgagc720ctgccgggct tctaccgcac cagcctgacc ctggccgcgc cggaggcggc gggcgaggtc780gaacggctga tcggccatcc gctgccgctg cgcctggacg ccatcaccgg ccccgaggag840gaaggcgggc gcctggagac cattctcggc tggccgctgg ccgagcgcac cgtggtgatt900ccctcggcga tccccaccga cccgcgcaac gtcggcggcg acctcgaccc gtccagcatc960cccgacaagg aacaggcgat cagcgccctg ccggactacg ctagccagcc cggcaaaccg 1020ccgaaagatg aactg1035<210>3<211>1458<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc-difference<222>(1)..(1458)<223>
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ccgccgaaag atgaactg
权利要求
1.一种IL-4突变基因IL-4-13，其特征在于具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列。
2.一种权利要求1所述IL-4突变基因IL-4-13的制备，其特征在于以人的IL-4基因为模板，通过两轮overlap PCR进行基因重组和点突变；第一轮PCR反应扩增出相当于天然人IL-4分子成熟蛋白38～129-GGNGG-1～37；第二轮PCR反应在相当于天然人IL-4分子成熟蛋白第13位氨基酸处引入一个点突变，即13Thr→Asp。
3.一种权利要求1所述IL-4突变基因IL-4-13的应用，其特征在于以IL-4(13D)和细胞毒素连接获得融合基因，所述细胞毒素为超抗原、核糖体延伸因子-2抑制剂或它们的突变体。
4.按照权利要求3所述IL-4突变基因IL-4-13的应用，其特征在于所述细胞毒素为绿脓杆菌外毒素A突变基因，其具有序列表SEQ ID NO2中碱基序列。
5.按照权利要求3所述IL-4突变基因IL-4-13的应用，其特征在于所述获得的融合基因具有序列表SEQ ID NO3中碱基序列。
全文摘要
本发明涉及基因重组技术，具体地说是一种白介素－4(IL－4)突变基因IL－4(13D)及其制备和应用，突变基因IL－4(13D)具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列；是以天然的人IL－4基因为基础，利用重叠PCR，对其基因上的碱基进行重组和点突变获得。主要特点是表达的融合蛋白与IL－4R的亲和力高，可用于杀伤表面含有IL－4R的肿瘤细胞，用于抗肿瘤靶向药物的研究。
文档编号C12P19/34GK1609227SQ200310104928
公开日2005年4月27日 申请日期2003年10月24日 优先权日2003年10月24日
发明者吴文芳, 崔京霞, 吕安国, 倪剑锋 申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所