专利名称：反转录扩增rna的方法
技术领域：
本发明涉及核酸体外合成方法，具体地涉及到核糖核酸的体外反转录和扩增的方法，更具体地涉及在同一体系中进行RNA体外反转录和扩增的方法。
背景技术：
丙型肝炎病毒是一种世界范围内的非肠道传染的病毒。据估计超过1％的世界人口感染有HCV。在卫生保健体系较落后的国家和地区，其比例更高，已成为严重危害人类健康的一种传染病。
来自全世界的对HCV编码序列的分析结果已经揭示出在各个病毒分离物中的相当可观的序列变化形式。此外，对来自各个患者的HCV序列分析结果已经证实这些病毒已所谓的“亚种”的形式传播，他们含有相关但不相同的序列。HCV遗传变异性的程度对预防、诊断和治疗具有重要意义。
目前我国普遍使用的免疫学方法受制于其间接检测原理的局限，不能解决HBV预防诊断治疗中的许多问题，HCV RNA检测方法的出现从根本上突破了免疫学方法的间接检测的局限性，通过直接检测病毒的核酸水平真实地反映病毒的情况从而对于HCV的准确诊断、有效治疗、精确预后及新药研制等各个方面具有重大意义。
HCV核酸检测一般应用AMV酶或MMLV酶合成cDNA第一链。第二链合成和后面的PCR扩增用Taq DNA聚合酶，反应在不同体系进行，效率低下，更主要的是核酸检测的高灵敏性要求低污染，反转录后的扩增操作容易导致污染。
目前有很多一步法RT-PCR试剂盒，但是，大部分RT-PCR方法建议合成cDNA第一链后随之对反转录酶进行抑制并且对合成第一链cDNA的反应体系进行稀释以消除反转录酶对Taq DNA酶的抑制作用。因此在第一次反应反转录结束后要添加一些必须成分到反应体系中去，还是会增加反应时间和导致污染。
除了检测HCV的RNA之外，在其他一些场合也需要检测RNA，尤其是检测其他一些RNA病毒的RNA。
综上所述，本领域目前的RT-PCR在减少反应时间和污染可能性方面还存在缺陷，因此，本领域迫切需要开发污染更低、反应时间更短的RNA检测方法，尤其是检测HCV RNA的方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种污染更低、反应时间更短的RNA检测方法。
在本发明的第一方面，提供了一种用于反转录和扩增的缓冲液，它含有以下组分(a)0.005-0.05U/微升的反转录酶；(b)0.001-0.1U/微升的高温DNA聚合酶；(c)1-10mM的镁离子；(d)dNTPs，各0.2±0.1mmol/L；且所述缓冲液不含锰离子。
在另一优选例中，所述缓冲液的体积为10-100微升，且还含有以下组分(e)0.1-5ug的RNA模板。
在另一优选例中，当反转录酶是M-MLV且RNA模板为0.1-1微克时，镁离子浓度为3±0.5mM；当反转录酶是M-MLV且RNA模板为1-5微克时，镁离子浓度为5±1mM；当反转录酶是AMV时，镁离子浓度为8±2mM。
在另一优选例中，所示缓冲液还含有以下组分(f)引物对，各0.3±0.1μmol/L。
在另一优选例中，所述的缓冲液还含有以下组分(g)探针，2.0±0.5mmol/L。
在另一优选例中，所述的反转录酶是M-MLV、AMV或SUPERSCRIPT II。
在另一优选例中，所述缓冲液含有以下组分(a)0.01U/μl的反转录酶SUPERSCRIPT II；(b)0.03U/μl的DNA聚合酶Taq酶；(c)2.0mmol/L镁离子；(d)dNTPs，0.2mmol/L；(e)0.1-5ug的RNA模板；
(f)引物对，各0.3±0.1μmol/L；(g)探针，2.0±0.5mmol/L；(h)5*PB缓冲液，其成分是Tris-HCl pH8.3，250mmol/L，KCL，360mmol/L，并且所述的缓冲液体积为20-50微升。
在另一优选例中，所述的RNA模板为HCV的RNA提取物，并且所述的引物对和探针选自下列各组A组上游引物1 TGCGGAACCGGTGAGTACA (SEQ ID NO1)下游引物1 GGAATTGCCAGGACGACCGG (SEQ ID NO2)探针1 FAM-GCGGGTAGATCCAAGAAAGGA-TAMRA (SEQ ID NO3)B组上游引物2 TGCGGAACCGGTGAGTACA (SEQ ID NO4)下游引物2 CGGAATTGCCAGGACGACCGG (SEQ ID NO5)探针2 FAM-TTGAGCGGGTAGATCCAAGAA-TAMRA (SEQ ID NO6)C组上游引物3 CACTCCCCTGTGAGGAACTACTGT (SEQ ID NO7)下游引物3 TCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGG (SEQ ID NO8)探针3 FAM-AGGCTGCACGACACTCATACTAAC-TAMRA(SEQ ID NO9)。
在本发明的第二方面，提供了本发明上述缓冲液的用途，它被用于制备同时进行RNA反转录和DNA扩增的反应体系或试剂盒。
在本发明的第三方面，提供了一种进行检测RNA的方法，它包括步骤(a)用反转录酶对RNA模板进行反转录，形成cDNA；(b)用高温DNA聚合酶对步骤(a)中形成的cDNA进行扩增，形成DNA扩增产物；(c)检测DNA产物；步骤(a)和(b)在同一反应体系中进行，并且在步骤(a)和(b)之间不向反应体系中添加物质。
在另一优选例中，在步骤(a)和(b)之间包括降解反转录酶的步骤在90-97℃保温1-5分钟。
更佳地，步骤(a)和(b)在本发明上述的缓冲液中进行。
图1显示了本发明一个实例中的测量结果。
具体实施例方式
本发明人经过对反转录体系和扩增体系的广泛而深入的研究，通过优化，得到一个既能反转录RNA，又能扩增DNA的反应体系。这样省略了在合成cDNA第一链后对反转录酶进行抑制的步骤，还省略了对合成第一链cDNA的反应体系进行稀释以消除反转录酶对Taq DNA酶的抑制作用的步骤。因此本发明方法污染可能性更低、反应时间更短。
反转录酶反转录酶催化RNA反转录成cDNA，第一个被使用的反转录酶是M-MLV和AMV。
反转录酶常用RNASE H-以提高反转录效率，在随后的扩增时形成的RNADNA复合体会阻碍扩增引物与cDNA结合，所以一般在扩增前加入RNASE H酶以降解RNADNA复合体中的RNA。但这样势必要求反转录和扩增分开，导致操作繁锁。
因此在本发明方法中优选无RNASE H活性的反转录酶。现在，有很多可供选择的RNASE H-的反转录酶出现。例如，SUPERSCRIPT II就是一种RNASE H-的反转录酶，可购自Life Technologies公司。
此外，如果采用有RNASE H活性的反转录酶，可以在扩增前加一个95℃以上程序，使RNA水解。这一程序还可以对反转录酶进行灭活，防止反转录酶阻碍Taq酶与cDNA模板结合，又不会对耐热性的Taq酶活性有影响。这一加热灭活反转录酶的步骤也可用于无RNASE H活性的反转录酶。
DNA聚合酶用于本发明的DNA聚合酶没有特别限制，可以本领域常用的耐热的DNA聚合酶，即在95℃保温1-5分钟仍可保持至少70％活力的DNA聚合酶。这些耐热DNA聚合酶可在市场上购得，例如Taq酶等。
引物和探针提高专一性(或特异性)是反转录反应的必须要求，专一性与选用引物直接相关，常见有三种反转录引物基因专一性引物，随机引物和Oligo(dT)引物。
在本发明中，优选的是专一性引物。专一性引物是与靶RNA上特定序列互补的寡核苷酸。专一性引物可以被设计成较高的退火温度，这样能够降低非特异性杂交提高转录效率和产量。更为重要的是，专一性反转录引物可以和扩增引物序列相同，这样可以用一对引物进行反转录和扩增，减少过多引物造成的竞争和引物二聚体，提高效率和产量。
专一性反转录引物和高温反转录酶的使用使得反转录在较高温度下反转录，比如55℃或更高(如55-65℃)，在低温下反转录往往会使模板RNA形成二级结构，使得引物的结合或延伸遇到阻碍降低效率和产量。
为了减低假阳性，还可使用专一性探针，如荧光探针。
专一性引物和任选的探针可根据检测对象的序列用常规方法进行设计和合成。
镁离子和锰离子反转录酶通常需要锰离子的存在，而Taq DNA聚合酶反应需要镁离子的存在。第一个商业化的试剂盒是在反转录反应后加入EGTA已除去锰离子，再加入镁离子。改进的试剂盒使用含锰离子的N-二甘氨酸缓冲液，这种缓冲液能进行反转录和扩增，但是，锰离子的存在会使扩增的忠实度大大下降，从而限制了它的应用。
因此，在本发明的缓冲液中宜不含有锰离子，而仅含有镁离子。而且反转录酶在仅含镁的情况下的转录效率也足够高了。
镁离子反转录和扩增体系中是一个至关重要的因子。通常，镁离子浓度为1-10mM。如果反转录酶是M-MLV，反应体系的中总RNA含量在1微克以内的镁离子含量为3mM，总RNA在1-5微克之间的镁离子含量应为5mM。如果反转录酶是AMV，最佳的镁离子浓度为8mM。
额外成分为了使反转录和扩增更有效地进行，需要在体系中添加一些辅助剂。在正常合成需要的dNTPs浓度基础上增加dNTPs的浓度会提高反转录的效率，这可能是高浓度的dNTPs可以增加RNA-引物的稳定性的结果。
此外，实验证明用一定浓度的乙酰化的BSA也可以起到增加低拷贝RNA检测灵敏度的作用。
糖原一般在RNA分离时作为一种RNA载体加入，可以提高小量样本提取时RNA的得率。糖原是水溶性的物质，在RNA分离处理时和RNA一起留在水相中，有助于后面的RNA沉淀。当样本小于50毫克组织或小于106拷贝数时，提取RNA时有必要加入糖原，同时在反转录和扩增体系中加入BSA。
象甘油和DMSO这样的添加物能够起到稳定核酸双链复合体和消除RNA二级结构的作用，20％以下的甘油(如5-20％)和10％以下的DMSO(如2-10％)用于反转录体系中不会对反转录酶活性有所抑制。10％以下的甘油(如1-10％)和5％以下的DMSO(如0.5-5％)在后面的扩增中不会对Taq酶活性有所影响。
在遇到不能有效地对某些RNA进行反转录时，最可能的原因是模板RNA有二级结构，解决这个问题一般采取高温温育的方法，同时高温温育还可以提高引物与模板结合的专一性，减少非特异性结合，提高反转录效率和目的cDNA产量。
反应体系中的某些物质会对反应有抑制作用，必须避免，比如甲酰胺，EDTA，糖原和SDS以及提取RNA时一些盐都会成为抑制反应的因素，所以反应体系要求提取少含杂质。
本发明的主要优点在于本发明的缓冲液可以使反转录和扩增都能正常进行，中间不需添加任何试剂，避免了污染和节省了时间。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1配制缓冲液配制成分如下的缓冲液(a)0.01U/微升的反转录酶SuperscriptII；(b)0.03U/微升的高温DNA聚合酶Taq酶；(c)2mM的镁离子；
(d)dNTPs，各0.2±0.1mmol/L；余量为水，供1000微升。
实施例2反转录和扩增HCV的RNA首先，配制成分如下的HCV PCR缓冲液
5*PB(荧光)的成分Tris-HCl pH8.3，250mmol/L，KCL，360mmol/L。
针对3对引物，分别配制3种单独的HCV PCR缓冲液1、2和3。同时配制一种同时含3对引物的HCV PCR缓冲液ALL。
然后，配制成分如下的PCR反应体系
对应于3对引物和相应的3个探针，分别配制3种单独的PCR反应体系1、2和3。同时配制一种同时含3对引物的PCR反应体系ALL。
在本实施例中，采用的GSP引物和探针的序列如下A组上游引物1TGCGGAACCGGTGAGTACA(SEQ ID NO1)下游引物1GGAATTGCCAGGACGACCGG (SEQ ID NO2)探针1FAM-GCGGGTAGATCCAAGAAAGGA-TAMRA(SEQ ID NO3)
B组上游引物2TGCGGAACCGGTGAGTACA (SEQ ID NO4)下游引物2CGGAATTGCCAGGACGACCGG (SEQ ID NO5)探针2FAM-TTGAGCGGGTAGATCCAAGAA-TAMRA (SEQ ID NO6)C组上游引物3CACTCCCCTGTGAGGAACTACTGT (SEQ ID NO7)下游引物3TCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGG (SEQ ID NO8)探针3FAM-AGGCTGCACGACACTCATACTAAC-TAMRA(SEQ ID NO9)。
反应用荧光实时PCR仪器，采用以下反应程序
结果如图1所示，表明阳性样本出现“S”型扩增曲线，而阴性样本荧光值一直保持平直。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>上海复星医学科技发展有限公司<120>反转录扩增RNA的方法<130>042147<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>1tgcggaaccg gtgagtaca 19<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<221>misc_feature<223>寡核苷酸<400>9aggctgcacg acactcatac taac 2权利要求
1.一种用于反转录和扩增的缓冲液，其特征在于，它含有以下组分(a)0.005-0.05U/微升的反转录酶；(b)0.001-0.1U/微升的高温DNA聚合酶；(c)1-10mM的镁离子；(d)dNTPs，各0.2±0.1mmol/L；且所述缓冲液不含锰离子。
2.如权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，所述缓冲液的体积为10-100微升，且还含有以下组分(e)0.1-5ug的RNA模板。
3.如权利要求2所述的缓冲液，其特征在于，当反转录酶是M-MLV且RNA模板为0.1-1微克时，镁离子浓度为3±0.5mM；当反转录酶是M-MLV且RNA模板为1-5微克时，镁离子浓度为5±1mM；当反转录酶是AMV时，镁离子浓度为8±2mM。
4.如权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，它还含有以下组分(f)引物对，各0.3±0.1μmol/L。
5.如权利要求4所述的缓冲液，其特征在于，它还含有以下组分(g)探针，2.0±0.5mmol/L。
6.如权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，所述的反转录酶是M-MLV、AMV或SUPERSCRIPT II。
7.如权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，它含有以下组分(a)0.01U/μl的反转录酶SUPERSCRIPT II；(b)0.03U/μl的DNA聚合酶Taq酶；(c)2.0mmol/L镁离子；(d)dNTPs，0.2mmol/L；(e)0.1-5ug的RNA模板；(f)引物对，各0.3±0.1μmol/L；(g)探针，2.0±0.5mmol/L；(h)5*PB缓冲液，其成分是Tris-HCl pH 8.3，250mmol/L，KCL，360mmol/L，并且所述的缓冲液体积为20-50微升。
8.如权利要求7所述的缓冲液，其特征在于，所述的RNA模板为HCV的RNA提取物，并且所述的引物对和探针选自下列各组A组上游引物1 TGCGGAACCGGTGAGTACA(SEQ ID NO1)下游引物1 GGAATTGCCAGGACGACCGG (SEQ ID NO2)探针1 FAM-GCGGGTAGATCCAAGAAAGGA-TAMRA(SEQ ID NO3)B组上游引物2 TGCGGAACCGGTGAGTACA(SEQ ID NO4)下游引物2 CGGAATTGCCAGGACGACCGG (SEQ ID NO5)探针2 FAM-TTGAGCGGGTAGATCCAAGAA-TAMRA(SEQ ID NO6)C组上游引物3 CACTCCCCTGTGAGGAACTACTGT (SEQ ID NO7)下游引物3 TCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGG (SEQ ID NO8)探针3 FAM-AGGCTGCACGACACTCATACTAAC-TAMRA (SEQ ID NO9)。
9.如权利要求1所述的缓冲液的用途，其特征在于，用于制备同时进行RNA反转录和DNA扩增的反应体系或试剂盒。
10.一种进行检测RNA的方法，它包括步骤(a)用反转录酶对RNA模板进行反转录，形成cDNA；(b)用高温DNA聚合酶对步骤(a)中形成的cDNA进行扩增，形成DNA扩增产物；(c)检测DNA产物；其特征在于，步骤(a)和(b)在同一反应体系中进行，并且在步骤(a)和(b)之间不向反应体系中添加物质。
全文摘要
本发明公开了一种核糖核酸的体外反转录和扩增的方法，更具体地涉及在同一体系中进行RNA体外反转录和扩增的方法。本发明的缓冲液可以使反转录和扩增都能正常进行，因而在反转录和扩增之间不需添加任何试剂，避免了污染和节省了时间。
文档编号C12Q1/68GK1786181SQ20041008936
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月10日 优先权日2004年12月10日
发明者夏懿, 周煜, 徐晓青 申请人:上海复星医学科技发展有限公司