体外构建组织工程化血管的方法

专利名称：体外构建组织工程化血管的方法
技术领域：
本发明涉及组织工程和材料学领域，更具体地涉及一种体外构建组织工程化血管的方法以及构建的组织工程化血管。
背景技术：
寻求理想的血管移植物是临床亟待解决的重大课题，组织工程学研究的兴起，为这一难题的解决带来了曙光。
在前期研究中，Weinberg、Shinoka、L’heureux与Bader等先后采用不同方法在体外建出组织工程化血管，并尝试用其修复动物血管缺损(Weinberg CB and Bell E.A blood vessel model constructed from collagenand cultured vascular cells.Science 1986；23397-340；Shinoka T，Tim DS，Ma PX，et al.Creation of viable pulmonary artery autograftsthrough tissue engineering.J Thorac Cardiovasc Surg 1998；115536-545；Bader A，Steinhoff G，Strobl K，et al.Engineerig of human vascularaortic tissue based on a xenogeneic starter matrix.Transplantation2000；707-14；L’heureux N，Paquet S，Labbe R，et al.A completelybiological tissue-engineeringed human blood vessel.FASEB J，1998，1247-55)。但血管是一个处于持续的血流动力学刺激下形成与生长的特殊组织器官，上述方法在构建过程中由于缺乏与体内环境相似的血液流体力学环境，因而产生的血管组织结构欠佳，无法执行正常的生理功能，修复血管缺损效果不佳(Nerem R.Tissue engineering a blood vessel substitutethe role of biomechanics.Yonsei Med J，2000，41(6)735-739)。
为此在构建过程中引入力学刺激因素，利用能模拟体内血液循环、血管搏动的装置一生物反应器，在培养早期即予以适当的力学刺激，是科学而又可行的。Niklason(Niklason LE，Gao J，Abbott WM，et al.Functionalarteries grown in vitro.Science 1999；284489-496)等曾报道利用血管生物反应器，采用PGA-细胞复合物，体外培养6-8周，构建出组织工程化血管，但其采用哺乳动物胚胎发育时期的血液流体力学条件来培养取自成年哺乳动物的血管壁细胞，因而大体观察管腔扁而欠弹性，组织学结构与正常血管组织仍有一定差距。
由于对人造血管(尤其是直径小于6毫米的人造血管)的需求非常大，因此本领域迫切需要开发具有良好弹性的组织工程化血管及其制备工艺。

发明内容
本发明的目的就是提供一种具有良好弹性的组织工程化血管及其制备工艺。
在本发明的第一方面，提供了一种组织工程化血管移植物，它包括(a)药学上可接受的生物可降解材料；(b)平滑肌细胞及其分泌的基质，所述的平滑肌细胞及其分泌的基质附着、充填和/或包裹于所述的生物可降解材料上，并形成环状，并且胶原成分占移植物总重量的20％-70％。
在另一优选例中，所述的平滑肌细胞是自体的平滑肌细胞。
在另一优选例中，平滑肌细胞的含量为0.5×106个细胞/ml-5×108个细胞/ml。
在另一优选例中，所述的移植物的厚度为5-200微米。
在另一优选例中，所述的移植物的缝合口张力为100-500g。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物。
在本发明的第二方面，提供了一种制备组织工程化血管移植物的方法，包括步骤(a)将平滑肌细胞接种于片状的药学上可接受的生物可降解材料，形成细胞材料复合物；
(b)将细胞材料复合物包卷于弹性材料管；(c)在适合平滑肌细胞生长的条件下培养步骤(b)的细胞材料复合物3-10天；(d)通过弹性材料管施加以下动力学刺激，继续培养5-50天搏动频率75±10次/分；扩张量5±1％；压力0.001-0.04Mpa；流量0.01-100ml/分，从而获得组织工程化血管移植物。
在另一优选例中，在该方法中，通过弹性材料管施加动力学刺激是连续的或间歇的。
在另一优选例中，移植物中平滑肌细胞的含量为0.5×106个细胞/ml-5×108个细胞/ml。
在另一优选例中，步骤(c)中动力学刺激条件是搏动频率75±5次/分；扩张量5±0.5％，压力0.001-0.02Mpa；流量0.01-80ml/分并且压力和流量是线性渐增(即在培养开始时采用下限，培养结束时采用上限，增加速率＝(上限-下限)/培养天数±20％)。


图1显示了本发明一个实例中用于构建组织工程化血管的生物反应器，其中图a是生物反应器；图b是生物反应槽。
图2显示了平滑肌细胞的形态学观察结果和超微结构观察，其中图a是贴块法原代9天(x40)；图b是平滑肌细胞投射电镜观察结果(x1000)，箭头示密斑。
图3显示了对平滑肌细胞的免疫组化检测结果，其中图a是平滑肌细胞α-SM actin免疫组化(x200)；b是阴性对照(真皮成纤维细胞，x200)。
图4显示了平滑肌细胞-PGA复合物的形态学观察结果，其中图a是PGA与SMC复合物(x100)；图b是PGA与SMC复合物扫描电镜观察(x300)。
图5显示了生物反应器的静态槽与动态槽内的组织工程化血管(3周)。
图6显示了组织工程化血管的外观，其中图a-b对照组正面与侧面观；图c-d实验组正面与侧面观。
图7显示了组织工程化血管的组织学观察及免疫组化检测结果，其中图a-b是对照组HE与弹力纤维染色(x200)；图c-d是实验组HE与弹力纤维染色(x200)。
图8显示了组织工程化血管的免疫荧光检测结果，其中图a是对照组免疫荧光(x200)；图b是实验组免疫荧光(x200)。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，优化了组织工程化血管的制备条件，在引入特定的动力学刺激后，可制得弹性极佳的血管移植物。该血管移植物可有效地用于修复血管缺损。在此基础上完成了本发明。
术语术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽。
术语“异种移植”指将所需生物材料(如平滑肌细胞)从某一物种中取出并再施用于另一物种对象的方法。
术语“自体移植”指将所需生物材料(如平滑肌细胞)从某病人中取出并再施用于同一病人的方法。
术语“异体移植”指将所需生物材料(如平滑肌细胞)从同一物种的某个体中取出并再施用于另一不同病人的方法。
平滑肌细胞本发明的平滑肌细胞的来源通常是自体的平滑肌细胞。获取平滑肌细胞的部位是截取后功能可被代偿的中动脉，如一侧颈总动脉。细胞可为自体的或异体的血管平滑肌细胞或其他平滑肌细胞。平滑肌细胞还可以是衍生自骨髓基质干细胞、或其他干细胞的平滑肌细胞。甚至是在胚胎发育时期有共同起源或是同一类型的细胞，如真皮成纤维细胞，在特定的力学作用下可转变为平滑肌细胞。
可用于本发明的平滑肌细胞可以来自任何脊椎动物，较佳地是哺乳动物如猪、牛、羊，更佳地是灵长类动物，尤其是人。
尽管自体的平滑肌细胞是优选的，但异体的平滑肌细胞的来源更为常用。研究已表明，不同生长、发育阶段的同种异体平滑肌细胞，可以在有组织相容性差异并且具有完全免疫功能的同种异体动物体内形成平滑肌细胞组织。
分离和获得平滑肌细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是取动脉，剥离外膜及刮去内膜后，将动脉中膜剪成1×1×1mm3的组织块，均匀铺于培养皿，贴壁后加入含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液，置于37℃，5％CO2培养箱内进行培养平滑肌细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将平滑肌细胞在饱和湿度、5％CO2培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)1)DMEM培养基((Gibco公司)+10％胎牛血清；2)DMEM培养基+20％小牛血清；3)DMEM培养基+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子(例如促进平滑肌细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成分、各种细胞成分。
适用于本发明的平滑肌细胞应能在体内或体外增殖。一种优选的平滑肌细胞是体外培养的生物可降解材料可用于本发明的组织工程化血管的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosamiooglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；(c)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料。
组织工程化血管体外培养扩增的平滑肌细胞接种到生物相容性良好并可被机体吸收的可降解生物材料上形成平滑肌细胞—生物材料复合物，将这一“平滑肌细胞—生物材料”复合物在特定的动力学刺激下生长，就形成了弹性好的组织工程化血管。
本发明的组织工程化血管的制备方法简便，将一定数量的平滑肌细胞接种于药学上可接受的生物可降解材料，然后将细胞材料复合物包卷于弹性材料管；先在适合平滑肌细胞生长的条件下培养步骤(b)的细胞材料复合物3-10天(更佳地5-8天)；然后通过弹性材料管施加以下动力学刺激，继续培养5-50天(较佳地7-30天)搏动频率75±10次/分；扩张量5±1％；压力0.001-0.04Mpa；流量0.01-100ml/分，从而获得组织工程化血管移植物。
本发明的组织工程化血管移植物的形状通常为环状。本发明血管移植物的的厚度，没有特别限制，通常为5-200微米，较佳地为10-50微米，更佳地为20-40微米。
本发明组织工程化血管中的平滑肌细胞浓度通常约为0.5×106/ml至5×108/ml或更高，较佳地为1×106/ml至1×108/ml，更佳地为5×106/ml至5×107/ml。通常，以培养液调整平滑肌细胞浓度，然后与可降解材料混合。混合时，培养液与可降解材料的比例没有特别限制，但是以该材料能够吸附的培养液最大量为宜。
此外，在本发明的组织工程化血管移植物中，还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种转基因成分，从而保持平滑肌细胞表型、促进平滑肌细胞生长。
用本发明方法形成的组织工程化血管移植物或平滑肌细胞，可直接植入体内皮下、平滑肌细胞缺损处。
本发明的主要优点在于(1)模拟哺乳动物血液动力学环境的生物反应器的应用使血管构建过程科学化，人性化。
(2)生物反应器参数的具体设定与选择使血管构建过程规范化，为将来产业化打下基础。
(3)应用生物反应器构建出的组织工程化血管不仅可解决自体血管移植来源有限，异体血管移植免疫排斥，小口径人工血管移植效果不佳的缺点，还有比静态培养的组织工程化血管更好的力学性能。
(4)应用生物反应器构建出的组织工程化血管具有广阔的产品开发的潜能与美好的市场应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1血管平滑肌细胞的分离、培养、扩增与观察选幼年长枫杂交猪，雌雄不限，体重10-15kg，2月龄。无菌环境下，手术切取一段猪颈总动脉，长3-4cm，剥离外膜及刮去内膜后，将动脉中膜剪成1×1×1mm3的组织块，均匀铺于培养皿，贴壁后加入含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液，置于37℃，5％CO2培养箱内进行培养，取第2代细胞用于实验。倒置相差显微镜观察细胞生长状况，同时留取样本作免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白的表达，透射电镜观察其超微结构。
结果(a)细胞的形态学观察组织块贴壁培养后第5-6天，可观察到有细胞从组织块周围爬出，初始细胞呈圆形，贴壁后伸展变为长梭形，2周可达融合状态(图2a)。传代后培养，4-5天生长融合。
(b)细胞的超微结构观察在细胞浆内近胞膜处，可以观察到有长条形电子密度集中的细胞器—密斑，为细肌丝与细胞骨架的附着点，是平滑肌细胞特征性超微结构(图2b)。
(c)细胞的免疫组化检测血管平滑肌细胞胞浆染成棕黄色，呈α-平滑肌肌动蛋白阳性(图3a)，空白对照及阴性对照(人真皮成纤维细胞)均为阴性(图3b)。
实施例2平滑肌细胞鉴定免疫组化染色检测α-平滑肌肌动蛋白将平滑肌细胞爬片分为实验组与空白对照组，同时留取人皮肤成纤维细胞爬片作阴性对照组。主要步骤组织切片无水丙酮固定，0.25％TritonX-100处理增加细胞通透性，1.5％H2O2处理阻断内源性过氧化物酶，绵羊血清孵浴清除非特异性染色，滴加一抗(鼠抗人平滑肌α-肌动蛋白抗体1∶50稀释DAKO公司，丹麦)，空白对照组滴加PBS，4℃冰箱过夜，滴加二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG)，37℃作用30分钟，DAB显色，苏木精衬染，梯度酒精脱水，中性树脂封片。结果判定胞质内呈现棕黄色颗粒者为阳性细胞，未呈现者为阴性细胞。
实施例3生物材料的制备与消毒取未编织聚羟基乙酸(PGA Albany公司，美国)30mg，将其排列为长方形，长/宽为2∶1，浸入75％乙醇内30分钟，PBS洗涤后晾干备用。
实施例4平滑肌细胞接种收集第2代平滑肌细胞，总数为2×107，离心去上清，加入100μl含10％FBS的DMEM培养液，制成细胞悬液，将上述细胞悬液均匀接种于PGA上，置于37℃，5％CO2培养箱内，4h后加入含10％FBS的DMEM培养液，静置于培养箱内继续培养，每天更换培养液。应用倒置相差显微镜观察细胞与材料的粘附生长状况。
结果(a)相差显微镜观察平滑肌细胞接种PGA纤维后首先呈圆形均匀分布，24h后，细胞与PGA纤维粘附牢固，并沿纤维方向向两极伸展，此后，细胞在PGA纤维上不断生长、增殖并分泌大量基质，至接种一周时细胞分泌产生的基质已将PGA纤维之间的间隙充满，形成膜状物(图4a)。
(b)扫描电镜观察平滑肌细胞分泌的大量基质融合成片，将PGA纤维包裹其中，多数平滑肌细胞被其分泌的基质包埋，形态不清(图4b)。
实施例5组织工程化血管的制备(a)血管生物反应器的原理、构造与消毒采用中国专利申请CN02136892.9中的血管生物反应器。该血管生物反应器(图1a)包括一个设有培养液出入口的反应器，有4个反应槽(图1b)，配有槽盖，每个槽半高处有一个可通过循环液体而起支撑作用并可拆卸的的硅管，由管道自出口致入口依次连接压力传感器、电磁阀、贮液罐及蠕动泵，并且由导线将控制器与压力传感器相连，控制器输出端口通过导线与电磁阀相连接，从而使控制器能根剧所测得压力控制电磁阀开与关，形成搏动的液流并能控制流量，以模拟体内的生理环境。组合后反应器可置于培养箱内，为血管构建提供一个相对封闭、无毒、无菌，充分氧供与稳定温度的环境。使用前予以环氧乙烷熏蒸消毒。
(b)实验分组实验分对照组(n＝5)与实验组(n＝5)，对照组为生物反应器静态槽内培养；实验组为生物反应器动态槽内，予以动态力学刺激培养。
将细胞材料复合物卷于无菌硅管外部，对照组将其置于生物反应器静态槽内培养；实验组将其接于动态槽内接口，予以动态力学刺激。两组均4-5天换一次液。
对于实验组而言，培养时分两个阶段，先在适合平滑肌细胞生长的条件下静态培养7天；然后在弹性材料管施加以下动力学刺激，继续培养5-50天搏动频率75次/分；扩张量5％；压力0.001-0.02Mpa；流量0.01-80ml/分；流量控制电压0.01-5V(后三个指标在给定的范围内由0开始基本上每日线性渐增，增加幅度＝参数范围/预计培养天数)。
3周后取材，行大体检测。
结果生物反应器静态槽与动态槽内硅胶管周围有类似血管的管型结构组织形成(图5)。
对照组围绕硅胶管虽然有类似血管的管型结构组织形成，但抽去硅胶管后，新生组织管型结构塌陷，且色泽暗淡，厚度不均(图6a-6b)。用镊子轻压后移开，管腔塌陷，无法复原，显示弹性欠佳。
实验组围绕硅胶管有类似血管的管型结构组织形成，抽去硅胶管后，新生组织仍维持管型结构，且色泽光亮，厚度均匀，与正常血管相仿(图6c-6d)。用镊子轻压后移开，凹陷的管壁可恢复原先管型结构，显示较好的弹性。
实施例6组织工程化血管的性能检测(1)组织学检测培养3周后，取出两组血管行4％多聚甲醛固定，石腊切片。
(a)H.E.染色切片经二甲苯脱腊，梯度酒精置换，苏木精染色，盐酸酒精分化，伊红染色，梯度酒精置换，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜镜检。
(b)弹力纤维染色切片经二甲苯脱腊，梯度酒精置换，维多利亚蓝染色，95％乙醇分色，丽春红S液染色，无水乙醇冲洗，干燥后二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜镜检。
(2)血管平滑肌纤维鉴定免疫荧光检测血管平滑肌纤维α-平滑肌肌动蛋白，包括实验组，对照组，空白对照组(不加一抗)和阴性对照组(软骨组织)。主要步骤经无水丙酮固定，滴加一抗(鼠抗人平滑肌α-肌动蛋白抗体1∶50稀释DAKO公司，丹麦)，在空白对照组细胞爬片上滴加PBS，置湿盒内37℃作用30分钟，滴加二抗(FITC标记的羊抗鼠IgG 1∶30稀释DAKO公司，丹麦)，37℃作用30分钟，PBS漂洗，三蒸水漂洗去盐，荧光显微镜观察荧光情况。结果判定胞质内呈现黄绿色荧光者为阳性细胞，未呈现者为阴性细胞。
结果(1)组织学观察及免疫组化检测对照组管壁内平滑肌纤维成分排列不规则，其间有散在分布的有核细胞，云絮状弹力纤维成分较少而疏。(图7a-7b)实验组管壁内平滑肌纤维成分排列较规则，略有层次感，其间有层次分布的有核细胞，弹力纤维成分较多而密。(图7c-7d)此外，用常规的标准方法测定缝合口张力。结果表明，所述的移植物的缝合口张力为100-500克(g)。
(b)免疫荧光检测在490nm蓝色激光束的激发下，于荧光显微镜下可见FITC呈黄绿色显示被检测血管组织的平滑肌纤维排列状况。
对照组荧光带排列松散，层次不清，厚薄不一，细胞少而排列杂乱。(图8a)实验组荧光带排列整齐，层次分明，厚薄均匀，细胞多而排列规则。(图8b)空白对照及阴性对照(软骨组织)均未见荧光带。
讨论理想的血管替代应具有良好的机械张力，足以承受动脉强大的血流冲击而不破裂；有完整的内皮细胞层而不形成血栓栓塞；具有血管生物活性，能对温度、血流变化有相应舒缩反应，并能分泌相应的生物活性物质。其中最重要的是血管替代物的力学性质，要经得起长时间的血流考验，这是修复血管缺损成败的关键(Conte MS.The ideal small arterial substituteasearch for the holy grail？FASEB J 1998；1243-45)。
血管组织工程前期的研究由于未充分考虑力学因素在血管构建中的重要作用，产生的组织工程化血管平滑肌纤维与弹力纤维结构欠佳，缺乏张力与弹性，其强度经不起血流的长期考验，同时内皮细胞层也因缺乏力学刺激而与中膜粘附不牢，易脱落而导致血栓形成，从而无法执行正常的生理代谢与调节功能，修复血管缺损长期通畅率较差。
另一方面，在血液流体动力学对血管生理影响机制的研究中，学者们发现体外培养的血管内皮与平滑肌细胞在流体剪切力的作用下，前者沿力作用方向排列，如同正常血管以保持内皮层的完整性，防止血栓形成；后者排列方向与力的作用方向垂直，类似正常血管以保持一定的弹性与张力，以缓冲流体量的变化(Lee AA，Graham DA，Cruz SD，et al.Fluid shearstress-induced alignment of cultured vascular smooth muscle cells.JBiomech Eng 2002；124；37-43)。
同时，适宜的力学作用可使平滑肌细胞选择性地抑制金属基质蛋白酶(MMP-1)的表达，从而减少对弹性中膜的细胞外基质成分，尤其是对I型胶原的消化作用(Lee RT，Schoen FJ，Loree HM，et al.Circumferential stressand matrix metalloproteinase-1 in human coronaryatherosclerosis.Implications for plaque rupture.ArteriosclerThromb Vasc Biol 1996；161070-1073)；并且通过自分泌或旁分泌使成纤维细胞生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子-β与血管内皮细胞生长因子增多，促进细胞生长(Rhoads DN，Eskin SG and McIntire LV.Fluidflow releases fibroblast growth factor-2 from human aortic smoothmuscle cells.Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000；20；416-421；SterpettiAV，Cucina A，Napoli F，et al.Growth factor released by smooth musclecells is dependent on hemodynamic factors.Eur J Vasc Surg 1992；6(6)；636-638；Papadaki M，McIntire LV and Eskin SG.Effects of shearstress on the growth kinetics of human aortic smooth muscle cellsin vitro.Biotechnol Bioeng 1996；50555-561；Feng Y，Yang JH，HuangH，et al.Transcriptional profile of mechanical induced genes inhuman vascular smooth muscle cells.Circ res 1999；85(12)；1118-1123)，羟脯氨酸合成增多，胶原产生更丰富。这些结果导致中膜层更稳固，使之能保持良好的血管张力(Jockenhoevel S，Zund G，Hoerstrup SP，etal.Cardiovascular tissue engineeringa new laminar flow chamberfor in vitro improvement of mechanical tissue properties.ASAIO J2002；48(1)8-11)。力学环境也会维持平滑肌细胞的收缩表型，促进收缩功能，同时使内皮细胞粘附能力、抗血栓能力及分泌生长因子的能力明显增加，与静态条件有显著差异(韩启德.血管生物学.北京北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社19973-37)。
正是考虑到力学因素的重要性，本发明人应用了能模拟体内血液流体动力学环境的装置——血管生物反应器。整个装置包括了循环系统、控制系统、监测系统与反应槽等几个部分。其中，作为主体的反应槽采用无毒副作用，化学性质较稳定的高分子材料制成，设计合理科学，有动态与静态槽各两个，循环液体通过动态槽的位于其中间部位的硅胶管，对卷于其外周的PGA-细胞复合物予以力学刺激。流体的参数由控制系统调控，并保持稳定，显示了整个系统的可操作性。目前选定的实验参数有哺乳动物胚胎发育期与成年哺乳动物循环系统两种参数，本实验探究采用后者主要考虑到细胞来源为成年哺乳动物，使其更符合生理条件。
本发明人的实验结果显示利用生物反应器对PGA-细胞材料复合物进行动态力学刺激，培养出血管样组织工程化组织色泽光亮，管腔圆润，厚度均匀，与正常血管相仿，触之有较好的弹性，组织学检测显示有弹力纤维和肌纤维的形成，免疫荧光带中，按力学作用的方向平滑肌细胞多而排列规则，并且有一定的层次感；相反，对照组管型结构塌陷，且色泽暗淡，厚度不均，组织学检测显示弹力纤维成分较少而疏，肌纤维成分排列欠规则，免疫荧光带中，平滑肌细胞少而排列杂乱，无层次感。由此说明了力学因素在组织工程化血管构建过程中的重要作用，实验组由于采用了合适的力学刺激，其与对照组结果的差异不仅在大体上，并且存在于细胞和其生化组分上。
本发明在成年哺乳动物的血液流体动力学参数作用下，证实体外动态力学刺激下可以构建具有良好弹性及一定形态学结构的组织工程化血管；体外静态环境下可以构建血管样组织工程化组织但缺乏弹性且形态学结构欠佳。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种组织工程化血管移植物，其特征在于，它包括(a)药学上可接受的生物可降解材料；(b)平滑肌细胞及其分泌的基质，所述的平滑肌细胞及其分泌的基质附着、充填和/或包裹于所述的生物可降解材料上，并形成环状，并且胶原成分占移植物总重量的20％-70％。
2.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的平滑肌细胞是自体的平滑肌细胞。
3.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，平滑肌细胞的含量为0.5×106个细胞/ml-5×108个细胞/ml。
4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的移植物的厚度为5-200微米。
5.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的移植物的缝合口张力为100-500g。
6.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组聚乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、脱细胞基质，及其混合物。
7.一种制备组织工程化血管移植物的方法，其特征在于，包括步骤(a)将平滑肌细胞接种于片状的药学上可接受的生物可降解材料，形成细胞材料复合物；(b)将细胞材料复合物包卷于弹性材料管；(c)在适合平滑肌细胞生长的条件下培养步骤(b)的细胞材料复合物3-10天；(d)通过弹性材料管施加以下动力学刺激，继续培养5-50天搏动频率75±10次/分；扩张量5±1％；压力0.001-0.04Mpa；流量0.01-100ml/分，从而获得组织工程化血管移植物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，通过弹性材料管施加动力学刺激是连续的或间歇的。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，移植物中平滑肌细胞的含量为0.5×106个细胞/ml-5×108个细胞/ml。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(c)中动力学刺激条件是搏动频率75±5次/分；扩张量5±1％；压力0.001-0.02Mpa；流量0.01-80ml/分，并且压力和流量是线性渐增。
全文摘要
本发明公开了一种体外构建组织工程化血管平滑肌层的方法以及构建的组织工程化血管。用本发明方法构建的组织工程化血管具有良好的弹性，管腔圆，色泽光亮；HE染色显示平滑肌纤维成分排列较规则，有层次感；弹力纤维染色显示弹力纤维成分较多而密；FITC标记的免疫荧光检测显示平滑肌纤维为黄绿色层状排列的荧光带。
文档编号C12N11/02GK1651572SQ20041001613
公开日2005年8月10日 申请日期2004年2月6日 优先权日2004年2月6日
发明者曹谊林, 崔磊, 刘伟, 许志成, 李宏, 刘阳 申请人:上海组织工程研究与开发中心