专利名称：酶法测定镁离子含量的方法及镁离子诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶法测定血浆、血清等样品中镁离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的镁离子诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
目前医学上测定血浆、血清等样品中镁离子含量(简称镁测定)的手段比较多，概括起来有比色法、荧光法、离子色谱法、离子选择性电极法(ISE)、酶法、原子吸收分光光度法(AAS)、同位素稀释质谱法(ID-MS)等。其中决定性的方法是ID-MS，其次是AAS，这两种方法虽然结果准确，但设备复杂、费用昂贵，不适用于常规实验室和自动分析。
比色法是应用最广泛的方法，包括甲基麝香草酚蓝法(MTB)、达旦黄法、邻甲酚酞络合酮法(OCPC)、钙镁试剂法(Calmagite)以及新近报道的2-(8’-羟基喹啉-5’-磺酸-7’-偶氮)-变色酸法(8Q5SAC)。比色法操作简便、费用低，适合常规实验室应用，但存在试剂空白吸光度高、易受胆红素和其它阳离子干扰、试剂稳定性差，以及试剂中含有腐蚀性或毒性成分等缺点。离子选择性电极法(ISE)可以测定生理溶液中镁离子活度，采用中性载体(ETH7025)液膜离子选择电极，测定的准确度较高，但仍存在生理范围内的钙干扰，Ca2+最大干扰达10％。离子色谱法在测定之前需要对样本进行预处理，包括酸化稀释和过滤。Thienpont等使用该方法对五种“国际标准和技术学会”用火焰原子吸收分光光度法的定值血清进行了分析，结果平均偏差仅为0.35％，认为离子色谱法可作为测定镁元素总量的有价值的参考方法。
酶法测定血浆、血清等样品中镁离子(主要是Mg2+)的研究近几年非常活跃，取得了较大进展。目前已应用于Mg2+测定的酶学方法有①甘油激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；②甘油激酶、磷酸甘油氧化酶和过氧化物酶偶联法；③葡萄糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；④酶联化学发光法；⑤磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联法；⑥异柠檬酸脱氢酶法；⑦丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶偶联法。
总体上看，采用酶法检测镁离子结果准确、干扰小、适合于自动化分析。但是，应用不同的检测试剂和测试路线，检测的灵敏度、检测结果的准确性会有很大差别，直接影响到该方法的使用与推广，这正是人们在该领域内不断研究、发展和创新的原因所在。由于有着非常好的应用前景，对酶法检测镁离子的研究已经成为该领域内的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法测定镁离子含量的方法，以及应用该方法配制而成的镁离子诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂，能够利用紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪对血浆、血清等样品中镁离子的含量进行快速、准确测定，以便推广使用酶法检测镁离子的方法以及相应的诊断试剂盒，使该领域内检测手段得到进一步丰富和发展。
为实现本发明的目的，一种酶法测定镁离子含量的方法，采用以下步骤进行首先，将血浆、血清等需要测定的样品与含有甘油、腺苷三磷酸、甘油激酶、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，
然后，将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降幅度，进而测算出样品中镁离子的含量。
测定过程中，被测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500，反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。
实现本发明方法的镁离子诊断试剂盒可以是单剂，由以下成分组成缓冲液40～200mmol/l，甘油 1～40mmol/l，腺苷三磷酸0.2～20mmol/l，磷酸烯醇式丙酮酸 1～5mmol/l，还原型辅酶0.2～0.3mmol/l，丙酮酸激酶2000～20000U/l，乳酸脱氢酶2000～50000U/l，甘油激酶 2000～50000U/l，稳定剂/试剂总体积 10～80％。
也可以将以上单剂中的各种成分进行组合配制成双剂，以利于消除内、外源物质的污染，比如
双剂的配方不仅仅限于上述表中所列，其中试剂I的成分腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、还原型辅酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶等，可以放在试剂II；试剂II中的成分甘油、甘油激酶等，也可以放到试剂I，如此可以形成多种配方，不再一一列举。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源物质的污染，还有利于试剂更稳定
与双剂类似，三剂的配方也不仅仅限于上述配方，其中试剂I中的腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸和还原型辅酶可以放在试剂II或试剂III中，试剂II中的丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶和甘油激酶可以放在试剂I或试剂III中，试剂III中的甘油也可以放到试剂I或者试剂II中，如此可以形成多种配方，不再一一列举。
上述诊断试剂盒的成分当中，选择缓冲液的基本要求是PH值在6.0～11.0范围之内，可以是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸(Tris-HCl)缓冲液”、“三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液”、“咪唑～盐酸(Imidazole-HCl)缓冲液”、“双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸(Phosphate)缓冲液”或者“磷酸盐(Phosphate-Sodium Chloride，PBS)缓冲液”中的至少一种，但选择范围并不受这些列举所限制。
此外，为减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I/试剂II、三剂的试剂I/试剂II/试剂III当中通常加入稳定剂，其用量约占所在试剂总体积的10～80％(或者浓度在10～50mmol/l范围之内)。
用作稳定剂的物质可以是乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
上述镁离子诊断试剂盒的试剂成分当中，所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NAD+)或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADP+)；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(thio-NADH)或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(thio-NADPH)。
研究表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的镁离子诊断试剂盒较为理想，也是本发明的优选方案缓冲液80～120mmol/l，甘油 10～20mmol/l，腺苷三磷酸2～8mmol/l，磷酸烯醇式丙酮酸 1～5mmol/l，还原型辅酶0.2～0.3mmol/l，丙酮酸激酶6000～12000U/l，乳酸脱氢酶10000～30000U/l，甘油激酶 10000～30000U/l，稳定剂/试剂总体积 10～50％。
本发明应用镁离子激活甘油激酶活性的特点，甘油激酶活性激化的程度与血浆、血清等被测样品中镁离子的含量成正比，在腺苷三磷酸的存在下与甘油反应生成腺苷二磷酸，再偶联丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶，将还原型辅酶反应成氧化型辅酶。由于还原型辅酶在340nm有非常明显的吸收峰，而它们对应的氧化型辅酶在340nm没有吸收峰，反应所产生的吸光度的变化与样品中镁离子的含量成正比。因此，在固定时间间隔内测定主波长340nm处吸光度的下降幅度，便能很好地反映出样品中镁离子的含量。
本发明技术方案的突出的实质性特点和显著的进步主要表现在(1)本发明纠正了现有技术中的误解，ZL 98123138.1中认为“样品中镁离子的存在使丙酮酸激酶的活性显著增强”，实际上并非如此，而是样品中的镁离子激化甘油激酶的活性，这才使测试过程得以进行；(2)本发明完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，通过将还原型辅酶反应成氧化型辅酶，定量反映出被测样品中镁离子的含量，测试结果准确；(3)参与酶偶联反应的成分都是外加的，不受内、外源物质的污染，测试过程精确度高；(4)该方法简便、易操作，可快速得到检测结果，而且反应是在缓冲液条件下进行，不会污染环境；(5)该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用；(6)应用本发明提供的测定方法可以制成液态试剂、干粉试剂、干试剂等多种形式的试剂，主要用于测定人体和其它动物体内镁离子的含量，也可以结合稀释、浓缩等辅助手段来测定其它样品中的镁离子；(7)本发明提供的液态镁离子诊断试剂盒，稳定性好，存在于其中的各种酶的三维空间结构保持完整，很好地保证了应用测试效果。做成双剂或者三剂以后，能够进一步降低各种成分之间的交叉影响，检测结果更加可信，试剂更为稳定，可以长时间储存。
图1是本发明提供的诊断试剂(三剂)用于测试镁离子样品的检测结果示意图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明技术方案作进一步说明。这些例子仅是一些应用范例，不能理解为对本发明权利要求保护范围的一种限制。
实施例一(单剂)按以下成分和用量配制血清中镁离子诊断试剂盒
双甘氨肽缓冲液 80mmol/l，甘油10mmol/l，腺苷三磷酸 2mmol/l，磷酸烯醇式丙酮酸1mmol/l，thio-NAD+0.2mmol/l，丙酮酸激酶 6000U/l，乳酸脱氢酶 10000U/l，甘油激酶10000U/l，乙二醇 50％(占试剂总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂的体积比例为1∶25，反应方向为负反应(吸光度下降，下同)。
加入血清样品和配成的单剂，两者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。一共检测读点31次，大约每隔20秒记录一次数据，根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中镁离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例二(双剂)按以下成分和用量配制血清中镁离子诊断试剂盒试剂I——咪唑～盐酸缓冲液100mmol/l，甘油15mmol/l，腺苷三磷酸 5mmol/l，磷酸烯醇式丙酮酸3mmol/l，NADP+0.25mmol/l，
丙酮酸激酶9000U/l，乳酸脱氢酶20000U/l，乙二醇50％(占试剂I总体积)；试剂II——咪唑～盐酸缓冲液 100mmol/l，甘油激酶 20000U/l，乙二醇50％(占试剂II总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度30℃、反应时间15分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为负反应。
先加入血清样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中镁离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
实施例三(三剂)按以下成分和用量配制血清中镁离子诊断试剂盒试剂I——三乙醇胺缓冲液120mmol/l，腺苷三磷酸8mmol/l，磷酸烯醇式丙酮酸 5mmol/l，thio-NADP+0.3mmol/l，丙二醇20mmol/l试剂II——三乙醇胺缓冲液120mmol/l，丙酮酸激酶12000U/l，
乳酸脱氢酶30000U/l，丙二醇50％(占试剂II总体积)；试剂III——三乙醇胺缓冲液120mmol/l，甘油 20mmol/l，甘油激酶 30000U/l，乙二醇50％(占试剂III总体积)。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度25℃、反应时间20分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I、试剂II和试剂III的总体积之比为1∶25，试剂I、试剂II和试剂III的用量为8∶1∶1，反应方向为负反应。
先加入血清样品和试剂I、试剂II，5分钟之后加入试剂III，它们在分析仪内部自动混匀，检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中镁离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
图1是本具体实施例的测试结果示意图。图中A点是血清样品和试剂I、试剂II同时加入的时间点，B点是第一次检测记录点，C点是试剂III的加入点，A点和B点之间的时间间隔大于仪器的检测启动时间(一般在1分钟左右)。从图中可以看出，试剂III加入之后仪器检测数据才有了明显的变化，这说明正是样品中的镁离子激化了甘油激酶的活性，这才使测试过程得以进行；中国专利ZL 98123138.1中认为的“样品中镁离子的存在使丙酮酸激酶的活性显著增强”实际上是一种误解。
实施例四(双剂优选例)按以下成分和用量配制血磷诊断试剂盒试剂I——Tris-HCl缓冲液100mmol/l，
磷酸烯醇式丙酮酸 1mmol/l，NAD+0.25mmol/l，丙酮酸激酶 12000U/l，乳酸脱氢酶 18000U/l，硫酸铵 20mmol/l；试剂II——Tris-HCl缓冲液 100mmol/l，甘油 20mmol/l，腺苷三磷酸 2mmol/l，甘油激酶 18000U/l，硫酸铵 20mmol/l。
在全自动生化分析仪(日立-7080)上设定温度37℃、反应时间10分钟、测试主波长340nm、测试副波长405nm以上，被测样品与试剂I和试剂II的总体积之比为1∶25，试剂I与试剂II的用量之比为4∶1，反应方向为负反应。
先加入血清样品和试剂I，5分钟之后加入试剂II，三者在分析仪内部自动混匀，发生以下原理性反应
检测、记录340nm吸光度的下降情况。根据速率法、终点法等方法，对照相应的标准曲线测算出血清样品中镁离子的含量。对同一批样品多次重复以上过程，测试结果重复性好、精确度高。
本发明的显著特色之一是可以消除内、外源腺苷二磷酸、丙酮酸的污染。消除内、外源腺苷二磷酸、丙酮酸的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间，受污染的内、外源腺苷二磷酸、丙酮酸已经被消耗殆尽，而后半段时间检测所需要的腺苷二磷酸、丙酮酸都是源自样品中含有的镁离子。
总之，实验证明采用本发明的测定方法，完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪器，测定出血浆、血清等样品中镁离子的含量，测试灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。而且，本发明提供的镁离子诊断试剂盒，稳定性好，长时间存放之后仍然能够准确检测各种类型样品中的镁离子含量。
权利要求
1.一种酶法测定镁离子含量的方法，包括以下步骤①将待测样品与含有甘油、腺苷三磷酸、甘油激酶、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶和还原型辅酶的试剂混匀，使之发生以下反应，②将反应混合物置于紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪下，检测主波长340nm的吸光度的下降幅度，测算出样品中镁离子的含量。
2.根据权利要求1所述的酶法测定镁离子含量的方法，其特征在于待测样品与试剂的使用比例按体积控制在1∶10～1∶500。
3.根据权利要求1或2所述的酶法测定镁离子含量的方法，其特征在于反应温度控制在20℃～50℃，反应时间控制在2～30分钟，检测时设定副波长在405nm以上。
4.一种镁离子诊断试剂盒，盒中试剂由以下成分组成缓冲液 40～200mmol/l，甘油 1～40mmol/l，腺苷三磷酸 0.2～20mmol/l，磷酸烯醇式丙酮酸 1～5mmol/l，还原型辅酶0.2～0.3mmol/l，丙酮酸激酶2000～20000U/l，乳酸脱氢酶2000～50000U/l，甘油激酶 2000～50000U/l，稳定剂/试剂总体积 10～80％。
5.根据权利要求4所述的镁离子诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液的PH范围是6.0～11.0。
6.根据权利要求5所述的镁离子诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲液是“三羟甲基氨基甲烷～盐酸缓冲液”、“三乙醇胺缓冲液”、“2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液”、“咪唑～盐酸缓冲液”、“双甘氨肽缓冲液”、“柠檬酸～柠檬酸钠缓冲液”、“巴比妥钠～盐酸缓冲液”、“硼酸～硼砂缓冲液”、“甘氨酸～氢氧化钠缓冲液”、“硼砂～氢氧化钠缓冲液”、“磷酸缓冲液”或者“磷酸盐缓冲液”中的至少一种。
7.根据权利要求4所述的镁离子诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、硫酸铵、硫基乙醇、牛血清白蛋白、碳酸盐、胆酸盐、葡聚糖、乙二胺四乙酸、黄素腺嘌呤二核苷酸、黄素单核苷酸、葡萄糖、谷氨酸盐、还原型谷胱甘肽、乳糖、甘露醇、丁二酸盐或者氯化钠中的至少一种。
8.根据权利要求4所述的镁离子诊断试剂盒，其特征在于所述氧化型辅酶是——氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+、氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADP+、氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NAD+或者氧化型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADP+；所述还原型辅酶是——还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH、还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸thio-NADH或者还原型硫代烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸thio-NADPH。
9.权利要求4～8中任意一项镁离子诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或者三剂。
全文摘要
本发明涉及酶法测定镁离子含量的方法以及镁离子诊断试剂盒。应用血浆、血清等样品中镁离子激活甘油激酶活性的特点，在腺苷三磷酸的存在下与甘油反应生成腺苷二磷酸，再偶联丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶，将还原型辅酶反应成氧化型辅酶，通过测定主波长340nm处吸光度的下降幅度而测定出样品中镁离子的含量。该方法特异性高，不受内、外源物质的污染，测试结果精确、准确性好。将诊断试剂盒制成双剂或三剂可减少各成分的交叉影响，保持试剂的稳定性，便于长期储存。该方法在普通紫外/可见光分析仪或者半自动/全自动生化分析仪上便可快速检测，不需要特殊或额外仪器，测试成本低廉，便于行业内推广应用。
文档编号C12Q1/48GK1778959SQ20041006555
公开日2006年5月31日 申请日期2004年11月23日 优先权日2004年11月23日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司