专利名称：一种调控木质素合成相关酶基因的启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物启动子及其应用，特别是涉及一种调控木质素合成相关酶基因C4H的启动子及其应用。
背景技术：
木质素是植物体中含量仅次于纤维素的一类高分子有机物质，陆生植物的木质素合成是适应陆地环境的重要进化特征之一。木质素为植物提供机械支持，保护植物免受真菌入侵，其疏水性保证了水分在植物体内的正常运输。然而它的存在不利于生产应用，在制浆造纸中，为去除木质素所采取的化学处理不仅费用昂贵，且对环境造成的危害极大；牧草中的木质素含量与其对牲畜的消化性呈负相关。因此，通过基因工程降低植物木质素含量具有重大的环保效益与经济意义(Douglas C J，etal.，1996，Trends Plant Sci，1171-178；Chemey，魏建华等.植物学报，2001，43(9)771-779.)。
我国森林资源匮乏，林木生产已经远远不能满足纸浆生产，至今我国造纸原料仍以草浆生产为主，这类原料加工容易，但产生的造纸废水极难处理，只好排放到江河湖海中，污染后果触目惊心，而且国家每年需消耗巨额外汇进口木浆。解决原料与生产的供需矛盾，维持原有生态平衡的关键，就是从林木育种开始，大力培育适用造纸的用材林。传统育种技术周期长，性状不易控制，不能在较短时间内解决我国造纸原料问题，若将基因工程与常规育种技术相结合，定向改良林木品质，则可大大缩短育种周期，同时也避免了大量人力和物力消耗，能更快更好地培育出适合造纸的新品种资源，以缓解我国林木供应和造纸生产间日趋突出的矛盾。此外，也会极大缩减用于治理污染的费用，达到经济、社会和环保效益相统一。因此利用生物技术手段调控植物中木质素生物合成代谢途径、培育低污染的造纸资源植物具有极大的应用前景。
目前人们从许多植物中分离了多种与木质素合成相关酶的编码基因及启动子序列，且已开始进行木质素合成调控的研究，并取得了一些进展(Higuchi T，et al.1994.J Biotechnol 37151-158；Lee D，et al.，1997，Plant Cell，9，1985-1998；Hu W J，et al，999，Nat Biotch.17，808-812；Guo D J，et al.，2001，Plant Cell，1373-88；Goujon T.，et al.，2003，Planta 217218-228.)。在此类研究中使用较多的仍是组成型启动子CaMV35S启动子，尽管该启动子表达效率强，然而由于其表达不受时空限制，在调控木质素合成代谢过程中，会驱动基因在一些非木质化的部位表达，既消耗生物能源，同时会导致一些可能对植物生长发育产生不利影响的代谢产物的合成。若选择木质部特异性启动子，有助于定时定向调控木质素合成途径，既节约能源，保证了植物正常生理活动不受干扰，同时又能有效地服务于生产。
肉桂酸4-羟基化酶(C4H)是一种细胞色素P450单氧化物酶，催化苯丙酸途径中的第一个氧化反应，即将反式-肉桂酸催化生成对-香豆酸。与苯丙氨酸裂解酶(PAL)和4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)一起，参与碳向木质素、软木脂、类黄酮等各种重要酚类物质的转换合成过程(Chapple C，1998.Annu Rev Plant Physiol PlantMol Biol，49311-343)。目前C4H基因已从许多植物中分离，多数基因编码的氨基酸序列具有85％以上的同源性。该酶的表达受多种因子调控，如光、受伤、激发子、病原菌侵染等，同时它与植物的木质化进程密切相关(Chapple C，1998.Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol，49311-343)。欧芹中C4H表达模式研究结果显示，该酶在维管束发达的花梗中表达丰富，在幼叶和老叶中不表达(Koopmann E，et al，1999.Plant Physiol，11949-56)，拟南芥中C4H基因于正在木质化的细胞中表达最强(Bell-Lelong DA，et al，1997.Plant Physiol 113729-738)。
发明创造内容本发明的目的是提供一种调控木质素合成相关酶基因C4H的启动子。
本发明所提供的调控木质素合成相关酶基因C4H的启动子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
序列表中SEQ ID №1的DNA序列由1117个碱基组成；序列表中序列1的自5′端第212-219位碱基为转录因子Myb26的结合位点GTTAGGTT，自5′端第910-917位碱基为转录因子MYB的结合位点CACCAACC。
含有所述木质素合成相关酶基因C4H启动子的表达盒、表达载体、细胞系和转基因株系也属于本发明的保护范围。
本发明的发明人设计引物，以毛白杨基因组DNA为模板，利用PCR方法从毛白杨中分离了与木质素合成酶相关基因C4H启动子，并初步研究了其在植物中的表达特性。实验证明本发明的启动子使荧光素酶报道基因只在维管束部位特异性表达。本发明的启动子分离及其功能的阐明，为将来应用于林木材性改良的研究奠定了基础，在培育更适于造纸用资源树种、低污染的造纸资源植物具有极大的应用前景。
图1为从毛白杨基因组DNA中PCR扩增C4H启动子的电泳图谱图2为C4H启动子融合GUS基因的植物表达载体PC4H构建过程示意3为植物表达载体PC4H鉴定图谱图4为C4H启动子与CCoAOMTcDNA融合的植物反义表达载体PC4HCOA构建过程示意5为植物反义表达载体PC4HCOA鉴定图谱图6a为转化PC4H载体的烟草威斯康辛38的PCR鉴定图谱图6b为转化PC4HCOA载体的烟草威斯康辛38的PCR鉴定图谱图7a为C4HGUS基因在转基因烟草威斯康辛38叶柄中的GUS活性染色结果图7b为C4HGUS基因在转基因烟草威斯康辛38茎中的GUS活性染色结果图8为C4HGUS基因在转基因烟草威斯康辛38各组织GUS荧光活性测定的柱状图具体实施方式
实施例1、毛白杨C4H启动子序列的分离1、启动子引物设计依据文献(Kawai S，et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.1996，60(10)，1586-1597)，设计启动子引物，并在其上依次添加两个酶切位点PstI和XbaI(下划线所示)，以便于载体构建。该启动子正向引物为5’-CTCTGCAGCC AAGTTAGCCAGACATG-3’(PstI)，反向引物为5’-CCCATCCAAC CATCACTCTCTAGAAC-3’(XbaI)。
2、PCR扩增C4H启动子序列CTAB小量提取法从毛白杨中分离基因组DNA，引物如前设计，反应程序95℃5min；95℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃，7min。分离的目标条带大约1kb，如图1所示，测序结果表明木质素合成相关酶基因C4H启动子序列大小为1117bp。图1中，泳道1为分子量标准，泳道2为C4H基因的启动子。
对该序列进行序列分析，结果表明该启动子包含转录因子MYB的结合位点CACCAACC(自5′端第910-917位碱基)和转录因子Myb26结合位点GTTAGGTT(自5′端第212-219位碱基)。前一序列在与苯丙氨酸代谢及木质素生物合成相关酶的编码基因启动子序列中都有分布；后一序列推测可能是苯丙酸合成相关酶基因启动子中的一个顺式反应元件。这些保守序列的存在与C4H参与苯丙酸代谢合成途径的生物学功能相吻合。
实施例2、毛白杨C4H启动子融合GUS基因的植物表达载体构建C4H启动子融合GUS基因的植物表达载体PC4H构建过程如图2所示，具体步骤如下用PstI和XbaI酶切该启动子片段后，插入经相同酶消化的质粒pSK中，获得质粒pSK-C4H。再用HindIII和XbaI同时酶切该质粒以及PBI121，将包含C4H启动子的酶切片段连入切除CaMV35S的PBI121中，构建成植物表达载体pC4H。对植物表达载体pC4H进行PCR及酶切鉴定，结果如图3所示，表明PC4H载体构建准确无误，图3中，带1是DL15000 Marker；带2是以C4H正向和反向引物(见实施例1)扩增得到的片段，约1.1kb；带3是XbaI和HindIII进行鉴定的酶切图谱，切出1.1kb的目标条带；带4是PstI单酶切鉴定结果，切出约2.0kb，5.0kb和8.0kb三条目的条带。
实施例3、毛白杨C4H启动子与CCoAOMTcDNA反向连接的植物反义表达载体构建C4H启动子与CCoAOMTcDNA融合的植物反义表达载体PC4HCOA构建过程如图4所示，具体过程如下将CCoAOMTcDNA片段用XbaI和平端酶Hinc II从载体质粒PMD-COA(魏建华，等。植物学报，2001，43(11)1179-1183)。中切下，然后连入用XbaI和平端酶EcoICRI切除GUS基因的质粒pC4H中，完成植物反义表达载体PC4HCOA的构建。对植物反义表达载体PC4HCOA进行PCR及酶切鉴定，结果如图5所示，图5中，带1是Marker；带2是以CCoAOMTcDNA正向引物和反向引物(魏建华，等。植物学报，2001，43(11)1179-1183)。
PCR扩增结果，得到一条约0.75kb目的片段；带3是以C4H启动子正向和反向引物(见实施例1)PCR扩增得到的目的片段约1.1kb；带4是用XbaI和HindIII进行鉴定的酶切图谱，切出0.5kb和1.1kb的目标条带；带5是EcoRI酶切鉴定结果，得到一条目的片段约2.1kb，这些结果表明表达载体PC4HCOA载体构建正确。
实施例4、转化植株的PCR鉴定结果用冻融法将实施例2和实施例3构建的表达载体导入农杆菌中转化烟草威斯康辛38，以SDS小量提取法提取的转化植株的DNA为模板进行PCR鉴定，其中转化PC4H载体的烟草威斯康辛38鉴定所用引物为GUS正向引物5’-GTGGAATTGATCAGCGTTGGTG-3’和反向引物5’-GGTCGCGAGTGAAGATCCCT-3’，鉴定转化PC4HCOA载体的烟草威斯康辛38使用的引物为C4H5’正向引物5’-TCTGCAGCCAAGTTAGCCAGACATG-3’和CCoAOMTcDNA正向引物(魏建华，等。植物学报，2001，43(11)1179-1183)。结果如图6a和图6b所示，图6a表明转化PC4H载体的烟草威斯康辛38扩增出一约1.8kb的片段，图6b表明转化PC4HCOA载体的烟草威斯康辛38扩增出一约为1.8kb片段；说明转化植株扩增出与阳性质粒同样片段，阴性对照中无特异片段出现，初步表明已获得转基因植株。图6a和图6b中，带1是marker，带2是阳性质粒，带3是未转化植株；带4-8是转化植株。
实施例5、转基因烟草威斯康辛38的组织化学分析鉴定将PCR呈阳性的植株进行组织化学染色。具体步骤将植物材料投入GUS染液(100mmol/L Na3PO4(PH7.0)；0.1％ritonX-100；10mmol/L EDTA；0.5mmol/L铁氰化钾；0.5mmol/L亚铁氰化钾；1mg/ml X-Gluc)中，抽气5分钟，然后置于37℃温育过夜，观察蓝色反应。染色后的组织用FAA固定液脱色。结果如图7a和图7b所示，图7a表明木质部中导管和射线薄壁细胞均产生很强信号，其他部位如形成层、韧皮部和髓均未着色；图7b表明转基因烟草威斯康辛38茎的木质部均染成兰色，其他部位未产生信号。说明该启动子表达具有一定的组织特异性，主要在木质部表达。
实施例6、转基因烟草威斯康辛38各组织GUS荧光活性测定按常规方法将成熟的转基因烟草威斯康辛38各部位进行荧光活性测定分析。结果如图8所示，表明木质化的组织中GUS表达活性高，如茎、根和花柱；在花瓣和去除主脉的叶中表达量低。其中在茎中，C4H启动子的表达随组织木质化程度的增高呈逐渐上升的趋势，表明该启动子的表达与植物木质化进程密切相关。图8中，1s，3s，5s，7s和9s分别表示从茎的顶端向下依次为第一、三、五、七、九节茎的茎间。
序列表<160>1<210>1<211>1117<212>DNA<213>杨属毛白杨(Populus tomentosa Carr)<400>1ctctgcagcc aagttagcca gacatgaaaa ggtgagaaaa acattttttg acataagaaa 60ctaacgttgc ttggatttaa gatagaatta ttgaccttgt aagaagacaa acgtattctt 120ggaaattaac atgtattaat aaatgcaaag tagtttgtca cactatggga taaaatctct 180aataaaaagt aagaccttat agtttcaaga ggttaggttg atatttaaag agagatttct 240tttataactt tttaggttga aatcttgaaa ttaatattaa aaagatttgt taatcatttt 300cttttaaata ctttggattg atgccagggg tttacattta aaattattct taaatgaaac 360ttgatggtgt gtgtttgata ttgtattttc acatgttttt aaaatgaatt tgtttttaaa 420aaatatcaaa ttaataattt ttttattttt tttcaaagat tttaatgtat taattttaaa 480aataaaataa aaattatttt aatatatttt taaataaaaa atattttcaa ataaaaaaat 540taaaaaataa aaagatagga aaaaaacttt cttggttgag ggcctcattc cttgaaattt 600aagaaagcgt ttgggaactc ggtgcaaacc gtgttcctat taaatttgaa tttttttttg 660ttaaaattta atgcggttta tattttttgg atcgttttga tgtgctgata tcaaaaataa 720ttttaaaaaa ataaaaaaaa ttattaatat gtatttcaac acgaaaagtt atttgaaaaa 780caatcaccac cccattgatt cacacgttct aaattatcat aaattagtgg cgcccacatt 840acatcttgaa tagaaataca aaaaggccag gcaaattaat taatatggtg accatatgac 900attttcagcc accaacccgc cttacctact actatccatg attatcaata acagtctcct 960accacctcaa atgtaacgcc gttaactctc tctctctccc ccacacacac aacccaacgc1020gtgaaattca acttcatttc ctctctaatt tttgcagctt ataaaaccca agctctcctc1080atcctgttgc tcccatccaa ccatcactct ctagaac 111权利要求
1.一种调控木质素合成相关酶基因C4H的启动子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于所述木质素合成相关酶基因C4H启动子是序列表中的SEQ ID №1。
3.根据权利要求2所述的启动子，其特征在于所述序列表中序列1的自5′端第212-219位碱基为转录因子Myb26的结合位点。
4.根据权利要求2或3所述的启动子，其特征在于所述序列表中序列1的自5′端第910-917位碱基为转录因子MYB的结合位点。
5.含有权利要求1所述的木质素合成相关酶基因C4H启动子的表达盒。
6.含有权利要求1所述的木质素合成相关酶基因C4H启动子的表达载体。
7.含有权利要求1所述的木质素合成相关酶基因C4H启动子的细胞系。
8.含有权利要求1所述的木质素合成相关酶基因C4H启动子的转基因株系。
9.权利要求1所述的木质素合成相关酶基因C4H启动子在培育造纸用资源植物中的应用。
10.权利要求1所述的木质素合成相关酶基因C4H启动子在培育造纸用资源树种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种木质素合成相关酶基因启动子及其应用。本发明所提供的木质素合成相关酶基因C4H启动子，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列。本发明的启动子分离及其功能的阐明，为将来应用于林木材性改良的研究奠定了基础，在培育更适于造纸用资源树种、低污染的造纸用资源植物具有极大的应用前景。
文档编号C12N15/63GK1626660SQ20031011829
公开日2005年6月15日 申请日期2003年12月11日 优先权日2003年12月11日
发明者宋艳茹, 赵华燕, 路静 申请人:中国科学院植物研究所