专利名称：：类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白编码序列及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等领域。具体地，本发明涉及一种在类番茄茄(SolanumlycopersicoidesDun.)中表达的抗大丽轮枝菌受体蛋白[VerticilliumdahliaeKleb.resistanceprotein(Ve)fromSolanumlycopersicoidesDun.，SlVe1]及其核酸序列。本发明还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。
背景技术：
：由大丽轮枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)等引起的黄萎病是一种世界范围的顽固性维管束病害，严重为害棉花、番茄、茄子、马铃薯、苜蓿等重要农作物的生长。作为一种土传病害，黄萎病的寄主广，危害重，化学防治成本高、效果差，并且存在食品安全性和生态安全性问题。选育抗黄萎病作物品种是黄萎病防治的根本途径，但却面临育种周期长和抗黄萎病资源严重匮乏的限制，利用基因工程技术分离植物抗黄萎病基因并通过遗传转化创造作物抗黄萎病新材料，具有基因型资源广泛、周期相对较短和不受生殖障碍限制等优点，是抗黄萎病遗传改良的一个重要方向。根据基因对基因学说(Gene-for-geneTheory)，植物抗病基因R的产物即受体蛋白R与来自病原菌无毒基因Avr的直接或间接产物即Avr配体之间的原初识别，是介导植物抗病反应的根本分子机制。许多抗病和感病植物材料之间的本质差异并不在于个别下游防卫反应基因的有无，而在于负责原初识别的抗病基因的有无或启动抗病信号传导的机制上存在差异，所以克隆和利用受体蛋白类的抗病基因是植物抗病基因工程的核心内容。采用类番茄茄的无菌苗，人工接种大丽轮枝菌诱导，构建了一个全长cDNA文库。首先从cDNA中经PCR扩增获得SlVe1的保守区685bp片断，进而扩增得到主体编码区2.9kb片断，据此设计两个正向引物和两个反向引物，分别进行cDNA的3’和5’末端锚定扩增，再根据cDNA末端序列信息设计引物成功扩增出全长3400bp(不计poly(dA))的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因SlVe1。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白SlVe1序列及其核酸序列。
发明内容本发明的第一目的就是提供一种新的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)，该基因是一个抗大丽轮枝菌受体蛋白基因。本发明的第二目的是提供一种新的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)。本发明的第三目的是提供这种类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白多肽和编码序列在利用转基因技术改良植物抗病特别是抗黄萎病上的应用。在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.3中从核苷酸第23-3175位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQIDNO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列。在本发明的另一方面，提供了一种分离出的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白质多肽，它包括具有SEQIDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。在本发明的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是烟草。在本发明的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物抗病能力的方法，其步骤如下(1)将编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞如植物细胞共培养，在22-28℃条件下，暗培养1-2天后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。含有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的转基因植株对植物病害具有增强的抗性作用。较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQIDNO.3中第23-3175位的序列。在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本发明中，术语“类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.3中第23-3175位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQIDNO.3序列的编码框第23-3175位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQIDNO.3中第23-3175位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQIDNO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQIDNO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQIDNO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白相同功能的蛋白的SEQIDNO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)；若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本发明中，术语“类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白或多肽”指具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白活性的SEQIDNO.4序列的多肽。该术语还包括具有与天然类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白相同功能的、SEQIDNO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白的活性片段和活性衍生物。本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。在本发明中，“类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白保守性变异多肽”指与SEQIDNO.4的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。表1发明还包括类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白多肽时，可以将类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白表达载体。如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。在本发明中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。还可用Northern印迹法技术分析类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因产物的表达，即分析类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。此外，根据本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白同源基因或同源蛋白。为了得到与类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因相关的类番茄茄cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选类番茄茄cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用32P对类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自类番茄茄的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，PaloAlto，Cal.。这种筛选方法可以识别与类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因相关的基因家族的核苷酸序列。本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis，WHFreemanCo.，SanFrancisco；MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc852149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成仪(FosterCity，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。表2为本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)与普通番茄抗黄萎病蛋白的核苷酸序列的同源比较(GAP)表。表3为本发明的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)与普通番茄抗黄萎病蛋白的氨基酸序列的同源比较(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)基因的克隆1.植物材料和RNA分离((PlantmaterialandRNAisolation)类番茄茄种系LA2386的种子由美国戴维斯加利福尼亚大学蔬菜作物系C.M.Rick番茄遗传资源中心(C.M.RickTomatoGeneticResourcesCenter，Dept.VegetableCrops，UniversityofCalifornia，Davis，USA)的Chetelat博士惠赠。种子经15％的次氯酸钠消毒液浸种30min，在4次换水的灭菌蒸馏水中漂洗4h，然后接种到几层灭菌滤纸中间于25℃催芽，萌发的种子播种到含有1∶1∶1比例壤土、蛭石和珍珠岩的培养罐中，保持于20℃和14h光/10h暗的条件待其出苗和生长，对再生植株进行大丽轮枝菌接种处理0、2、4、6、8、12、24、48、72、96和120小时后取植物根、茎、叶的混合样抽提总RNA。RNA抽提采用TRIZOL试剂(GIBCOBRL，USA)根据其说明的方法进行。用甲醛变性胶电泳鉴定总RNA质量，然后在分光光度计上测定RNA含量。2.大丽轮枝菌诱导的类番茄茄全长cDNA文库的构建(ConstructionofcDNAlibraryfromVerticilliumdahliae-inducedSolanumlycopersicoidesplantmaterials)鉴于普通番茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因Ve1的mRNA很长及在总mRNA中的丰度较低，我们构建了类番茄茄的全长cDNA文库。来自不同诱导时间的总RNA各取相等比例混合形成的250μg总RNA按试剂盒(OligotexmRNASpinColumn，QIAGEN)的方法过Oligotex层析柱，纯化获得的总mRNA马上用于全长cDNA文库构建(SMARTcDNALibraryConstructionKit，CLONTECHLaboratories)。反转录合成的cDNA一链经LDPCR扩增文库得到文库cDNA双链(dd-cDNA)，取5μLdd-cDNA经琼脂糖凝胶电泳后获得一条分子量为约250bp-8kb大小的smear，丰度的重心在1000bp-4000bp左右)，说明合成的文库dd-cDNA质量是理想的。经cDNA纯化、SfiI酶切、cDNA的大小分级、目的cDNA最后与λ载体的两臂(A、B)的连接，获得的诱导全长cDNA文库重组λ最后包装到Stratagene公司的GoldenPackaging包装蛋白中形成λ文库，经检测其滴度达到1.2×106pfu·mL-1，重组率85.9％。3.类番茄茄中Ve同源基因保守区片断的扩增(AmplificationofconservativefragmentofVehomologuefromSolanumlycopersicoides)根据普通番茄抗大丽轮枝菌受体蛋白Ve1的mRNA全长和来自马铃薯的几条类似Ve基因3’近中部序列的EST在VectorNTISuite6上的多重比的结果，我们设计了一对扩增类番茄茄中Ve同源基因保守区的PCR引物FVE685(5’-GTTGTTGGAGGTCCTGAATGTTGGAAATAA-3’，SEQIDNO.1)和RVE685(5’-GTTTCCTTCAAAGGAATCTGCTGAGAATGT-3’，SEQIDNO.2)。50μL的反应体系中包括文库dd-cDNA1μL，10×PCRbuffer5μL，25mmol·L-1MgCl23μL，10mmol·L-1dNTP1μL，10μmol·L-1FVE6851μL，10μmol·L-1RVE6851μL，TaqDNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH2O37.5μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下94℃预变性3min→35个扩增循环(94℃变性45sec→55℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃继续延伸10min。获得一条685bp的PCR扩增片断。4.SlVe1主要编码区2.9kb片断的扩增(Amplificationof2.9kbfragmentofSlVe1codingregion)685bp片断测序后经多重比对和BLAST发现与Ve1基因具有高相似性(similarity)，所以根据Ve1的起始密码区设计了一条上游引物FSLO(5’-ATGAAAATGATGGCAACTCTGTACT-3’)与RVE685联合扩增SlVe1编码区的主体片断。50μLPCR的反应体系中包括文库dd-cDNA1μL，10×LAPCRbufferwithMg2+5μL，10mmol·L-1dNTP2μL，10μmol·L-1FSLO2μL，10μmol·L-1RVE6852μL，LATaqDNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH2O37.5μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下94℃预变性3min→30个扩增循环(94℃变性60sec→52℃退火90sec→72℃延伸3min)→72℃继续延伸10min。5.SlVe13’cDNA末端的扩增(Ampiificationof3’endofSlVe1)根据SlVe1主要编码区2.9kb片断的测序结果，设计了两条扩增SlVe13’cDNA末端的PCR引物FSL3-1(5’-CGATTGGGAAGCTACAAATGCTTGAATCAC-3’)和FSL3-2(5’-CCACCTGTCCGGGGAGATCCCATCAGAGCT-3’)。引物FSL3-1与文库试剂盒提供的CDSIII/3’PCRPrimer(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3’)联合进行SlVe13’cDNA末端的PCR初扩。50μL的反应体系中包括文库dd-cDNA1μL，10×PCRbuffer5μL，25mmol·L-1MgCl23μL，10mmol·L-1dNTP1μL，10μmol·L-1FSL3-11μL，10μmol·L-1CDSIII/3’PCRPrimer1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH2O37.5μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下94℃预变性3min→30个扩增循环(94℃变性1min→65℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃继续延伸10min。初扩产物15μL经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，直接吸取0.25μL初扩产物为模板进入PCR巢式扩增，50μL的反应体系中包括初扩产物0.25μL，10×PCRbuffer5μL，25mmol·L-1MgCl23μL，10mmol·L-1dNTP1μL，10μmol·L-1FSL3-21μL，10μmol·L-1CDSIII/3’PCRPrimer1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH2O38.25μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下94℃预变性3min→28个扩增循环(94℃变性1min→68℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃继续延伸10min。6.SlVe15’cDNA末端的扩增(Amplificationof5’endofSlVe1)根据SlVe1主要编码区2.9kb片断的测序结果，设计了两条扩增SlVe15’cDNA末端的PCR引RSL5-1(5’-CCATCAAGGTAAAGCTCTCTAAGCTCTG-3’)andRSL5-2(5’-GAGTTCTCAATGAAATGTCTCAAATTGGGA-3’)。采用RSL5-1与文库试剂盒提供的5’PCRPrimer(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)联合进行SlVe15’cDNA末端的PCR初扩。50μL的反应体系中包括文库dd-cDNA1μL，10×PCRbuffer5μL，25mmol·L-1MgCl23μL，10mmol·L-1dNTP1μL，10μmol·L-1RSL5-11μL，10μmol·L-15’PCRPrimer1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH2O37.5μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下94℃预变性3min→30个扩增循环(94℃变性1min→60℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃继续延伸10min。初扩产物15μL经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，直接吸取0.25μL初扩产物为模板进入PCR巢式扩增，50μL的反应体系中包括初扩产物0.25μL，10×PCRbuffer5μL，25mmol·L-1MgCl23μL，10mmol·L-1dNTP1μL，10μmol·L-1RSL5-21μL，10μmol·L-15’PCRPrimer1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH2O38.25μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下94℃预变性3min→28个扩增循环(94℃变性1min→60℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃继续延伸10min。7.SlVe1cDNA全长的扩增(Cloningoffull-lengthSlVe1cDNA)将上面测序得到的SlVe1cDNA5’末端、3’末端及2.9kb主体编码区序列在VectorNTISuite6上经拼接而成SlVe1cDNA全长contig。我们据此序列设计了一对扩增SlVe1cDNA全长(不含poly(dA)尾)的PCR引物FSL1(5’-CATATTCAAGCTAACAAGTTGCATGAAA-3’)和RSL1(5’-AAGCCATAATAAGTTTGGGATATCATTA-3’)。50μL的反应体系中包括文库dd-cDNA1μL，10×LAPCRbufferwithMg2+5μL，10mmol·L-1dNTP2μL，10μmol·L-1FSL12μL，10μmol·L-1RSL12μL，LATaqDNA聚合酶0.5μL(2.5单位)和ddH2O37.5μL。混匀后覆盖1滴矿物油，PCR反应条件如下94℃预变性3min→30个扩增循环(94℃变性1min→55℃退火1min→72℃延伸4min)→72℃继续延伸10min。BLAST的结果证明从类番茄茄中新得到的基因确为一个与植物抗黄萎病相关的基因。因此通过研究最终获得了类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白的全长编码序列(SEQIDNO.3)。实施例2类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)基因的序列信息与同源性分析本发明新的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)全长cDNA的长度为3400bp(不计polyA)，详细序列见SEQIDNO.3，其中开放读框位于23-3175位核苷酸。根据全长cDNA推导出SlVe1编码的氨基酸序列，共1050个氨基酸残基，分子量为116.97kDa，等电点(pI)为5.22。详细序列见SEQIDNO.3。将类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与普通番茄抗黄萎病基因(AF272307)在核苷酸水平上具有91％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它与普通番茄抗黄萎病蛋白(AAK58682)也有84％的相同性(附表3)。由此可见，类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因与普通番茄抗黄萎病蛋白基因无论在核酸还是在蛋白水平上都存在较高的同源性，故可以认为类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因在抗黄萎病上也具有相似的作用。实施例3类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)基因的在类番茄茄中的拷贝数分析采用常规方法从类番茄茄叶片中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分别用DraI，EcoRV和HindIII酶切DNA[13μg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上。采用AmershamPharmacia公司的GeneImagesTMContentsCDP-StarTMlabelingmodule(PRN3540)杂交及检测系统以SlVe1基因部分编码序列(685bp，利用FVE685和RVE685为引物经PCR扩增类番茄茄cDNA得到)为探针对杂交膜进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照RocheDIGlabeled试剂盒说明书)。结果(Southernblot)发现在杂交膜上出现2-3杂交条带(附图1)，说明类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因在类番茄茄中属于低拷贝基因。实施例4类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白在烟草细胞中进行真核细胞表达及转基因植株的抗病性(抗黄萎病性)鉴定含目的基因(类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因SlVe1)的表达载体的构建含目的基因(类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因)的表达载体的构建，根据类番茄茄抗大丽轮枝菌受体的全长序列(SEQIDNO.3)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体pCAMBIA2301中，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌EHA105中，获得含有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体基因SlVe1表达载体pSL1(附图2)的农杆菌EHA105(pSL1)，利用叶盘法技术转化烟草。利用叶盘法转化烟草1.用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2mlYEB液体(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振荡培养24-36小时；2.室温下4,000g离心10min；3.弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；5.将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；6.把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；7.将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；8.约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；9.待根系生长发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。利用Southernblot检测类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)是否已整合入植物(烟草)基因组中采用常规方法从转基因植株和非转基因对照植株中提取DNA(参考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，用SacI酶切植物DNA[8μg(微克)/样品]后，将DNA转至杂交膜(尼龙膜)上，采用AmershamPharmacia公司的GeneImagesTMContentsCDP-StarTMlabelingmodule(PRN3540)杂交及检测系统以SlVe1基因部分编码序列(685bp，利用FVE685和RVE685为引物经PCR扩增类番茄茄cDNA得到)为探针对杂交膜进行杂交(于60℃杂交16小时)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同样15分钟。用X光片压片60-90分钟，然后显影、定影(方法参照RocheDIGlabeled试剂盒说明书)。结果(Southernblot)发现，不同转基因植株具有不同的杂交带型，证明SlVe1基因已整合入烟草基因组中，且所获得的转基因植株为不同的独立转基因植株(附图3。1非转基因植株；2-4不同的转基因植株)。为了研究外源基因(SlVe1)在转基因植株中是否表达，对转基因植株进一步进行了Northernblot分析。利用Northernblot检测类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)在转基因烟草植株中的表达1.RNA的提取制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)2.RNA的定量参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD260；RNA含量计算1OD260＝40μg/ml。3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离1)取6ml25*电泳缓冲液，假如117ml无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液张，于微波炉里加热融化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA(30μg)溶解于15mlRNA稀释溶液中，在55℃-65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2μl10*上样缓冲液，混匀。9)在电泳液未盖过胶的条件下点样，80V电压电泳10分钟，待样品全部进入胶后，加电泳液盖过胶面约半厘米。80-100V电泳5小时。4.RNA尼龙膜上转移1)转移之前，将尼龙膜用10*SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2*SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤1-2小时。5.膜上RNA的检测1)将膜浸在4*SSC中10分钟，取出膜置滤纸上吸去多余的液体，将膜放入预杂交液中(50％甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸钠(pH6.4)，5*Denhart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA)，42℃下预杂交过夜。2)倒出预杂交液，换入等量的杂交液，将用32P标记的DNA探针(SlVe1基因部分编码序列，685bp，利用FVE685和RVE685为引物经PCR扩增类番茄茄cDNA得到)在沸水中变性5分钟，加入杂交液(50％甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸钠(pH6.4)，10％葡聚糖硫酸脂，1*Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鲑鱼精DNA)中，于42℃杂交24-48小时。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于42℃漂洗3次，每次5分钟。转入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于55℃-65℃漂洗1-3次。4)用X光片压片1-7天，然后显影、定影。结果(Northernblot)发现，类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)在不同转基因植株中的表达量不同(附图4。1非转基因植株；2-4不同转基因植株)，因此Northernblot分析证实了类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)在转基因植株中的表达。表达类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)的转基因植株的抗病性鉴定鉴于编码抗大丽轮枝菌受体蛋白如番茄的抗大丽轮枝菌受体蛋白的基因已被证明对植物病害特别是黄萎病具有抗性，而类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白(SlVe1)与番茄的抗大丽轮枝菌受体蛋白具有较高的同源性，我们进一步对表达类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白的转基因植株进行黄萎病抗性鉴定。接种大丽轮枝菌菌液3周后调查发现，转基因植株的受害程度比对照明显轻，少数植株未发现明显症状，且转基因植株对大丽轮枝菌的抗性与SlVe1的mRNA表达量成正相关，而非转基因对照植株普遍发病，表现出极度萎蔫(附图5)。研究证明，类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)对黄萎病确有抗性，因此类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因(SlVe1)可应用于利用转基因技术改良植物抗病性特别是抗黄萎病的研究和产业化中。表291％identityin3207ntoverlapQuery1catattcaagctaacaagttgcatgaaaatgatgacaactctgtacttcc-tatggcttc59|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1472catattcaagctaacaagttgcatgaaaatgatggcaactctgtacttccctatgg-ttc1530Query60tcttggttcccttgtttcaaatcctgtcaggaaatgacattttcttggtttcctctcaat119|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1531tcttgattccctcgtttcaaatcttatcaggataccacattttcttggtttcctctcaat1590Query120gtcttgatgatcaaaagtcattgttgctgcagttgaagggcagcttccaatatgattcta179|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1591gccttgacgatcaaaagtcattgttgctgcagtttaagggaagcctccaatatgattcta1650Query180ctttgtcgaataaattggaaagatggaaccacaacacaagtgaatgttgcaattggaatg239|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1651ctttgtcaaagaaattggcaaaatggaacgacatgacaagtgaatgttgcaattggaatg1710Query240gggttacatgtgacctctctggtcatgtgattgccttggaactggatgatgagaaaattt299||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1711gggttacatgcaatctctttggtcatgtgatcgctttggaactggatgatgagactattt1770Query300ctagtggaattgagaatgcaagtgctcttttcagtcttcagtatcttgagagcctaaatt359||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1771ctagtggaattgagaattctagtgcacttttcagtcttcaatatcttgagagcctaaatt1830Query360tggcttacaacaagttcaatgttggcataccagttggtataggcaacctcaccaacttga419||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1831tggctgacaacatgttcaatgttggcataccagttggtatagacaacctcacaaacttga1890Query420agtacctgaatttatccaatgccggttttgttggccaaattcctatgatgttatcaaggt479|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1891agtacctgaatttatccaatgctggttttgtcgggcaaattcctataacattatcaagat1950Query480taacaaggctagttactcttgatctctcaactcttttccctgactttgaccagccactta539||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1951taacaaggctagttactcttgatctctcaactattctccctttttttgatcagccactta2010Query540aacttgagaatcccaatttgagacatttcattgagaactcaacagagcttagagagcttt599|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct2011aacttgagaatcccaatttgagtcatttcattgagaactcaacagagcttagagagcttt207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--SESLPPLTSQSDSDDEWKFIFAAVGYLV1018NQFQTFSADSFEGNSGLCGLPLN+SCQSNGSESLPPTDSDDEW+FIFAAVGY+VSbjct961NQFQTFSADSFEGNSGLCGLPLNNSCQSNGSASESLPPPTPLPDSDDEWEFIFAAVGYIV1020Query1019GAANTISPLWFYEPVKKWFDKHAEKWLLWFSR1050GAANTIS+WFY+PVKKWFDKHEKLLWFSRSbjct1021GAANTISVVWFYKPVKKWFDKHMEKCLLWFSR1052Query类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白氨基酸序列Sbjct普通番茄抗黄萎病基因蛋白氨基酸序列(AAK58682)本发明涉及的序列及记号分列如下(1)SEQIDNO.1的信息(i)序列特征(A)长度30bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQIDNO.1GTTGTTGGAGGTCCTGAATGTTGGAAATAA(2)SEQIDNO.2的信息(i)序列特征(A)长度30bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型寡核苷酸(iii).序列描述SEQIDNO.2GTTTCCTTCAAAGGAATCTGCTGAGAATGT(3)SEQIDNO.3的信息(i)序列特征(A)长度3400bp(B)类型核苷酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型核苷酸(iii).序列描述SEQIDNO.31CATATTCAAGCTAACAAGTTGCATGAAAATGATGACAACTCTGTACTTCCTATGGCTTCT61CTTGGTTCCCTTGTTTCAAATCCTGTCAGGAAATGACATTTTCTTGGTTTCCTCTCAATG121TCTTGATGATCAAAAGTCATTGTTGCTGCAGTTGAAGGGCAGCTTCCAATATGATTCTAC181TTTGTCGAATAAATTGGAAAGATGGAACCACAACACAAGTGAATGTTGCAATTGGAATGG241GGTTACATGTGACCTCTCTGGTCATGTGATTGCCTTGGAACTGGATGATGAGAAAATTTC301TAGTGGAATTGAGAATGCAAGTGCTCTTTTCAGTCTTCAGTATCTTGAGAGCCTAAATTT361GGCTTACAACAAGTTCAATGTTGGCATACCAGTTGGTATAGGCAACCTCACCAACTTGAA421GTACCTGAATTTATCCAATGCCGGTTTTGTTGGCCAAATTCCTATGATGTTATCAAGGTT481AACAAGGCTAGTTACTCTTGATCTCTCAACTCTTTTCCCTGACTTTGACCAGCCACTTAA541ACTTGAGAATCCCAATTTGAGACATTTCATTGAGAACTCAACAGAGCTTAGAGAGCTTTA601CCTTGATGGTGTTGATCTTTCAGCTCAGAGGACTGACTGGTGTCAATCTTTATCTTCATA661TTTGCCTAACTTGACCGTCTTGAGTTTGTGTGCTTGTCAAATTTCAGGCCCTATTGATGA721ATCACTTTCTAAGCTTCAGATTCTCTCTATCATTCGTCTTGAACGGAACAATCTCTCTAC781CACAGTTCCAGGATATTTTGCCAATTTCACAAACTTGACTACCTTGTCCCTCGACTCTTG841TAATCTGCAAGGAGCTTTTCCTAAAAAGATCTTTCAGGTACAAGTTTTAGAGAGTTTGGA901CTTGTCAAATAACAAGTTGCTTAGTGGTAGTATTCCGAGTTTTCCTCGAAATGGATCTTT961GAGGAGGATATCACTAAGCTACACCAACTTTTCGGGTTCATTACCAGAGTCCATTTCGAA1021CCTTCAGAACCTGTCCAGGTTAGGGCTTTCTGATTTCAATTTCAATGGACCAATACCTTC1081CACAATGGCAAACCTTATCAATCTTGGTTATTTGGACTTCTCCCGGAACAACTTCACTGG1141TTCTATCCCACATTTTCAACGGTCCAAGAAACTCACCTACTTGGACCTTTCACGTAATGG1201TCTAACTGGTCTCTTATCTAGAGCTCATTTTGAAGGACTCTCAGAGCTTGTCTACATAAA1261TGTAGGGGACAATTCACTCAACGGAACCCTTCCTGCATATATATTTGAGCTCCCCTCCTT1321GCAGCAGCTTTTTCTTAACAGCAATCAATTTGTTGGCCAAGTCGACGAATTCCGCAATGC1381ATCCTCCTCTCTGTTGGATACAGTTGATCTAAGAAACAACCACCTGAATGGATCGATTCC1441CAAGTCCACATTTGAAATTGGCAGGCTTAAGGTCCTCTCACTTTCTTCCAACTTCTTTAG1501CGGGACAGTGACCCTTGATCTCATTGGGAGGCTGAACAACCTTTCAAGACTGGAGCTTTC1561TTACAATAACTTGACTGTTGATGCAAGTAGCAGCAATTCAACCTCTTTCACATTTCCTCA1621GTTGAGCATATTGAAATTAGCTTCTTGCCGGTTGCAAAAGTTCCCTGATCTCATGAATCA1681GTCAATGATGATCCACTTGGACCTTTCAGACAACCAAATACGGGGGGCAATACCAAATTG1741GATTTGGGGAATTGGTGATCAAGGTTTGACTCACCTGAACCTTTCCTTCAATCAGCTGGA1801GTACATGGAACAACCTTACACTGCTTCCAGCAATCTTGTAGTGCTTGACTTGCATACCAA1861CCGTTTGAAAGGTGACTTACTAATTCCACCTTCCTCTCCCATCTATGTGGATTACTCGAG1921CAATAATTCAAATAATTCCATCCCACTAGATATTGGAAAGTCTCTTGGTTTTGCCTCCTT1981TTTCTCGGTAGCAAACAATGGCATTACTGGAATAATTCCTGAATCCATATGCGATGTCAG2041CTACCTTCAAATTCTTGATTTCTCTAACAACGCCTTGAGTGGAACAATACCACCATGTCT2101ACTGGAATATAGTACAACTCTTGGAGTGCTGAATCTAGGGAACAATAGACTCCATGGTGT2161TATTCCAGATTCATTTCCGATTGATTGTGCTCTAAATACTCTAGACCTCAGTGAGAATAA2221GTTACAAGGTAGGCTGCCAAAATCGCTTGTGAACTGCAAGTTGTTGGAGGTCCTGAATGC2281TGGAAATAACAGACTTGTTGATCATTTCCCATGCATGCTGAGGAACTCAAACAGTCTGAG2341GGTCCTTGTCTTGCGCTCCAATCAATTCAGTGGAAATCTTCAGTGTGAAGTAACCATAAA2401TAGCTGGCCAAATCTCCAGATCATAGATATAGCTTCCAACAACTTCACTGGTGTGTTGAA2461TGCAGAATTCTTTTCAAATTGGAGAGGAATGATGGTTGCAGATGATTACGTGGAGACAGG2521ACGCAATCATATCCAGTATAAGTTCTTCGAACTAAGTAACATGTACTATCAGGACACAGT2581GACATTAACCATCAAAGGCATGGAGCTGGAGCTTGTGAAGATTCTCAGGGTCTTCACATC2641TATTGATTTCTCTTCAAATAGATTTCAAGGAGCGATACCAGATACTATCGGGAATCTCAG2701CTCACTTTATGTTCTGAACTTGTCACACAATGCCCTTGAGGGACCAATCCCAAAATCGAT2761TGGGAAGCTACAAATGCTTGAATCACTAGACCTGTCAAGAAACCACCTGTCCGGGGAGAT2821CCCATCAGAGCTTGCAAGTCTCACATTCTTAGCAGCTTTGAACTTATCGTTCAACAAATT2881TTTTGGCAAAATCCCATCAACTAATCAGTTTCAAACATTCTCAGCAGATTCCTTTGAAGG2941AAACAGTGGCCTATGCGGTCTCCCTCTCAACGACAGTTGTCAGAGCAATGGTTCGGAGTC3001CCTGCCTCCACTAACTTCGCAATCAGACTCAGATGATGAATGGAAGTTCATTTTTGCAGC3061AGTTGGATACTTAGTAGGGGCAGCAAACACCATTTCACCTCTGTGGTTTTACGAGCCCGT3121GAAGAAATGGTTTGATAAGCATGCGGAGAAATGGTTGCTTTGGTTTTCAAGAATGTGATC3181CTTAAACCCATAACTAATGAGTTTATTTAATCCTTGCTTTGTAGTATTAATAAACATCAG3241GATCCAAATTCAAGTTATTTCCCTTGATGAATGTATACAATCAGAAACAGCACCCACTTT3301TGGATTAAATAGCTTGAGTGGGATATAGTACATAGTATCAGACCACAGTGATCGAATCAT3361TGTCTTCATGCATAATGATATCCCAAACTTATTATGGCTT3400(4)SEQIDNO.4的信息(i)序列特征(A)长度1051氨基酸(B)类型氨基酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii).分子类型多肽(iii).序列描述SEQIDNO.41MKMMTTLYFLWLLLVPLFQILSGNDIFLVSSQCLDDQKSLLLQLKGSFQYDSTLSNKLER61WNHNTSECCNWNGVTCDLSGHVIALELDDEKISSGIENASALFSLQYLESLNLAYNKFNV121GIPVGIGNLTNLKYLNLSNAGFVGQIPMMLSRLTRLVTLDLSTLFPDFDQPLKLENPNLR181HFIENSTELRELYLDGVDLSAQRTDWCQSLSSYLPNLTVLSLCACQISGPIDESLSKLQI241LSIIRLERNNLSTTVPGYFANFTNLTTLSLDSCNLQGAFPKKIFQVQVLESLDLSNNKLL301SGSIPSFPRNGSLRRISLSYTNFSGSLPESISNLQNLSRLGLSDFNFNGPIPSTMANLIN361LGYLDFSRNNFTGSIPHFQRSKKLTYLDLSRNGLTGLLSRAHFEGLSELVYINVGDNSLN421GTLPAYIFELPSLQQLFLNSNQFVGQVDEFRNASSSLLDTVDLRNNHLNGSIPKSTFEIG481RLKVLSLSSNFFSGTVTLDLIGRLNNLSRLELSYNNLTVDASSSNSTSFTFPQLSILKLA541SCRLQKFPDLMNQSMMIHLDLSDNQIRGAIPNWIWGIGDQGLTHLNLSFNQLEYMEQPYT601ASSNLVVLDLHTNRLKGDLLIPPSSPIYVDYSSNNSNNSIPLDIGKSLGFASFFSVANNG661ITGIIPESICDVSYLQILDFSNNALSGTIPPCLLEYSTTLGVLNLGNNRLHGVIPDSFPI721DCALNTLDLSENKLQGRLPKSLVNCKLLEVLNAGNNRLVDHFPCMLRNSNSLRVLVLRSN781QFSGNLQCEVTINSWPNLQIIDIASNNFTGVLNAEFFSNWRGMMVADDYVETGRNHIQYK841FFELSNMYYQDTVTLTIKGMELELVKILRVFTSIDFSSNRFQGAIPDTIGNLSSLYVLNL901SHNALEGPIPKSIGKLQMLESLDLSRNHLSGEIPSELASLTFLAALNLSFNKFFGKIPST961NQFQTFSADSFEGNSGLCGLPLNDSCQSNGSESLPPLTSQSDSDDEWKFIFAAVGYLVGA1021ANTISPLWFYEPVKKWFDKHAEKWLLWFSRM105权利要求1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQIDNO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQIDNO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列杂交。2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码具有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列的多肽。3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQIDNO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列。4.一种分离出的类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQIDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。6.一种载体，其特征在于，它包含权利要求1所述的DNA。7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞，其特征在于它是真核细胞。8.一种利用转基因技术将编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白质活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物抗病特别是抗黄萎病的方法，以及类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白基因在改良植物抗病性特别是抗黄萎病上的应用，特征在于其步骤如下(1)将编码具有类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白质活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含类番茄茄抗大丽轮枝菌受体蛋白质的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQIDNO.3中从核苷酸第23-3175位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入植物细胞；(3)通过筛选如抗生素筛选，获得转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。转基因植物及其后代对植物病害特别是黄萎病具有增强的抗性。全文摘要本发明提供了一种在类番茄茄(SolanumlycopersicoidesDun.)中表达的新的抗大丽轮枝菌受体蛋白(S1Ve1)、编码序列及其在改良植物抗病性特别是抗黄萎病上的应用。本发明涉及包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体。还涉及被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。本发明将所说基因在植物中表达，所获得的转基因植物对植物病害特别是黄萎病具有增强的抗性。文档编号C12N15/82GK1557952SQ20041001609公开日2004年12月29日申请日期2004年2月3日优先权日2004年2月3日发明者唐克轩,柴有荣,孙小芬,左开井,李柱刚申请人:复旦大学