介导除虫菌素b2b1比例的除虫链霉菌基因的制作方法

专利名称：介导除虫菌素b2b1比例的除虫链霉菌基因的制作方法
技术领域：
本发明申请是申请号为99805027.X，发明名称为“介导除虫菌素B2∶B1比例的除虫链霉菌基因”，申请日为1999年1月25日的国际申请PCT/IB99/00130的分案申请。
1.发明领域本发明涉及除虫菌素的组合物及除虫菌素的生产方法，主要应用于动物健康领域。更具体地，本发明涉及包含有编码aveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子，该多核苷酸分子可被用于调整除虫链霉菌培养物发酵所产生的除虫菌素2类∶1类的比例，本发明还涉及筛选该多核苷酸分子的组合物及方法。本发明进一步涉及到载体，转化的宿主细胞，除虫链霉菌的新型突变株(其中aveC基因已经被突变以调整所产生的除虫菌素2类∶1类的比例)。
2.发明背景2.1.除虫菌素链霉菌可产生各种各样的次级代谢产物，其中包括除虫菌素，其含有一系列八种相关的能产生有效的抗蠕虫和杀昆虫活性的十六员的大环内脂类化合物，这八种截然不同但又密切相关的化合物主要指A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a及B2b。“a”系列化合物指的是天然除虫菌素，其在C25位的取代基为(S)-仲丁基，“b”系列化合物指的是C25位的取代基为异丙基的那些化合物。代号“A”及“B”指的是C5位取代基分别为甲氧基和羟基的除虫菌素；数字“1”指的是在C22位及C23位为双键的除虫菌素。而数字“2”为C22位有一个氢原子及在C23位有一个羟基的除虫菌素；在这些相关的除虫菌素中，B1型的除虫菌素被公认为具有最强的抗寄生虫和杀害虫活性，因而也是最具商业前景的除虫菌素。
除虫菌素及其通过除虫链霉菌菌株需氧发酵的生产方法在美国专利4,310,519及4,429,042中都已有描述。天然除虫菌素的生物合成被认为可以通过异丁酸及S-(+)-2-甲基丁酸的辅酶A硫代脂类似物内源性起始。
经过随机诱变进行菌株改进并联合使用外源提供的脂肪酸可以有效生产除虫菌素类似物。支链二氧酸脱氢酶缺陷的除虫链霉菌的突变体(bkd缺陷突变体)只有在补充有脂肪酸发酵时才能产生除虫菌素。筛选和分离支链脱氢酶活性缺陷的突变体(如除虫链霉菌，ATCC 53567)在欧洲专利(EP)276103中已有描述。在有外源提供的脂肪酸存在下发酵这些突变体的结果为对应于所使用的脂肪酸仅产生四种除虫菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸补充除虫链霉菌(ATCC 53567)发酵，结果产生天然除虫菌素A1a，A2a，B1a及B2a；用异丁酸补充发酵，结果产生天然除虫菌素A1b，A2b，B1b及B2b；而用环戊烷羧酸补充发酵，结果产生四种新型的环戊基除虫菌素A1，A2，B1及B2。
如果用其它脂肪酸补充发酵可以产生新的除虫菌素。通过筛选800多种潜在的前体，已经鉴定出60多种其它新的除虫菌素(例见Dutton等，1991，抗生素杂志，44357-365；和Banks等，1994，Roy.Soc.Chem.14716-26)。此外，5-O-甲基转移酶活性缺陷的除虫链霉菌突变体实际上只能产生B类除虫菌素，因而，同时缺少支链二氧酸脱氢酶及5-O-甲基转移酶活性的除虫链霉菌的突变体对应于补充发酵所用的脂肪酸仅生产出B类除虫菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸补充该双重突变体发酵，结果仅产生天然除虫菌素B1a及B2a，而用异丁酸或环戊烷羧酸补充发酵则可以分别产生天然除虫菌素B1b及B2b或新型环戊基B1及B2除虫菌素。而用环己烷羧酸补充该双重突变体菌是产生商业上重要的新型除虫菌素环己基除虫菌素B1(doramectin)的首选方法。该双重突变体如除虫链霉菌(ATCC53692)的分离及特性描述在欧洲专利申请EP 276103中。
2.2.参与除虫菌素生物合成的基因在很多情况下，涉及次生代谢产物生产的基因及编码一特定抗菌素的基因在染色体上的位置常常是簇集在一起的，例如，链霉菌聚酮化合物合成酶基因簇(PKS)(见Hopwood和Sherman，1990，遗传学年评，2437-66)。这样，通过生物合成途径进行基因克隆的一个策略是分离抗药性基因及然后检测染色体上相邻区域中其它与特定抗生素生物合成相关的基因。另外一种克隆重要代谢产物生物合成之相关基因的策略是突变体互补。例如，来自能产生特定代谢产物之生物的DNA文库部分被导入不产生该代谢产物的突变体和筛选产生该代谢产物的转化株。另外，利用来自于其它链霉菌的探针进行文库杂交已被用于鉴别及克隆生物合成途径中的基因。
涉及除虫菌素生物合成的基因(ave基因)，就象其它链霉菌次生代谢产物(例如，PKS)生物合成所需基因一样，同样簇集于染色体上。使用载体已成功克隆了许多ave基因以补充除虫菌素生物合成受阻的除虫链霉菌突变体。这些基因的克隆在美国专利5,252,474中已有描述。此外，Ikeda等，1995，抗生素杂志48532-534，描述了涉及C22，C23脱水步骤的染色体区域(aveC)定位在除虫链霉菌4.82Kb BamHI酶切片断上，并描述了产生单一组份B2a生产者的aveC基因突变。既然双氢除虫菌素，一潜在抗蠕虫化合物，能由除虫菌素B2a化学合成，该除虫菌素B2a的单一组分生产者被认为在商业上生产双氢除虫菌素是比较有用的。
可以使除虫菌素生产的复杂度最小化的aveC基因突变，例如，降低除虫菌素B2∶B1比率的突变的鉴定可以简化商业上重要的除虫菌素的生产及纯化。
3.发明简述本发明提供了分离的多核苷酸分子，其含有除虫链霉菌完整的aveC ORF基因或其实质性部分，该分离的多核苷酸分子缺少位于除虫链霉菌染色体上aveC ORF所处位置下游的下一个完整的ORF。本发明分离的多核苷酸分子优选包括同质粒pSE 186(ATCC 209604)的除虫链霉菌aveC基因产物编码序列相同的核苷酸序列，或者同图1(SEQ ID NO1)aveC ORF或其实质性部分相同的核苷酸序列。
本发明进一步提供了多核苷酸分子，其具有的核苷酸序列与质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌aveC基因产物编码序列同源或者同图1(SEQ ID NO1)中存在的aveC ORF的核苷酸序列或其实质性部分同源。
本发明进一步提供了多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列与质粒pSE 186(ATCC 209604)的aveC基因产物编码序列编码的氨基酸序列同源或者同图1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列或其实质性部分同源。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，其含有一编码AveC同系物基因产物的核苷酸序列。在优选的实施方案中，分离的多核苷酸分子含有编码吸水链霉菌AveC同系物基因产物的核苷酸序列，其中的同系物基因产物含有如SEQ ID NO4的氨基酸序列或其实质性部分。在优选的实施方案中，编码吸水链霉菌AveC同系物基因产物的本发明分离的多核苷酸分子含有SEQ ID NO3的核苷酸序列或其实质性部分。
本发明进一步提供了多核苷酸分子，其含有与SEQ ID NO3所示的吸水链霉菌核苷酸序列同源的核苷酸序列。本发明还提供了多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列编码的多肽与具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的吸水链霉菌AveC同系物基因产物同源。
本发明还提供了寡核苷酸，其与具有图1(SEQ ID NO1)或SEQ IDNO3所示核苷酸序列的多核苷酸分子杂交，或与具有图1(SEQ ID NO1)或SEQ ID NO3所示核苷酸序列的互补核苷酸序列的多核苷酸分子杂交。
本发明进一步提供了重组克隆载体及表达载体，它们可用于克隆或表达本发明的多核苷酸，包括含有除虫链霉菌的aveC ORF或者aveC同系物的ORF的多核苷酸分子。在一非限制性的实施方案中，本发明所提供的质粒pSE186(ATCC 209604)含有除虫链霉菌aveC基因完整的ORF。本发明进一步提供了转化宿主细胞，其含有本发明的多核苷酸分子或重组载体及由此得到的新的菌株或细胞系。
本发明进一步提供了基本上纯化或分离的重组表达的AveC基因产物或AveC同系物基因产物或其实质性部分及其同系物。本发明进一步提供了产生重组AveC基因产物的方法，所述方法包括在有利于生产重组AveC基因产物或AveC同系物基因产物的条件下，培养用重组表达载体转化的宿主细胞，并从细胞培养物中回收AveC基因产物或AveC同系物基因产物，其中所述重组表达载体所含有的多核苷酸分子的核苷酸序列可以编码AveC基因产物或AveC同系物基因产物，该多核苷酸分子与控制多核苷酸分子在宿主细胞中表达的一个或多个调控元件可操作相连。
本发明进一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列同质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列相同，或同如图1(SEQ ID NO1)所示的除虫链霉菌aveC ORF的核苷酸序列相同，但是其进一步包含一个或多个突变以使其中野生型的aveC等位基因已经失活且其表达的多核苷酸分子含有突变的核苷酸序列的除虫链霉菌菌株(ATCC53692)的细胞相对于仅表达野生型的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株(ATCC 53692)细胞而言，产生不同比例或量的除虫菌素。根据本发明，可使用这种多核苷酸分子生产除虫链霉菌新菌株，其与仅表达野生型的aveC等位基因的相同菌株相比较，除虫菌素的产量有可测的改变。在优选的实施方案中，这种多核苷酸分子可用于生产除虫链霉菌新菌株(其与仅表达野生型的aveC等位基因的相同菌株相比以减少的2类∶1类比例生产除虫菌素)。在进一步优选的实施方案中，这种多核苷酸分子可用于生产除虫链霉菌新菌株(其与仅表达野生型的aveC等位基因的相同菌株相比可以生产增加水平的除虫菌素)。在进一步优选的实施方案中，这种多核苷酸分子可用于生产除虫链霉菌新菌株(其中aveC基因已经失活)。
本发明提供了鉴别能够改变所产生的除虫菌素的比例和/或量的除虫链霉菌aveC ORF突变的方法。在优选的实施方案中，本发明提供了鉴别能够改变所产生的除虫菌素2类∶1类比例的aveC ORF突变的方法，所述方法包括(a)测定除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素2类∶1类的比例，所述细胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有编码突变的AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子被导入该细胞并在其中被表达；(b)测定与步骤(a)的除虫链霉菌相同的菌株细胞产生的除虫菌素2类∶1类的比例，但不同的是该细胞仅表达具有如图1(SEQ 1D NO1)所示的ORF的核苷酸序列或者与其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比较步骤(a)的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素2类∶1类的比例与步骤(b)的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素2类∶1类的比例，如果二者不同的话，则鉴定出能够改变除虫菌素2类∶1类比例的aveC ORF突变存在，在优选的实施方案中，除虫菌素2类∶1类的比例因突变而减少。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种鉴定能够改变所产生的除虫菌素量的aveC ORF突变或者包含有aveC ORF的基因构建体突变的方法，所述方法包括(a)测定除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的量，所述细胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有编码突变的AveC基因产物的核苷酸序列或含有编码AveC基因产物的核苷酸序列的基因构建体的多核苷酸分子被导入该细胞并在其中表达；(b)测定与步骤(a)的除虫链霉菌相同的菌株细胞产生的除虫菌素的量，但不同的是该细胞仅表达具有如图1(SEQ 1D NO1)所示的ORF的核苷酸序列或者与其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比较步骤(a)的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的量与步骤(b)的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的量，如果二者不同的话，则鉴定出能够改变除虫菌素量的aveC ORF突变或基因构建体突变存在。在优选的实施方案中，除虫菌素的量因突变而增加。
本发明进一步提供了重组载体，该载体可用于制备具有改变的除虫菌素产量的除虫链霉菌新菌株。例如，本发明提供了这样一种载体，其可用于将任一个包含有本发明的突变核苷酸序列的多核苷酸分子靶向除虫链霉菌染色体上的aveC基因位点，或者插入，或者以同源重组的方式取代aveCORF或其部分。然而，根据本发明，当插入到除虫链霉菌染色体上除aveC基因以外的位点时或者在除虫链霉菌细胞中以附加体的形式出现时，包含有本发明的突变核苷酸序列的多核苷酸分子在调控除虫菌素生物合成方面也起到一定作用。因此，本发明也提供了这样一种载体，其含有的多核苷酸分子含有本发明的突变核苷酸序列，可使用该载体将多核苷酸分子插入到除虫链霉菌染色体上除aveC基因以外的位点处，或者该载体可以附加体的形式出现。在优选实施方案中，本发明所提供的基因取代载体可被用于将突变的aveC等位基因插入到除虫链霉菌染色体上以产生新型的细胞株，其可以较仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株细胞以减少的2类∶1类比例生产除虫菌素。
本发明进一步提供了一种制备除虫链霉菌新菌株的方法，所述菌株包含有能够表达突变的aveC等位基因的细胞，其与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株细胞相比，所产生的除虫菌素的比例和/或量发生改变。在优选的实施方案中，本发明进一步提供了一种制备除虫链霉菌新菌株的方法，所述菌株包含有能够表达突变的aveC等位基因的细胞，其与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株细胞相比，所产生的除虫菌素的2类∶1类比例发生改变，所述方法包括用携有突变的aveC等位基因的载体转化除虫链霉菌菌株细胞，该突变的aveC等位基因编码的基因产物使得表达突变的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株细胞与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株细胞相比，所产生的除虫菌素的2类∶1类比例发生改变，选择转化细胞，该转化细胞产生的除虫菌素2类∶1类比例较仅表达野生型aveC等位基因的菌株细胞有所改变。在优选实施方案中，在新菌株细胞中，所产生的除虫菌素2类∶1类的比例有所减少。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了制备除虫链霉菌新菌株的方法，所述菌株包括能产生改变量的除虫菌素的细胞，所述方法包括用携有突变aveC等位基因或者含有该aveC等位基因的基因构建体的载体转化除虫链霉菌菌株细胞，其表达的结果使表达突变aveC等位基因或基因构建体的除虫链霉菌菌株细胞所生产的除虫菌素量较仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株细胞产生的除虫菌素的量有所改变，挑选已转化的细胞，该转化细胞产生的除虫菌素量较仅表达野生型aveC等位基因的菌株细胞产生的除虫菌素量有所改变。在优选实施方案中，在新菌株细胞中，所产生的除虫菌素的量有所增加。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了一种制备除虫链霉菌新菌株的方法，这些除虫链霉菌细胞中含有失活的aveC等位基因，所述方法包括用使得aveC等位基因失活的载体转化表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌菌株细胞，并且挑选其中aveC等位基因已经失活的转化细胞。
本发明进一步提供了除虫链霉菌新菌株，其含有的细胞已被任一含有本发明的突变核苷酸序列的多核苷酸分子或载体转化。在优选的实施方案中，本发明提供了除虫链霉菌新菌株，其含有的细胞表达了突变的aveC等位基因而不是野生型的aveC等位基因，或者同时表达突变的aveC等位基因和野生型的aveC等位基因，其中该新菌株细胞产生的除虫菌素的2类∶1类比例相对于仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株细胞而言有所改变。在更优选的实施方案中，新菌株细胞产生的除虫菌素的2类∶1类比例相对于仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株细胞而言有所降低。这种新菌株可用于大规模生产有商业应用价值的除虫菌素例如doramectin。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了除虫链霉菌新菌株，其含有的细胞可以表达突变的aveC等位基因或者含有aveC等位基因的基因构建体，而不是野生型的aveC等位基因，或者同时表达这两者，其结果是相对于仅表达野生型的aveC等位基因的相同菌株细胞产生的除虫菌素的量而言，含有该突变的aveC等位基因的细胞产生的除虫菌素的量有所改变。在优选的实施方案中，新细胞产生的除虫菌素的量有所增加。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了除虫链霉菌新菌株，其含有的细胞中aveC基因已失活。这种菌株不仅对它们产生的与野生型菌株所产生的不同谱的除虫菌素有用，对于本文所述的测定靶向或随机诱变的aveC基因是否影响除虫菌素产量的互补筛选试验也是非常有用的。
本发明进一步提供了生产除虫菌素的方法，所述方法包括在允许或者诱导除虫菌素生产的条件下，在培养基中培养除虫链霉菌菌株细胞，并从培养物中回收除虫菌素，所述细胞表达突变的aveC等位基因，与不表达突变aveC等位基因而仅表达野生型的aveC等位基因的相同菌株细胞相比，该突变等位基因编码的基因产物改变了表达突变的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的2类∶1类的比例。在优选的实施方案中，表达突变的细胞产生的除虫菌素的2类∶1类的比例有所减少。该方法提供了商业上有价值的除虫菌素例如doramectin的高效率的生产方法。
本发明进一步提供了生产除虫菌素的方法，所述方法包括在允许或者诱导除虫菌素生产的条件下，在培养基中培养除虫链霉菌菌株细胞，并从培养物中回收除虫菌素，所述细胞表达突变的aveC等位基因或含有aveC等位基因的基因构建体，与不表达突变aveC等位基因或基因构建体而仅表达野生型的aveC等位基因的相同菌株细胞相比，表达突变的aveC等位基因或基因构建体的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的量有所改变。在优选的实施方案中，表达突变或基因构建体的细胞产生的除虫菌素的2类∶1类的量有所减少。
本发明进一步提供了由表达本发明的突变的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的新的组合物，其中与仅表达野生型的aveC等位基因而不表达突变的aveC等位基因的除虫链霉菌的相同菌株细胞所产生的除虫菌素的2类∶1类的比例相比，其以减少的2类∶1类比例生产除虫菌素。这种新型的除虫菌素组合物可以存在于发酵培养液中或者从培养液中获得，并且可以部分或基本上纯化。
4.


图1.含有除虫链霉菌aveC ORF的DNA序列(SEQ ID NO1)及其推定的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图2.含有除虫链霉菌aveC基因完整的ORF的质粒载体pSE186(ATCC209604)。
图3.含有插入除虫链霉菌aveC ORF中的Sacc.Erythraea之ermE基因的基因取代载体pSE180(ATCC 209605)。
图4.用五种重叠的粘粒(即pSE65，pSE66，pSE67，pSE68，PSE69)克隆识别的，来自于除虫链霉菌的除虫菌素聚酮化合物合成酶基因簇的BamHI限制性酶切图谱。通时指出了pSE118及pSE119的关系。
图5.除虫链霉菌菌株的发酵产物的HPLC分析。通过与环己基B1的标准量比较进行峰定量。环己基B2的保留时间是7.4-7.7分钟，环己基B1的保留时间是11.9-12.3分钟。FIG.5A.除虫链霉菌菌株SE180-11，其具有失活的aveC ORF；FIG.5B.用pSE186(ATCC 209604)转化的除虫链霉菌菌株SE180-11；FIG.5C.用pSE187转化的除虫链霉菌菌株SE180-11；FIG.5D.用pSE188转化的除虫链霉菌菌株SE180-11。
图6.由除虫链霉菌aveC ORF编码的推定氨基酸序列(SEQ IDNO2)，灰产色链霉菌的aveC同系物的部分ORF(SEQ ID NO5)，及来自于吸水链霉菌的aveC同系物ORF(SEQ ID NO4)的比较。以粗体表示的缬氨酸残基是该蛋白质推定的起始位点。以大写字母表示的保守残基显示出全部三种序列中的同源性，以小写字母表示的保守残基显示出3种序列中的2种的同源性。这些氨基酸序列有近50％的序列同一性。
图7.含有来自于吸水链霉菌aveC同系物基因(其插入在除虫链霉菌的aveC ORF的BsaAI/KpnI位点)的564 bp的BsaAI/KpnI片段的杂合质粒构建体。
5.发明详述本发明涉及鉴定及表征具有编码除虫链霉菌AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子，构建可用于筛选突变的AveC基因产物对生产除虫菌素的影响的除虫链霉菌新菌株，并且发现某些突变的AveC基因产物可以降低除虫链霉菌产生的除虫菌素B2∶B1的比例。作为例子，本发明将在下文中描述具有与质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列相同的核苷酸序列，或者具有图1(SEQ ID NO1)的ORF的核苷酸序列的多核苷酸分子，及具有由此得来的突变核苷酸序列的多核苷酸分子。然而，本发明阐明的原理可被类似地应用于其它的多核苷酸分子，包括来自于其它链霉菌例如吸水链霉菌及灰产色链霉菌等的aveC同系物基因。
5.1.编码除虫链霉菌aveC基因产物的多核苷酸分子本发明提供了一种分离的多核苷酸分子，其包含有除虫链霉菌完整的aveC ORF或其实质性部分，该分离的多核苷酸分子缺少处于除虫链霉菌染色体中aveC ORF所处位置下游的下一个完整的ORF。
本发明分离的多核苷酸分子优选包括的核苷酸序列与质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物的编码序列相同，或者与图1(SEQ ID NO1)的ORF的核苷酸序列或其实质性部分相同。本文所用的含有编码除虫链霉菌AveC基因产物的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子的“实质性部分”指的是分离的多核苷酸分子，其至少包括图1(SEQ IDNO1)所示的完整的aveC ORF序列的约70％，并且编码功能等同的AveC基因产物。这里，“功能等同”的AveC基因产物被定义为基因产物，当其在其中天然aveC等位基因失活的除虫链霉菌菌株ATCC 53692中表达时，结果产生的除虫菌素与仅表达除虫链霉菌菌株ATCC 53692天然的野生型功能性aveC等位基因的除虫链霉菌菌株ATCC 53692产生的除虫菌素具有基本上相同的比例及量。
除了aveC ORF的核苷酸序列外，本发明分离的多核苷酸分子可以进一步包括天然侧翼于除虫链霉菌原位aveC基因的核苷酸序列，例如图1(SEQ ID NO1)所示的侧翼核苷酸序列。
本文所用的术语“多核苷酸分子”，“多核苷酸序列”，“编码序列”，“开放阅读框”及″ORF′″都意指出DNA分子和RNA分子，其可以是单链或者双链，其可以被转录或者翻译(DNA)，或者被翻译(RNA)成AveC基因产物，或者，如下所述，被翻译为AveC同系物基因产物，或被翻译成多肽(当置于适当调控元件的控制之下时，在适当宿主细胞表达系统中其与AveC基因产物或者AveC同系物基因产物同源)。编码序列包括但不限于原核序列，cDNA序列，基因组DNA序列，及化学合成的DNA和RNA序列。
如图1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列在bp位置42，174，177及180包含四个不同的GTG密码子。如下面第9部分所示，可构建aveC ORF(图1SEQ ID NO1)5′区域的多个缺失以帮助确定这些密码子中的哪些能在aveC ORF中用作蛋白质表达的起始位点。bp 42位置处第一个GTG位点的缺失并不能消除AveC的活性。此外，再缺失bp位置174，177及180的所有GTG密码子才能消除AveC的活性，这表明该区域对于蛋白质表达是必须的。本发明因此包括了不同长度的aveC ORF及其相应的多肽，所述aveCORF可以在如图1(SEQ ID NO1)所示的bp 174，177或者180 bp的任一GTG位点启动翻译。
本发明进一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列同质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列同源，或与图1(SEQ ID NO1)所示的除虫链霉菌aveC ORF核苷酸序列或其实质性部分同源。术语“同源”当用于指与除虫链霉菌AveC基因产物编码序列同源的多核苷酸分子时，意味着该多核苷酸分子具有的核苷酸序列(a)编码与质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列相同的AveC基因产物，或编码与图1(SEQ ID NO1)所示的除虫链霉菌的aveC ORF核苷酸序列所编码的相同的AveC基因产物，但其根据遗传密码的简并性对核苷酸序列作了一个或多个沉默改变；或者(b)在中度严紧的条件下，与下述多核苷酸分子的互补序列杂交，该多核苷酸分子含有的核苷酸序列编码由质粒pSE186(ATCC 209604)AveC基因产物编码序列所编码的氨基酸序列，或者编码图1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列，并编码如上文所定义的功能等同的AveC基因产物。所述中度严紧的条件也即在65℃下，0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA中与结合于滤膜上的DNA杂交，及在42℃下，在0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(例见Ausubel等(编)，1989，分子生物学最新方法，Vol.1，GreenPublishing Associates公司，和John Wiley & Sons公司，纽约，p.2.10.3)。在优选的实施方案中，同源的多核苷酸分子在高度严紧的条件下与质粒pSE186(ATCC 209604)中编码AveC基因产物的核苷酸序列的互补序列杂交，或者与图1(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列或其实质性部分的互补序列杂交，并编码如上文所定义的功能等同的AveC基因产物。高度严紧的条件指的是在65℃，0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA中与结合于滤膜上的DNA杂交，及在68℃下，在0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等，1989，见上文)。
如下文实施例所述，AveC基因产物及其潜在的功能等同物的活性可以通过用HPLC分析发酵产物的方式来测定。不管是天然的还是人工合成的，多核苷酸分子(其含有的核苷酸序列编码除虫链霉菌AveC基因产物的功能等同物)包括天然存在于除虫链霉菌其它菌株的AveC基因，存在于链霉菌其它种的aveC同系物基因及突变的aveC等位基因。
本发明进一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列所编码的多肽含有的氨基酸序列与质粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因产物编码序列编码的氨基酸序列，或与图1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列或其实质性部分有同源性。本文所用的图1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列的“实质性部分”指的是该多肽至少包括约70％的如图1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列，并且组成了如上所定义的功能等同的AveC基因产物。
本文用于指与来自于除虫链霉菌的AveC基因产物的氨基酸序列有同源性的氨基酸序列的术语“同源性”指的是质粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因产物编码序列编码的多肽，或含有如图1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列(但其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基保守取代，该保守取代的结果产生了如上所述的功能等同的基因产物)的多肽。保守的氨基酸取代是本领域众所周知的。进行这样的取代的规则描述于Dayhof，M.D.，1978，Nat.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.，Vol.5，Sup.3等。更具体地，保守的氨基酸取代一般发生在与酸性，极性，其侧链大小相关的氨基酸家族中。基因编码的氨基酸一般分为四组(1)酸性＝天冬氨酸，谷氨酸；(2)碱性＝赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极性＝丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸；及(4)不带电的极性＝甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸也可以被通称为芳香的氨基酸。在任何特定组中的一个或多个取代，例如，用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，或者用谷氨酸取代天冬氨酸，或者用丝氨酸取代苏氨酸，或用结构相关的氨基酸残基取代任一个其它氨基酸残基。例如，具有相似的酸性，极性，侧链大小或其某些结合的相似性的氨基酸残基进行取代对于整个多肽的功能没有显著的影响。
本发明进一步提供了分离的多核苷酸分子，其包括的核苷酸序列编码aveC同系物基因产物。本文所用的“AveC同系物基因产物”被定义为一基因产物，其与含有由质粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因产物编码序列编码的氨基酸序列的除虫链霉菌AveC基因产物至少具有50％的氨基酸序列同一性，或者与图1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列至少具有50％的氨基酸序列同一性。在一个非限制性的实施方案中，AveC同系物基因产物来自于吸水链霉菌(欧洲专利申请0298423已有描述；保藏号为FERM BP-1901)，其包含有SEQ ID NO4的氨基酸序列或其实质性部分。SEQ IDNO4的氨基酸序列的“实质性部分”指的是至少含有70％的SEQ ID NO4氨基酸序列的多肽，其构成功能等同的AveC同系物基因产物。“功能等同的”AveC同系物基因产物被定义成基因产物，当在吸水链霉菌菌株FERMBP-1901中表达时(其中天然的AveC同系物等位基因已经失活)，导致所产生的米尔倍霉素的比例和量基本上同于仅表达吸水链霉菌菌株FERM BP-1901天然的野生型功能性aveC同系物等位基因的吸水链霉菌菌株FERM BP-1901所产生的比例和量。在一个非限制性实施方案中，本发明分离的多核苷酸分子(其编码吸水链霉菌AveC同系物基因产物)含有SEQ ID NO3的核苷酸序列或其实质性部分。在这点上，含有SEQ ID NO3之核苷酸序列的分离的多核苷酸分子的“实质性部分”指的是该分离的多核苷酸分子至少包括70％的如SFQ ID NO3所示的核苷酸序列，并且编码如上所定义的功能相当的AveC同系物基因产物。
本发明进一步提供了多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列同SEQ IDNO3所示的吸水链霉菌核苷酸序列同源。术语“同源”当用于指含有与SEQ ID NO3的吸水链霉菌AveC同系物基因产物编码序列同源的核苷酸序列的多核苷酸分子时，意味着该多核苷酸分子具有的核苷酸序列(a)编码与SEQ ID NO3的核苷酸序列或其实质性部分相同的基因产物，但其根据遗传密码的简并性对核苷酸序列作了一个或多个沉默变化；或者(b)在中度严紧的条件下，与具有编码SEQ ID NO4之氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸分子的互补序列杂交并编码上述功能等同的AveC同系物基因产物，所述中度严紧的条件也即在65℃下，0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA中与结合于滤膜上的DNA杂交，及在42℃下，0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤(例见Ausubel等，文献同上)。在优选的实施方案中，同源的多核苷酸分子在高度严紧的条件下与SEQ ID NO3中编码AveC同系物基因产物的核苷酸序列或其实质性部分的互补序列杂交，并编码上述功能等同的AveC同系物基因产物，所述高度严紧条件指的是在65℃，0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸钠(SDS)，1mM EDTA中与结合于滤膜上的DNA杂交，及在68℃下，0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel等，1989，见上文)。
本发明进一步提供了一多核苷酸分子，其包含的核苷酸序列所编码的多肽与吸水链霉菌AveC同系物基因产物具有同源性。本文用于指与来自于吸水链霉菌的SEQ ID NO4的AveC同系物基因产物具有同源性的多肽的术语“同源性”指的是含有如SEQ ID NO4所示氨基酸序列(但其中一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基保守取代，该保守取代的结果在于产生了如上所述的功能等同的同系物基因产物)的多肽。
本发明进一步提供了寡核苷酸分子，其与具有如图1(SEQ ID NO1)或者SEQ ID NO3之核苷酸序列的多核苷酸分子杂交，或者与具有如图1(SEQ ID NO1)或者SEQ ID NO3之核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列的多核苷酸分子杂交。该寡核苷酸的长度至少约为10个核苷酸，且优选约为15-30个核苷酸，其在高度严紧的条件下与前述之一种多核苷酸分子杂交，即在37℃左右，6×SSC/0.5％焦磷酸钠中洗涤14个碱基左右的寡核苷酸，在48℃左右洗涤17个碱基左右的寡核苷酸，在55℃左右洗涤20个碱基左右的寡核苷酸，及在60℃左右洗涤23个碱基左右的寡核苷酸。在一个优选实施方案中，该寡核苷酸与前述多核苷酸分子之一的部分互补。这些寡核苷酸分子可用于不同目的，包括编码，或用作基因调控所用的反义核酸分子，或用作扩增编码aveC或aveC同系物的多核苷酸分子的引物。
此外，可以结合已知技术，使用本文公开的多核苷酸分子或寡核苷酸在链霉菌的其它种或菌株中鉴定其它aveC同系物基因。例如，含有图1(SEQ ID NO1)的除虫链霉菌核苷酸序列的一部分或者SEQ ID NO3的吸水链霉菌核苷酸序列的一部分的寡核苷酸分子可被可测地标记及用于筛选由来源于相关生物体的DNA所构建的基因组文库)。杂交条件严紧性的选择是基于所涉及生物体的相互关系，在这个例子中，指的是除虫链霉菌或者吸水链霉菌与其它相关生物体的关系。对不同严紧条件的要求是本领域技术人员众所周知的，这样的条件将根据衍生得到文库及标记序列的特定生物体的不同而进行可预测的改变。优选所述寡核苷酸的长度至少约为15个核苷酸，其包括，如下述实施例描述的那些。可以利用这些或其它的寡核苷酸通过应用聚合酶链反应(PCR)等标准技术进行同系物基因扩增，但也可使用本领域已知的其它扩增技术，如连接酶链反应。
可以检测被鉴定为包含有aveC同系物核苷酸序列的克隆编码功能AveC同系物基因产物的能力。为此，可对该克隆进行序列分析以鉴别适当的阅读框以及起始和终止信号。或者或另外，可将克隆的DNA序列插入合适的表达载体，即含有转录及翻译插入的蛋白质编码序列所必需的元件的载体。可按下述使用多种宿主/载体系统中的任一种，包括但不局限于如质粒，噬菌体，或粘粒表达载体等的细菌系统。可以如下面第7部分所述，通过使用如HPLC分析发酵产物来分析用含有潜在aveC同系物编码序列的载体转化的适当宿主细胞的AveC型活性。
本文所述的多核苷酸分子的生产和操作是本领域技术人员易于做到的，其可以依下述的重组技术进行操作，例如，Maniatis等，1989，分子克隆实验指南，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Ausubel等，1989，现代分子生物学教程，Greene Publishing Associates & WileyInterscience，纽约；Sambrook等，1989，分子克隆实验指南，(第二版)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约；Innis等(编)，1995，PCR策略，Academic Press公司，San Diego；和Erlich(编)，1992，PCR技术，牛津大学出版社，纽约(列入本文作为参考)。编码AveC基因产物或AveC同系物基因产物的多核苷酸克隆可以通过本领域已知的任何方法进行鉴别，包括但不限于下面第7部分所列举的方法。通过使用如Benton和Davis，1977，科学196180中所述的筛选噬菌体文库的方法和Grunstein及Hogness，1975，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，723961-3965所述的筛选质粒文库的方法，可以从基因组DNA文库中筛选aveC及aveC同系物编码序列。存在于质粒pSE186(ATCC 209604)，或质粒pSE119中，且具有已知包含有aveC ORF之核苷酸序列的多核苷酸分子(在下面第7部分进行描述)可以用作这些筛选实验的探针。或者，可以合成对应由纯化的AveC同系物基因产物的部分或全部氨基酸序列推出的核苷酸序列的寡核苷酸探针。
5.2.重组系统5.2.1.克隆与表达载体本发明进一步提供了重组克隆载体与表达载体，其可用于克隆及表达本发明的，包括有除虫链霉菌aveC ORF或任一aveC同系物ORF的多核苷酸分子。在一非限制性实施方案中，本发明提供了质粒pSE186(ATCC209604)，其包含有除虫链霉菌aveC基因完整的ORF。
除非特别说明，所有下面有关除虫链霉菌aveC ORF或包含有除虫链霉菌aveC ORF或其部分的多核苷酸分子，或除虫链霉菌AveC基因产物的描述，同时也指的是AveC同系物和AveC同系物基因产物。
已研制出多种不同的具体用于链霉菌的载体，包括噬菌体，高拷贝数质粒，低拷贝数质粒，及大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒等，其中任一个都可以用来实践本发明。也从链霉菌中克隆了大量药物抗性基因，其中某些基因被掺入载体作为选择性标记。在其它文献如Hutchinson，1980，应用生物化学与生物技术，16169-190中已经列举了在链霉菌中使用这些载体的例子。
优选构建出的本发明的重组载体，尤其是表达载体使得本发明多核苷酸分子的编码序列与转录或翻译编码序列所必需的一个或多个调控元件可操作相连以生产多肽。本文所用术语“调控元件”包括但不限于这样的核苷酸序列，其编码可诱导的及不可诱导的启动子，增强子，操作子，及本领域已知的用于驱动和/或调控多核苷酸编码序列的表达的其它元件。同时，如本文所用，该编码序列与一个或多个调控元件“可操作相连”，其中这些调控元件有效地调节并允许转录编码序列或翻译其mRNA，或者既转录也翻译。
可被加工成包含有本发明的多核苷酸分子的典型的质粒载体包括pCR-Blunt，pCR2.1(Invitrogen)，pGEM3Zf(Promega)，及其穿梭载体pWHM3(Vara等，1989，细菌学杂志，1715872-5881)等。
构建包含有特殊编码序列(其与合适的调控元件可操作相连)的重组载体的方法是本领域众所周知的，可使用这些方法实践本发明。这些方法包括体外重组技术，合成技术，体内基因重组。例见Maniatis等，1989，文献同上；Ausubel等，1989，文献同上；Sambrook等，1989，文献同上；Innis等，1995，文献同上；及Erlich，1992，文献同上中描述的技术。
这些载体的调控元件的强度和特异性可以不同。根据所用的宿主/载体系统，可使用多种适当的转录及翻译元件中的任一种。对于细菌来说，转录调控区或启动子的非限制性例子包括有；β-gal启动子，T7启动子，TAC启动子，λ左及右启动子，trp及lac启动子，trp-lac融合启动子，对于链霉菌来说则较特殊，启动子为ermE，melC，及tipA等。在下面第11部分所述的具体的实施方案中，一个包含有aveC ORF的表达载体得以产生，所述ORF被克隆在与红色糖多孢菌的强组成型ermE启动子相邻的位置。将该载体转化到除虫链霉菌中，随后用HPLC分析发酵产物显示所产生的除虫菌素的滴度相对于仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株的产量有所增加。
融合蛋白表达载体可被用于表达AveC基因产物-融合蛋白。纯化的融合蛋白可被用于提高抗AveC基因产物的抗血清，用于研究AveC基因产物的生化特性，用不同的生化活性加工AveC融合蛋白，或有助于鉴定及纯化表达的AveC基因产物。可能的融合蛋白表达载体包括但不局限于这样的载体，其整合有编码β-半乳糖苷酶及trpE融合子，麦芽糖结合蛋白融合子，谷胱甘肽-S-转移酶融合子及多组氨酸融合子(运载区域)的序列。在一个可替代的实施方案中，AveC基因产物或其部分可与AveC同系物基因产物或其部分融合，该AveC同系物基因产物来源于链霉菌的其它种或菌株，例如吸水链霉菌或灰产色链霉菌。在下面第12部分及图-7所述的特定实施方案中，构建了嵌合质粒，其含有吸水链霉菌aveC同系物ORF的564bp的区域，其替代了除虫链霉菌aveC ORF的同源564bp的区域。将该杂合载体转化至除虫链霉菌细胞中，并且检测其对所产生的除虫菌素2类∶1类之比例的影响。
AveC融合蛋白可被设计成包含有对纯化有用的区域。例如，可以使用直链淀粉树脂纯化AveC-麦芽糖结合蛋白融合子；可以使用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化AveC-谷胱甘肽-S-转移酶融合蛋白；可以使用二价镍树脂纯化AveC-多组氨酸融合子。或者，抗载体蛋白或多肽的抗体可被用于融合蛋白的亲和层析纯化。例如，可将与调控元件可操作相连的编码单克隆抗体靶表位的核苷酸序列插入表达载体的适当位置处，以使表达的表位与AveC多肽融合。例如，可通过标准技术将编码FLAGTM表位标记(InternationalBiotechnologies Inc.)(其为亲水性标记肽)的核苷酸序列插入表达载体中对应于AveC多肽羧基末端的位点。可以利用商购的抗FLAGTM抗体检测及亲和纯化表达的AveC多肽FLAGTM表位融合产物。
编码AveC融合蛋白的表达载体同样也可以被设计成包含有编码特殊的蛋白酶裂解位点的多接头序列，以使表达的AveC多肽经用特定的蛋白酶处理可以从载体区域或融合配对物中释放。例如，该融合蛋白载体可以包括编码凝血酶或Xa因子酶切位点等的DNA序列。
利用已知的方法将aveC ORF上游和框内的信号序列插入表达载体中以介导表达的基因产物的运输和分泌。信号序列的非限制性例子包括得自α因子，免疫球蛋白，外膜蛋白，青霉素酶和T细胞受体等的信号序列。
为了帮助选择用本发明的克隆或表达载体转化或转染的宿主细胞，该载体也可被设计为进一步包括报道基因产物或其它可选择标记的编码序列。优选所述编码序列与上述调控元件编码序列可操作相连。对本发明有用的报道基因是本领域众所周知的，其包括那些编码绿荧光蛋白，荧光素酶，xylE及酪氨酸酶等的报道基因。编码可选择标记的核苷酸序列是本领域众所周知的，其包括那些编码赋予抗生素抗性，抗代谢物抗性，或提供营养缺陷型需求之基因产物的序列。这些序列包括例如编码红霉素，硫链丝菌肽或卡那霉素等抗性的核苷酸序列。
5.2.2宿主细胞的转化本发明进一步提供转化的宿主细胞，其含有本发明的多核苷酸分子或重组载体，或由该宿主细胞衍生的新菌株或细胞系。可用于本发明实施中的宿主细胞优选为链霉菌细胞，但其它的原核细胞或真核细胞同样也可被使用。该转化的宿主细胞一般包括但不局限于微生物，例如用重组噬菌体DNA，质粒DNA，或粘粒DNA载体转化的细菌，或用重组载体等转化的酵母。
本发明的多核苷酸分子欲在链霉菌细胞中发挥作用，其也可以因克隆及表达目的转化至其它细菌或真核细胞中。例如一般使用大肠杆菌菌株，如DH5α菌株，可得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，USA(保藏号31343)，或可商购(Stratagene)。优选的真核宿主细胞包括酵母细胞，但哺乳动物细胞或昆虫细胞也可被有效使用。
本发明的重组表达载体最好被转化或转染至基本上均一培养的一个或多个宿主细胞中。一般根据已知技术，例如，通过原生质体转化，磷酸钙沉淀，氯化钙处理，微量注射，电穿孔，通过与重组病毒接触进行转染，脂质体介导的转染，DEAE-葡聚糖转染，转导，接合，或微粒轰击将表达载体导入宿主细胞中。可以通过标准方法选择转化子，例如，选择表达与上述重组载体相关的选择性标记，如抗生素抗性的细胞。
一旦将表达载体导入宿主细胞，可以通过检测预期基因产物的标准技术证实aveC编码序列已整合并维持在宿主染色体上或以游离体的形式存在，所述技术如Southern杂交分析，限制性酶切分析，PCR分析，包括逆转录酶PCR(rt-PCR)或者免疫测定法。含有和/或表达重组aveC编码序列的宿主细胞可以通过至少四种公知的一般方法中的任一种来证实，所述方法包括(i)DNA-DNA，DNA-RNA，或者RNA-反义RNA杂交；(ii)检测标记基因功能的存在；(iii)通过测定宿主细胞中aveC特异性mRNA转录物的表达来评估转录水平，及(iv)通过免疫测定法或AveC生物活性的存在(例如，特定比例和量的除虫菌素的产生表示除虫链霉菌宿主细胞中存在AveC活性)检测成熟多肽产物的存在。
5.2.3.重细AveC基因产物的表达及鉴定一旦aveC编码序列被稳定导入合适的宿主细胞，该转化的宿主细胞被无性增殖，可以在有助于AveC基因产物最大量生产的条件下培养所得细胞。所述条件一般包括将细胞培养至高密度。当表达载体含有可诱导的启动子时，在需要诱导表达时可使用合适的诱导条件例如，温度变化，营养耗尽，添加义务诱导物(例如，碳水化合物的类似物，例如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG))，过量的代谢副产物的积累等。
当表达的AveC基因产物保留在宿主细胞内部时，收集细胞并裂解，在本领域已知的提取条件下，例如，在4℃或有蛋白酶抑制剂的存在，或二者共存的条件下，从裂解物中分离及纯化产物以使蛋白质的降解最小化。当表达的AveC基因产物从宿主细胞中分泌时，只需收集耗尽的营养培养基并从中分离产物。
利用标准方法，可从细胞裂解物或培养基(适当时)中分离或基本上纯化表达的AveC基因产物，所述方法包括但不局限于下列方法的任何组合硫酸铵沉淀，大小分级分离，离子交换层析，HPLC，密度离心及亲和层析。当表达的AveC基因产物表现出生物活性时，可使用适当的检测方法监测纯化方法的每一步中制品纯度的提高。不管表达的AveC基因产物是否表现出生物活性，都可以依据其大小，与抗体或特异于AveC的抗体的反应性，或者在融合标记的存在下检测该基因产物。
因此，本发明提供了重组表达的除虫链霉菌AveC基因产物及其同系物，所述基因产物含有可以被质粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因产物编码序列所编码的氨基酸序列，或图1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列或其实质性部分。
本发明进一步提供了重组表达的吸水链霉菌AveC同系物基因产物及其同系物，所述基因产物含有如SEQ ID NO4所示的氨基酸序列或其实质性部分。
本发明进一步提供了生产AveC基因产物的方法，所述方法包括在有助于产生重组AveC基因产物的条件下，培养用重组表达载体转化的宿主细胞，并从细胞培养物中回收AveC基因产物，其中所述载体含有具有编码AveC基因产物之核苷酸序列的多核苷酸分子，所述多核苷酸分子与一个或多个控制多核苷酸分子在宿主细胞中的表达的调控元件可操作相连。
重组表达的除虫链霉菌AveC基因产物可用于不同的目的，其中包括筛选可以改变AveC基因产物功能的化合物，及因此调制除虫菌素的生物合成以及产生针对AveC基因产物的抗体。
一旦获得纯度足够高的AveC基因产物，通过下列标准方法就可以鉴定基因产物，所述方法如SDS-PAGE，大小排阻层析，氨基酸序列分析，在除虫菌素生物合成途径中产生合适产物的生物活性等等。例如，可以使用标准的肽测序技术测定AveC基因产物的氨基酸序列。可以用亲水性分析(例见Hopp和Woods，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 783824)，或者类似的软件运算法则鉴定AveC基因产物的亲水区及疏水区，籍此进一步鉴定AveC基因产物。可进行结构分析以鉴定AveC基因产物中具有特殊二级结构的区域，例如可使用如X-射线结晶学的生物物理法(Engstrom，1974，Biochem.Exp.Biol.117-13)，计算机模型制作法(Fletterick及Zoller(编)，1986，分子生物学最新通讯，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)和核磁共振(NMR)作图及研究AveC基因产物及其底物之间相互作用的位点。通过研究所取得的信息可被用于选择aveC ORF的新突变位点，以帮助开发具有更合适的除虫菌素生产特性的除虫链霉菌新菌株。
5.3.AveC突变体的构建及应用本发明进一步提供了多核苷酸分子，其或者具有与质粒pSE186(ATCC209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列相同的核苷酸序列，或具有如图1(SEQ ID NO1)所示的除虫链霉菌aveC ORF的核苷酸序列，但其进一步包含有一个或多个突变，以致于除虫链霉菌菌株ATCC 53692(其中野生型aveC等位基因已经失活并表达含有突变的核苷酸序列的多核苷酸分子)较仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌菌株ATCC 53692的细胞产生了不同比例及量的除虫菌素。
按照本发明，所述多核苷酸分子可被用于生产除虫链霉菌新菌株，所述新菌株与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株比较，除虫菌素的生产发生可测的改变。在优选的实施方案中，所述多核苷酸分子可用于生产除虫链霉菌新菌株(其与仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株相比，以减少的2类∶1类比例生产除虫菌素)。在另一个优选的实施方案中，所述多核苷酸分子可用于生产除虫链霉菌新菌株(其与仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株相比可以产生增加水平的除虫菌素)。在进一步优选的实施方案中，所述多核苷酸分子可用于生产除虫链霉菌新菌株(其中aveC基因已经失活)。
AveC编码序列的突变包括将氨基酸缺失，添加或取代导入AveC基因产物，或导致AveC基因产物截短或其任何组合并产生所需结果的任何突变。例如，本发明提供了多核苷酸分子，其包含质粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因产物编码序列或如图1(SEQ ID NO1)所示的除虫链霉菌aveCORF核苷酸序列，但其进一步包含有一个或多个突变，其编码用不同的氨基酸残基在AveC基因产物的选定位点对氨基酸残基进行的取代。在下文例举的几个非限制性的实施方案中，该取代发生在氨基酸残基第55，138，139，或230位，或其中几个位点。
通过多种已知方法的任一种可以进行aveC编码序列的突变，包括使用易错聚合酶链式反应，或通过盒式诱变。例如，可以使用寡核苷酸介导的诱变以一种确定的方式例如在aveC ORF序列的特定区域导入一个或多个限制性位点或终止密码子来改变aveC ORF序列。正如美国专利5,605,793所述，也可使用包括随机片断化，重复诱变循环及核苷酸改组的方法产生较大的具有编码aveC突变的核苷酸序列的多核苷酸文库。
靶向突变是有用的，对于改变AveC基因产物的一个或多个保守的氨基酸残基尤其有用。例如，如图6所示，通过将AveC基因产物与来自除虫链霉菌(SEQ ID NO2)、灰产色链霉菌(SEQ ID NO5)及吸水链霉菌(SEQ ID NO4)的AveC同系物基因产物推定的氨基酸残基序列相比较，显示了这些种之间显著保守的氨基酸残基位点。导致一个或多个所述保守的氨基酸残基改变的靶向诱变对于产生可以显示所需的除虫菌素产量改变的新突变株是非常有效的。
随机诱变也是有用的，可以通过将除虫链霉菌细胞暴露于紫外线或X-射线照射，或者暴露于如N-甲基-N′-亚硝基胍，甲烷磺酸乙酯，亚硝酸或者氮芥子类的化学诱变剂进行诱变。有关诱变技术的综述可参见Ausubel，1989，文献同上。
一旦产生突变的多核苷酸分子，可进行筛选以测定其是否可调制除虫链霉菌中的除虫菌素生物合成。在优选的实施方案中，通过互补除虫链霉菌菌株(其中aveC基因已经失活从而给出aveC-背景)检测具有突变的核苷酸序列的多核苷酸分子。在非限制性方法中，突变的多核苷酸分子被剪接成与一个或多个调控元件可操作相连的表达质粒，其中质粒优选包括一个或多个药物抗性基因以选择转化细胞。使用已知技术将该载体转化至aveC-宿主细胞，选择转化细胞并在允许或者诱导除虫菌素产生的条件下在合适的发酵培养基中进行培养。然后通过HPLC分析发酵产物以测定突变的多核苷酸分子互补宿主细胞的能力。在下面8.3部分要举例说明携有能降低除虫菌素B2∶B1比例的突变的多核苷酸分子的几个载体，其包括pSE188，pSE199及pSE231。
本发明提供了鉴定除虫链霉菌aveC ORF突变(其可以改变所产生的除虫菌素的比例和/或产量)的方法。在优选的实施方案中，本发明提供了鉴定除虫链霉菌aveC ORF突变(其可以改变所产生的除虫菌素的B2∶B1比例)的方法，所述方法包括(a)测定除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素2类∶1类的比例，所述细胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有编码突变的AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子被导入该细胞并在其中被表达；(b)测定与步骤(a)的除虫链霉菌相同的菌株细胞产生的除虫菌素2类1类的比例，但不同的是该细胞仅表达具有如图1(SEQ ID NO1)所示的ORF的核苷酸序列或者与其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比较步骤(a)的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素2类∶1类的比例与步骤(b)的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素2类∶1类的比例，如果二者不同的话，则鉴定出有能够改变除虫菌素2类∶1类比例的aveC ORF突变存在。在优选的实施方案中，除虫菌素2类∶1类的比例因突变而减少。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种方法，该方法用于鉴定aveC ORF或者包含有aveC 0RF的基因构建体中能够改变所产生的除虫菌素量的突变，所述方法包括(a)测定除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的量，所述细胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有编码突变的AveC基因产物的核苷酸序列或含有编码AveC基因产物的核苷酸序列的基因构建体的多核苷酸分子被导入该细胞并在其中表达；(b)测定与步骤(a)的除虫链霉菌相同的菌株细胞产生的除虫菌素的量，但不同的是该细胞仅表达具有如图1(SEQ ID NO1)所示的ORF的核苷酸序列或者与其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比较步骤(a)的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的量与步骤(b)的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的量，如果二者不同的话，则鉴定出有能够改变除虫菌素量的aveC ORF突变或基因构建体突变存在。在优选的实施方案中，除虫菌素的量因突变而增加。
上述的任一用于鉴定突变的方法可以通过使用发酵培养基进行，优选在该培养基中添加环己烷羧酸，但其它合适的脂肪酸前体，例如，如表1所列的脂肪酸前体中的任一种也可以被使用。
一旦鉴定出按所需方向调制除虫菌素生产的突变的多核苷酸分子，也可以确定核苷酸序列上发生突变的位置。例如，可以通过PCR分离含有编码突变的AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子并使用已知方法对其进行DNA序列分析。通过比较突变的及野生型的aveC等位基因的DNA序列，可以确定负责改变除虫菌素生产的突变。在本发明具体的、但非限制性的实施方案中，含有第55(S55F)，138(S138T)，139(A139T)或230(G230D)位残基单个氨基酸取代或者第138(S138T)及139(A139T)位残基双重取代的除虫链霉菌AveC基因产物的AveC基因产物功能发生改变，使得所产生的除虫菌素2类∶1类的比例发生改变(参见下文第8部分)。因此，本发明包括多核苷酸分子，其含有的核苷酸序列所编码的突变的除虫链霉菌AveC基因产物包含第55，138，139或230位氨基酸残基或其任意组合处发生的一个或多个氨基酸取代。
本发明进一步提供了制备新的除虫链霉菌菌株的组合物，该菌株的细胞含有突变的aveC等位基因而导致除虫菌素生产的变化。例如，本发明提供了重组载体，可使用该载体将任何含有本发明的突变核苷酸序列的多核苷酸分子靶向除虫链霉菌染色体上的aveC基因位点，以通过同源重组插入或取代aveC ORF或其部分。然而，按照本发明，此处提供的含有本发明突变的核苷酸序列的多核苷酸分子也可以在插入到除虫链霉菌染色体上除aveC基因外的位点，或在除虫链霉菌细胞中保持游离状态时，同样起到调制除虫菌素生物合成的作用。因此，本发明还提供了具有含有本发明突变的核苷酸序列的多核苷酸分子的载体，可使用这些载体将多核苷酸分子插入到除虫链霉菌染色体上除aveC基因位点以外的位置，或保持游离状态。
在优选的实施方案中，本发明提供了基因取代载体，其可以用于将突变的aveC等位基因插入除虫链霉菌菌株中，籍此产生新的除虫链霉菌菌株，所述菌株的细胞与仅表达野生型的aveC等位基因的相同菌株细胞相比，产生的除虫菌素2类∶1类比例有所改变。在优选的实施方案中，该细胞产生的除虫菌素2类∶1类比例减少。可使用本文提供的表达载体如pSE188，pSE199，及pSE231(这些表达载体在下面第8.3部分将举例说明)中存在的突变的多核苷酸分子构建所述基因取代载体。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了载体，可使用该载体将突变的aveC等位基因插入除虫链霉菌菌株细胞中以产生新细胞株，所述新细胞与仅表达野生型的AveC等位基因的相同菌株细胞相比，产生的除虫菌素的量有所改变。在优选的实施方案中，所述新细胞产生的除虫菌素的量增加。在具体的、非限制性实施方案中，该载体进一步包含本领域已知的强启动子，例如，来自Saccharopolyspora erythraea的强组成型ermE启动子，其位于aveC ORF上游并与aveC ORF可操作相连。所述载体可以是如下面实施例11所描述的质粒pSE189，或可通过使用质粒pSE189的突变的aveC等位基因进行构建。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了基因取代载体，该载体可用于灭活野生型除虫链霉菌菌株中的aveC基因。在非限制性的实施方案中，可以通过使用质粒pSE180(ATCC 209605)中存在的突变的多核苷酸分子构建所述基因取代载体，其在下面第8.1部分举例说明(图3)。本发明进一步提供了包含有多核苷酸分子的基因取代载体，所述多核苷酸分子包含天然侧翼于除虫链霉菌染色体上原位aveC基因的核苷酸序列或由该序列组成，例如，包括那些如图1(SEQ ID NO1)所示的侧翼核苷酸序列，可使用所述载体缺失除虫链霉菌aveC ORF。
本发明进一步提供了制备除虫链霉菌新菌株的方法，所述新菌株含有表达突变的aveC等位基因的细胞，其与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株的细胞比较，所产生的除虫菌素的比例和/或量发生改变。在优选的实施方案中，本发明进一步提供了制备除虫链霉菌新菌株的方法，所述新菌株含有表达突变的aveC等位基因的细胞，其与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株的细胞比较，所产生的除虫菌素2类∶1类比例发生改变，所述方法包括用携有突变的aveC等位基因的载体转化除虫链霉菌菌株细胞，该突变的aveC等位基因编码的基因产物使得与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株的细胞比较，表达突变的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的2类∶1类比例有所改变；选择所产生的除虫菌素2类∶1类的比例较仅表达野生型aveC等位基因的菌株细胞有所改变的转化细胞。在优选实施方案中，除虫菌素2类∶1类的比例有所减少。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了制备除虫链霉菌新菌株的方法，所述菌株含有生产改变量的除虫菌素的细胞，所述方法包括用携有突变aveC等位基因的载体或者含有该aveC等位基因的基因构建体转化除虫链霉菌菌株细胞，所述突变的aveC等位基因的表达使得表达突变aveC等位基因或基因构建体的除虫链霉菌菌株细胞所产生的除虫菌素的量较仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株细胞产生的除虫菌素的量有所改变；选择所产生的除虫菌素的量较仅表达野生型aveC等位基因的菌株细胞有所改变的转化细胞。在优选实施方案中，转化细胞中所产生的除虫菌素的量有所增加。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了制备除虫链霉菌新菌株的方法，所述菌株的细胞含有失活的aveC等位基因，所述方法包括用失活的aveC等位基因的载体转化表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌菌株细胞；选择其中aveC等位基因已失活的转化细胞。在优选的、非限制性的实施方案中，除虫链霉菌菌株细胞被基因取代载体转化，该载体所携带的aveC等位基因已经因突变或用异源基因序列取代AveC等位基因的一部分而失活，其中选择天然aveC等位基因已经被失活的aveC等位基因所取代的转化细胞。如下所述，AveC等位基因的失活可以通过用HPLC分析发酵产物来测定。在如下面第8.1部分所述的具体的、非限制性的实施方案中，通过在aveC ORF中插入来自红色糖多孢菌的ermE基因而使aveC等位基因失活。
本发明进一步提供了除虫链霉菌的新菌株，其含有用本发明的任一多核苷酸分子或载体转化的细胞。在优选的实施方案中，本发明提供了除虫链霉菌新菌株，其含有表达突变的aveC等位基因以取代野生型的aveC等位基因或含有同时表达这两种等位基因的细胞，其中新菌株细胞以相对于仅表达野生型的aveC等位基因的相同菌株细胞而言有所改变的2类∶1类的比例生产除虫菌素。在优选的实施方案中，新细胞产生的除虫菌素的2类∶1类比例降低。该新菌株对于商用除虫菌素如doramectin的大规模生产是非常有用的。
本文描述的筛选试验的根本目的是鉴定突变的aveC等位基因，其在除虫链霉菌细胞中的表达改变了，特别是降低了所产生除虫菌素的2类∶1类的比例。在优选的实施方案中，本发明的表达可降低所产生的除虫菌素的2类∶1类比例的突变的aveC等位基因的除虫链霉菌新菌株细胞所产生的除虫菌素的B2∶B1的比例减小的范围是1.6∶1～0∶1以下；在更优选的实施方案中，比例约为1∶1～0∶1；在最优选的实施方案中，比例约为0.84∶1～0∶1。在下面描述的具体实施方案中，本发明的新细胞所产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例小于1.6∶1。在下面描述的另一个不同的具体实施方案中，本发明的新细胞所产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例大约是0.94∶1。在下面描述的另一个不同的具体实施方案中，本发明的新细胞所产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例大约是0.88∶1。在下面描述的另一个不同的具体实施方案中，本发明的新细胞所产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例大约是0.84∶1。
在更优选的实施方案中，本发明提供了除虫链霉菌新菌株，其含有表达突变的aveC等位基因，或含有aveC等位基因的基因构建体以取代野生型aveC等位基因或含有同时表达突变的和野生型aveC等位基因的细胞，其中新菌株细胞以相对于仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株细胞而言有所改变的量生产除虫菌素。在优选的实施方案中，新菌株产生的除虫菌素的量增加。在非限制性的实施方案中，基因构建体进一步包括强启动子，例如，来自红色糖多孢菌的强组成型ermE启动子，其位于aveC ORF上游并与aveC ORF可操作相连。
在进一步优选的实施方案中，本发明提供了除虫链霉菌新菌株，其含有其中aveC基因已经失活的细胞。所述菌株可用于产生与野生型菌株相比有不同谱的除虫菌素，在本文所述的互补筛选试验中还可测定aveC基因靶向或随机诱变是否影响除虫菌素的生产。在下文所述的具体实施方案中，除虫链霉菌宿主细胞经基因改造后含有失活的aveC基因。例如，下面实施例中所述的菌株SE180-11就是使用基因取代质粒pSE180(ATCC209605)(图3)产生的，通过在aveC基因编码区插入ermE抗性基因而使除虫链霉菌aveC基因失活。
本发明进一步提供了重组表达的，突变的除虫链霉菌AveC基因产物及其制备方法，所述基因产物由本发明上述多核苷酸分子的任一种编码。
本发明进一步提供了生产除虫菌素的方法，所述方法包括在允许或者诱导除虫菌素生产的条件下，在培养基中培养除虫链霉菌菌株细胞，并从培养物中回收所述除虫菌素，所述细胞表达编码基因产物的突变的aveC等位基因，与仅表达野生型的aveC等位基因的相同菌株细胞相比，所述突变的等位基因改变了表达突变的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的2类∶1类的比例。在优选的实施方案中，表达突变的aveC等位基因的细胞产生的除虫菌素的2类∶1类的比例有所减少。该方法提供了商业上有价值的除虫菌素例如doramectin的高效率的生产方法。
本发明进一步提供了生产除虫菌素的方法，所述方法包括在允许或者诱导除虫菌素生产的条件下，在培养基中培养除虫链霉菌菌株细胞，并从培养物中回收所述除虫菌素，所述细胞表达突变的aveC等位基因或含有aveC等位基因的基因构建体，与不表达突变aveC等位基因或基因构建体而仅表达野生型的aveC等位基因的相同菌株细胞相比，表达突变的aveC等位基因或基因构建体的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的量有所改变。在优选的实施方案中，在培养物中表达突变aveC等位基因或基因构建体的细胞产生的除虫菌素的量有所增加。
本发明进一步提供了由表达突变的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株产生的除虫菌素的新的组合物，其中，突变的aveC等位基因所编码的基因产物使表达突变的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株细胞所产生的除虫菌素2类∶1类的比例与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株的细胞相比有所降低，其中，与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株的细胞产生的除虫菌素2类∶1类比例相比，新组合物中的除虫菌素以降低的2类∶1类比例产生。这种新型的除虫菌素组合物可以存在于耗尽的发酵培养液中或者从中回收，并且可以通过已知的生化纯化技术如硫酸铵沉淀，透析，大小分级分离，离子交换层析，HPLC等从培养液中部分纯化或基本纯化。
5.4.除虫菌素的用途除虫菌素是一种非常有效的抗寄生虫药剂，特别是作为驱虫剂、外寄生物杀死药、杀虫剂及杀螨剂。按照本发明的方法所产生的除虫菌素化合物均可用于这些用途。例如，按照本发明的方法所产生的除虫菌素化合物可用于治疗人类的各种疾病或症状，尤其是本领域已知的由寄生虫感染造成的那些疾病。参见Ikeda and Omura，1997，Chem.Rev.97(7)2591-2609。更为具体的是，按照本发明的方法所产生的除虫菌素化合物对于由内寄生虫所导致的各种疾病或症状能产生有效的治疗作用，所述内寄生虫例如寄生性线虫类可以感染人体，家畜，猪，绵羊，家禽，马或者牛。
更具体的是，按照本发明的方法所产生的除虫菌素化合物对于抵抗感染人体的线虫以及感染各种动物的线虫均有效。这样的线虫包括肠胃寄生虫如钩虫，线虫，蛔虫，类圆线虫，旋毛虫，毛细线虫，鞭虫，蛲虫，恶丝虫病及在血管、其它组织或器官中发现的寄生虫如丝虫性蠕虫及类园属及旋毛虫的肠道提取物。
按照本发明的方法所产生的除虫菌素化合物也可用于治疗外寄生物感染，包括例如由螺、螨、虱子、跳蚤、绿头苍蝇、咬人的昆虫、或者骚扰马、牛的移栖双翅目幼虫等引起的哺乳类或鸟类等的节肢感染。
按照本发明的方法所产生的除虫菌素化合物也可用作家用杀虫剂，如杀灭蟑螂、衣蛾、地毯甲虫、及家蝇等，以及对储存谷物和农作物有害的昆虫，包括革螨、蚜虫、毛虫、和鳞翅类幼虫如蝗虫等。
用按照本发明的方法所产生的除虫菌素化合物能够治疗的动物包括绵羊、牛、马、鹿、山羊、猪、鸟类包括家禽、狗和猫。
按照本发明的方法所产生的除虫菌素化合物可以配制成适合于特定用途的剂型，这与被治疗的宿主动物的特定种类、所涉及的寄生虫及昆虫有关。对于作为一种驱虫剂使用的话，按照本发明的方法所产生的除虫菌素化合物可以以胶囊、丸剂、片剂、液体兽用顿服剂的形式口服，或者倾注，注射或植入的形式进行给药。这种制剂可以以传统的方式按标准的兽医学实践进行制备。这样，胶囊、丸剂或片剂可以通过将活性成分与适当精制的稀释剂或载体混合，另外含有崩解剂和/或粘合剂如淀粉、乳糖、滑石、硬脂酸镁等。兽用顿服剂的配制是将活性成分分散在分散剂或润湿剂等的水溶液中。注射剂可配制成消毒液，其中可含其它物质如足够的盐和/或葡萄糖使该溶液与血液等渗。
这些制剂中有关活性成分的用量依照患者、被治疗的宿主动物的种类、感染的严重性及类型、寄主的体重等的不同而变化。一般来讲，对于口服给药的制剂，活性组分的剂量可以从0.001到10mg/kg患者或动物的体重，在1天到5天内以单一剂量或分剂量服用均可。然而，在有些情况下，内科医生或兽医可依照临床症状给予较高或较低的剂量。
或者，按照本发明的方法所产生的除虫菌素化合物也可以与动物饲料一起给药，对于这种目的，动物饲料中也可混和有浓缩的食物添加剂或预混剂。对于作为一种杀虫剂及处理农业害虫来说，按照本发明的方法所产生的除虫菌素化合物也可以以喷雾，撒粉，乳剂及类似方式按农业上标准的方法进行使用。
6.实施例除虫链霉菌的发酵及除虫菌素B2∶B1的分析同时缺少支链2-氧酸-脱氢酶及5-0-转甲基酶活性物质的菌株如果在发酵介质中不补充脂肪酸的话，其将不产生除虫菌素。该实施例证明了在这样的突变株中，在有不同脂肪酸存在下引发生物合成时，可获得B2∶B1的比例范围很宽的除虫菌素。
6.1.材料及方法除虫链霉菌ATCC 53692储存在-70℃的全肉汤种子培养基中，培养基的组成为淀粉(Nadex，Laing National)-20g；药介质(Trader′s Protein，Memphis，TN)-15g；Ardamine pH(YeastProducts Inc.)-5g；碳酸钙-1g。用自来水调整最终的体积为1升，pH调整至7.2，在121℃下高压灭菌25分钟。
取2ml上述准备的解冻的悬浮液接种到一个含有50ml同样培养基的烧瓶中。在28℃在180rpm的旋转振荡器上将其培养48小时后，用2ml肉汤接种到一个含有50ml生产培养基的烧瓶中，该培养基含有淀粉-80g碳酸钙-7g；Pharmamedia-5g；磷酸氢二钾-1g；硫酸镁-1g；谷氨酸-0.6g；七水合硫酸亚铁-0.01g；硫酸锌-0.001g；硫酸亚镁-0.001g。用自来水调整最终的体积为1升，pH调整至7.2，在121℃下高压灭菌25分钟。
不同的羧酸酶底物(参见表1)在甲醇中溶解并添加到发酵的肉汤基中接种24小时后最终浓度为0.2g/1。发酵的肉汤培养基在28℃培养14天，然后将其离心(2,500rpm，2分钟)，去除上清液。用丙酮(15ml)，然后用二氯甲烷(30ml)萃取菌丝沉淀，分离有机相，过滤，然后蒸发干燥。残余物用1ml甲醇吸收，并用配有240nm的扫描二极管组检测器的Hewlett-Packard 1090A液相色谱进行HPLC分析，所用柱子是BeckmanUltrasphere C-18，5μm，4.6mm×25cm的柱子，保持在40℃。将上述甲醇溶液25μm注入柱子中。在0.85/毫升分钟下，用甲醇-水线性梯度从80∶20到95∶5进行洗脱超过40分钟。环己基B1的两种标准浓度用于校准检测器的反应，测量对应于除虫菌素B2及B1的曲线的面积。
6.2.结果所观察到的除虫菌素B2和B1的HPLC保留时间，及2∶1比例如表1所示。
表1
表1所列数据证明了产生的除虫菌素的B2∶B1的比例有一个很宽的范围，表明了2类化合物与1类化合物脱水转化的结果有很大的差异，这取决于所提供的脂肪酸侧链启动单元的性质。这表明B2∶B1比例的改变(由aveC蛋白的改变所产生)对于特定的底物具有特异性。因此，用特定的底物获得的展示B2∶B1比例变化的突变子的筛选也需要在该底物的存在下进行。下面这些例子描述了使用环己烷羧酸作为筛选底物。然而，该底物仅用于举例说明本发明潜在的实用性，而不是有意要限制本发明。
7.实施例aveC基因的分离本实施例描述了编码AveC基因产品的除虫链霉菌染色体一个区域的分离及鉴定，正如下所描述的，aveC基因被鉴定为能够改变所产生的除虫菌素环己基B2与B1的比例(B2∶B1)。
7.1.材料与方法7.1.1.用于DNA分离的链霉菌的生长下面的方法用于培养链霉菌。除虫链霉菌ATCC 31272株单菌落(单菌落分离物#2)在1/2浓度的YPD-6中分离，YPD-6包含有Difco YeastExtract-5g；Difco Bacto-胨-5g；葡萄糖-2.5g；MOPS-5g；Difco Bacto琼脂-15g.，最终的体积用dH2O调整至1升，pH调整至7.0，培养基在121℃下高压灭菌25分钟。
上述培养基培养的菌丝体用于接种到10ml TSB培养基(DifcoTryptic Soy Broth-30g，在1升dH2O中，在121℃下高压灭菌25分钟)，在一个25mm×150mm试管中以300rpm振荡，在28℃下培养48-72小时。
7.1.2.从链霉菌中分离染色体DNA将上述生长的等分菌丝体(0.25ml或0.5ml)放置于一个1.5ml的微量离心试管并将该细胞在12,000×g离心60秒而浓缩。去除上清液，使细胞悬浮于0.25ml TSE缓冲液中(20ml 1.5M蔗糖，2.5ml 1MTris-HCl，pH8.0，2.5ml 1M EDTA，pH8.0，和75ml dH2O)，其含有2mg/ml溶菌酶。样品在37℃下振荡培养20分钟，运载至一个AutoGen540TM自动的核酸分离装置(Integrated Separation Systems，Natick，MA)，基因组DNA用Cycle 159(仪器软件)按照操作手册进行分离。
或者，将5ml的菌丝体置于一个17mm×100mm的试管中，通过在3,000rpm下离心5分钟进行细胞浓缩，去除上清液。细胞重新悬浮在1ml TSE缓冲液中，通过在3,000rpm下离心5分钟进行细胞浓缩，去除上清液。细胞重新悬浮在1ml含有2mg/ml溶菌酶的TSE缓冲液中，并在37℃振荡孵育30-60分钟。经过培养后，加入0.5ml 10％十二烷基硫酸钠(SDS)，将细胞在37℃下孵育，直到裂解完成。裂解产物在60℃下孵育10分钟，冷却至室温，分到两个1.5ml Eppendorf试管中，并用0.5ml苯酚/氯仿(50％苯酚，预先用0.5M Tris平衡，pH8.0；50％氯仿)萃取1次。去除水相，用氯仿∶异戊醇(24∶1)萃取2到5次。通过加入1/10体积3M醋酸钠，pH4.8沉降DNA，在冰中孵育混合物10分钟，在15,000rpm，5℃将混合物离心10分钟，将上清液移至一干净的试管，并在其中加入1体积的异丙醇。然后将上清液与异丙醇一起在冰中孵育20分钟，在15,000rpm，5℃将混合物离心20分钟，将上清液移除，用70％乙醇洗涤DNA粒状沉淀物1次。在粒状沉淀物干燥后，将DNA再悬浮于TE缓冲液中(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)。
7.1.3.从链霉菌中分离质粒DNA将一部分菌丝体(1.0ml)放置于一个1.5ml的微量离心试管，其在12,000xg下离心60秒浓缩细胞。去除上清液，细胞再悬浮于1.0ml10.3％蔗糖中，在12,000×g下离心浓缩60秒，去除上清液。然后将细胞重悬浮于0.25ml TSE缓冲液中，其含有2mg/ml溶菌酶，在37℃下振荡孵育20分钟，然后载至AutoGen 540TM自动的核酸分离装置中。按照操作手册，使用Cycle 106(仪器软件)分离质粒DNA。
或者，将1.5ml的菌丝体放置于1.5ml微型离心试管中，在12,000xg下离心60秒浓缩细胞。去除上清液，细胞再悬浮于1.0ml 10.3％蔗糖，在12,000×g下离心浓缩60秒，去除上清液。细胞重悬浮于0.5ml TSE缓冲液中，其含有2mg/ml溶菌酶，在37℃孵育15-30分钟。孵育后，加入0.25ml碱性SDS(0.3N NaOH，2％SDS)，在55℃下孵育15-30分钟或直到溶液变清。将醋酸钠(0.1ml，3M，pH4.8)加入到DNA溶液中，将其在冰中孵育10分钟。DNA样品在5℃下在14,000rpm离心10分钟。将上清液移至一干净的试管，并在其中加入0.2ml的苯酚/氯仿(50％苯酚50％氯仿)并轻轻混和。DNA溶液在5℃下以14,000rpm离心10分钟，上清液移至一干净的Eppendorf试管。加入异丙醇0.75ml，将溶液轻轻混和，然后在室温下孵育20分钟。将该DNA溶液在5℃下以14,000rpm离心15分钟，移除上清液，用70％乙醇洗涤DNA沉淀颗粒，干燥，再在TE缓冲液中重悬浮。
7.1.4.从大肠杆菌中分离质粒DNA将单一的转化的大肠杆菌菌落在5ml Luria-Bertani(LB)培养基中(Bacto-胨-10g，Bacto-yeast extract-5g，和NaCl-10g在1升dH2O中，pH7.0，在121℃下高压灭菌25分钟，并用100μg/ml氨卡青霉素补充)孵育。将培养物过夜培养，将1μm等分试样置于1.5ml微型离心试管中，将培养样品载至AutoGen 540TM自动核酸分离器中，按照操作手册，使用Cycle 3(仪器软件)分离质粒DNA。
7.1.5.除虫链霉菌原生质体的制备及转化将除虫链霉菌的单一菌落在1/2浓度的YPD-6中分离。菌丝体用于接种到25mm×150mm试管中的10ml TSB培养基中，并且在28℃下以300rpm振荡培养48小时。用1ml菌丝体接种50ml YEME培养基。每升YEME培养基含有Difco Yeast Extract-3g；Difco Bacto-栋-5g；DifcoMalt Extract-3g；蔗糖-300g。经过在121℃下高压灭菌25分钟后，加入下列物质2.5M MgCl2·6H2O(分别在121℃下高压灭菌25分钟)-2ml；及甘氨酸(20％)(过滤灭菌)-25ml。
将菌丝体在30℃下培育48-72小时，然后在50ml离心管(Falcon)中在3,000rpm下离心20分钟收获。去除上清液，菌丝体在P缓冲液中重悬浮，P缓冲液含有蔗糖-205g；K2SO4-0.25g；MgCl26H2O-2.02g；H2O-600ml；K2PO4(0.5％)-10ml；痕量元素溶液-20ml；CaCl22H2O(3.68％)-100ml；及MES缓冲液(1.0M，pH6.5)-10ml(*痕量元素溶液每升含有ZnCl2-40mg；FeCl3·6H2O-200mg；CuCl2·2H2O-10mg；MnCl2·4H2O-10mg；Na2B4O7·10H2O-10mg；(NH4)6Mo7O24·4H2O-10mg)。pH调至6.5，最终体积调至1升，用0.45微米的筛子热过滤培养基。
菌丝体以3,000rpm离心20分钟得到粒状沉淀，去除上清液，将菌丝体在含有2mg/ml溶菌酶的20ml P缓冲液中重悬浮。菌丝体在35℃下振荡孵育15分钟，在显微镜下观察以确定形成原生质体的范围。当原生质体形成结束时，将其在8,000rpm下离心10分钟。去除上清液，将原生质体在10ml P缓冲液中重悬浮。将原生质体在8,000rpm离心10分钟，去除上清液，将其在2ml P缓冲液中重悬浮，大约有1×109个原生质体分布在2.0ml低温小瓶(Nalgene)中。
装有1×109个原生质体的小瓶在8,000rpm下离心10分钟，去除上清液，原生质体在0.1ml P缓冲液中重悬浮。将2～5μg转化的DNA加入到原生质体中，接着加入0.5ml工作T缓冲液。T缓冲基含有PEG-1000(Sigma)-25g；蔗糖-2.5g；H2O-83ml.。用1N的NaOH将pH调节至8.8(过滤消毒后)，T缓冲基是过滤杀菌并在40℃下保存。工作T缓冲液(当天制作使用)是T缓冲基-8.3ml；K2PO4(4mM)-1.0ml；CaCl2·2H2O(5M)-0.2ml；及TES(1M，pH8)-0.5ml.。该工作T缓冲液的每一组分都是分别过滤杀菌的。
在20秒钟内将T缓冲液加入到原生质体，同时加入1.0ml P缓冲液，然后将原生质体在8,000rpm离心10分钟。去除上清液后将原生质体在0.1ml P缓冲液中重悬浮。然后将原生质体在RM14培养基平板培养，该培养基含有蔗糖-205g；K2SO4-0.25g；MgCl2·6H2O-10.12g；葡萄糖-10g；Difco Casamino Acids-O.1g；Difco Yeast Extract-5g；Difco Oatmeal琼脂-3g；Difco Bacto琼脂-22g；dH2O-800ml。溶液在121℃下高压灭菌25分钟。经过灭菌，加入下列消过毒的组分K2PO4(0.5％)-10ml；CaCl2·2H2O(5M)-5ml；L-脯氨酸(20％)-15ml；MES缓冲液(1.0M，pH6.5)-10ml；痕量元素(同上)-2ml；环己酰亚胺原液(25mg/ml)-40ml；及1N NaOH-2ml。将25ml RM14培养基等分在每个平板上，这些平板在使用前都要干燥24小时。
原生质体在湿度95％，温度30℃下孵育20-24小时。为了选择硫链丝菌肽抗性转化子，将含有125μg/ml硫链丝菌的1ml重复缓冲液均匀地平铺在RM14再生板上，每100ml重复缓冲液含有蔗糖-10.3g；痕量元素溶液(与上相同)-0.2ml；及MES(1M，pH6.5)-1ml。原生质体在湿度95％，温度30℃下孵育7-14天直到硫链丝菌肽抗性(ThiO’)菌落出现。
7.1.6.链霉菌紫原生质体的转化在某些情况下，链霉菌紫原生质体(S.lividans)TK64(由JohnInnes研究所，Norwich，U.K提供)被用于转化。S.lividans生长、原生质化及转化的方法和组分在Hopwood等人，1985，链霉菌的基因操作(Genetic Manipulation of Streptomyces，A Laboratory Manual，JohnInnes Foundation，Norwich，U.K.中已有描述，并如其中所述地进行。质粒DNA从S.lividans转化株中的分离如上述7.1.3中所描述。
7.1.7.除虫链霉菌株的发酵分析除虫链霉菌的菌丝体在1/2浓度的YPD-6上培养4-7天后，接种到1×6英寸的试管中，其中含有8ml预制成的培养基及两个5mm玻璃珠子，预制成的培养基含有可溶性淀粉(或者低沸点的淀粉或者KOSO，JapanCom Starch Co.，Nagoya)-20g/L；Pharmamedia-15g/L；ArdaminepH-5g/L(Champlain Ind.，Clifton，NJ)；CaCO3-2g/L；2x bcfa(″bcfa′″指的是支链脂肪酸)在培养基中含有一最终浓度为50ppm 2-(+/-)-甲基丁酸，60ppm异丁酸，及20ppm异戊酸。将pH调至7.2，培养基在121℃下高压灭菌25分钟。
试管以17°角在29℃下以215rpm振荡培养3天。将用2-ml种子培养的等分试样接种到一个300ml Erlenmeyer烧瓶中，其中含有25ml生长培养基，该培养基含有淀粉(或者低沸点的淀粉或者KOSO)-160g/L；Nutrisoy(Archer Daniels Midland，Decatur，IL)10g/L；Ardamine pH-10g/L；K2HPO4-2g/L；MgSO4·4H2O-2g/L；FeSO4·7H2O-0.02g/L；MnCl2-0.002g/L；ZnSO4·7H2O-0.002g/L；CaCO3-14g/L 2x bcfa(同上)；及环己烷羧酸(CHC)(在pH7.0下制成20％的溶液)-800ppm。pH调至6.9，培养基在121℃下高压灭菌25分钟。
接种后，将烧瓶在29℃下以200rpm振荡培养12天。经过培养，从烧瓶中抽取2ml的样品，用8ml甲醇稀释，混合，混合物在1,250×g下离心10分钟沉淀碎片。用Beckman Ultrasphere ODS柱子(25cm×4.6mm ID)通过HPLC分析上清液，流速为0.75毫升/分钟，并通过在240nm下的吸光度检测。流动相为86/8.9/5.1甲醇/水/乙腈。
7.1.8.除虫链霉菌PKS基因的分离除虫链霉菌(ATCC 31272，SC-2)染色体DNA的粘粒文库用由红色多孢菌聚酮合成酶(PKS)基因片段制成的酮合成酶(KS)探针进行制备及杂交。有关粘粒文库制备的详细描述在下列文献可以找到；Sambrook等人，1989，同上。有关链霉菌染色体DNA文库制备的详细描述在下列文献可以找到；Hopwood等人，1985，同上。含有酮合成酶-杂交区域的粘粒菌落可以通过与一个2.7Kb的来自pEX26(由Dr.P.Leadlay，Cambridge，UK提供)的Ndel/Eco47III片段杂交识别。使用Ndel及Eco47III，大约有5ng pEX26被消化。反应混合物被载于0.8％SeaPlaque GTG琼脂糖凝胶(FMC BioProducts，Rockland，ME上。经过电泳后从凝胶中切除2.7KbNdel/Eco47III片段，并使用Fast Protocol的GELaseTM(EpicentreTechnologies)从凝胶中回收DNA。2.7Kb的Ndel/Eco47III片段用[α-32P]dCTP(脱氧胞苷5′-三磷酸盐，四(三乙胺)盐，[alpha-32P]-)(NEN-Dupont，Boston，MA)按照提供者的指导使用BRL Nick翻译系统(BRL生命技术公司，Gaithersburg，MD)进行标记。在0.05ml体积中进行典型的反应。加入5μl终止缓冲液后，按照厂商指导，将标记的DNA分子用G-25 Sephadex Quick SpinTMColumn(Boehringer Mannheim)从尚未整合的核酸分子中分离。
大约1,800粘粒菌落通过菌落杂交进行筛选。鉴定出10个与红色多孢菌KS探针强力杂交的菌落。包含有粘粒DNA的大肠杆菌菌落在LB液体培养基中生长，按照操作说明用Cycle 3(仪器软件)在AutoGen 540TM自动核酸分离器中从每一培养物中分离粘粒DNA。限制性核酸内切酶图谱及DNA印迹杂交分析揭示了五种菌落中含有重叠的染色体区域。五种粘粒(也即pSE65，pSE66，pSE67，pSE68，pSE69)的除虫链霉菌基因组BamHl酶切图谱通过分析重叠的粘粒及杂交法进行构建(图4)。
7.1.9.调控除虫菌素B2∶B1比例的DNA鉴定及aveC ORF的鉴定下面的方法用于测试来自于pSE66粘粒克隆的亚克隆片段调控AveC突变株中除虫菌素B2∶B1比例的能力。用Sacl及BamHl消化pSE66(5μg)。反应混合物载于0.8％SeaplaqueTMGTG琼脂糖凝胶(FMC BioProducts)，2.9Kb Sacl/BamHl片段切自电泳后的凝胶，并使用Fast Protocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)从凝胶中回收DNA。大约有5μg的穿梭载体pWHM3(Vara等人，1989，J.Bacteriol.17158 72-5881)被Sacl及BamHI所消化。有0.5μg的2.9Kb插入子及0.5μg消化的pWHM3被一起混合，并按照厂商说明用1单位的连接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)在15℃、总体积为20μl条件下孵育过夜。经过孵育，5μl的连接混合物在70℃下孵育10分钟，冷却至室温，按照操作手册用于转化感受态的E.coli DH5α细胞(BRL)。质粒DNA从氨卡青霉素抗性转化子中分离，通过限制性酶切分析可以证实2.9Kb Sacl/BamHI插入子的存在。该质粒被命名为pSE119。
如上7.1.5部分所描述的，除虫链霉菌菌株1100-SC38(Pfizer内部菌株)的原生质体用pSE119进行制备和转化。株1100-SC38是一个突变子，当用环己烷羧酸进行补充时，与除虫菌素环己基-B1形式比较，其产生明显多的除虫菌素环己基-B2形式(B2∶B1的比例大约是30∶1)。用于转化除虫链霉菌原生质体的pSE119从E.coli株GM2163(得自Dr.B.J.Bachmann，Curator，E.coli Genetic Stock Center，YaleUniversity)、E.coli株DM1(BRL)、或者S.lividans株TK64中分离。分离菌株1100-SC38的硫链丝菌肽抗性转化子并通过HPLC分析发酵产品来进行分析。含有pSE119的除虫链霉菌株1100-SC38的转化子产生比例改变的除虫菌素环己基B2环己基-B1，该比例大约是3.7∶1(表2)。
确定了pSE119能够调控AveC突变子中的除虫菌素B2∶B1的比例后，测出插入的DNA序列。按照操作手册，使用质粒DNA分离试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)，大约有10μg的pSE119被分离，然后用ABI 373A自动DNA测序仪(Perkin Elmer，Foster City，CA)进行测序。用遗传学计算机组程序(GCG，Madison，WI)组合和编辑测序数据。DNA序列及aveC ORF在图1(SEQ ID NO1)中已经列出。
如下构建一种新的质粒，命名为pSE118。用SphI及BamHI消化大约5μg的pSE66。将反应混合物载在0.8％SeaPlaque GTG琼脂糖凝胶(FMCBioProducts)上，2.8Kb的SphI/BamHI片段经过电泳从凝胶中切除，使用Fast Protocol的GELaseTM(Epicentre Technologies)从凝胶中回收DNA。大约有5μg的穿梭载体pWHM3被SphI及BamHI所消化。有0.5μg的2.8Kb插入子及0.5μg消化的pWHM3被一起混合，并在15℃、总体积为20μl条件下按照厂商说明用1单位的连接酶(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA)与其一起孵育过夜。经过孵育，5μl的连接混合物在70℃下孵育10分钟，冷却至室温，按照操作手册用于转化受感态的E.coliDH5α细胞。质粒DNA从氨卡青霉素抗性转化子中分离，通过限制性酶切分析可以证实2.8Kb SphI/BamHI插入子的存在。该质粒被命名为pSE118。在pSE118及pSE119中的插入子DNA中大约有838个核苷酸重叠(表4)。
除虫链霉菌株1100-SC38的原生质体用pSE118进行如上转化。分离菌株1100-SC38的硫链丝菌肽抗性转化子并通过HPLC分析发酵产品来进行分析。含有pSE118的除虫链霉菌株1100-SC38的转化株相对于株1100-SC38在除虫菌素环己基B2环己基-B1的比例上并未改变(表2)。
7.1.10.来自除虫链霉菌染色体DNA的aveC基因的PCR扩增一个含有aveC ORF的-1.2Kb片段通过PCR扩增法从除虫链霉菌染色体DNA中分离，其使用的引物按照从上所获的aveC核苷酸序列进行设计。PCR引物由Genosys Biotechnologies，Inc.(Texas)提供。向右引物是5′-TCACGAAACCGGACACAC-3(SEQ ID NO6)；向左引物是5′-CATGATCGCTGAACCGAG-3′(SEQ ID NO7)。在由生产商所提供的缓冲液中用Deep VentTM聚合酶(New England-Biolabs)进行PCR反应，并存在300μM dNTP，10％甘油，200pmol每种引物，0.1μg模板及2.5单位酶，最终体积为100μl，使用Perkin-Elmer Cetus热交换器。第一个循环的热分布图为95℃5分钟(变性步骤)，60℃2分钟(退火步骤)，72℃下2分钟(延伸步骤)。随后的24循环有一个相似的热谱图，但变性步骤的时间缩短至45秒种以及退火时间缩短至1分钟。
PCR产品在1％琼脂糖凝胶中电泳后，检测到一个-1.2Kb的单DNA带。从凝胶中纯化该DNA，并按照操作手册用25ng线性的钝的PCR-钝性载体(Invitrogen)在一个比例为1∶10摩尔的载体插入子进行连接。按照操作手册将连接混合物用于转化ShotTM感受态的E.coil细胞(Invitrogen)。质粒DNA从氨苄青霉素抗性转化子中分离，该～1.2Kb插入子的存在可以通过限制性酶切分析证实。该质粒被命名为pSE179。
来自pSE179的插入子DNA通过用BamHI/XbaI进行消化分离，用电泳法进行分离，从凝胶中纯化，并用穿梭载体pWHM3进行连接(也已被BamHI/XbaI消化)，其在一个以比例为1∶5摩尔的载体与插入子存在的1μg总DNA浓度中进行。按照操作手册连接混合物用于转化感受态的E.coilDH5α细胞。质粒DNA从氨苄青霉素抗性转化体中分离，该～1.2Kb插入子的存在可以通过限制性酶切分析证实。该质粒(被命名为pSE186(图2，ATCC 209604))被转化至E.coil DM1中，并且质粒DNA从氨苄青霉素抗性转化子中分离。
7.2.结果鉴定出来自pSE119的2.9Kb SacI/BamHI酶切片段，当其转化至除虫链霉菌株1100-SC38中时，显著地改变了B2∶B1除虫菌素的产量比。一般情况下，除虫链霉菌株1100-SC38 B2∶B1的比例约为30∶1，但当用含有2.9Kb SacI/BamHI酶切片段的载体转化时，除虫菌素B2∶B1的比例减少至大约3.7∶1。对转化体培养物进行后发酵分析证实了转化DNA的存在。
对2.9Kb pSE119片段进行测序，并鉴定了约0.9Kb的ORF(图1)(SEQ ID NO1)，其包含一个PstI/SphI片段，以前在其它地方发生突变时其仅产生B2产物(Ikeda等人，1995，同上)。该ORF或者其相应诱导的多肽，与已知数据库(GenEMBL，SWISS-PROT)相比，并不表明其与已知DNA或者蛋白序列有任何的同源性。
表2表示用不同质粒进行转化的除虫链霉菌株1100-SC38的发酵分析表2
8.实施例除虫链霉菌Avec突变株的构建本实施例描述了利用上述组分及方法构建几种不同的除虫链霉菌AveC突变株。将突变株引入至链霉菌基因中的技术可以参见Kieser及Hopwood，1991，Meth.Enzym.204430-458的一般描述。一个更加详细的说明可以参见Anzai等人，1988，J.Antibiot XLI(2)226-233及Stutzman-Engwall等人，1992，J.Bacteriol.174(1)144-154。这些参考资料在此都被全文引用。
8.1.除虫链霉菌AveC基因的失活含有失活的AveC基因的AveC突变株可以通过如下所述的几种方法进行构建。
在第一种方法中，一个在pSE119(如上第7.1.9所描述的质粒)aveC基因内部的640bp的SphI/PstI片段被来自于Sacc.erythraea的ermE基因所取代(对于红霉素抗性来说)。用Bg/II及EcoRI通过限制性酶切消化，从pIJ4026(来自John Innes Institute，Norwich，U.K.；还参见Bibb等人，1985，Gene 41357-368)中分离ermE基因，然后进行电泳，并从凝胶中纯化。该约1.7Kb片段连接到pGEM7Zf(Promega)，其用BamHI及EcoRI进行消化，并依照操作手册，将连接混合物转化到感受态的E.coli DH5α细胞中。将质粒DNA从氨苄青霉素抗性转化子中分离，该约1.7Kb插入子的存在可以通过限制性酶切分析证实。该质粒被命名为pSE27。
pSE118(如上第7.1.9部分描述)用SphI及BamHI进行消化，将消化物进行电泳，并将该约2.8Kb SphI/BamHI插入子从凝胶中纯化。pSE119用PstI及EcoRI进行消化，然后进行电泳，并将该约1.5Kb PstI/EcoRI插入子从凝胶中纯化。将穿梭载体pWHM3用BamHI及EcoRI进行消化。pSE27用PstI及SphI进行消化。然后进行电泳，并将该约1.7Kb的PstI/SphI插入子从凝胶中纯化。所有这四个片段(即约2.8Kb，约1.5Kb，约7.2Kb，约1.7Kb)以四种形式连接在一起。依照操作手册，将连接混合物转化到感受态的E.coli DH5α细胞中。从氨苄青霉素抗性转化子中分离质粒DNA，通过限制性酶切分析证实校正插入子的存在。该质粒被命名为pSE180(图3；ATCC209605)。
pSE180被转化入S.lividans TK64细胞，通过抗硫链丝菌肽及红霉素抗生素鉴定已转化的菌落。从S.Lividans中分离pSE180，并且用于转化除虫链霉菌的原生质体。鉴定四种硫链丝菌肽抗性除虫链霉菌转化体，并制备原生质体并将其在非选择性条件的RM14培养基中进行铺板。原生质体再生后，筛选有红霉素抗性及无硫链丝菌肽抗性的单菌落，表明了失活aveC基因的染色体整合及自由复制子的缺失。鉴定ErmrThios转化体，并将其命名为SE180-11菌株。将整个染色体DNA从SE180-11株中进行分离，并用限制性酶BamHI，HindIII，PstI或者SphI进行消化，并在0.8％琼脂糖凝胶中进行电泳分离，然后转移至尼龙膜上，并与ermE探针进行杂交。这些分析显示，ermE抗性基因的染色体整合及伴随的640bpPstI/SphI片段的缺失是由一个双重交换的过程发生的。SE180-11株发酵产品的HPLC分析显示一般的除虫菌素不再产生(图5A)。
在使aveC基因失活的第二种方法中，1.7Kb ermE基因从除虫链霉菌SE180-11株的染色体上除去，在aveC基因中留下一个640bp PstI/SphI缺失。如下构建基因取代质粒用XbaI部分消化pSE180，将约11.4Kb片段从凝胶中纯化。该约11.4Kb带缺少1.7Kb ermE抗性基因。然后该DNA连接并转化进E.coli DH5α细胞。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，校正插入子的存在可以通过限制性酶切分析证实。该质粒(被命名为pSE184)被转化进E.coli DM1中，从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA。该质粒用于转化除虫链霉菌SE180-11株的原生质体。从SE180-11株的硫链丝菌肽抗性转化体中制备原生质体，并在RM14上作为单菌落进行铺板。原生质体再生后，筛选出无红霉素抗性及硫链丝菌肽抗性的单菌落，表明了失活aveC基因的染色体整合及含有ermE基因的自由复制子的缺失。鉴定出ErmrThios并命名为SE184-1-13。对SE184-1-13的发酵分析显示一般的除虫菌素不再产生，SE184-1-13具有与SE180-11相同的发酵特征。
在第三种使aveC基因失活的方法中，使用PCR方法在核苷酸位置471的C后加入两个G将一个移码引进染色体aveC基因上，因此产生一个BspEl位点。加工的EspEl位置的存在对于检测基因替代过程是有用的。设计PCR引物以在aveC基因中引进移码突变，该引物由GenosysBiotechnologies公司所提供。向右引物为5′-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3′(SEQ ID NO8)向左引物为5′-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3′(SEQ IDNO9)。进行PCR的条件如上第7.1.10部分所描述。用Sphl消化666bp的PCR产品，分别给出两个278 bp及388 bp的片段。从凝胶中纯化388bp片段。
基因替代的质粒如下构建用EcoRI及BamHI消化穿梭载体pWHM3。用BamHI及SphI消化pSE119，然后进行电泳，从凝胶中分离约840bp的片段。用EcoRI及XmmI消化pSE119，然后进行电泳分离，并从凝胶中纯化约1.7Kb的片段。四种片段(也即～7.2Kb，～840bp，～1.7Kb及388bp)以四种不同方式连接在一起。连接混合物被转化进感受态的E.coliDH5α细胞中。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，通过限制性酶切分析及DNA序列分析证实校正插入子的存在。该质粒(命名为pSE185)转化进入E.coli DM1细胞，从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA。该质粒用于转化除虫链霉菌株1100-SC38的原生质体。分离菌株1100-SC38的硫链丝菌肽抗性转化体，并通过HPLC分析发酵产品来分析。当pSE185转化入除虫链霉菌株1100-SC38中时，并未明显改变除虫菌素B2∶B1的比例(表2)。
pSE185用于转化除虫链霉菌原生质体以在染色体aveC基因中产生一个移码突变。从硫链丝菌肽抗性转化株制备原生质体，并在RM14培养基上作为单菌落铺板。原生质体再生后，筛选无硫链丝菌肽抗性的单菌落。通过PCR分离和筛选来自硫链丝菌肽敏感的菌落的染色体DNA的整合至染色体中的移码突变的存在。该PCR引物是以aveC核苷酸序列为基础设计的，由Genosys Biotechnologies(Texas)公司提供。向右的PCR引物为5′-GCAAGGATACGGGGACTAC-3′(SEQ ID NO10)，向左的PCR引物为5′-GAACCGACCGCCTGATAC-3′(SEQ ID NO11)，进行PCR的条件如上第7.1.10部分所述。所获得的PCR产品为543bp，当用BspE1进行消化时，可以检测到三个片段368bp，96bp，及79bp，表明了失活aveC基因的染色体整合及自由复制子的缺失。
在aveC基因上含有移码突变的除虫链霉菌突变株发酵分析表明一般的除虫菌素不再产生，这些突变株具有与株SE180-11及SE184-1-13相同的HPLC发酵特征。Thios转化株被鉴定并命名为SE185-5a。
此外，aveC基因上产生突变，使核苷酸位置520由G变为A，其结果是在位置116上编码色氨酸(W)的密码子改变为一个终止密码子。有这种突变的除虫链霉菌株不产生一般的除虫菌素并具有与株SE180-11、SE184-1-13、及SE185-5a相同的发酵特征。
此外，在aveC基因产生的突变改变了两个位置(i)核苷酸位置970由G变为A，使氨基酸位置256从甘氨酸(G)变为天冬氨酸(D)，及(ii)核苷酸位置996由T变为C，使氨基酸位置275从酪氨酸(Y)变为组氨酸(H)。具有这些突变(G256D/Y275H)的除虫链霉菌株并不产生一般的除虫菌素并具有与株SE180-11、SE184-1-13、及SE185-5a相同的发酵特征。
除虫链霉菌aveC失活突变株SE180-11、SE184-1-13、SE185-5a，及此处所提的其它株，提供了筛选工具用于评估aveC基因其它突变的影响。含有aveC基因的野生型拷贝的pSE186转化入E.coil DM1细胞中，使质粒DNA从氨苄青霉素抗性转化株中分离。该pSE186 DNA用于转化除虫链霉菌的SE180-11株。分离SE180-11株的硫链丝菌肽抗性转化体，测定红霉素抗性的存在，通过HPLC分析发酵产品来分析ThiorErmr转化体。反位的功能性aveC基因的存在就能将正常的除虫菌素产量恢复到SE180-11株(图5B)。
8.2改变B2∶B1比例的AveC基因的突变分析如上所述，含有失活的aveC基因的除虫链霉菌菌株SE180-11通过用一含有功能性aveC基因的质粒(pSE186)转化而补充。SE180-11株也可用作宿主菌株来鉴定aveC基因的其它突变，如下所述。
从菌株1100-SC38中分离染色体DNA，并用作aveC基因进行PCR扩增的模板。通过PCR扩增分离1.2Kb ORF，扩增所使用的引物是以aveC核苷酸序列为基础而设计的。向右的引物为SEQ ID NO6，向左的引物为SEQ IDNO7(参见上述第7.1.10部分所述)。PCR及亚克隆条件如第7.1.10部分所述。1.2Kb ORF的DNA序列分析显示了在核苷酸位置337由C变为T的aveC基因突变，在位置55处的氨基酸由丝氨酸(S)变为苯基丙氨酸(F)。含有S55F突变的aveC基因亚克隆入pWHM3以产生一个质粒，其被命名为pSE187，并用于转化除虫链霉菌菌株SE180-11的原生质体。分离SE180-11株的硫链丝菌肽抗性转化体，以确定红霉素抗性的存在，通过HPLC分析发酵产品来分析ThiorErmr转化体。编码氨基酸残基55(S55F)上发生改变的aveC基因的存在，能够将正常的除虫菌素产量恢复到SE180-11株(图5C)；然而，环己基B2环己基B2的比例大约是26∶1，与用pSE186进行转化的SE180-11株相比，其B2∶B1的比例大约是1.6∶1(表3)，显示了单一的突变(S55F)调控了相对于环己基B1的环己基B2的产量。
鉴定出在aveC基因中的另一个突变，使核苷酸位置862由G变为A，位置230处的氨基酸由甘氨酸(G)变为天冬氨酸(D)。含有该突变(G230D)的除虫链霉菌株产生的除虫菌素B2∶B1的比例大约是30∶1。
8.3.减少B2∶B1比例的突变可以如下构建减少环己基-B2对环己基-B1比例的几种突变。
鉴定出aveC基因的突变，使核苷酸位置588由G变为A，位置139处的氨基酸由丙氨酸(A)变为苏氨酸(T)。含有A139T突变的aveC基因被亚克隆入pWHM3中以产生一个质粒，其命名为pSE188，其被用于转化除虫链霉菌SE180-11株的原生质体。分离SE180-11株的硫链丝菌肽抗性转化体，测定红霉素抗性株的存在，通过HPLC分析发酵产品来分析ThiorErmr转化体。编码氨基酸残基139(A139T)变化的突变的aveC基因的存在能够将除虫菌素产量恢复至SE180-11株(表5D)；然而，B2∶B1的比例约是0.94∶1，这表明该突变减少了环己基B2相对于环己基B1的产量。该结果并不是预期的，因为公布的结果以及上述突变的结果仅仅证明了aveC基因的失活或者增加除虫菌素B2形式相对于B1形式的产量(见表3)。
因为A139T突变以更加适宜的B1方向改变了B2∶B1的比例，因此构建编码氨基酸位置138的苏氨酸而非丝氨酸的突变。这样，用EcoRI消化pSE186并克隆入已经被EcoRI消化的pGEM3Zf(Promega)中。该被命名为psE186a的质粒用ApaI及KpnI进行消化，在琼脂糖凝胶中分离DNA片段，从凝胶中纯化两个片段～3.8Kb及～0.4Kb。来自pSE186的～1.2Kb插入的DNA片段被用作一个PCR模板以诱发在核苷酸位置585上发生单一碱基的改变。将PCR引物设计成在核苷酸位置585能引进一个突变，该引物是由GenosysBiotechnologies公司(Texas)提供。向右的PCR引物为5′-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3′(SEQ ID NO12)；向左的PCR引物为5′-GGAACCGACCGCCTGATACA-3′(SEQ ID NO13)。使用先进的GC基因组PCR试剂盒(Clonetech Laboratories，Palo Alto，CA)在由厂商提供的缓冲液中在存在200μM dNTPs，200pmol每种引物，50ng模板DNA，1.0M GC-Melt及1单位的KlenTaq多聚酶混合物下，最终体积为50μl，进行PCR反应。第一循环的热学曲线为94℃1分钟，接下来25个循环都是以94℃30秒钟及68℃2分钟进行，及一个循环68℃3分钟。将295bp的PCR产品用ApaI及KpnI进行消化以释放一个254bp的片段，其通过电泳进行分辨并从凝胶中纯化。所有三种片段(～3.8Kb，-0.4Kb及254bp)用三种方式连接在一起。将连接混合物转化入完整的E.coil DH5α细胞中。质粒DNA从氨苄青霉素抗性转化株中分离，校正插入子的存在可以通过限制性酶切分析确认。该质粒被命名为pSE198。
pSE198用EcoRI进行消化，克隆进入已经用EcoRI消化的pWHM3中，并将其转化进入E.coil DH5α细胞中。从氨苄青霉素抗性转化株中分离质粒DNA，通过限制性酶切分析及DNA序列分析确认校正插入子的存在。该质粒DNA转化进入E.coil DM1，从氨苄青霉素抗性转化株中分离质粒DNA，通过限制性酶切分析确认校正插入子的存在。该质粒，被命名为pSE199，可以用于转化除虫链霉菌株SE180-11原生质体。分离菌株SE180-11的硫链丝菌肽抗性转化株，确定红霉素抗性的存在，通过用HPLC法分析发酵产品而分析ThiorErmr转化株。编码在氨基酸残基138(S138T)位发生改变的突变aveC基因的存在能够将正常的除虫菌素产量恢复至株SE180-11；然而，B2∶B1的比例为0.88∶1，表明了该突变减少了环己基-B2相对于环己基-B1的数量(见表-3)。该B2∶B1的比例甚至低于0.94∶1(这是用pSE188转化菌株SE180-11而产生的A139T突变所观察到的比例，如上所述)。
构建另一个突变以同时在氨基酸位置138及139处引进一个苏氨酸。来自于pSE186的约1.2Kb插入的DNA被用做PCR的模板。将PCR引物设计成能在核苷酸位置585及588处诱发突变，该引物由Genosys Biotechnologies公司(Texas)提供。向右的PCR引物为5’-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3′(SEQ ID NO14)；向左的PCR引物为5′-GGAACATCACGGCATTCACC-3′(SEQ ID NO15)。使用本部分上述的条件进行PCR反应。用Apal及Kpnl消化449bp的PCR产物以释放254bp的片段，其通过电泳进行分辨并从凝胶中纯化。将pSE186a用ApaI及KpnI进行消化，在琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段，及将3.8Kb与0.4Kb的两个片段从凝胶中提纯。所有这三个片段(～3.8Kb，～0.4Kb及254bp)以三种方式进行连接，连接混合物被转化进入活性的E.coliDH5α细胞中。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，通过限制性酶切分析确认校正插入子的存在。该质粒被命名为pSE230。
用EcoRI消化pSE230，克隆进已经被EeoRI消化的pWHM3质粒中，并且转化进入E.coli DH5α细胞中。从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，通过限制性酶切分析及DNA序列分析确认校正插入子的存在。该质粒DNA被转化进入E.coli DM1细胞中，从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，通过限制性酶切分析确认校正插入子的存在。该质粒，其被命名为pSE231，用于转化除虫链霉菌株SE180-11的原生质体。分离SE180-11的硫链丝菌肽抗性转化体，确定红霉素抗性株的存在，然后通过发酵分析ThiorErmr。编码S138T/A139T的双重突变的aveC基因的存在能够使正常的除虫菌素产量恢复到SE180-11株；然而，B2∶B1的比例为0.84∶1，显示了与用pSE188或者pSE199转化SE180-11株所提供的减少量相比，该突变进一步减少了环己基-B2相对于环己基B1的产量(见表3)。
表3
这些结果第一次证明了发生在aveC基因上特定的突变提高了商业上所需要的1类除虫菌素相对于2类除虫菌素的产量。
9.实施例5′端缺失突变子的构建如上面第5.1部分所解释的那样，如图1(SEQ ID NO1)所显示的除虫链霉菌核苷酸序列在为潜在的起始位点的四个bp位置42，174，177及180处有四个不同的GTG密码子。本部分将要描述aveC ORF(图1；SEQ IDNO1)5′区多重缺失的构建，以帮助确定这些密码子中哪个在aveC ORF中用作蛋白表达的起始位点。
在5’端有各种缺失的aveC基因片段可以通过PCR扩增从除虫链霉菌染色体DNA中分离。PCR引物以aveC DNA序列为基础进行设计，其由GenosysBiotechnologies公司提供。向右的引物为5′-AACCCATCCGAGCCGCTC-3′(SEQ ID NO16)(D1F1)；5′-TCGGCCTGCCAACGAAC-3’(SEQ ID NO17)(D1F2)；5′-CCAACGAACGTGTAGTAG-3′(SEQ ID NO18) (D1F3)；及5′-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3′(SEQ ID NO19)(D2F2)。向左的引物为5′-CATGATCGCTGAACCGA-3′(SEQ ID NO20)；5′-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3′(SEQ ID NO21)；及5′-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3′(SEQ ID NO22)。PCR反应如上述第8.3部分进行。
通过在1％琼脂糖凝胶中进行电泳来分离PCR产品，检测到的单一DNA带为1.0Kb或者1.1Kb。从凝胶中纯化PCR产品，并依照操作手册用25ng线性化的pCR2.1载体(Invitrogen)以1∶10摩尔载体-插入片段的比例进行连接。依照操作手册将连接混合物用于转化One ShotTM感受态的E.coli细胞(Invitrogen)。从氨苄青霉素抗性转化体中分离出质粒DNA，该插入片段的存在通过限制性酶切分析及DNA序列分析确认。这些质粒被命名为pSE190(用引物D1F1获得)、pSE191(用引物D1F2获得)、pSE192(用引物D1F3获得)及pSE193(用引物D2F2获得)。
将插入的DNA分别用BamHI/XbaI进行消化，通过电泳进行分离，从凝胶中纯化，并用在一个总DNA浓度为1μg以1∶5摩尔载体-插入片段比例时分别与已经用BamHI/XbaI消化的穿梭载体pWHM3连接。连接混合物被用于转化活性的E.coli DH5α细胞。从氨苄青霉素抗性转化体中分离出质粒DNA，插入片段的存在可以通过限制性酶切分析进行确认。这些质粒被命名为pSE194(D1F1)、pSE195(D1F2)、pSE196(D1F3)及pSE197(D2F2)，被分别转化进入E.Coli株DM1中，从氨苄青霉素抗性转化体中分离质粒DNA，通过限制性酶切分析确认校正插入片段的存在。该DNA被用于转化除虫链霉菌株SE180-11的原生质体。分离菌株SE180-11的硫链丝菌肽抗性转化体，确定红霉素抗性转化体的存在，通过HPLC分析发酵产品来分析Thior Errnr转化体以确定哪一个GTG位点为aveC表达所必需。结果指出在位置42处的GTG密码子可以被消除，并不影响aveC的表达，因为pSE194、pSE195及pSE196每一个都缺乏位置42处的GTG位点，但在位置174、177及180处有三个GTG位点，当转化进SE180-11时，每一个都能恢复正常的除虫菌素产量。只有当SE180-11株用缺少所有这四种GTG位点的pSE197进行转化时，其才不能恢复正常的除虫菌素产量(表4)。
表4
10.实施例克隆吸水链霉菌及产灰色链霉菌的aveC同系物本发明鉴定和克隆了链霉菌的其它产生除虫菌素或比蜜霉素菌种的aveC同系物基因。例如，吸水链霉菌(FERM BP-1901)基因组DNA的粘粒文库与上述除虫链霉菌的1.2Kb aveC探针杂交。鉴定出几种有很强的杂交的粘粒菌落。将染色体DNA从这些粘粒中分离，并鉴定出4.9Kb KpnI片段与aveC探针杂交。测定该DNA的序列，鉴定出与除虫链霉菌的aveC ORF有很明显的同源性的ORF(SEQ ID NO3)。从吸水链霉菌aveC同系物ORF推导出来的氨基酸序列(SEQ ID NO4)如图6所示。
此外，将产灰色链霉菌基因组DNA的粘粒文库与来自上述的除虫链霉菌的1.2Kb aveC探针进行杂交。鉴定出几种强烈杂交的粘粒克隆。从这些粘粒中分离染色体DNA，鉴定出一个与aveC探针杂交的5.4Kb的PstI片段。对该DNA进行测序，并鉴定出与除虫链霉菌的aveC ORF有很明显的同源性的aveC同系物的部分ORF。推导出来的部分氨基酸序列(SEQ ID NO5)如图6所示。
来自吸水链霉菌和产灰色链霉菌的aveC同系物的DNA与氨基酸序列分析显示这些区域彼此之间共有明显的同源性(在氨基酸水平上约有50％的序列同一性)或者与除虫链霉菌aveC ORF及AveC基因产物也有明显的同源性(图6)。
11.实施例在ermE启动子后用aveC基因构建质粒pSE186的1.2Kb aveC ORF被亚克隆在pSE34中，其为一个穿梭载体pWHM3，具有300bp ermE启动子，该启动子作为一个KpnI/BamHI片段被插入在pWHM3的KpnI/BamHI位点(参见Ward等人，1986，Mol.Gen.Genet 203468478)。用BamHI及HindIII消化pSE186，通过电泳分辨消化物，将1.2Kb片段从琼脂糖凝胶中分离并与已经用BamHI及HindIII消化的pSE34进行连接。依照操作说明，该连接混合物被转化进入感受态的E.coil DH5α细胞中。从氨苄青霉素抗性转化体中分离出质粒DNA，通过限制性酶切分析确认1.2Kb插入片段的存在。该质粒(被命名为pSE189)被转化进入E.coli DM1中，并从氨苄青霉素抗性转化体中分离出质粒DNA。用pSE189转化除虫链霉菌菌株1100-SC38的原生质体。分离菌株1100-SC38的硫链丝菌肽抗性转化体，并通过HPLC分析发酵产品来进行分析。
含有pSE189的除虫链霉菌株1100-SC38转化体所产生的除虫菌素的环己基-B2与环己基-B1的比例(大约是3∶1)相对于菌株1100-SC38所产生的上述物质的比例(大约是34∶1)已经改变，但与用pSE119进行转化的菌株1100-SC38相比，总的除虫菌素产量增加了约2.4倍(表5)。
pSE189也可以转化进入野生型除虫链霉菌菌株的原生质体中。分离硫链丝菌肽抗性转化株，并通过HPLC分析发酵产物来进行分析。用pSE189转化的除虫链霉菌野生型的除虫菌素总产量与用pSE119转化的野生型除虫链霉菌株相比增加了2.2倍(表5)。
表5
12.实施例含有除虫链霉菌aveC ORF及吸水链霉菌aveC同系物序列的嵌合质粒如下所述，构建命名为pSE350的杂合质粒，其含有564bp部分的吸水链霉菌aveC同系物，取代除虫链霉菌aveC ORF的564bp的同系物部分(见图7)。使用BsaAI限制性位点和KpnI限制性位点构建pSE350，BsaAI限制性位点存在于两个序列中(aveC 225位)，KpnI限制性位点存在于除虫链霉菌aveC基因中(aveC 810位)。用上述第7.1.10部分所述的PCR条件，通过PCR将kpnI位点引入吸水链霉菌DNA中，其所用的向右引物为5’-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3’(SEQ ID NO23)，向左引物为5’-GAACTGGTACCAGTGCCC-3’(SEQ ID NO24)(由Genosys Biotechnologies公司提供)。将PCR产物用BsaAI及KpnI进行消化，通过在1％琼脂糖凝胶中进行电泳来分离这些片段，从凝胶中分离564bp的BsaAI/KpnI片段。将pSE179(如上述第7.1.10部分所述)用KpnI及HindIII消化，通过在1％琼脂糖凝胶中进行电泳以分离这些片段，并将约4.5Kb的片段从凝胶中分离。用HindIII及BsaAl消化pSE179，通过在1％琼脂糖凝胶中进行电泳来分离这些片段，并从凝胶中分离一个约0.2Kb的BsaAI/HindIII片段。该4.5Kb的HindIII/kpnI片段、0.2Kb BsaAl/HindIII片段及来自于吸水链霉菌的564 bp的BsaAI/KpnI片段以三种方式连接在一起，该连接混合物转化进感受态的E.coli DH5α细胞中。从氨苄青霉素抗性转化体中分离出质粒DNA，通过使用KpnI及AvaI限制性酶切分析确认该校正插入片段的存在。该质粒用HindIII及XbaI进行消化以释放1.2Kb插入片段，然后与pWHM3(其已经用HindIII及XbaI消化)进行连接。将该连接混合物转化进感受态的E.coli DH5α细胞中。从氨苄青霉素抗性转化体中分离出质粒DNA，并用HindIII及AvaI限制性酶切分析确认校正插入片段的存在。该质粒DNA转化进入E.coli DM1中，从氨苄青霉素抗性转化体中分离出质粒DNA，通过限制性酶切分析及DNA序列分析确认校正插入片段的存在。该质粒被命名为pSE350，并用于转化除虫链霉菌株SE180-11的原生质体。将菌株SE180-11的硫链丝菌肽抗性转化体分离，确定有红霉素抗性存在，并通过HPLC分析发酵产物对Thior Ermr转化体进行分析。结果显示出含有除虫链霉菌/吸水链霉菌杂合质粒的转化体的平均B2∶B1比例约为109∶1(参见表6)。
表6
生物材料的保藏1998年1月29日，下列生物材料保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，MD，20852，USA，给出下列保藏号质粒保藏号质粒pSE180 209605质粒pSE186 209604以上所引用的全部的专利，专利申请，及公开文献在此全面引作参考。
本发明并不局限于本文所描述的具体实施方案的范围，这些仅为本发明各个方面的个别举例，功能上相当的方法及组合物都属于本发明的范围。实际上，除了上述说明及示例外，从上述说明和附图，本发明的各种变化对于本领域技术人员来说都是很明显的。这些变化都将落入所附权利要求书的保护范围之内。
序列表<110>辉瑞产品公司(非美国申请)<120>介导除虫菌素B2∶B1比例的除虫链霉菌基因<130>PC9916A<140>
<141>
<150>60/074,636<151>1998-02-13<160>24<170>PatentIn Ver.2.0-beta<210>1<211>1229<212>DNA<213>除虫链霉菌<220>
<221>CDS<222>(174)..(1085)<400>1tcacgaaacc ggacacacca cacacacgaa ggtgagacag cgtgaaccca tccgagccgc 60tcggcctgcc caacgaacgt gtagtagaca cccgaccgtc cgatgccacg ctctcacccg 120aggccggcct gaacaggtca ggagcgctgc cccgtgaact gctgtcgttg ccg gtg 176Val1gtg gtg tgg gcc ggg gtc ggc ctg ctg ttt ctg gcc ctg cag gcg tac224Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala Tyr5 10 15gtg ttc agc cgc tgg gcg gcc gac ggt ggc tac cgg ctg atc gag acg272Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu Ile Glu Thr20 25 30gcg ggc cag ggt cag ggc ggc agc aag gat acg ggg act acc gat gtg320Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Asp Val35 40 45gtc tat ccc gtg att tcc gtc gtc tgc atc acc gcc gcg gcg gcg tgg368
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<210>5<211>215<212>PRT<213>灰产色链霉菌<400>5Val Ile Gly Trp Ala Ala Leu Gly Ala Val Phe Leu Val Leu Gln Val1 5 10 15Tyr Val Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Gly Gly Tyr His Leu Ala Asp20 25 30Val Ser Gly Pro Asp Gly Arg Glu Pro Gly His Arg Arg Ile Ile Asp35 40 45Val Leu Leu Pro Ala Leu Ser Met Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Phe50 55 60Trp Leu Val Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Phe Asp Ala65 70 75 80Leu Leu Phe Thr Gly Val Leu Phe Ala Gly Trp Leu Ser Pro Leu Met85 90 95Asn Trp Phe His Pro Val Leu Met Ala Asn Thr His Val Trp Gly Ala100 105 110Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Arg Gly Leu Pro Pro115 120 125Gly Lys Glu Ala Glu Leu Pro Leu Val Thr Phe Ser Leu Gly Ser Thr130 135 140Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Cys Cys Gln Val Met Ser Arg Val Arg145 150 155 160Glu Arg Trp Pro Gly Val Arg Pro Trp Gln Leu Val Gly Leu Ala Phe165 170 175Leu Thr Ala Val Ala Phe Asp Leu Ser Glu Pro Phe Ile Ser Phe Ala180 185 190Gly Val Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Thr Val Thr Leu Trp Arg195 200 205Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg210 215<210>6
<211>18<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>6tcacgaaacc ggacacac 18<210>7<211>18<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>7catgatcgct gaaccgag 18<210>8<211>20<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>8ggttccggat gccgttctcg20<210>9<211>21<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>9aactccggtc gactcccctt c 21<210>10<211>19<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>10gcaaggatac ggggactac 19<210>11<211>18<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>11
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<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>17tcggcctgcc aacgaac 17<210>18<211>18<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>18ccaacgaacg tgtagtag 18<210>19<211>20<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>19tgcaggcgta cgtgttcagc 20<210>20<211>17<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>20catgatcgct gaaccga 17<210>21<211>20<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>21catgatcgct gaaccgagga 20<210>22<211>20<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>22aggagtgtgg tgcgtctgga 20
<210>23<211>19<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>23cttcaggtgt acgtgttcg 19<210>24<211>18<212>DNA<213>除虫链霉菌<400>24gaactggtac cagtgccc18
权利要求
1.分离的多核苷酸分子，其包含除虫链霉菌完整的aveC ORF或其实质性部分，该分离的多核苷酸分子缺少位于除虫链霉菌染色体中aveC ORF原位下游的下一个完整的ORF。
2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸分子，其包括与质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列相同的核苷酸序列，或者与图1(SEQ ID NO1)所示的aveC ORF核苷酸序列或其实质性部分相同的核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的分离的多核苷酸分子，其进一步包括天然侧翼于除虫链霉菌中的原位AveC基因的核苷酸序列。
4.分离的多核苷酸分子，其包括与质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列，或者与图1(SEQ ID NO1)所示的aveCORF的核苷酸序列或其实质性部分具有同源性的核苷酸序列。
5.分离的多核苷酸分子，其包括编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有的氨基酸序列与质粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因产物编码序列所编码的氨基酸序列，或者与图1(SEQ ID NO2)所示的氨基酸序列或其实质性部分具有同源性。
6.分离的多核苷酸分子，其包括SEQ ID NO3的核苷酸序列或其实质性部分，或者与SEQ ID NO3的核苷酸序列具有同源性的核苷酸序列。
7.分离的多核苷酸分子，其包括编码多肽的核苷酸序列，该多肽与SEQ ID NO4的氨基酸序列具有同源性。
8.寡核苷酸分子，其在高度严紧的条件下，与具有图1(SEQ ID NO1)或者SEQ ID NO3的核苷酸序列的多核苷酸分子进行杂交，或者与具有与图1(SEQ ID NO1)或者SEQ ID NO3的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸分子进行杂交。
9.如权利要求8所述的寡核苷酸分子，其与图1(SEQ ID NO1)或者SEQ ID NO3的核苷酸序列互补，或者与具有与表1(SEQ ID NO1)或者SEQ ID NO3的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸分子互补。
10.重组载体，其包括多核苷酸分子，该多核苷酸分子含有选自下列的核苷酸序列(a)核苷酸序列，其与质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列相同，或者与图1(SEQ ID NO1)的aveC ORF的核苷酸序列或其实质性部分相同；(b)核苷酸序列，其与质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列，或者与图1(SEQ ID NO1)的aveC ORF的核苷酸序列或其实质性部分具有同源性；(c)核苷酸序列，其编码的多肽具有的氨基酸序列与质粒pSE186(ATCC 209604)的AveC基因产物编码序列所编码的氨基酸序列，或者与图1(SEQ ID NO2)的氨基酸序列或其实质性部分具有同源性。
11.如权利要求10所述的重组载体，其进一步包括编码一个或多个调控元件的核苷酸序列，该编码调控元件的核苷酸序列与如权利要求10所述的核苷酸序列可操作相连。
12.如权利要求11所述的重组载体，其进一步包括编码选择性标记的核苷酸序列。
13.如权利要求12所述的重组载体，其为质粒PSE186(ATCC209604)。
14.包括如权利要求12所述的重组载体的宿主细胞。
15.如权利要求14所述的宿主细胞，其为除虫链霉菌。
16.重组载体，其包括含有核苷酸序列的多核苷酸分子，所述核苷酸序列选自下列序列SEQ ID NO3的核苷酸序列或其实质性部分，与SEQID NO3所示的核苷酸序列具有同源性的核苷酸序列，编码与SEQ IDNO4所示的氨基酸序列具有同源性的多肽的核苷酸序列。
17.如权利要求16所述的重组载体，进一步包括编码一个或多个调控元件的核苷酸序列，该编码调控元件的核苷酸序列与如权利要求16所述的核苷酸序列可操作相连。
18.如权利要求17所述的重组载体，进一步包括编码选择性标记的核苷酸序列。
19.包括如权利要求18所述的重组载体的宿主细胞。
20.如权利要求19所述的宿主细胞，其为吸水链霉菌。
21.重组表达的除虫链霉菌AveC基因产物或其同源性多肽，所述基因产物具有由质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列或其实质性部分。
22.重组表达的吸水链霉菌AveC同系物基因产物或其同源多肽，所述基因产物具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列。
23.用于生产重组AveC基因产物的方法，其包括在利于重组AveC基因产物生产的条件下培养用重组表达载体转化的宿主细胞，并从细胞培养物中回收AveC基因产物，所述重组表达载体包括具有核苷酸序列的多核苷酸分子，所述核苷酸序列编码由质粒pSE186(ATCC 209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码核苷酸序列所编码的氨基酸序列，或者编码SEQ IDNO2所示的氨基酸序列或其实质性部分，所述多核苷酸分子与一个或多个控制多核苷酸分子在宿主细胞中的表达的调控元件可操作相连。
24.用于生产重组AveC同系物基因产物的方法，其包括在利于重组AveC同系物基因产物生产的条件下培养用重组表达载体转化的宿主细胞，并从培养物中回收AveC同系物基因产物，所述重组表达载体包括具有核苷酸序列的多核苷酸分子，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO4所示的氨基酸序列或其实质性部分，所述多核苷酸分子与一个或多个控制多核苷酸分子在宿主细胞中的表达的调控元件可操作相连。
25.多核苷酸分子，其具有的核苷酸序列或者与质粒pSE186(ATCC209604)的除虫链霉菌AveC基因产物编码序列相同，或者与如图1(SEQ IDNO1)所示的除虫链霉菌的aveC ORF的核苷酸序列相同；但是该核苷酸序列进一步包括一个或多个突变，从而使得其中野生型aveC等位基因已经失活并且表达含有突变的核苷酸序列的多核苷酸分子的除虫链霉菌菌株ATCC53692的细胞产生的除虫菌素的比例和量与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌菌株ATCC 53692的细胞所产生的比例和量有所不同。
26.如权利要求25所述的多核苷酸分子，其调制除虫菌素的生产，使得其中野生型aveC等位基因已经失活并且表达权利要求25所述的多核苷酸分子的除虫链霉菌菌株ATCC 53692的细胞与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌菌株ATCC 53692的细胞相比以降低的2类∶1类比例产生除虫菌素。
27.如权利要求26所述的多核苷酸分子，其中2类∶1类除虫菌素为环己基B2∶环己基B1除虫菌素。
28.如权利要求27所述的多核苷酸分子，其中降低的环己基B2∶环己基B1比例小于1.6∶1。
29.如权利要求28所述的多核苷酸分子，其中降低的环己基B2∶环己基B1比例约为0.94∶1。
30.如权利要求29所述的多核苷酸分子，其中图1(SEQ ID NO1)所示的除虫链霉菌AveC ORF的突变编码AveC基因产物的残基139处由丙氨酸变为苏氨酸的氨基酸取代。
31.如权利要求28所述的多核苷酸分子，其中降低的环己基B2∶环己基B1的比例大约为0.88∶1。
32.如权利要求31所述的多核苷酸分子，其中图1(SEQ ID NO1)所示的除虫链霉菌AveC ORF的突变编码AveC基因产物的残基138处由丝氨酸变为苏氨酸的氨基酸取代。
33.如权利要求28所述的多核苷酸分子，其中降低的环己基B2∶环己基B1比例大约为0.84∶1。
34.如权利要求33所述的多核苷酸分子，其中图1(SEQ ID NO1)所示的除虫链霉菌AveC ORF的突变编码AveC基因产物的残基138处由丝氨酸变为苏氨酸的第一氨基酸取代，和AveC基因产物的残基139处由丙氨酸变为苏氨酸的第二氨基酸取代。
35.如权利要求25所述的多核苷酸分子，其中图1(SEQ ID NO1)所示的除虫链霉菌AveC ORF的突变编码AveC基因产物的残基55处由丝氨酸变为苯丙氨酸的氨基酸取代。
36.如权利要求25所述的多核苷酸分子，其中图1(SEQ ID NO1)所示的除虫链霉菌AveC ORF的突变编码AveC基因产物的残基230处由甘氨酸变为天冬氨酸的氨基酸取代。
37.含有强启动子的多核苷酸分子，所述启动子与图1(SEQ ID NO1)所示的除虫链霉菌AveC ORF可操作相连。
38.如权利要求37所述的多核苷酸分子，其中所述强启动子是来自红色多孢菌的ermE启动子。
39.多核苷酸分子，其包含的编码AveC基因产物的核苷酸序列已通过将异源核苷酸序列插入所述核苷酸序列中而失活。
40.如权利要求25所述的多核苷酸分子，其包括aveC等位基因，该等位基因通过从图1(SEQ ID NO1)的AveC ORF中缺失640bp的PstI/SphI片断而失活。
41.如权利要求25所述的多核苷酸分子，其包括aveC等位基因，该等位基因通过向该等位基因中导入移码突变而失活。
42.如权利要求41所述的多核苷酸分子，其中通过在图1(SEQ IDNO1)的aveC ORF的471位核苷酸处的C核苷酸后增加两个G核苷酸而导入移码突变。
43.如权利要求25所述的多核苷酸分子，其包括aveC等位基因，其中通过在编码除虫链霉菌AveC基因产物的第116位氨基酸的核苷酸位置处导入终止密码子而使该等位基因失活。
44.如权利要求25所述的多核苷酸分子，其包括aveC等位基因，其中通过在AveC基因产物的氨基酸位置258处导入由甘氨酸变为天冬氨酸的第一突变，并在AveC基因产物的氨基酸位置275处导入由酪氨酸变为组氨酸的第二突变而使aveC等位基因失活。
45.基因取代载体，其包括的多核苷酸分子含有天然侧翼于除虫链霉菌染色体中的原位AveC基因的核苷酸序列。
46.重组载体，其包括如权利要求25-44任一所述的多核苷酸分子。
47.重组载体，其含有如权利要求39所述的多核苷酸分子，所述载体为pSE180(ATCC 209605)。
48.含有如权利要求46所述的重组载体的链霉菌宿主细胞。
49.鉴别aveC ORF中能够改变所产生的除虫菌素2类∶1类比例的突变的方法，所述方法包括(a)测定除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素2类∶1类的比例，所述细胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有编码突变的AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子被导入该细胞并在其中被表达；(b)测定与步骤(a)的除虫链霉菌相同的菌株细胞产生的除虫菌素2类∶1类的比例，但不同的是该细胞仅表达具有如图1(SEQ 1D NO1)所示的ORF的核苷酸序列或者与其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比较步骤(a)的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素2类∶1类的比例与步骤(b)的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素2类∶1类的比例，如果二者不同的话，则可以证实有能够改变除虫菌素2类∶1类比例的aveC ORF突变存在。
50.如权利要求49所述的方法，其中除虫菌素2类∶1类的比例因突变而减少。
51.鉴定aveC ORF或者包含有aveC ORF的构建体中能够改变所产生的除虫菌素量的突变的方法，所述方法包括(a)测定除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的量，所述细胞中的野生型aveC等位基因已失活，包含有编码突变的AveC基因产物的核苷酸序列或含有编码AveC基因产物的核苷酸序列的基因构建体的多核苷酸分子被导入该细胞并在其中表达；(b)测定与步骤(a)的除虫链霉菌相同的菌株细胞产生的除虫菌素的量，但不同的是该细胞仅表达具有如图1(SEQ ID NO1)所示的ORF的核苷酸序列或者与其同源的核苷酸序列的aveC等位基因；及(c)比较步骤(a)的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的量与步骤(b)的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的量，如果二者不同的话，则可以证实有能够改变除虫菌素量的aveC ORF或基因构建体突变存在。
52.如权利要求51所述的方法，其中所产生的除虫菌素的量因突变而增加。
53.制备除虫链霉菌新菌株的方法，所述菌株包含有能够表达突变的aveC等位基因的细胞，其与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株细胞相比，所产生的除虫菌素的2类∶1类比例发生改变，所述方法包括用携有突变的aveC等位基因的载体转化除虫链霉菌菌株细胞，该突变的aveC等位基因编码的基因产物使得表达突变的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株细胞与仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株细胞相比，所产生的除虫菌素的2类∶1类比例发生改变，选择转化细胞，该转化细胞产生的除虫菌素2类∶1类比例较仅表达野生型aveC等位基因的菌株细胞有所改变。
54.如权利要求53所述的方法，其中除虫菌素2类∶1类的比例因突变而减少。
55.制备除虫链霉菌新菌株的方法，所述菌株包括能产生改变量的除虫菌素的细胞，所述方法包括用含有突变aveC等位基因或者含有该aveC等位基因的基因构建体转化除虫链霉菌菌株细胞，其表达的结果使表达突变aveC等位基因或基因构建体的除虫链霉菌菌株细胞所生产的除虫菌素量较仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株细胞产生的除虫菌素的量有所改变，挑选已转化的细胞，该转化细胞产生的除虫菌素量较仅表达野生型aveC等位基因的菌株细胞产生的除虫菌素量有所改变。
56.如权利要求55所述的方法，其中所产生的除虫菌素的量因突变而增加。
57.制备除虫链霉菌新菌株的方法，所述菌株细胞含有失活的aveC等位基因，所述方法包括用使该aveC等位基因失活的载体转化除虫链霉菌菌株细胞，并且选择其中aveC等位基因已经失活的转化细胞。
58.如权利要求57所述的方法，其中载体是pSE 180(ATCC209605)。
59.除虫链霉菌菌株，其含有表达突变的aveC等位基因的细胞，结果产生2类∶1类比例有所改变的除虫链霉菌细胞，所述的2类∶1类比例的改变是相对于仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株细胞而言的。
60.如权利要求59所述的菌株，其中除虫菌素2类∶1类的比例因突变而减少。
61.如权利要求60所述的细胞株，其中细胞所产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例小于1.6∶1。
62.如权利要求61所述的菌株，其中细胞所产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例大约是0.94∶1。
63.如权利要求61所述的菌株，其中细胞所产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例大约是0.88∶1。
64.如权利要求61所述的菌株，其中细胞所产生的环己基B2∶环己基B1除虫菌素的比例大约是0.84∶1。
65.除虫链霉菌菌株，其含有表达突变的aveC等位基因或者基因构建体的细胞，结果产生量有所增加的除虫菌素，所述的量增加是相对于仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株细胞而言的。
66.除虫链霉菌菌株，其含有aveC基因已经失活的细胞。
67.生产除虫菌素的方法，所述方法包括在允许或者诱导除虫菌素生产的条件下，在培养基中培养除虫链霉菌菌株细胞，并从培养物中回收除虫菌素，所述细胞表达突变的aveC等位基因，与不表达突变aveC等位基因而仅表达野生型的aveC等位基因的相同菌株细胞相比，该突变等位基因编码的基因产物改变了表达突变的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的2类∶1类的比例。
68.如权利要求67所述的方法，其中除虫菌素的2类∶1类的比例因突变而减少。
69.生产除虫菌素的方法，所述方法包括在允许或者诱导除虫菌素生产的条件下，在培养基中培养除虫链霉菌菌株细胞，并从培养物中回收除虫菌素，所述细胞表达突变的aveC等位基因或含有aveC等位基因的基因构建体，与不表达突变aveC等位基因或基因构建体而仅表达野生型的aveC等位基因的相同菌株细胞相比，表达突变的aveC等位基因或基因构建体的除虫链霉菌菌株细胞产生的除虫菌素的量有所改变。
70.如权利要求69所述的方法，其中所产生的除虫菌素的量通过表达突变的aveC等位基因或基因构建体而增加。
71.由除虫链霉菌菌株细胞所产生的除虫菌素组合物，所述细胞表达编码基因产物的突变的aveC等位基因，所述基因产物减少了表达突变的aveC等位基因的除虫链霉菌菌株细胞所产生的除虫菌素2类∶1类比例，所述除虫菌素2类∶1类比例的减少是相对于不表达突变的aveC等位基因而仅表达野生型aveC等位基因的相同菌株细胞而言的，其中相对于不表达突变的aveC等位基因而仅表达野生型aveC等位基因的除虫链霉菌相同菌株细胞所产生的除虫菌素2类∶1类比例而言，以减少的2类∶1类比例生产除虫菌素。
全文摘要
本发明涉及包含有编码aveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子，该多核苷酸分子可被用于改变除虫链霉菌发酵培养物中所产生的除虫菌素2类∶1类的比例或量。本发明进一步涉及载体、宿主细胞和除虫链霉菌的突变菌株，其中aveC基因已经被失活或突变以改变所产生的除虫菌素2类∶1类的比例或量。
文档编号C12P19/62GK1521180SQ20041000541
公开日2004年8月18日 申请日期1999年1月25日 优先权日1998年2月13日
发明者金·J·施图茨曼-恩格沃尔, 加藤芳弘, 哈米什·A·I·麦克阿瑟, A I 麦克阿瑟, 弘, 金 J 施图茨曼-恩格沃尔 申请人:辉瑞产品公司