专利名称：一种生产视紫红质蛋白的方法及其专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物生物技术和新材料技术领域中一种生产视紫红质蛋白的方法及其专用菌株。
背景技术：
光敏蛋白是一类具有重要生物功能的蛋白质，也是较早研究的一类生物纳米材料，它接受光后，内部构象发生改变，从而带来一系列效应。视紫红质蛋白是人们发现的第一种含视黄醛的光敏蛋白。它位于动物视觉器官的感光细胞中，将接受的光信号转变为电信号。1971年Oesterhelt和Stoeckenius在嗜盐菌(Halobacteriumsalinarum)中发现了一种含视黄醛的膜蛋白，命名为细菌视紫红质蛋白(bacteriorhodopsin)。细菌视紫红质(BR)是一种具有特别机构和功能的光敏蛋白，它具有独特的光驱动质子泵功能(即在光照下，构型发生一系列变化，导致质子跨膜运输，在膜两侧产生电化学能，由ATP合成酶合成ATP)、优良的光致变色特性、超快速的光电响应特性，还具有自组装和自修复功能，同时具有极好的稳定性，如在140℃的高温和失水状态下以及很宽的pH范围的环境中仍然具有活性，加上产生视紫红质的微生物易于培养、视紫红质的分离、纯化过程简单，视紫红质可进行化学修饰和分子改性，所以它一直被认为在仿生物视觉，光存储器件，光计算机，光显示器件，传感等方面具有重大的应用价值，并将产生巨大的经济和社会效益。Syracuse大学的Birge教授的研究小组利用BR已研究出海量三维存储器和用于神经网络与并行计算中的相关存储器的原型器件。
目前使用的用于纳米材料的视紫红质均是由盐杆菌属的菌株(Halobacteriumsalinarum)产生的，此菌株产生的细菌视紫红质具有光电响应性质和光循环特性。尽管BR有望成为具有实际应用价值的生物纳米材料，但它仅仅是成千上万种有可能成为生物纳米的生物大分子中的一员，开发和研究特性更好，功能更优的其他纳米材料具有十分重要的意义。
发明创造内容本发明的目的是提供一种能够产生视紫红质蛋白的菌株。
能够产生视紫红质蛋白的菌株是红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1，已于2003年11月25日保藏于中国普通菌种保藏中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC №1040。
红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1 CGMCC №1040自新疆硝尔库勒盐湖分离得到。具有以下特征(1)菌落特征在B培养基平板上培养5天的菌落大小直径为1-2mm，菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，凸起，红色。
(2)细胞形态特征适宜于pH7.0-8.0范围内40℃高盐浓度3.1-3.4M培养，细胞为短杆状，有鞭毛，革兰氏染色阴性，细胞大小为0.6μm×2.0μm。
(3)生理生化特征好氧生长，接触酶和氧化酶阳性，不水解淀粉和酪素，可利用葡萄糖、半乳糖、木糖和甘油。可利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖和木糖产酸。
(4)16S rRNA基因序列特征其16S rDNA具有如序列表中序列1所示的核苷酸序列。
本发明的第二个目的是提供一种生产视紫红质蛋白的方法。
本发明所提供的生产视紫红质蛋白的方法，是培养红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1 CGMCC №1040，并自菌体中提取视紫红质蛋白。
培养红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1 CGMCC №1040的培养基，可采用包括碳源、氮源和无机盐在内的通常用于培养细菌的培养基；优选为包括Na+浓度为3.1-3.4M、pH7.0-8.0的细菌培养基，如含有如下组分的培养基酪蛋白水解物(Casmino acids)1g/L，酵母抽提物1g/L，柠檬酸钠3.0g/L，KCl 2.0g/L，MgSO4.7H2O10g/L，FeSO4.7H2O 0.005g/L，葡萄糖10g/L，MnSO4.7H2O 0.2mg/L，NaCl 200g/L。固体培养基中加入1.5g％的琼脂。培养温度可为10-54℃，优选为40℃；培养时间可为72-120小时，优选为96小时。
本发明通过培养红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1 CGMCC №1040得到了视紫红质蛋白，红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1 CGMCC №1040与盐杆菌属的菌株(Halobacterium salinarum)相比，生长速度要快于(Halobacterium salinarum)，这样可以缩短生长周期。本发明的菌株产生的视紫红质蛋白具有光电响应性质和光循环特性，可以用于新型的纳米材料进一步研究。
图1为视紫红质蛋白的分离提取过程示意2为视紫红质蛋白M412中间态的闪光光解光谱图3为视紫红质蛋白在白光照射下光学性质图4为视紫红质蛋白在绿光照射下光学性质具体实施方式
实施例1、红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1 16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1接种于高盐平板(实施例2的培养基+1.5％琼脂粉)，从平板中直接挑取一环菌体，加入100μL无菌重蒸水中，漩涡混匀后，沸水浴2min，12000r/min离心5min，上清液直接用于PCR。用于16S rDNA扩增的PCR反应的引物为一对通用引物。正向引物Pf5’ATT CCG GTT GAT CCT GCCGGA 3’；反向引物Pr5 ’AGG AGG TGA TCC AGC CGC AG 3’，分别对应于大肠杆菌的16S rRNA基因的8-27和1495-1514碱基。PCR反应体系(50μL)为10×缓冲液5μL、25mmol/L MgCl24μL、10mmol/L dNTPs 1μL、30pmol/L引物各1μL、BSA 0.5μL、ddH2O 37μL、Taq DNA酶0.4μL。PCR反应条件为95℃ 4min，95℃ 1min，48℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min，4℃保存。PCR产物的纯化和测序由上海申能博彩生物科技有限公司完成。16S rDNA基因序列长度为1412bp，与菌株Halorubrum trapanicum的16S rDNA(GenBank登录号为X82168)序列的相似性为98％。其16S rDNA的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
实施例2、培养红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1生产视紫红质蛋白1)培养基(B培养基)酪蛋白水解物(Casmino acids)1g/L，酵母抽提物1g/L，柠檬酸钠3.0g/L，KCl2.0g/L，MgSO4.7H2O 10g/L，FeSO4.7H2O 0.005g/L，葡萄糖10g/L，MnSO4.7H2O0.2mg/L，NaCl 200g/L。
2)将红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1 CGMCC № 1040接种于1)中的培养基中，在40℃培养96小时，其中，在前48小时，通气量大，以HYG-A全温摇床进行转速150rpm摇育，后48小时限氧培养，转速90rpm，然后按照图1所示的分离步骤提取视紫红质蛋白，结果表明每1000ml的培养基可产生5.6mg视紫红质蛋白。
在光的照射下，视紫红质蛋白发生一系列构型的变化，产生光循环的中间态，采用闪光光解技术测定红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1产生的视紫红质蛋白在光循环中的中间态之一M412状态的光吸收特性，结果如图2所示，可以看到明显的吸收峰，这证明红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1产生的视紫红质蛋白具有光循环的特性，所提取的产物为视紫红质蛋白。
在光的照射下，视紫红质蛋白可通过H+的运输产生光电流，按常规方法测定在白光和绿光照射下红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1的视紫红质蛋白产生的光电流，结果分别如图3和图4所示，表明产生了光电流。
序列表<160>1<210>1<211>1301<212>DNA<213>红皮嗜盐菌属(Halorubrum sp.)<400>1gctcagtaac acgtggccaa actacccttc ggaacacaat accctcggga aactgaggct60aatagtgtat accataccac cactggaatg agtggtatgc caaacgctcc ggcgccgaag 120gatgtggctg cggccgatta ggtagacggt ggggtaacgg cccaccgtgc caataatcgg 180tacgggtcat gagagtgaga acccggagac ggaatctgag acaagattcc gggccctacg 240gggcgcagca ggcgcgaaac ctttacactg cacgacagtg cgataggggg atcccaagtg 300cacaggcata gcgcctgtgc ttttcggtac cgtaaggtgg taccagaata agggctgggc 360aagaccggtg ccagccgccg cggtaatacc ggcagcccaa gtgatggccg atcttattgg 420gcctaaagcg tccgtagctg gccgcgcaag tccatcggga aatccacctg ctcaacaggt 480gggcgcccgg tagaaactgc gtggcttggg accggaaggc gcgacgggta cgtccggggt 540aggagtgaaa tcccgtaatc ctggacggac cgccgatggc gaaagcacgt cgcgagaacg 600gatccgacag tgagggacga aagccagggt ctcgaaccgg attagatacc cgggtagtcc 660tggccgtaaa caatgcctgc taggtgtggc tcccactacg agtgggtgct gtgccgtagg 720gaagccgcta agcaggccgc ctgggaagta cgtccgcaag gatgaaactt aaaggaattg 780gcgggggagc actacaaccg gaggagcctg cggtttaatt ggactcaacg ccggacatct 840caccagcatc gactgtaata atgacgacca ggttgatgac cttgtccgag tttcagagag 900gaggtgcatg gccgccgtca gctcgtaccg tgaggcgtcc tgttaagtca ggcaacgagc 960gagacccgca tccttacttg ccagcagtac cgcgaggtag ctggggacag tagggagacc 1020gccgtggcta acacggagga aggaacgggc aacggtaggt cagtatgccc cgaatgtgct 1080gggcaacacg cgggctacaa tggtcaggac aaagggttcc tactccgaaa ggagacggta 1140atctcagaaa cctgatcgta gttcggattg tgggctgcaa ctcgcccaca tgaagctgga 1200ttcggtagta atcgcgtgtc acaagcgcgc ggtgaatacg tccctgctcc ttgcacacac 1260cgcccgtcaa agcacccgag tgaggtccgg atgaggcgta c 130权利要求
1.红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1 CGMCC №1040。
2.一种生产视紫红质蛋白的方法，是培养红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1CGMCC №1040，并自菌体中提取视紫红质蛋白。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于培养红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1 CGMCC №1040的培养基为包括Na+浓度为3.1-3.4M、pH7.0-8.0的细菌培养基。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于培养红皮嗜盐菌(Halorubrumsp.)BD-1 CGMCC №1040的培养基为酪蛋白水解物(Casmino acids)1g/L，酵母抽提物1g/L，柠檬酸钠3.0g/L，KCl 2.0g/L，MgSO4.7H2O 10g/L，FeSO4.7H2O 0.005g/L，葡萄糖10g/L，MnSO4.7H2O 0.2mg/L，NaCl 200g/L。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于培养红皮嗜盐菌(Halorubrumsp.)BD-1 CGMCC №1040的温度为10-50℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于培养红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1 CGMCC №1040的温度为40℃。
7.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于培养红皮嗜盐菌(Halorubrumsp.)BD-1 CGMCC №1040的时间为72-120小时。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于培养红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD-1 CGMCC №1040的时间为96小时。
全文摘要
本发明公开了一种生产视紫红质蛋白的方法及其专用菌株。本发明所提供的生产视紫红质蛋白的菌株为红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD－1 CGMCC № 1040。生产视紫红质蛋白的方法，是培养红皮嗜盐菌(Halorubrum sp.)BD－1 CGMCC № 1040，并自菌体中提取视紫红质蛋白。本发明的菌株产生的视紫红质蛋白具有光电响应性质和光循环特性，可以用于新型的纳米材料进一步研究。
文档编号C12P21/00GK1626649SQ20031011829
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月11日 优先权日2003年12月11日
发明者刘双江, 冯婕, 周培瑾, 刘志培 申请人:中国科学院微生物研究所