一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因与利用该基因检测猪眼肌面积的方法。
背景技术：
中国是养猪大国，也是猪种资源最丰富的国家，很早就开始将野猪驯化为家猪。经过长期选择，形成了许多各具特色的地方品种，仅《中国猪品种记》(张仲葛主编，中国地方猪品种志，上海科技出版社，1986)记载的就有48个。与国外的商品猪相比，中国地方品种具有许多突出的优点肉质好，产仔数高，抗逆性好和适应性强等，但却有着两个共同的缺点瘦肉率低和增重慢。因此，增加胴体瘦肉率和提高生长速度一直是我国家猪的遗传改良工作的主要目标。
产肉性状主要包括以下几个方面1)饲料转化率和日增重；2)胴体各组分的度量值，如背膘厚度、眼肌面积、胴体长、小肠长度以及各种内脏重等；3)胴体各组成的重量百分比，如屠宰率、腿臀比率、腿臀肉骨率、板油率和内脂率等。
产肉性状属于数量性状，由多基因控制、并存在主基因(major gene)效应。在产肉性状中，大多性状表现晚且不便活体测量，采用常规育种方法对其进行选择周期长，收效慢。分子生物学技术的发展，使人们可以在DNA水平寻找控制产肉性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，在育种过程中用于标记辅助选择(markerassisted selection，MAS)，以便提高选择进展，更好地改善猪肉品质，满足人们的需要，同时获得较大的经济效益。
目前，通过候选基因法，已经找到了一些影响猪产肉性状的基因。位于猪12号染色体上的生长激素基因(Growth Hormon，GH)是神经分泌内生长轴中调控动物生长发育的核心基因，其产物生长激素具有调节新陈代谢、促进生长发育等作用，是与猪的生长和胴体性状相关的主要候选基因，中外学者对它的基因型与生产性状的关系进行了广泛的研究。Knorr等(Knorr C，Moser G，Muller E，Geldermann H.Associations of GH gene variants with performance traits in F2 generationsof European wild boar，Pietrain and Meishan pigs.Anim Genet，1997，28124-128.)发现梅山猪与皮特兰猪杂交的F2代群体中，不同的GH基因型与8个胴体性状显著相关。李加琪等(李加琪，陈赞谋，刘德武，刘小红，孙宝丽，凌飞，张豪，陈瑶生.IFG-1基因对长白×蓝塘猪资源群生产性能的遗传效应分析。遗传学报，2003，30(9)835-839)发现在长白×蓝塘猪构建的资源群体中类胰岛素生长因子1(Insulin-like growth factor I，IGF-I)不同基因型对断奶后日增重、骨率、胴体瘦肉量和皮脂率等性状有显著影响。刘桂兰等(刘桂兰，蒋思文，熊远著，郑嵘，屈彦纯.IGF2基因PCR-RFLP多态性与脂肪沉积相关性状的关联分析。遗传学报，2003，30(12)1107-1112)分析了类胰岛素生长因子2(Insulin-like growth factorII，IGF-II)基因第8内含子两个NciI酶切位点的多态性在大白猪×梅山猪构成的F2代中的多态性分布情况，发现B位点B1B1基因型的个体显著比B2B2基因型的个体背膘薄18.28％(P＜0.01)，瘦肉率高8.71％(P＜0.01)。垂体转录因子(Pituitantranscription factor 1，PIT1)是生长激素、催乳素和促甲状腺素重要的调节因子，Yu等(Yu TP，Tuggle CK，Schmitz CB，Rothschild MF.Association of PIT1polymorphisms with growth and carcass traits in pigs.J Anim Sci，1995，731282-1288)曾报道PIT1与平均背膘厚存在显著相关，近年来Kuryl等(Kuryl J，Pierzchala M.Association of POU1F1/RsaI genotypes with carcass traits inpigs.J Appl Genet，2001，42309-316.)和Brunsch等(Brunsch C，SternsteinI，Reinecke P，Bieniek J.Analysis of associations of PIT1 genotypes withgrowth，meat quality and carcass composition traits in pigs.J Appl Genet，2002，4385-91)分别在不同的资源家系中检测到PIT1与数种胴体性状相关。其它与胴体性状相关的候选基因还包括生长激素释放素(GHRH)、瘦素(Leptin)、生长素(Ghrelin)、肌细胞生成素(Myogenin)、生长激素抑制素(somatostatin，SS)、黑素皮质激素受体4(Melanocortin-4，MC4R)和生长素受体(growth hormonereceptor，GHR)(Xia，et al.，2003)、MSTN(Jiang YL，Li N，Plastow G，Liu ZL，Hu XX，Wu CX.Identification of three SNPs in the porcine myostatin gene(MSTN).Anim Biotechnol，2002，13173-178)等基因。位于18号染色体上的瘦素基因(Leptin)被认为是与生长、胴体性状相关的一个基因(Sasaki S，Clutter AC，PompD.Assignment of the porcine obese(leptin)gene to chromosome 18 by linkageanalysis of a new PCR-based polymorphism.Mamm Genome，1996，7471-472)，但Jiang等(Jiang ZH，Gibson JP.Genetic polymorphisms in the leptin gene andtheir association with fatness in four pig breeds.Mamm Genome，1999，10191-193)的研究却没有发现明显的关联。位于猪9号染色体上的肌细胞生成素(Myogenin)是MyoD基因家族的成员，主要功能是调节成肌细胞分化为肌纤维。TePas等(Te Pas MF，Soumillion A，Harders FL，Verburg FJ，van den Bosch TJ，Galesloot P，Meuwissen TH.Influences of myogenin genotypes on birth weight，growth rate，carcass weight，backfat thickness，and lean weight of pigs.JAnim Sci，1999，772352-2356.)在两个大白猪群中检测了该基因的多态性，分析发现不同基因型的个体在出生重、生长速度和瘦肉量等性状上有显著差异。对两个选择系肌肉的MyoD基因家族成员mRNA表达水平比较发现F-系(选择生长速度)中myogenin、myf-5、MyoD1的mRNA表达水平比L-系(选择瘦肉率)高，在F-系中，背膘厚与成肌细胞的表达成负相关(Te Pas MF，Verburg FJ，Gerritsen CL，de GreefKH.Messenger ribonucleic acid expression of the MyoD gene family in muscletissue at slaughter in relation to selection for porcine growth rate.J AnimSci，2000，7869-77)。Kim等(Kim KS，Larsen N，Short T，Plastow G，RothschildMF.A missense variant of the porcine melanocortin-4 receptor(MC4R) geneis associated with fatness，growth，and feed intake traits.Mamm Genome，2000，11131-135)在5个猪商品系中检测到MC4R基因遗传变异与背膘厚显著相关。刘桂兰等(刘桂兰，蒋思文，熊远著，郑嵘，屈彦纯.猪资源家系MC4R基因扫描及其与脂肪性状的相关分析。遗传学报，2002，29(6)497-501)对大白×梅山的F2代174个体检测发现MC4R基因多态性与猪胸腰椎间膘厚(P＜0.05)、臀部膘厚(P＜0.02)、平均背膘厚(P＜0.04)、眼肌宽度(P＜0.003)、眼肌面积(P＜0.05)、皮率(P＜0.02)呈显著相关。
采用基因组扫描法，研究者们还定位了一些影响胴体性状的数量性状位点(QTL)。影响背膘厚的主基因被定位于第2和7号染色体上(de Koning DJ，JanssLL，Rattink AP，van Oers PA，de Vries BJ，Groenen MA，van der Poel JJ，etal.Detection of quantitative trait loci for backfat thickness andintramuscular fat content in pigs(Sus scrofa).Genetics，1999，1521679-1690)。Paszek等(Paszek AA，Wilkie PJ，Flickinger GH，Miller LM，LouisCF，Rohrer GA，Alexander LJ，Beattie CW，Schook LB.Interval mapping ofcarcass and meat quality traits in a divergent swine cross.Anim Biotechnol，2001，12155-165)利用119个分子标记对116个F2个体的胴体和肉质性状进行分析后发现在猪12号染色体上存在影响胴体长、第10肋骨背膘厚、平均背膘厚、板油率、眼肌面积和肌内脂肪含量等多个性状的QTL。最近，Clop等(Clop A，Ovilo C，Perez-Enciso M，Cercos A，Tomas A，Fernandez A，Coll A，et al.Detection ofQTL affecting fatty acid composition in the pig.Mamm Genome，2003，14650-656)对伊比利亚猪与长白猪构建的F2进行基因组扫描，发现12号染色体上存在影响不饱和脂肪酸(亚麻酸)含量的QTL。Yue(Yue G，Schroffel JR，Moser G，Bartenschlager H，Reiner G，Geldermann H.Linkage and QTL mapping for Susscrofa chromosome 12.Journal of Animal Breeding and Genetics，2003，12095-102)等以野猪、梅山猪和皮特兰构成的三个F2群体为研究对象，在12号染色体上发现了数个影响13-14肋骨间的背膘厚、瘦肉切割率等性状的QTL。据统计，除了SSC16和SSC17外，猪的所有染色体上均发现了影响背膘厚的QTL(Bidanel JP，Rothschild MF.Current status of quantitative trait locus mapping in pigs.pig news and information，2002，2339N-53N)。
CAV3(M-Caveolin)是小窝蛋白家族之一。小窝(caveolae)为一种非包被的细胞小囊/小泡，有胞膜小窝、胞膜穴样内陷两种形式单独或成簇存在于多种细胞表面，成纤维细胞、脂肪细胞、I型肺泡细胞、上皮细胞、平滑肌及骨骼肌细胞中丰度最高。小窝蛋白家族由三种蛋白质组成，分别为CAV1、CAV2和CAV3。他们的功能可能是作为小窝膜内支架蛋白、组织并浓缩特异脂质(胆固醇和鞘糖脂)和修饰信号传导分子(如Src样激酶、H Ras、eNOS、G蛋白)。其中，CAV3仅在骨骼肌系统中表达。在人类疾病机理研究中，研究者初步认为CAV3与生长发育延迟，智力发育滞后，心脏隔膜缺陷，肢-带肌营养不良。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。这种变异可能是转换(C→T，在其互补链上则为G→A)，也可能是颠换(C→A，G→T，C→G，A→T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。
SNP检测方法常采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等，也采用根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。
基因表达谱是目的基因在不同生理或病理状态下，mRNA在组织内的表达变化。其表达量的变化与基因的功能存在十分密切的关系。目前进行基因表达检测的方法已有一些成熟的技术，如Northern blot，芯片技术，Real-time PCR技术，semi-quantitative RT-PCR技术等。
发明创造内容本发明的目的是提供一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因。
本发明所提供的猪眼肌面积性状相关蛋白，来源于猪，名称为CAV3，具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或为将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与猪眼肌面积性状相关的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №2由151个氨基酸残基组成。
上述猪眼肌面积性状相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。
猪眼肌面积性状相关蛋白的编码基因，可具有以下核苷酸序列之一1)序列表中序列1的多核苷酸序列；2)与序列表中序列1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同活性的核苷酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的序列1由950个碱基组成，其编码序列为自序列1的5’端第90-546位碱基。
含有本发明的猪眼肌面积性状相关蛋白编码基因的载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种检测猪眼肌面积的方法。
本发明所提供的检测猪眼肌面积的方法，是用具有序列表中SEQ ID №4和SEQ ID №5的核苷酸序列的一对引物对待测猪的总DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO3的5′端第148位碱基为A还是C。
如果PCR扩增产物的单核苷酸多态性检测结果是自序列表中SEQ ID NO3的5′端第148位碱基，即自序列表中序列1的5′端第495位碱基为C时，其纯合体的基因型为CC；自序列表中SEQ ID NO3的5′端第148位碱基，即自序列表中序列1的5′端第495位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；它们的杂合体基因型为AC。
其中，具有AA基因型的个体眼肌面积比CC基因型个体大，并且达到显著水平(P＜0.01)，具有AC基因型的个体大于具有CC基因型的个体。
所述单核苷酸多态性检测可采用DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)、根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等进行检测。
实验证明，本发明的猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因可用于检测猪眼肌面积，为猪的分子育种提供了一个新的遗传标记，将在猪的育种中发挥重要作用。


图1a为Sfi I A和Sfi I B接头序列图1b为pBluescript II SK(-)的物理图谱图2为猪CAV3基因的染色体定位结果3a为不同发育阶段通城猪CAV3基因在骨骼肌中表达结果图3b为不同发育阶段杜洛克猪CAV3基因在骨骼肌中表达结果图4为CAV3基因在不同发育阶段的表达趋势图5为CAV3基因在组织间的表达差异图6为序列3的148bp处的多态位点示意图具体实施方式
实施例1、猪CAV3的cDNA基因的获得利用Clontech公司的SMART cDNA Library Construction Kit和改造的pBluescript II SK克隆载体(pBluescript II SK的改造载体，具体为将pBluescriptII SK(-)的EcoR I和Not I之间的序列改造为Sfi I A和Sfi I B接头序列，利用Sfi I A和Sfi I B酶切后可定向插入cDNA片断(Sfi I A→Sfi I B)。Sfi I A和Sfi I B接头序列和pBluescript II SK(-)的物理图谱分别如图1a和图1b所示)，用猪胚胎发育第55天的骨骼肌组织的mRNA，按照常规方法构建了全长cDNA文库。通过对文库克隆子的测序获得了大量的在骨骼肌组织中表达的基因。
利用比较功能基因组学原理和方法，利用BLAST在NCBI的数据库中进行比对发现了其中测序结果中的一条序列与人CAV3基因具有92％的同源性，将其命名为猪CAV3基因，它具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列，其编码序列表中序列2的氨基酸序列。
通过比较猪，小鼠和人CAV3基因cDNA序列的同源性，根据猪cDNA序列设计猪特异的引物PrimerL5’-GTGATGCTGCGGAAAGAA-3’，PrimerR5’-GGATGGGAACTGAGTGCTG-3’。
以猪×啮齿类体细胞杂种克隆板(SCHP，27个杂种细胞系)和RH克隆板(INRA-Minnesota porcine radiation hybrid panel，ImpRH，118个杂种细胞系)中的DNA(购自法国农业科学院，Laboratoire de Génétique Cellulaire，INRA)为模板进行PCR扩增。扩增条件为95℃变性3min，94℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸20s，35个循环。最后在72℃延伸3min。其中的反应体系组成如表1所示。
表1.PCR的反应体系

在猪×啮齿类体细胞杂种克隆板中扩增结果经2％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR扩增片段分型，其中在第6，12，22号杂种细胞系中的DNA中获得阳性扩增结果。将PCR分型数据提交给HybWeb(http//www.toulouse.inra.fr/lgc/lgc.html/)进行统计分析以获得区域定位信息，数据分析结果表明CAV3基因定位于猪13号染色体上(P＝1.000)，进一步的区域定位结果为SSC13C q23-(1/2 q41)(P＝0.8004，与该区域标记间的相关系数为1，误差低于0.5％)。在RH克隆板中的结果经2％的琼脂糖凝胶电泳进行PCR扩增片段分型。其中，阳性结果的为1，阴性结果的为0。结果为0000000010010000000100000010000000000100000100000011010001000000000010000000011010001110111000100100011100001000000001，将该结果提交到IMpRH数据统计分析服务器(http//www.toulouse.inra.fr/lgc/pig/RH/IMpRH.html/)上进行分析，结果表明该基因被定位在猪13号染色体上与微卫星标记SW960紧密连锁，LOD值为3.47。
比较作图分析结果表明人CAV3基因位于3p25染色体上，该染色体与猪SSC13q23-(1/2)q24号染色体有大区段的同源片段(图2)。
实施例2、猪CAV3的表达谱分析1、试验样本的设计对猪CAV3基因的表达分析主要分以下两部分，一为检测CAV3基因在不同组织中的表达，所用的组织包括心、肝、脾、肺、肾、骨骼肌组织和膀胱等组织的总RNA。二为检测胚胎发育不同阶段骨骼肌组织中CAV3基因的表达变化。选用的发育阶段为以下几个阶段，人工授精后第45天，55天，65天，75天，90天，105天和出生当日(114天)的骨骼肌组织(每个阶段分别取2-3头胚胎)。对不同发育阶段进行分析时所用的品种有两个，分别为中国地方品种通城猪(纯种)，国外引进品种杜洛克(纯种)。
2、引物设计根据CAV3基因的cDNA序列，设计的引物如下正向引物5’-TGCTCTGGGGCTTCCTGT-3’；反向引物5’-CATGGCGGCAAAGACTGG-3’。
3、总RNA的提取、检测和DNase-I处理总RNA的提取采用GIBCO公司的TRIZOL Reagent进行，并根据产品说明书提供的方法提取骨骼肌组织的总RNA。总RNA提取出来后，须用无RNase的DNase-I处理以除去其中的痕量DNA污染，具体过程如下在一灭过菌的0.5mL的微量离心管加入50μg总RNA、10μL无RNase的DNase-I(10U/μL)与1μL RNasin(40U/μL)，混匀后于37℃水浴温育30min。将微量离心管取出稍加离心，加入等体积的酸性苯酚∶氯仿(体积比为3∶1)，混匀后冰浴20min。于台式离心机10000rpm/min离心10min，吸取上清入另一0.5mL的微量离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L乙酸钠(pH4.0)，混匀后于-20℃放置1h以沉淀总RNA。然后10000rpm/min离心10min，弃上清。用预冷的75％乙醇漂洗RNA沉淀后于室温干燥10min，溶于适量DEPC处理水。
经无RNase的DNase-I处理的总RNA需要进行完整性检测后才能进行下一步的反转录分析。总RNA的完整性通过甲醛变性凝胶电泳进行检测，过程如下(1)制备0.8％凝胶将0.8g琼脂糖溶于63mL DEPC处理水，冷却至60℃，加入20mL 5×甲醛凝胶电泳缓冲液和17mL 37％的甲醛，混匀后在通风橱内灌制凝胶，于室温放置30min，使凝胶凝固。
(2)制备总RNA样品在一灭过菌的0.5mL的微量离心管中混合4.5μL总RNA(2-10μg)，2μL 5×甲醛凝胶电泳缓冲液，3.5μL 37％的甲醛和10μL去离子甲酰胺，于65℃水浴温育15min，冰浴冷却，稍加离心使管内液体集中于管底。往管中加入2μL甲醛凝胶加样缓冲液和1μL 1mg/mL的EB溶液，混匀。
(3)电泳及拍照将已凝固的凝胶浸入1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，5V/cm电压预电泳5min。然后将已制备好的总RNA样品加入点样孔，5V/cm电压电泳1h。结束电泳，将凝胶放入紫外透射仪内观察并拍照。得到的RNA的完整性良好，质量可以保证后续研究的正常进行。
4、反转录、扩增和表达分析在一灭菌的0.5mL的微量离心管加入2μg DNase-I处理过的总RNA与0.5μgOligo(dT)18，于70℃温育5min，迅速冰浴。将离心管稍加离心后顺次加入10μL5×反转录缓冲液，2.5μL 10mmol/L dNTP混合物，1μL RNasin和1.5μL M-MLV反转录酶(200U/μL)，用DEPC处理水将终体积补至50μL，混匀离心后于37℃温育1h，再在95℃温育5min以灭活反转录酶。反转录后的cDNA可保存于-20℃冰箱和-86℃超低温冰箱中。用DU640紫外分光光度计测定各阶段反转录产物的浓度。用于检测CAV3基因表达的内标为看家基因(house-keepinggene)GAPDH(glceraldhyde-6-phosphate dehydrogenase)。用于扩增GAPDH片段的引物如下
正向引物 5′-CCTTCATTGACCTCCACTAC-3′；反向引物 5′-GTTGTCATACTTCTCATGGTTC-3′。
GAPDH扩增条件为94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s共25个循环；CAV3的扩增条件为94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 30s共25个循环。在同一PCR仪中同时进行PCR反应。PCR产物用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测结果如图3a和图3b所示，表明CAV3基因在不同品种以及同一品种不同发育阶段的骨骼肌组织内的表达存在差异。图象数字化采用Quantity One软件。不同时期基因的表达变化采用TWO-FACTOR ANOVA方差分析。结果如图4所示，表明在国外品种杜洛克和国内品种通城猪中，在胚胎发育45天直至胎儿娩出，CAV3基因在这两个品种中的表达变化趋势基本一致，但是表达量在两品种和不同时期间存在着显著差异，通城猪CAV3基因在不同发育阶段表达量的分析结果如表2所示，杜洛克猪CAV3基因在不同发育阶段表达量的分析结果如表3所示。同时，在组织间进行分析，结果如图5所示，表明该基因仅在骨骼肌组织和心脏器官中表达。
表2.为通城猪CAV3基因在不同发育阶段表达量的多重比较分析

55d65d75d90d105d114d45d 55d 65d 75d 90d 105d注**表示不同时期表达量间差异极显著。
表3.为杜洛克猪CAV3基因在不同发育阶段表达量的多重比较分析

55d65d75d90d105d114d45d 55d 65d 75d 90d 105d注**表示不同时期表达量间差异极显著正向引物5’-CTCTGGGGCTTCCTGTTC-3’；反向引物5’-CATCACCTTGATGTTGCTG-3’分别以纯繁通城猪62头、纯繁长白猪22头、长白♂×(大白×通城)♀24头和大白♂×(长白×通城)♀21头三元杂交组合猪的猪血液基因组的总DNA为模板进行PCR扩增。其中，反应体系ddH2O(19.25μl)，10×Buffer(含Mg2+)(2.5μl)，10mM正向引物(0.75μl)，10mM反向引物(0.75μl)，10mMdNTP(0.5μl)，Taq聚合酶5U/ul(0.25μl)，总DNA(1μl)。反应体系共为25μl。反应程序①95℃变性3分钟；②以退火温度55℃进行35个循环的扩增(94℃变性15秒，55℃退火15秒，72℃延伸10秒)；③72℃下延伸3分钟。PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测。然后按照如下方法进行PCR产物的纯化、克隆和测序(1)PCR产物的纯化在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml Ependorff管中，于70℃温育至凝胶完全融化，然后用PCR产物纯化试剂盒(Promega)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是在每300μl融化的凝胶中加入1ml树脂(Resin)，混匀20s，将Resin/DNA混合物装入注射器，使浆液通过微柱(Minicolumn)挤出。再在注射器中加入80％的异丙醇2ml，轻推活塞使异丙醇通过Minicolumn挤出，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，10,000g离心2min以干燥Resin，将Minicolumn装入另一个干净的1.5ml Ependorff管中，加入30-50μl无菌水，静置1min，10,000g离心20s，以洗脱DNA存于Ependorff管中。
(2)连接反应将纯化的PCR产物与pGEM-T easy载体连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl 2×缓冲液，0.5μl的T载体，1.5μl的纯化PCR产物，0.5μl的T4DNA连接酶，置16℃水浴过夜。
(3)感受态细胞的制备从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的摇瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将摇瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃ 4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃ 4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。
(4)转化无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。
(5)质粒的小量制备挑取平板上的单菌落，接种于2-3ml LB中，37℃ 300r/min培养过夜。用1.5ml EP管12000r/min离心数秒收集菌体。每管加入100μl用冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM EDTA(pH8.0))，涡旋振荡至菌体充分悬浮。加入新配制的溶液II
200μl，快速颠倒混匀，冰浴5min，然后加入预冷的溶液III(5M乙酸钾，冰乙酸11.5ml，H2O 28.5ml)150μl，混匀后冰浴5min，12000r/min离心5min，将上清转至另一EP管中，加入苯酚氯仿异戊醇500μl，涡旋振荡，离心后小心吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min，12000r/min离心5min，沉淀用70％乙醇洗涤2次，抽干，加入含有RNA酶的TE 20μl。
(6)重组质粒的酶切鉴定取3μl质粒DNA与双蒸水混匀，使其总体积为10μl，加入5U限制性内酶EcoRI及1μl相应的10×限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混匀并离心，置37℃水浴1-2小时，取2-3μl反应液于琼脂糖凝胶电泳检测，得到酶切结果与预计完全相同的目的重组质粒。
(7)测序重组质粒采用双脱氧末端终止法在DNA自动测序仪上进行测序，序列测定由上海博亚生物技术有限公司完成。测序结果表明该PCR产物的长度为180bp，具有序列表中序列3的核苷酸序列。
其中在序列表中SEQ ID NO3的5′端第148位碱基，即自序列表中序列1的5′端第495位碱基处存在A、C两个等位基因(图6)。图6中，箭头示多态位点。
实施例3、检测猪眼肌面积以61头纯繁通城猪、22头纯繁长白猪、24头长白♂×(大白×通城)♀和21头大白♂×(长白×通城)♀三元杂交组合猪，共128个个体为实验对象进行性状关联分析，具体方法如下1、按照实施例2中的方法，分别以上述128头猪的猪血液基因组的总DNA为模板，在正向引物5’-CTCTGGGGCTTCCTGTTC-3’(序列表中序列4)；和反向引物5’-CATCACCTTGATGTTGCTG-3’(序列表中序列5)的引导下进行PCR扩增，对扩增产物进行测序。如测序结果表明自序列表中SEQ ID NO3的5′端第148位碱基，即自序列表中序列1的5′端第495位碱基为A时，其纯合体的基因型为AA；自序列表中SEQ IDNO3的5′端第148位碱基，即自序列表中序列1的5′端第495位碱基为C时，其纯合体的基因型为CC；它们的杂合体基因型为AC。
2、用如下最小二乘模型分析胴体性状(屠宰体重，胴体重，屠宰率，瘦肉重，脂肪重，骨重，平均膘厚，眼肌面积)和肉质性状(肌间脂肪含量，pH值，失水率，大理石纹评分，肉色，滴水损失)yij＝μ+GENOTYPEi+GROUPj+GENOTYPEi×GROUPj+εij，其中，yij是性状观察值，μ为总体均数，GENOTYPEi为基因型效应，GROUPj为不同杂交组合的效应，GENOTYPEi×GROUPj为这两者的互作效应，εij为随机误差，假定服从N(0，σ2)分布。
结果表明在所检测的群体中，AA基因型的个体有62头，AC基因型的个体有34头，CC基因型的个体有32头。不同基因型之间的性状显著差异的结果(最小二乘均数和标准误分析)如表4，其它性状在不同的基因型之间没有显著的差异。表4表明，在眼肌面积中，具有AA基因型的个体眼肌面积比CC基因型个体大，并且达到显著水平(P＜0.01)表4.猪CAV3基因495位点不同基因型与眼肌面积性状的关联分析

**表示在0.01水平上差异极显著。
序列表<160>5<210>1<211>950<212>DNA<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)<220>
<221>misc-feature<222>(495)<223>m＝a或c<400>1gatgaggccg tgaaaccccg gccccaggtc tcttcagccc cgccggccac acggctccca 60tctcctccca ctgaccaccc agctccacaa tgatggccga ggagcgcaca gacctggagg120ctcagatcgt caaggacatt cacttcaagg agatcgacct ggtgatccgg taccccaaga180acattaacga ggacatagtg aaggtggact tcgaggatgt gattgcggag ccagtgggca240cctacagctt cgacggcgtg tggaaggtga gctacaccac cttcaccgtg tccaagtatt300ggtgctaccg cctgctgtcc acgctgctgg gcgtgccgct ggccctgctc tggggcttcc360tgttcgcctg catctacttc tgctacatct gggcgatggt gccatgcatc aagagctacc420tgatcgagat ccagtgcatc agccatatct actcactctg cacccgcacc ttctgcaacc480cagtctttgc cgccmtgggt caggtctgca gcaacatcaa ggtgatgctg cggaaagaag540tgtaaggccg ggtgggtgaa ggggggagat ggcgagggca ggggaaccag gccaagctgc600cctccccggt actgctccaa ggggctgccg gcaagcccgc tctccttccc ccaagactgc660tgcttccccc agatgggggc tcatagtaaa gggaagccag agaggtaaga cagtccgacc720acgagtgccg tggccttccc tctgtcccct gccccgccac aaggcccccg ttgggcacca780gggaagatga tttgctaaga ggcggctacc acaaatattt gcattcactt gtactgtaac840agcataaacc agcactcagt tcccatccag gacgcaccca cccagggact gttggcctta900ggagggtggc tccaataaag ggttttggct gcaaaaaaaa aggaattccg 950
<210>2<211>151<212>PRT<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)<400>2Met Met Ala Glu Glu Arg Thr Asp Leu Glu Ala Gln Ile Val Lys Asp1 5 10 15Ile His Phe Lys Glu Ile Asp Leu Val Ile Arg Tyr Pro Lys Asn Ile20 25 30Asn Glu Asp Ile Val Lys Val Asp Phe Glu Asp Val Ile Ala Glu Pro35 40 45Val Gly Thr Tyr Ser Phe Asp Gly Val Trp Lys Val Ser Tyr Thr Thr50 55 60Phe Thr Val Ser Lys Tyr Trp Cys Tyr Arg Leu Leu Ser Thr Leu Leu65 70 75 80Gly Val Pro Leu Ala Leu Leu Trp Gly Phe Leu Phe Ala Cys Ile Tyr85 90 95Phe Cys Tyr Ile Trp Ala Met Val Pro Cys Ile Lys Ser Tyr Leu Ile100 105 110Glu Ile Gln Cys Ile Ser His Ile Tyr Ser Leu Cys Thr Arg Thr Phe115 120 125Cys Asn Pro Val Phe Ala Ala Met Gly Gln Val Cys Ser Asn Ile Lys130 135 140Val Met Leu Arg Lys Glu Val145 150<210>3<211>180<212>DNA<213>野猪属猪(Sus scrofa domestica Brisson)
<220>
<221>misc-feature<222>(148)<223>m＝a或c<400>3ctctggggct tcctgttcgc ctgcatctac ttctgctaca tctgggcgat ggtgccatgc 60atcaagagct acctgatcga gatccagtgc atcagccata tctactcact ctgcacccgc120accttctgca acccagtctt tgccgccmtg ggtcaggtct gcagcaacat caaggtgatg180<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4ctctggggct tcctgttc 18<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5catcaccttg atgttgctg 19
权利要求
1.猪眼肌面积性状相关蛋白，具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或为将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与猪眼肌面积性状相关的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
2.猪眼肌面积性状相关蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述猪眼肌面积性状相关蛋白的编码基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中序列1的多核苷酸序列；2)与序列表中序列1限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有相同活性的核苷酸序列；3)在高严谨条件下可与序列表中序列1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述基因的编码序列为序列表中序列1的自5′端90-546位碱基。
5.含有权利要求2-4中任一所述的猪眼肌面积性状相关蛋白编码基因的载体。
6.含有权利要求2-4中任一所述的猪眼肌面积性状相关蛋白编码基因的细胞系。
7.含有权利要求2-4中任一所述的猪眼肌面积性状相关蛋白编码基因的宿主菌。
8.一种检测猪眼肌面积的方法，是用具有序列表中SEQ ID №4和SEQ ID №5的核苷酸序列的一对引物对待测猪的总DNA进行PCR扩增，然后对PCR扩增产物进行单核苷酸多态性检测，确定自序列表中SEQ ID NO3的5′端第148位碱基为A还是C。
全文摘要
本发明公开了一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因与应用，目的是提供一种猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因与利用该基因检测猪眼肌面积的方法。本发明所提供的猪眼肌面积性状相关蛋白，具有序列表中SEQ ID№2的氨基酸残基序列或为将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过1－10个氨基酸残基的取代、缺失或添加且与猪眼肌面积性状相关的由SEQ ID№2衍生的蛋白质。本发明的猪眼肌面积性状相关蛋白及其编码基因将在猪的育种中发挥重要作用。
文档编号C12Q1/68GK1769297SQ20041008886
公开日2006年5月10日 申请日期2004年11月5日 优先权日2004年11月5日
发明者朱正茂, 赵书红, 李奎 申请人:李奎, 赵书红