专利名称：小球藻营养缺失突变体的高效表达体系的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中生物体转化及生产技术。即以导入外源基因的小球藻营养缺失突变体为表达体系，通过转基因藻的繁殖，规模生产目的基因的产物。
背景技术：
小球藻在植物分类学上属绿藻纲绿球藻目小球藻科，是具有原始形态的单细胞真核藻类，大约在20亿年前就出现在地球上。通常在淡水中进行浮游生活，形状呈球形或椭圆形，直径3-12微米，细胞壁平滑，进行无性分裂繁殖，分裂周期为10-20小时。目前世界上已知的小球藻有15种左右，加上它的变种可达数百种之多，且分布范围广泛，生态习性多样。小球藻具有很强的光合作用能力，它通过空气中的二氧化碳和水在阳光的照射下能合成包括蛋白质在内的各种有机物。如用有机物做为碳源也能进行无光繁殖。因此，小球藻外源基因表达体系的培养简单，生产成本低。
近年来，随着藻类分子遗传学的发展，将外源基因导入藻类并高效表达，把藻类作为新型的生物反应器，生产贵重的药品，保健品和精细化工产品，以及通过基因工程方法提高藻类蛋白含量，改善其营养品质是近年来藻类生物技术发展的主要趋势之一。
做为单细胞真核藻类与大型藻类相比具有以下特点一其培养条件简单，生产成本低；二繁殖迅速；三体积相对较小，结构简单，便于外源基因表达产物的提取。小球藻硝酸还原酶功能缺失突变体在利用氮源上有一定的缺陷，不能在以硝酸盐为唯一氮源的培养基上生长，其余的生理功能与普通的小球藻是一样的。因此硝酸还原酶基因就可以作为转基因藻的筛选标记基因，赋予转基因藻利用硝酸盐的能力。该筛选标记是与抗生素筛选标记相比，成本低廉、安全性好，不存在对环境污染的风险，这是本项目的特色。
发明内容
本发明旨在建立成熟的小球藻营养缺失突变体外源基因转化体系，将目前从动物、植物、微生物中分离到的基因通过电击穿孔转化技术导入小球藻营养缺失突变体中，使其成为新型高效的生物反应器，低成本地规模生产有用产品，特别是来源紧俏、造价昂贵的药物。本发明主要包括以下八方面的技术一、小球藻硝酸还原酶功能缺失突变体的培养技术；二、小球藻中硝酸还原酶基因的克隆技术；三、哺乳动物防御素的小球藻表达载体构建；四、病毒乙肝疫苗基因小球藻表达载体构建；五、植物天麻凝集素的小球藻表达载体构建。
六、用电击穿孔法将外源目的基因导入小球藻的技术；
七、转基因小球藻的筛选、分离纯化技术；八、转基因小球藻中外源基因产物的分离提取技术。
具体实施例方式
实施例1小球藻营养缺失突变体的培养技术小球藻硝酸还原酶功能缺失突变体的培养基成份为(NH4)2SO41.0g/l，K2HPO40.2g/l，MgSO4·7H2O 0.2g/l，KCl 0.12g/L，FeCl310mg/l，附加0.4％的葡萄糖。
固体培养液体培养基附加1.8％的琼脂，划线培养使藻长成单藻落。
液体培养将在固体培养基中生长的直径约1mm左右的单藻落接种于20ml液体培养基中悬浮培养，培养条件如下转速120-130rpm，温度20-25℃，每天光照培养16小时，光照条件3000-4000lux，黑暗培养8小时。在这样的培养条件下，小球藻营养缺失突变体生长良好。
由于藻类极易与菌类共生，因此在未长出菌落之前，将单藻落在固体培养基上划线，经几次继代直到无菌落出现为止。
实施例2小球藻硝酸还原酶基因的克隆和特性分析通过对拟南芥、莱茵衣藻等NR基因的氨基酸功能区进行分析，根据它们的氨基酸最保守的功能区序列及小球藻密码子的偏爱性，设计兼并引物，通过RT-PCR和5′RACE的方法，克隆了椭圆小球藻全长的NR基因的cDNA序列3304bp，该序列已经提交GenBank，接收号为AY275834。该cDNA编码898个氨基酸，编码这些氨基酸的密码子多偏爱G/C。NR具有Molyb氧化区、MoCo二聚体结合区、Heme区、FAD结合区及NAD结合区五个保守的功能区。同时通过RT-PCR的方法，对该基因在不同氮盐(硝酸盐、铵盐及无任何氮盐)处理的情况下的mRNA丰度定量，结果表明该基因的mRNA在有铵盐存在的情况下几乎检测不到，具有非常低的量。而在含有硝酸盐或没有氮盐的情况下，其mRNA强度则较强，在硝酸盐中，强度最大。这和在高等植物中的表达调控是不同的，在高等植物中只有在硝酸盐诱导的情况下才具有较强的活性，在不含有氮盐时，mRNA的表达量是很弱的。
实施例3以硝酸还原酶为筛选标记的防御素小球藻表达载体构建首先构建含硝酸还原酶完整基因的质粒载体。将PCR扩增得到的硝酸还原酶下游启动子NRPro用HindIII酶切开成线形，37℃3hr，酶切体系20μl，质粒DNA约1μg，10×buffer2μl，HindIII 3U在酶切体系中加1mmoldNTP，0.5μl Klenow酶，37℃温育30min，75℃ 10min终止反应，回收片段备用。
同样的方法将pBluescript SK的用EcoRI酶切，得到线形分子。载体pGEMT-NR2.8也用EcoRI酶切，得到2.8KB的NR基因。连接两酶切产物，连接比例为1∶1.5，45℃温育5分钟，冰上放置2分钟，加入0.5μlT4DNA连接酶，1μl 10×buffer用无菌水补至10μl，4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌感受态，兰白斑筛选阳性克隆，并进行酶切鉴定，鉴定正确的即为质粒载体pSK-NR2.8。回收，再将其用HindIII酶切，37℃3hr，酶切体系20μl，质粒DNA约1μg，10×buffer2μl，SmaI3U在酶切体系中加1mmoldNTP，0.5μl Klenow酶，37℃温育30min，75℃ 10min终止反应，回收片段，产物与上述NRPro连接，连接比例为1∶1.5，45℃温育5分钟，冰上放置2分钟，加入0.5μlT4DNA连接酶，1μl 10×buffer用无菌水补至10μl，4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌感受态，筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，鉴定正确的即为质粒载体pSK-NRPro-NR2.8。
从工具载体pBI101上PCR扩增nos中止子，用酶XbaI和NotI切，将PCR扩增产物5μg中加入XbaI和NotI各3U，两者10xbuffer 2μl，加水补至20μl，37℃酶切3小时，用试剂盒回收小片段nos。用同样的方法，同样的酶来切pSK-NRPro-NR2.8，连接两酶切产物，连接比例为1∶1.5，45℃温育5分钟，冰上放置2分钟，加入0.5μlT4DNA连接酶，1μl 10×buffer用无菌水补至10μl，4℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌感受态，筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，鉴定正确的即为NRPro-NR2.8，中止子nos相串连的载体pBluescriptSK-NR。
工具载体pBinUΩNP1中含有串联的Ubiquitin启动子，Ω增强子，NP1基因和nos中止子，nos中止子下游带有EcoRI酶切位点，首先用该酶将pBinUΩNP1切开成线形，37℃3hr，酶切体系20μl，质粒DNA约1μg，10×buffer2μl，EcoRI 3U在酶切体系中加1mmoldNTP，0.5μl Klenow酶，37℃温育30min，75℃ 10min终止反应。Klenow酶补平，回收，回收试剂盒购自鼎国生物技术有限公司。用同样的实验方法将已构建好的硝酸还原酶表达载体pBluescript SK-NR用BssHII酶切下NR基因，两端补平后，与上述线形pBinUΩNP1酶切回收产物连接，连接体系同上。产物即为我们的目的载体pBinUΩNP1-NR。直接通过基因枪或电激法转化硝酸还原酶缺失突变体小球藻，得到的转基因藻可以恢复其在硝酸盐的培养基上正常生长的能力。从该转基因小球藻分离纯化获得了防御素NP-1。
实施例4乙肝疫苗的小球藻表达载体构建实验室已构建好的工具载体pBinUΩNP1-NR，NP1片段两端为BamHI和SacI酶切位点，首先取5μl pBinUΩNP1-NR，加入BamHI 3U，10×buffer2μl，0.5μl Klenow酶，无菌水补至20μl，37℃温育3小时，回收线状片段。大片段pBinU-NR。同法再将其用SacI酶切，但不加Klenow酶，完成后，回收大片段pBinU-NR。将含有乙肝疫苗基因(HbsAg)的工具载体pUΩHBsAg同样用XbaI和SacI酶切，酶切体系20μl，同质粒载体pBinUΩNP1-NR。切下的HbsAg基因回收后与pBinU-NR片段连接，连接比例为2∶1，45℃温育5分钟，以解开粘端，冰上放置2分钟，加入0.5μlT4DNA连接酶，1μl 10×buffer无菌水补至10μl，4℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌感受态，筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，鉴定正确的即为乙肝疫苗的小球藻表达载体pBinUΩHBsAg-NR。此载体直接通过基因枪或电激法转化小球藻营养缺失突变体，得到的转基因藻在硝酸盐培养基上正常生长，并检测到了其表达的乙肝抗原蛋白。
实施例5植物天麻凝集素的小球藻表达载体构建天麻凝集素(Gastrodia Antifungal Protein简称GAFP)来自传统中药天麻的一种抗真菌蛋白，对许多植物的病原菌都有非常强的抑制作用，在抗病基因工程中有非常重要的应用。
工具载体pBinUΩNP1上Ω增强子，NP1基因两端的酶切位点分别是BamHI和SacI。首先取5μl pBinUΩNP1-NR，加入BamHI 3U，10×buffer2μl，0.5μl Klenow酶，无菌水补至20μl，37℃温育3小时，回收线状片段pBinUΩNP1-NR。然后取5μl线状pBinUΩNP1-NR，加入SacI 3U，10×buffer2μl，无菌水补至20μl，37℃温育3小时，回收大片段pBinU-nos。
同样的方法将工具载体pBI35SGAFP-Bar先用酶XbaI切，补平，再用SacI酶切，得到GAFP基因片段。将pBinU-nos与GAFP基因片段连接，连接比例为2∶1，45℃温育5分钟，以解开粘端，冰上放置2分钟，加入0.5μlT4DNA连接酶，1μl 10×buffer无菌水补至10μl，4℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌感受态，筛选阳性克隆并进行酶切鉴定，鉴定正确的即为植物天麻凝集素的小球藻表达载体pBinUGAFP-NR。通过基因枪法或电穿孔方法将此载体导入小球藻营养缺失突变体，得到的表达天麻凝集素的转基因小球藻在硝酸盐为唯一氮源的培养基上正常生长。
实施例6用电击法将外源目的基因导入小球藻的技术取培养第四天的小球藻培养液，1000rpm离心10min，弃上清，用含有0.2M甘露醇和0.2M山梨醇的培养液处理2hr，1000rpm离心10min，弃上清，加入一定量的小球藻液体培养液，使其密度达到107-108个/ml，加入电击缓冲液(Electroporation buffer)，成分为(80mM KCl，5mM CaCl2，10mM HEPES(N-2-Hydrox-yethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid，0.425MMannitol，pH 7.2)，使其密度达107-108个/ml。同时加入终浓度为10μg/ml的质粒DNA及25μg/ml的鲑精DNA，混匀后，在冰上放置5-10min，吸取0.4ml置于轰击小室中待用。
采用Baekon2000型电击仪进行电击，电压为9.5KV，每次电击时间为0.05sec，电击次数为210，循环次数为100次，电击高度为2mm，每次电击间隔时间为62.5sec。
实施例7转基因小球藻的筛选分离与纯化取电击转化法的小球藻0.4ml，铺于以硝酸盐为唯一氮源的固体培养基的培养皿中，进行筛选培养。非转基因的小球藻因为硝酸还原酶功能的缺陷，在筛选培养基上是不能生长的，只有转基因的藻株才能生长，在适宜培养条件下，3-4周后形成菌落，用牙签将此菌落挑取后，分别悬浮培养于只以硝酸盐为氮源的20ml液体培养基中，以后不断继代培养，大量繁殖后再进行外源基因表达产物的检测。
实施例8转基因小球藻中外源基因产物的分离纯化与活性测定(以防御素为例)转基因小球藻在含硝酸盐的液体培养基中培养至对数期时，8000rpm离心5分钟收获细胞，用3倍体积的磷酸缓冲液(PBS)重悬细胞后，同样条件下离心收获细胞，然后再用PBS(W/V＝1/2)重悬细胞，400V超声破碎1分钟，4℃放置2-4hr后，12000rpm离心10分钟，弃沉淀，上清放入50ml离心管中，沸水浴中煮10分钟，将再次12000rpm离心10分钟后的上清过SephadexG-50分子筛柱，收集第二个峰，用无离子水充分透析后，冻干成粉末，即得到较为纯净的防御素蛋白。
活性测定以大肠杆菌为指示菌，将37℃培养过夜的大肠杆菌100ul涂布在LB固体培养基上，待表面液体消失后，用无菌打孔器在培养基上做点样孔(孔径1cm)，吸取200ul待测样品加入孔中，对照是野生型小球藻的蛋白提取液，37℃培养过夜，观察到指示菌生长受抑制的情况，从而确定样品中活性成分的含量。
权利要求
1.一种小球藻的外源基因表达体系，该体系转基因小球藻含有外源目的基因、筛选标记基因，并能产生外源基因的产物。
2.根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于用小球藻硝酸还原酶功能缺失突变体为载体，突变体在以硝酸盐为唯一氮源的培养基上是不能生长的。
3.根据权利要求1所述的反应体系，其特征在于用电击穿孔法将外源基因导入小球藻营养突变体并得到表达。
4.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于将来自人与哺乳动物的基因，如防御素基因和抗菌肽基因等导入小球藻营养突变体中，并得到表达。
5.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于将来自病毒等的基因，如乙肝疫苗基因导入小球藻中，并得到表达。
6.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于将来自高等植物的基因，如天麻凝集素基因导入小球藻中，并得到表达。
7.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于导入外源基因后，以硝酸盐基因作为转基因小球藻的筛选标记，转基因小球藻可以在以硝酸盐为唯一氮源的培养基上生长。
全文摘要
本发明将外源目的基因导入到小球藻营养缺失突变体中，以硝酸还原酶基因作为筛选基因，以硝酸盐作为转基因藻的筛选标记，建立了成熟的小球藻外源基因转化体系，可将目前从动物、植物中分离到的基因通过基因枪、电击穿孔转化技术导入小球藻营养缺失突变体中，使其成为新型高效的生物反应器，可大量、低成本地生产有用产品，特别是紧俏价高的各种生物活性物质、生长因子等药物的规模生产。
文档编号C12N1/12GK1676597SQ200410029679
公开日2005年10月5日 申请日期2004年3月31日 优先权日2004年3月31日
发明者王义琴, 孙勇如, 王鹏, 张利明, 李文彬, 赵世民, 白琴华, 张小宇, 李霞 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所