专利名称：一种耐高温、高比活植酸酶基因及其克隆和表达的制作方法
技术领域：
一种耐高温、高比活植酸酶基因及其克隆和表达，本发明属于微生物基因工程领域，更具体地说是通过基因工程方法克隆出具有耐高温、高比酶活并能够在高温下保持长时间活性的植酸酶基因。
背景技术：
植酸(phytic acid)化学名称为环己六醇六磷酸酯，又称六磷酸肌醇，是由一分子的肌醇和六分子的磷酸组成。分子式为C6H18O24P6，分子量为660.08。
植酸广泛存在于植物中，特别是在谷类、豆类和油料作物种子中含量丰富。植物籽实中的磷主要是以植酸磷的形式贮存。植酸容易同许多二价金属离子，如Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+等结合形成植酸盐(复合盐或者是单盐)，降低自由离子的浓度。
植酸酶(myo-inositol hexakisphosphate phosphohydrolase；EC 3.1.3.8)是一类可以水解植酸的酸性磷酸酶，能催化分解植酸生成无机磷酸和肌醇。这一性质使得植酸酶在饲料工业中具有很重要的应用意义。植物来源组分在饲料中占很大的比重，而植物中的磷元素又主要是以植酸的形式存在。有些谷物、油料作物中的植酸含量甚至高达1％～3％。由于单胃动物消化道中缺乏分解植酸的酶系，因此植酸不能被单胃动物分解生成无机磷，而是随着粪便被排出体外，进入到环境中。这样既造成磷元素的大量浪费，需要人们在饲料中额外添加磷元素，司时大量的磷元素被排放到环境中，加剧了环境污染。此外，植酸还是强抗营养因子，能螯合Ca2+、Fe2+、Zn2+等金属离子形成难溶性植酸盐络合物，能与带正电荷的蛋白质、维生素等形成难溶复合物，影响蛋白质、维生素的吸收并降低了饲料的营养价值。作为单胃动物的饲料添加剂，植酸酶的饲喂效果已经得到充分的确证它可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，减少了饲料中无机磷的添加量，动物粪便中无机磷排出量减少40％，减轻了环境的磷污染量；植酸酶还能解除植酸对金属离子和蛋白质的螯合作用，提高单胃动物对金属离子尤其是微量金属离子的吸收，提高蛋白质的利用率。
植酸酶大多是单亚基糖蛋白，其糖基组成及比例为甘露糖∶半乳糖∶N-乙酰葡萄糖胺＝9∶1∶3，分子量一般在40～120kDa，它们的最适pH范围在4.5～6.0，最适温度在45～60℃之间。现已知的植酸酶有3种类型，肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶(3-Phytase，EC3.1.3.8)、肌醇六磷酸-6-磷酸水解酶(6-Phytase，EC 3.1.3.26)和非特征性的正磷酸单酯磷酸水解酶(EC 3.1.3.2)。通常所说的植酸酶是指肌醇六磷酸-3-磷酸水解酶，编码它的基因称之为phyA(Wyss 1999，Appl.Environ.Microbiol)。PhyA的高级结构中有5对二硫键。二硫键的作用主要是参与酶活性中心空间结构的形成，因此任何破坏二硫键的变性剂都将导致酶活力的丧失。此外，二硫键还与植酸酶的耐热性有关。PhyA的晶体结构由一个大的α’结构域和一个较小的α结构域组成。α’结构域的中心是一个由6个相对应的氨基酸序列组成的β折叠片。α结构域中则共有14个α螺旋构成。在两个结构域的内表面有一很深的凹套，凹套中有酶活性中心的必需氨基酸——Arg58和His59，它们是植酸酶活性位气保守序列RHG×R×P中的前两个氨基酸。酶蛋白分子共有19个Arg。RHG×R×P序列中Arg58直接涉及其酶活性，Arg58在其晶体结构中的位置也与它的功能相吻合。底物结合部位RHG×R×P中的Arg58被认为是维持酶活所必需的残基，即底物结合部位利用其带正电荷的残基与带有负电荷的底物通过静电吸附作用形成具有特定构象的ES复合物，再借助催化部位功能，将底物水解。酶活力的丧失是由于底物结合部位中RHG×R×P的精氨酸R基被修饰。微生物中PhyA的晶体结构与鼠的低分子酸性磷酸酶的晶体结构有很高的相似性，说明它属于组氨酸族酸性磷酸酶。微生物中PhyB虽然属于组氨酸酸性磷酸酶家族，也有活性位点保守序列RHG×R×P，但它的最适底物不是植酸盐，因而只能看作是具备植酸酶活性的酸性磷酸酶。细菌植酸酶编码基因phyC较短，基因全长1152，编码383个氨基酸，N端前26个氨基酸为信号肽，所编码的酶蛋白分子量也较小，它的核苷酸序列及编码的氨基酸序列与phyA和phyB及已报道的磷酸酶基因没有同源性，也不具有phyA和phyB编码的氨基酸序列活性位点RHG×R×P保守序列，说明它不属于组氨酸酸性磷酸酶家族。phyA基因含1个内含子，2个最适pH；phyB基因含3个内含子，1个最适pH。
植酸酶作用于植酸，植酸分子上的磷酸基团逐个切下，形成中间产物IP5、IP4、IP3、IP2，终产物为肌醇和磷酸。按作用起始位点的不同，植酸酶可分为两类3-植酸酶(EC 3.1.3.8)和6-植酸酶(EC 3.1.3.26)。3-植酸酶先从植酸的第3碳位点开始水解酯键释放无机磷，然后依次水解其他位点的酯键，这类酶需要二价镁离子作为辅基，主要存在于微生物中。6-植酸酶则先从植酸的第6碳位点开始水解酯键，这类酶主要存在于植物中。植酸酶并不能彻底分解肌醇磷酸酯，要彻底分解肌醇磷酸酯，则需要酸性磷酸酶的帮助。植酸酶作用机理研究最透彻的是假单胞菌植酸酶，此外对麦麸植酸酶、无花果曲霉植酸酶的作用机理也有初步了解。理论上1g植酸完全分解可释放出281.6mg无机磷。
植酸酶广泛存在于自然界中，在动物、植物、微生物中均有发现。据报道目前注册的植酸酶蛋白序列接近200种，其中大部分是从自然界发现的，也包括许多人工改造过的，还不断有新的天然酶被发现。然而能应用于饲料工业的天然植酸酶并不是很多。这主要是以下两因素起到了限制作用一、饲喂单胃动物的植酸酶的最适pH值最好能与动物消化系统如胃、肠等器官的pH环境一致，这样才有利于被摄入的植酸酶较好的发挥作用。据报道(韩正康，1991)，猪胃中食糜pH值在1.8～3.6之间，十二指肠食糜pH值在3.9～7.0之间。鸡的胃糜pH则在4.5～4.8之间，十二指肠在5.7～6.0之间。因此，当植酸酶的最适pH范围越宽，对猪、鸡等动物消化道pH环境适应性越强。二、饲料加工过程中的热处理，如制粒、膨化等工艺对植酸酶的活性有直接影响，许多植酸酶不能经受比较高的加工温度(通常是75℃～93℃)，因而也限制了它的应用(王红宁2000，凹川农业大学学报)。
目前植酸酶的研究重点为微生物来源的植酸酶，尤其是真菌来源的植酸酶已经有许多的报道，像Aspergillus ficuum，A.fumigatus，A.niger，A.terrus，A.oryzae，Emericella nidulans，Mycleiophthora thermophila，Thermomyces lanuginose(Berka 1998，Appl.Environ.Microbiol；Mitchell 1997，Microbiology)等等。与植物来源的植酸酶相比，微生物植酸酶具有较大的pH值范围，有的pH值在2.5～5.5之间，与单胃动物的肠胃生理条件接近。而植物来源的植酸酶作用pH值在5.0～7.5之间，且耐热性能不好，在饲料加工过程中不能耐受80℃制粒温度(Simons 1990，Br JNutr)。现在用于工业生产植酸酶的微生物主要是黑曲霉、无花果曲霉、米曲霉等，它们能分泌较高活性的胞外酶，并且作用pH在酸性范围内。这些酶在37℃时具有较好的酶活性，但也不大能经受制粒时的高温。而从嗜温微生物M.thermophila，A.terreus等分离到的高温植酸酶最适温度在70～80℃，虽然有很好的耐温性，但它在37℃(植酸酶在动物体内的作用温度)时酶的活性极低，没有使用价值。所以如何使得酶能短暂的耐高温且在动物正常体温下具有高酶活性是目前包括植酸酶在内的饲用酶制剂急需解决的一个问题。此外，饲喂单胃畜禽的植酸酶属酸性植酸酶，并不适用于淡水养殖的鲤鱼科鱼类，因为鲤鱼科鱼类无胃，只有pH呈中性的肠道，要使添加在鱼饲料中的植酸酶发挥作用必需使用最适pH为中性的中性植酸酶。目前开发中性植酸酶也成为研究的热点。近年报道的芽孢杆菌植酸酶具有近乎中性的最适pH值，酶活性高，热稳定性好，有可能广泛应用于鱼类饲料(Choi 2001，J Protein Chem)。
植酸酶的研究已有近40年历史。20世纪70年代中期，限制养殖业的磷排泄量成为欧共体成员国实施的环境保护议会指引的核心内容之一。欧洲开始致力于寻找全面解决无机磷污染的方案。直到1980年，荷兰Wageningen大学找到植酸酶基因，Gist-brocades公司(DSM的前身)确认了植酸酶的功能，植酸酶的开发成为可能。德国巴斯夫(BASF)和Gist-brocades率先利用基因转移技术，于1989年首次成功地用A.niger工业化规模生产商品植酸酶。1990年获得欧洲饲料添加剂管理机构的全面批准认可，酶他富(Natuphos)为商品名上市。从此，各国以大学、研究所和各类商业研究机构为主纷纷投入了大量的人力物力资源从事开发研究。如今，在国际市场上至少已有几家公司生产的近10个品种，在中国国内至少有3～5家企业已经开发出植酸酶产品。还有更多的企业和研究机构正在从事植酸酶的开发工作。
对植酸酶的研究开发大致有两条途径一、通过传统的遗传学方法对已有的菌株进行改良以获得性能更优良的菌株；二、通过基因工程的手段克隆性能优良的植酸酶基因并将其导入到合适的宿主体内得到优良的重组菌。以上两种途径都有成功的例子报道。如1994年Marisa等人对无花果曲霉NRLL3115进行紫外诱变，选育出产酶量为野生型菌株3.3倍的突变株。1997年陈红歌等人对黑曲霉MAO21进行紫外、亚硝基胍诱变获得一株植酸酶高活性菌株，其酶活力是原始菌株的3.6倍。1991年Van Gorcom等将无花果曲霉的植酸酶基因phyA在淀粉葡萄糖苷酶的启动子的控制下，克隆到黑曲霉CBS513.88中表达，产酶量提高1400倍。1998年姚斌等将筛选的高产植酸酶的黑曲霉的植酸酶基因克隆到毕赤氏酵母中，表达量比原菌株高3000倍(朱靖环2002微生物学杂志)。并同时开发了利用生物反应器大规模、低成本生产饲料添加剂植酸酶的工艺。但是，该植酸酶存在一个不容忽视的缺陷不能耐受较高的温度，在加工过程中酶活力单位大量丧失(Kim 1998，Enz Microbial Tech)。从A.fumiga分离的植酸酶能够耐受90～100℃高温，而且能在较宽的pH范围内降解植酸，因此具有很大的市场潜力(Vall Loon1998，Appl Environ Microbiol)。根据A.fumigatus的植酸酶基因序列，用化学合成和体外基因重排等技术在酵母中高效表达了此酶，酶活力为130,000u/ml。表达量是野生型基因的13倍。经高密度发酵，蛋白表达量为每升5.6g。但此酶的不足之处是经过基因重排后重组植酸酶的比酶活也仅为23,000u/mg(中国发明专利02136531.8)，仅为野生型A.niger植酸酶的四分之一。
发明内容
本发明的目的是寻找一种耐高温、高比活的植酸酶及其编码基因，并利用酵母中表达制备该植酸酶的方法。
本发明提供了一种来源于粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)AS 3.1604中的耐热性、高比活植酸酶基因序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有N.crassa AS3.1604植酸酶基因的克隆载体pUC-Ncphy和在酵母中表达的表达载体pP-Ncphy。利用本发明成果，可以用于植酸酶工业化生产的基因工程菌的构建和现有植酸酶基因的分子改造，提高微生物发酵法生产植酸酶的水平和质量，还可以用于动植物的基因转化，达到改善物种品质的目的。
本发明的技术方案以来源于所有曲霉属的植酸酶基因的高度保守区序列为基础，经过同源比对N.crassa OR74A全基因组序列，从中获得一段与黑曲霉phyA有40％同源性的未知基因功能的区域。通过PCR技术，以N.crassa AS 3.1604染色体DNA为模板，以NC-phy801，5’-ACCGGAATTCATGCTACGAGTACTATCCCCAAATCC-3’和NC-phy901，5’-ACCGGAATTCccgcttcggtAATTCGCAGC-3’为引物扩增出植酸酶成熟肽基因并去除5’端的内含子。在扩增片段两端引入EcoR I酶切位点，回收1.5kb的植酸酶基因片段，EcoR I酶切，插入pUC19，获得pUC-Ncphy；正向插入到pPIC9K载体，构建成耐高温、高比活植酸酶基因的酵母表达载体pP-Ncphy。pUC-Ncphy用于序列测定，pP-Ncphy用于转化酵母和含植酸酶基因Ncphy重组酵母的构建。
基因Ncphy的核苷酸序列如下atgctacgag tactatcccc aaatccagca tcatgcgaca gcccagagct tggttaccaa60tgtaactcag agacaaccca cacatggggt caatactcgc ccttcttctc cgtcccgtcg120gaaatctccc cctccgttcc cgagggttgc cgcctcacct ttgcccaagt tctttctcgc180cacggcgctc gcttcccaac tcccggaaaa gccgccgcca tctccgccgt tctcaccaag240atcaaaacct ccgccacctg gtacgccccc gacttcgagt tcatcaaaga ctacaactat300gtcctcggcg tcgaccacct cactgccttt ggcgagcaag agatggtcaa ctcgggcatc360aaattctacc aacgctacgc ttccctcatc cgggactaca ctgacccaga atccctcccc420tttatccgtg cctcggggca ggagcgcgtc attgcctcag ctgagaactt caccactggg480ttctactctg ccctccttgc cgacaagaac ccaccccctt cctccctccc gcttccccgc540caggagatgg tcatcatctc cgaatcgccc acggccaaca acaccatgca ccacggtctc600tgccgcgcct ttgaggactc caccaccggc gatgcggccc aggcgacctt tatagctgcc660aatttcccgc ccatcaccgc gcggttgaat gcgcagggtt tcaaaggcgt cactctttcc720gacacggacg tgctctcgct catggatctc cgcccctttg acaccgtcgc ttacccgccc780tcctcctctc tcaccacctc gtcctctccc tcggggggaa gcaagctctc ccccttttgc840
tcccttttta ccgctcaaga ctttaccgtg tacgactacc tccagtccct cggcaagttc900tacggctacg gcccgggtaa ttctctggct gccacgcagg gggtggggta cgtgaacgag960cttttggctc gcctcacggt ttccccggtg gtggataaca cgaccaccaa ttccacgctg1020gacgggaacg aggacacgtt tccgctgagt aggaacagga cggtgtttgc ggatttcagt1080catgataatg atatggtggg gatcttgact gctttgagaa tctttgaggg ggtggatgcg1140gagaagatga tggataatac gaccataccg agagagtacg gggagactgg cgatgatccg1200gcaaatttga aagagaggga gggcttgttc aaggttggtt gggtggtgcc atttgcggcg1260agggtgtatt ttgaaaagat gatttgtgat ggggatggga gtggagagat ggttcagagc1320gaggaggaac aggacaagga gttggtgagg atcttggtta acgatagagt ggttaaacta1380aatggatgtg aggccgatga gttggggagg tgtaagttgg ataaatttgt agagagtatg1440gagtttgcta ggaggggtgg agattgggac aagtgttttg cttag 1485其中， 为人工加入的转录启始密码子， 为终止密码子。
根据以上核苷酸序列，N.crassa AS 3.1604的植酸酶的氨基酸序列如下Met Leu Arg Val Leu Ser Pro Asn Pro Ala Ser Cys Asp Ser Pro1 5 10 15Glu Leu Gly Tyr Gln Cys Asn Ser Glu Thr Thr His Thr Trp Gly20 25 30Gln Tyr Ser Pro Phe Phe Ser Val Pro Ser Glu Ile Ser Pro Ser35 40 45Val Pro Glu Gly Cys Arg Leu Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser 50 55 60 Thr Pro Gly Lys Ala Ala Ala Ile Ser65 70 75Ala Val Leu Thr Lys Ile Lys Thr Ser Ala Thr Trp Tyr Ala Pro80 85 90Asp Phe Glu Phe Ile Lys Asp Tyr Asn Tyr Val Leu Gly Val Asp95 100 105His Leu Thr Ala Phe Gly Glu Gln Glu Met Val Asn Ser Gly Ile110 115 120Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Ala Ser Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp125 130 135Pro Glu Ser Leu Pro Phe Ile Arg Ala Ser Gly Gln Glu Arg Val140 145 150
Ile Ala Ser Ala Glu Phe Thr Thr Gly Phe Tyr Ser Ala Leu155 160 165Leu Ala Asp Lys Asn Pro Pro Pro Ser Ser Leu Pro Leu Pro Arg170 175 180Gln Glu Met Val Ile Ile Ser Glu Ser Pro Thr Ala Asn Thr185 190 195Met His His Gly Leu Cys Arg Ala Phe Glu Asp Ser Thr Thr Gly200 205 210Asp Ala Ala Gln Ala Thr Phe Ile Ala Ala Asn Phe Pro Pro Ile215 220 225Thr Ala Arg Leu Asn Ala Gln Gly Phe Lys Gly Val Thr Leu Ser230 235 240Asp Thr Asp Val Leu Ser Leu Met Asp Leu Arg Pro Phe Asp Thr245 250 255Val Ala Tyr Pro Pro Ser Ser Ser Leu Thr Thr Ser Ser Ser Pro260 265 270Ser Gly Gly Ser Lys Leu Ser Pro Phe Cys Ser Leu Phe Thr Ala275 280 285Gln Asp Phe Thr Val Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Gly Lys Phe290 295 300Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Asn Ser Leu Ala Ala Thr Gln Gly Val305 310 315Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Val Ser Pro Val320 325 330Val Asp Thr Thr Thr Ser Thr Leu Asp Gly Asn Glu Asp335 340 345Thr Phe Pro Leu Ser Arg Arg Thr Val Phe Ala Asp Phe Ser350 355 360His Asp Asn Asp Met Val Gly Ile Leu Thr Ala Leu Arg Ile Phe365 370 375Glu Gly Val Asp Ala Glu Lys Met Met Asp Thr Thr Ile Pro380 385 390
Arg Glu Tyr Gly Glu Thr Gly Asp Asp Pro Ala Asn Leu Lys Glu395 400 405Arg Glu Gly Leu Phe Lys Val Gly Trp Val Val Pro Phe Ala Ala410 415 420Arg Val Tyr Phe Glu Lys Met Ile Cys Asp Gly Asp Gly Ser Gly425 430 435Glu Met Val Gln Ser Glu Glu Glu Gln Asp Lys Glu Leu Val Arg440 445 450Ile Leu Val Asn Asp Arg Val Val Lys Leu Asn Gly Cys Glu Ala455 460 465Asp Glu Leu Gly Arg Cys Lys Leu Asp Lys Phe Val Glu Ser Met470 475 480Glu Phe Ala Arg Arg Gly Gly Asp Trp Asp Lys Cys Phe Ala485 490 494该植酸酶由494个氨基酸残基组成，从蛋白质一级结构分析，含有6个糖基化位点 和一个近氨基端活性中心保守序列 本发明的有益效果1、本发明的植酸酶具有明显的高比酶活，比酶活为125,000u/mg。是黑曲霉野生型植酸酶的1.2倍，A.fumigatus重组植酸酶的5.1倍。
2、本发明的植酸酶具有明显的耐高温性能，80℃和20 min，保留58％的酶活。同等条件下，黑曲霉植酸酶仅保存28％的酶活。
3、本发明的植酸酶具有广pH有效性和稳定性，在pH2.0～8.0之间有植酸酶活性，在pH3.5～9.5之间，有较好的pH稳定性。
4、本发明的植酸酶对环境因子具有较好的抗性，Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe2+、Co2+、Zn2+和EDTA等对其酶活影响很小。
图1构建成的细菌克隆植酸酶载体。
图2酵母表达植酸酶载体。
图3重组酵母表达植酸酶的蛋白电泳图谱。lane 1protein molecular weightmarkers comprising babbit phosphorylase b(97,400)，bovine serum albumin(66,200)，rabbit actin(43,000)，bovine carbonic anhydrase(31,000)，trypsin inhibitor(20,100)，henegg white lysozyme(14,400)；lane 2purified phytase；lane 3unpurified phytase；lane 4culture broth of the vector control图4不同pH条件下，植酸酶的相对活力。
图5重组酶的最适反应温度。
图6重组酶与商品酶热稳定性的比较。
图7重组酶pH稳定性的测定。
具体实施例方式
实施例1产植酸酶的N.crassa的初步筛选以本实验室保藏或来自于中国菌种保藏管理委员会的共11株N.crassa为出发菌株。产酶培养基成分1.5％葡萄糖，0.3％蛋白胨，0.2％(NH4)2SO4，0.05％MgSO4·7H2O，0.05％KCl，0.003％FeSO4·7H2O，0.003％MnSO4·4H2O，pH5.7。培养条件接种适量N.crassa孢子到50mL产酶培养基中，28℃，200r/min摇瓶振荡培养4d。培养液经过滤除去菌丝体，再8000r/min离心10min。吸取上清液，进行植酸酶酶活测定。植酸酶酶活测定方法按国家标准GB/T 18634-2002进行，植酸酶酶活性单位(u)定义为在37℃下，每分钟分解植酸盐释放出1nmol无机磷酸所需要的酶量为1u。从中筛选出的中国菌种保藏管理委员会的N..crassa AS3.1604(详见《菌种目录数据库》)。其发酵液中的植酸酶活最高，酶活为18.5u/mL。
实施例2N.crassa AS 3.1604植酸酶基因的克隆通过与黑曲霉、土曲霉等微生物植酸酶基因的高度保守区序列比对，发现N.crassa基因组中有一段编码未知功能的多肽的核苷酸序列很可能是编码植酸酶的基因。进一步Signal P V2.0程序推测N.crassa植酸酶信号肽序列，推测第88个氨基酸(第3个蛋氨酸)为起始密码子。其中，氨基端的68氨基酸残基为假基因编码序列。故以如下寡核苷酸为引物NC-phy801，5’-ACCGGAATTCATGCTACGAGTACTATCCCCAAATCC-3’NC-phy901，5’-ACCGGAATTCCCGCTTCGGTAATTCGCAGC-3’通过PCR技术，以N.crassa AS 3.1604染色体DNA为模板，扩增出植酸酶成熟肽基因并去除5’端的内含子。
N.crassa AS 3.1604染色体DNA提取按如下方法进行。用过滤的方法收集菌丝，并用生理盐水充分洗涤1～2次。置于5mL离心管中，最大转速离心，去除残余的生理盐水。将收集好的菌体置于5mL离心管中，每0.5g菌体加入1mL裂解缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，180mmol/L EDTA pH8.0，1％SDS(华美公司)，现配)，同时加入3/10总体积的石英砂，盖紧离心管盖，在漩涡振荡器上振荡5min～8min，每隔1min用力上下晃动离心管30s，使内容物混合均匀。65℃放置10min，加入600μL 7.5mol/L乙酸铵溶液，冰浴8min。以最大转速离心5min，转移上清至另一无菌的5mL离心管中，加入0.1倍体积的3mol/L的NaAc以及0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，冰浴8min。室温下以最大转速离心收集沉淀，弃上清，用200μL TE溶解沉淀，加入适量RNA酶，65℃温浴10min。取出，加入200μL氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次，将上清转入另一无菌的1.5mL离心管中，加入0.1倍体积的3mol/L的NaAc以及2.5倍体积的无水乙醇，以最大转速离心8min收集染色体DNA，70％乙醇洗涤一次，待乙醇挥发完全，用适量TE溶液溶解沉淀。
采用PCR技术，以N.crassa AS 3.1604染色体DNA为模板，用引物NC-phy801，5’-ACCGGAATTCATGCTACGAGTACTATCCCCAAATCC-3’和 NC-phy901，5’-ACCGGAATTCCCGCTTCGGTAATTCGCAGC-3’进行PCR扩增。PCR的扩增条件为94℃变性10min，加入PyrobestTMDNA聚合酶(大连宝公司)1个单位，混匀加入矿物油约100□l，然后94℃变性1min，56℃退火1.5min，72℃延伸3min，经过30个循环后，再72℃延伸7min。
PCR扩增产物的两端引入EcoR I酶切位点，回收1.5kb的植酸酶基因片段，EcoR I酶切，插入pUC19，获得pUC-Ncphy，如图1所示。pUC-Ncphy用于序列测定，对其插入的Ncphy采用Sanger链终止法进行核苷酸序列测定。
实施例3酵母表达植酸酶载体构建在扩增片段的两端引入EcoRI酶切位点，回收1.5kb的植酸酶基因片段，EcoRI酶切，插入pUC19，获得pUC-Ncphy，用EcoRI酶切pUC-Ncphy，切胶回收Ncphy片段，正向插入到pPIC9K载体(来自Invitrogen公司)的EcoR I位点，构建成酵母表达载体pP-Ncphy，如图2所示。
实施例4表达植酸酶重组酵母的构建将活化的毕赤氏酵母菌株Pichia pastoris KM71(来自Invitrogen公司)于500ml YPD(1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中30℃培养18h，至OD600＝1.7，5000r/min离心收集菌体，先后用500ml，250ml预冷的无菌水洗菌体，离心去上清液，用20ml预冷的1mol/L山梨醇悬浮菌体。离心后菌体再用0.5ml预冷的山梨醇悬浮，作为感受态细胞用于电击转化。
大量抽提酵母表达载体pP-Ncphy，Nco I酶切线性化pP-Ncphy，片段加入50uL感受态细胞，冰浴5min，用Bio-Rad GenePulser电击仪电击，参数为2.5Kv，25uF。电击结束后立即加入1.0ml预冷的1mol/L山梨醇，取200ul涂布于YNBG培养基(1.34％YNB培养基，2％葡萄糖)，30℃培养直至转化子出现。用牙签将转化子点种到YNBG-G418(YNBG培养基中补加2mg/ml抗生素G418(购自Sigma公司))，良好生长的菌落通过酵母菌落PCR的方法鉴定转化子，阳性重组酵母用于产植酸酶发酵试验。
重组酵母菌菌株的高密度发酵将获得的5株重组毕赤氏酵母分别接种于20mL YPD液体培养基，30℃振荡培养至稳定期。离心收集菌体，转入100mL MGY培养基(1.34％YNB，1％甘油，4×10-5％生物素)中30℃、200r/min剧烈振荡培养48h，离心收集菌体，转入30mL MM培养基(1.34％YNB，0.5％甲醇，4×10-5％生物素)液体培养基中30℃剧烈振荡培养至7d，每隔12h进行植酸酶活性测定。重组菌发酵液酶活在1,000～13,000u/mL不等。其中，重组酵母Y79a最高产植酸酶水平为13,200u/mL。比野生菌株的产酶水平提高了710倍。
实施例5植酸酶的制备和纯化8,000r/min×10min冷冻离心收集重组酵母Y79a的发酵液，装入透析带中透析脱盐，透析带悬浮在生理盐水中，透析时保持温度在4℃，透析2d后至发酵液基本透明无色。取透析后的发酵液15mL用Amico Ultrafitration-15(Biomax 10K；Millipore)在4500g转速下离心25min，获得终体积约为500μL的液体，浓缩倍数大约为30倍。然后以0.25M、pH5.5的乙酸钠溶液为洗脱液，将得到的500μL的浓缩液通过Superdex 200 column(Pharmacia Biotech)进行分离。洗脱液分步收集，每管收集1mL液体。根据测得的蛋白质峰对应的试管编号，进行植酸酶活的测定。将具有酶活的洗脱液合开，上样于阴离子交换层析柱DEAE-52，用0～1.0mol/L NaCl，0.25mol/L NaAc，pH6.0梯度洗脱。测出有明显酶活的收集管，用Amico Ultrafitration-15(Biomax 10K；Millipore)浓缩后进行SDS-PAGE电泳。采用Bradford法测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白作为标准。重组菌发酵液比空载体对照明显多出一条蛋白条带。电泳图谱结果见图3，重组酶分离纯化后达电泳均一，分子量接近60kDa，为单亚基蛋白。比酶活为125,000u/mg。
实施例6植酸酶酶学性质分析重组酶的最适pHpH缓冲液0.2mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液(pH2.0、2.5、3.0、3.5)，0.2mol/L乙酸钠缓冲液(pH4.0、4.5、5.0、5.5)，0.2mol/L咪唑-盐酸缓冲液(pH6.0、6.5)，0.2mol/L Tris缓冲液(pH7.0、8.0)。将重组酶纯酶(28.3μg/mL)120μL稀释到480μL，取40μL分别在pH2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0测定酶活。计算相对酶活确定最适pH。测定条件下，重组酶的最适pH为3.5～5.5，pH5.5时酶活达到最大值。pH2.0～8.0之间具有活性(图4)。
重组酶的最适反应温度的测定将重组酶纯酶(28.3μg/mL)120μL稀释到480μL，取40μL分别在25、37、45、50、55、60、65、70、80℃温度下测定酶活，计算相对酶活确定最适温度。测定条件下，重组酶的最适温度为60℃。25～70℃之间维持较好活性(图5)。
重组酶对温度的稳定性测定将重组酶纯酶(28.3μg/mL)70μL稀释到280□L，取15□L分别在30、40、50、60、70、80、90℃温浴10、20、60min，立即取出，冰浴30min后在37℃测酶活。计算相对酶活比较重组酶对温度的稳定性。重组酶对温度的稳定性的研究表明重组酶在70～90℃加热20min后，相对酶活仍然剩余39～58％，与文献报道的毕赤氏酵母表达的黑曲霉植酸酶相比要高些。
重组酶与商品酶热稳定性的比较在80℃时，将重组酶与商品酶分别加热5、10、15、20min立即取出，冰浴30min后在37℃测酶活，并计算相对酶活。重组酶在80℃加热后出现了热激活现象。重组酶与商品酶在80℃热稳定性比较发现，当加热到15、20min时重组酶比商品酶酶活下降幅度要小(图6)。
重组酶pH稳定性的测定将重组酶纯酶(28.3μg/mL)70μL稀释到280μL，取15μL在pH2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5室温放置24h。然后再在37℃、pH5.5的条件下测定酶活，计算相对酶活比较重组酶对pH的稳定性。该酶在pH3.5～9.5之间，稳定性较好(图7)。
重组酶动力学参数Km与Vmax值的测定将重组酶纯酶(28.3μg/mL)70μL稀释到280μL，取20μL置于不同浓度(5、2.5、1.25、1、0.5、0.25mM)的底物植酸钠中测定酶活，反应速度用每min生成的无机磷的量(μmol..表示，采用Lineweaver-Burk双倒数作图法计算Km与Vmax值。Km与Vmax值分别为228μM、128μmol/mg pro.min-1。
不同金属离子对重组酶酶活的影响将20μL重组酶纯酶(28.3μg/mL)分别加入到280μL 1mM浓度的Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ca2+、Al3+等金属盐溶液中，室温放置30min。再加200μL NaAc，至体积为500μL再测酶活，酶活测定方法同前，并计算相对酶活。Mg2+、Ca2+、Al3+、Fe2+、Co2+、Zn2+和EDTA等对其酶活影响很小。
权利要求
1.一种来源于粗糙脉胞霉(Neurospora crassa)AS 3.1604中的耐高温、高比活植酸酶基因Ncphy，其核苷酸序列为atgctacgag tactatcccc aaatccagca tcatgcgaca gcccagagct tggttaccaa60tgtaactcag agacaaccca cacatggggt caatactcgc ccttcttctc cgtcccgtcg 120gaaatctccc cctccgttcc cgagggttgc cgcctcacct ttgcccaagt tctttctcgc 180cacggcgctc gcttcccaac tcccggaaaa gccgccgcca tctccgccgt tctcaccaag 240atcaaaacct ccgccacctg gtacgccccc gacttcgagt tcatcaaaga ctacaactat 300gtcctcggcg tcgaccacct cactgccttt ggcgagcaag agatggtcaa ctcgggcatc 360aaattctacc aacgctacgc ttccctcatc cgggactaca ctgacccaga atccctcccc 420tttatccgtg cctcggggca ggagcgcgtc attgcctcag ctgagaactt caccactggg 480ttctactctg ccctccttgc cgacaagaac ccaccccctt cctccctccc gcttccccgc 540caggagatgg tcatcatctc cgaatcgccc acggccaaca acaccatgca ccacggtctc 600tgccgcgcct ttgaggactc caccaccggc gatgcggccc aggcgacctt tatagctgcc 660aatttcccgc ccatcaccgc gcggttgaat gcgcagggtt tcaaaggcgt cactctttcc 720gacacggacg tgctctcgct catggatctc cgcccctttg acaccgtcgc ttacccgccc 780tcctcctctc tcaccacctc gtcctctccc tcggggggaa gcaagctctc ccccttttgc 840tcccttttta ccgctcaaga ctttaccgtg tacgactacc tccagtccct cggcaagttc 900tacggctacg gcccgggtaa ttctctggct gccacgcagg gggtggggta cgtgaacgag 960cttttggctc gcctcacggt ttccccggtg gtggataaca cgaccaccaa ttccacgctg 1020gacgggaacg aggacacgtt tccgctgagt aggaacagga cggtgtttgc ggatttcagt 1080catgataatg atatggtggg gatcttgact gctttgagaa tctttgaggg ggtggatgcg 1140gagaagatga tggataatac gaccataccg agagagtacg gggagactgg cgatgatccg 1200gcaaatttga aagagaggga gggcttgttc aaggttggtt gggtggtgcc atttgcggcg 1260agggtgtatt ttgaaaagat gatttgtgat ggggatggga gtggagagat ggttcagagc 1320gaggaggaac aggacaagga gttggtgagg atcttggtta acgatagagt ggttaaacta 1380aatggatgtg aggccgatga gttggggagg tgtaagttgg ataaatttgt agagagtatg 1440gagtttgcta ggaggggtgg agattgggac aagtgttttg cttag 1485
2.根据权利要求1所述基因Ncphy，其氨基酸组成为Met Leu Arg Val Leu Ser Pro Asn Pro Ala Ser Cys Asp Ser Pro1 5 10 15Glu Leu Gly Tyr Gln Cys Asn Ser Glu Thr Thr His Thr Trp Gly20 25 30Gln Tyr Ser Pro Phe Phe Ser Val Pro Ser Glu Ile Ser Pro Ser35 40 45Val Pro Glu Gly Cys Arg Leu Thr Phe Ala Gln Val Leu Ser 50 55 60 Thr Pro Gly Lys Ala Ala Ala Ile Ser65 70 75Ala Val Leu Thr Lys Ile Lys Thr Ser Ala Thr Trp Tyr Ala Pro80 85 90Asp Phe Glu Phe Ile Lys Asp Tyr Asn Tyr Val Leu Gly Val Asp95 100 105His Leu Thr Ala Phe Gly Glu Gln Glu Met Val Asn Ser Gly Ile110 115 120Lys Phe Tyr Gln Arg Tyr Ala Ser Leu Ile Arg Asp Tyr Thr Asp125 130 135Pro Glu Ser Leu Pro Phe Ile Arg Ala Ser Gly Gln Glu Arg Val140 145 150Ile Ala Ser Ala Glu Phe Thr Thr Gly Phe Tyr Ser Ala Leu155 160 165Leu Ala Asp Lys Asn Pro Pro Pro Ser Ser Leu Pro Leu Pro Arg170 175 180Gln Glu Met Val Ile Ile Ser Glu Ser Pro Thr Ala Asn Thr185 190 195Met His His Gly Leu Cys Arg Ala Phe Glu Asp Ser Thr Thr Gly200 205 210Asp Ala Ala Gln Ala Thr Phe Ile Ala Ala Asn Phe Pro Pro Ile215 220 225Thr Ala Arg Leu Asn Ala Gln Gly Phe Lys Gly Val Thr Leu Ser230 235 240Asp Thr Asp Val Leu Ser Leu Met Asp Leu Arg Pro Phe Asp Thr245 250 255Val Ala Tyr Pro Pro Ser Ser Ser Leu Thr Thr Ser Ser Ser Pro260 265 270Ser Gly Gly Ser Lys Leu Ser Pro Phe Cys Ser Leu Phe Thr Ala275 280 285Gln Asp Phe Thr Val Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Gly Lys Phe290 295 300Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Asn Ser Leu Ala Ala Thr Gln Gly Val305 310 315Gly Tyr Val Asn Glu Leu Leu Ala Arg Leu Thr Val Ser Pro Val320 325 330Val Asp Thr Thr Thr Ser Thr Leu Asp Gly Asn Glu Asp335 340 345Thr Phe Pro Leu Ser Arg Arg Thr Val Phe Ala Asp Phe Ser350 355 360His Asp Asn Asp Met Val Gly Ile Leu Thr Ala Leu Arg Ile Phe365 370 375Glu Gly Val Asp Ala Glu Lys Met Met Asp Thr Thr Ile Pro380 385 390Arg Glu Tyr Gly Glu Thr Gly Asp Asp Pro Ala Asn Leu Lys Glu395 400 405Arg Glu Gly Leu Phe Lys Val Gly Trp Val Val Pro Phe Ala Ala410 415 420Arg Val Tyr Phe Glu Lys Met Ile Cys Asp Gly Asp Gly Ser Gly425 430 435Glu Met Val Gln Ser Glu Glu Glu Gln Asp Lys Glu Leu Val Arg440 445 450Ile Leu Val Asn Asp Arg Val Val Lys Leu Asn Gly Cys Glu Ala455 460 465Asp Glu Leu Gly Arg Cys Lys Leu Asp Lys Phe Val Glu Ser Met470 475 480Glu Phe Ala Arg Arg Gly Gly Asp Trp Asp Lys Cys Phe Ala485 490 494含有6个糖基化位点 一个近氨基端活性中心
3.如权利要求1所述耐高温、高比活植酸酶基因Ncphy的克隆，其特征是采用PCR技术，以粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)AS 3.1604染色体DNA为模板，以NC-phy801，5’-ACCGGAATTCATGCTACGAGTACTATCCCCAAATCC-3’和NC-phy901，5’-ACCGGAATTCCCGCTTCGGTAATTCGCAGC-3’为引物扩增出植酸酶成熟肽基因并去除5’端的内含子；PCR的扩增条件为94℃变性10min，加入PyrobestTMDNA聚合酶1个单位，混匀加入矿物油，然后94℃变性1min，56℃退火1.5min，72℃延伸3min，经过30个循环后，再72℃延伸7min。
4.如权利要求1所述耐高温、高比活植酸酶基因Ncphy的表达，其特征是在扩增片段两端引入EcoRI酶切位点，回收1.5kb的植酸酶基因片段，EcoRI酶切，插入pUC19，获得pUC-Ncphy；正向插入到pPIC9K载体，构建成耐高温、高比活植酸酶基因的酵母表达载体pP-Ncphy。
全文摘要
一种耐高温、高比活植酸酶基因及其克隆和表达，属于微生物基因工程领域。本发明提供了来源于粗糙脉胞霉(N.crassa)AS3.1604编码的一种耐高温、高比活植酸酶基因Ncphy，提供了Ncphy的核苷酸序列和相应蛋白质的氨基酸序列，提供了含有Ncphy的克隆载体pUC－Ncphy和酵母表达载体pP－Ncphy，以及用酵母表达载体进行重组酵母的构建和重组酶的酶学性质。本发明可用于植酸酶工业化生产的基因工程菌的构建和现有植酸酶基因的分子改造，提高微生物发酵法生产植酸酶的水平和质量，还可以用于动植物的基因转化，达到改善物种品质的目的。
文档编号C12N15/11GK1616659SQ20041006495
公开日2005年5月18日 申请日期2004年10月13日 优先权日2004年10月13日
发明者王正祥, 周小玲 申请人:江南大学