专利名称：一种表达虎纹捕鸟蛛毒素－i的方法及其专用载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达虎纹捕鸟蛛毒素-I的方法及其专用载体。
背景技术：
虎纹捕鸟蛛毒素-I(HWTX-I)是从中国珍稀毒蜘蛛种虎纹捕鸟蛛的粗毒中分离纯化的一种作用于突触前膜的多肽类神经毒素，其相对分子质量为3.75kD，由33个氨基酸残基组成，其中6个半胱氨酸残基以1-4、2-5、3-6方式连接形成3个二硫键。它是一种作用于突触前膜的神经毒素，而且是一种N型Ca2+离子通道的阻断剂，因而是一种研究离子通道与受体相互作用的极好工具试剂。最近经研究发现，该神经毒素还具有明显的镇痛功效，与吗啡相比，其成瘾性低且无其它毒副作用，可能被开发成一种新型的镇痛药物，具有潜在的临床应用价值和良好的应用前景。但仅靠天然的虎纹捕鸟蛛资源无法满足对该神经毒素的研究开发及其临床应用的需要。
据报道，曾有人用芴甲氧羰基固相方法化学合成了HWTX-I，但该合成方法的成本较高，且合成量有限，无法进行推广应用(梁宋平、夏赞贤、谢锦云，虎纹捕鸟蛛毒素-I的化学合成及其结构与生理活性分析。中国科学(C辑)，1997，27(5)391-397)。也有人在大肠杆菌中对HWTX-I进行了原核表达，但因HWTX-I具有有3个二硫键，致使对该原核表达产物的复性较困难，并且大肠杆菌细胞壁中的脂多糖为强有力的内毒素原，因而用该表达系统也不利于大规模的开发利用(李敏、李路怡、梁宋平，化学合成虎纹捕鸟蛛毒素I基因的克隆和表达。生命科学研究，1998，2(3)229-232；刁建波、刘君梁、梁宋平，重组虎纹捕鸟蛛毒素-I用pET31b载体的表达和纯化。中国生物化学与分子生物学报，2003，19(2)195-200)。还有人在巴氏毕赤酵母中表达了HWTX-I，虽然表达量较高，但表达的重组蛋白质经纯化后其生物学活性仅为天然蛋白质的60％左右(聂东宋、李敏、徐辉明等，重组虎纹捕鸟蛛毒素-I在巴氏毕赤酵母中的表达和纯化。生物工程学报，2002，18(2)172-177)。上述方法都未能实现高效表达有活性的HWTX-I。
杆状病毒表达载体系统是80年代发展起来的一种高效的真核细胞表达系统。用该表达系统表达蛋白，不仅表达量高，而且对表达产物的后加工较完善，昆虫细胞对蛋白质的后加工系统与哺乳动物细胞接近，能使表达产物具有糖基化、磷酸化、脂肪酶化、酰胺化、切割信号肽和形成三级或四级高级结构的特点，因此表达的外源蛋白接近天然蛋白，具有较高的生物活性。
发明内容
本发明的目的是提供一种虎纹捕鸟蛛毒素-I的专用表达载体。
本发明所提供的表达虎纹捕鸟蛛毒素-I的专用载体是含有虎纹捕鸟蛛毒素-I基因的重组杆状病毒表达载体。
为了便于虎纹捕鸟蛛毒素-I的纯化，所述虎纹捕鸟蛛毒素-I基因的5′端连接有组氨酸标签(His-tag)编码序列。
所述虎纹捕鸟蛛毒素-I基因为带组氨酸标签编码序列(其中组氨酸标签编码序列自序列1的5′端第4位碱基-第21位碱基)，具有序列表中序列1的核苷酸序列。
其中，用于构建所述专用表达载体的出发载体可为基因工程领域中的杆状病毒表达载体，如pFastBac1、pFastBacHTA、pFastBacHTB、pFastBaC或pFastBac Dual；优选为pFastBac1。
所述虎纹捕鸟蛛毒素-I基因可插入杆状病毒表达载体pFastBac1多克隆位点处的BamH I和EcoR I限制性内切酶识别位点之间得到重组杆状病毒表达载体pFastBac1-HWTX。
上述虎纹捕鸟蛛毒素-I的专用表达载体均可按常规方法构建。
含有本发明所述载体的工程菌、宿主细胞也属于本发明的保护范围。
本发明的第二个目的是提供一种表达虎纹捕鸟蛛毒素-I的方法。
本发明所提供的表达虎纹捕鸟蛛毒素-I的方法，是将上述专用表达载体转化含有杆状病毒质粒的大肠杆菌，获得重组杆状病毒，将该重组杆状病毒转染昆虫细胞，表达虎纹捕鸟蛛毒素-I。
所述方法中表达得到的虎纹捕鸟蛛毒素-I采用镍离子亲和层析柱法进行纯化。
所述含有杆状病毒质粒(Bacmid)的大肠杆菌为大肠杆菌DH10Bac；所述转染昆虫细胞的方法可为脂质体载体法、磷酸钙转染法、电穿孔转染法、基因显微注射法或DEAE-葡聚糖转染法；优选为脂质体载体法。
所述昆虫细胞可为Sf9细胞、Sf21细胞或Tn-5B1-4细胞，优选为Sf9细胞。脂质体载体法转染的优选条件为细胞密度为1-2×106个细胞/mL，感染复数为5，感染时间为72小时。
应用本发明进行捕鸟蛛毒素-I的表达，不仅蛋白的表达量高(900ng/mL)，而且具有较高的生物活性，弥补了现有虎纹捕鸟蛛毒素-I制备方法以及原核表达系统表达方式的不足，此外，若将本发明应用于工业化虎纹捕鸟蛛毒素-I的生产，则具有原料生物体生长周期短，生产规模大，提取成本低的优点，表达产物经纯化后可用于药效药理及毒理等研究，具有重要的工业应用前景和实际意义。
图1为重组表达载体pFastBac1-HWTX的构建流程2为HWTX-I的表达流程3为表达蛋白的Western Blot分析结果图4a为最佳感染时间的优化结果图4b为最佳感染复数的优化结果图5为HWTX-I表达蛋白的纯化流程6为HWTX-I表达蛋白的生物学活性检测具体实施方式
下述实施例中所用实验方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、含有HWTX-I基因的杆状病毒表达载体pFastBac1-HWTX的构建杆状病毒表达载体pFastBac1-HWTX的构建过程如图1所示，包括以下步骤1、HWTX-I基因的克隆根据HWTX-I的已知氨基酸序列以及载体pFastBac1适宜的酶切位点设计一对引物，引物序列如下(该引物序列中含有组氨酸标签序列，自引物1序列的第14位碱基-第31位碱基)，以便用实施例3所述的方法对表达蛋白进行纯化引物15’-GGATCCCCATATGCACCACCACCACCACCACTCCATG-3’引物25’-GAATTCACAGCTTCCACTTGCACCACTTGTGCTTGTCG-3’以虎纹捕鸟蛛的基因组DNA为模板，在引物1和引物2的引导下，PCR扩增HWTX-I基因，并在其5’和3’端分别加上BamH I和EcoR I限制性内切酶识别位点。其中，反应体系为去离子水39μl、dNTP混合物2μl(终浓度为0.8mM)、上游引物1μl(终浓度为1μM)、下游引物1μl(终浓度为1μM)、模板1μl(1μg基因组DNA)、10×Taq酶反应缓冲液5μl和Taq酶1μl(1U)(上海申友生物技术公司)，反应条件为94℃下预变性3min；然后94℃下变性30s，67℃下退火45s，72℃下延伸2.5min，循环35次；72℃下充分延伸5min。扩增产物进行2.0％琼脂糖凝胶电泳，结果得到一条约150bp左右的条带。扩增条带经回收后，克隆至pGEM-T载体，进行基因序列分析，结果表明扩增得到的HWTX-I基因具有序列表中SEQ ID NO1的核苷酸序列。
2、将载体pFastBac1(购自GIBCO/BRL公司)用BamH I和EcoR I双酶切后用低熔点琼脂糖凝胶回收得到电泳纯的大片段酶切产物，然后用T4 DNA连接酶将回收的酶切产物与经相同酶双酶切的HWTX-I DNA片段连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经筛选获得阳性重组子，对阳性重组质粒进行测序(北京三博远志生物技术有限责任公司)，测序结果表明克隆的HWTX-I基因序列正确(具有序列表中序列1的核苷酸序列)，且正确地插入到载体pFastBac1的BamH I和EcoR I酶切位点之间，将该测序正确的含有HWTX-I基因的杆状病毒表达载体命名为pFastBac1-HWTX。
实施例2、HWTX-I的表达HWTX-I的表达过程如图2所示，包括以下步骤1、重组杆状病毒的获得将实施例1构建的杆状病毒表达载体pFastBac1-HWTX转化含有杆状病毒质粒(Bacmid)的大肠杆菌DH10Bac(购自GIBCO/BRL公司)感受态细胞，用蓝白斑法筛选重组Bacmid，发生转座作用的Bacmid由于LacZ基因的插入失活，使得含有重组Bacmid的菌落生长为白色，不含有重组Bacmid的菌落生长为蓝色，挑取白色单菌落接种至含X-gal和IPTG的选择培养板，再次进行蓝白筛选，最后挑取白色单菌落进行液体培养，提取重组杆状病毒质粒用于转染草地银纹夜蛾细胞(Spodopterafrugiperda 9，Sf9细胞)(美国Invitrogen公司)以表达HWTX-I。
2、重组杆状病毒转染Sf9细胞采用脂质体载体法进行转染，具体方法为1)Sf9细胞的培养将处于对数生长期的Sf9细胞(美国Invitrogen公司)按每孔接入1mL细胞密度为9×105个细胞/mL的细胞数量接种于含有10％胎牛血清的Grace’s昆虫培养基(含水解乳蛋白、酵母浸出物(美国Invitrogen公司)和25μg/mL庆大霉素，Sigma)的六孔板上，27℃培养1小时，使细胞贴壁。
2)向步骤1)中含有贴壁的Sf9细胞的六孔板中加入1μg(每孔)步骤1获得的重组杆状病毒质粒，并在脂质体转染试剂(Cellfectin Reagent，美国Invitrogen公司)的作用下，先27℃培养5小时，然后更换新的Grace’s昆虫培养基继续培养72小时。培养结束后，收集上清，即得到重组杆状病毒(P1)，在Sf9细胞中扩增后得到(P2、P3等)，用终点稀释法测定其滴度。
3)用合适滴度的重组杆状病毒感染Sf9细胞，然后收集细胞，用PBS洗涤1次后，悬于1/20培养体积的裂解液(含10mmol/L Tris-HCl pH7.4，150mmol/L NaCl)，置冰浴中，超声破碎细胞，然后经高速离心得到含有总蛋白的细胞裂解上清，分装后-80℃冻存备用。
3、表达蛋白的免疫印迹分析先将步骤2提取的含总蛋白的细胞裂解上清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再以抗HWTX-I兔多克隆抗体(以天然HWTX-I的为抗原，按常规方法制备)为一抗，以羊抗兔IgG(Promega公司)为二抗，用免疫印迹法(Western Blot)检测HWTX-I表达情况，结果如图3所示(泳道1为感染重组杆状病毒的Sf9细胞裂解上清液，泳道2为未感染重组杆状病毒的Sf9细胞裂解上清液(阴性对照)，泳道3为感染重组杆状病毒的Sf9细胞培养上清，泳道4为天然HWTX-I(阳性对照)，泳道1在4kD处出现一阳性条带，与天然HWTX-I的分子量大小一致，表明获得了表达正确的HWTX-I。
4、HWTX-I表达量的测定采用酶联免疫吸附测定技术(ELISA)测定HWTX-I表达量。具体方法包括以下步骤1)将100μL天然HWTX-I(1μg/ml，溶于pH 9.6碳酸盐缓冲液中)加入96孔酶标板孔中，4℃孵育48小时；2)去除孔中液体，用5％脱脂奶粉封闭，37℃温育2小时；3)在离心管中配制抗原-抗HWTX-I兔多克隆抗体(以天然HWTX-I的为抗原，按常规方法制备)溶液，其中抗体的浓度为2nM，而抗原(天然HWTX-I)的浓度分别为10mM、20mM、40mM、80mM、160mM、320mM、640mM；同时步骤2获得的含有表达蛋白的细胞裂解上清，经过PBST 1∶2系列稀释后，也与2nM的抗体混合。以上溶液室温放置3小时；4)每孔分别加入100μl上述溶液，37℃温育2小时；3)每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Promega公司)，室温温育40分钟；4)每孔加入100μL TMB/H2O2显色15分钟后，用1N H2SO4终止反应，最后用酶标仪测定A450nm值。结果表明HWTX-I的表达量为900ng/mL裂解上清，获得了较高的表达量。
5、转染条件的优化重组蛋白的表达水平与Sf9细胞密度、病毒感染复数和转染时间有关，根据HWTX-I的表达量确定其最佳参数。
1)确定Sf9细胞最佳密度将步骤2获得的重组杆状病毒在感染复数为5，感染时间为72小时(具体方法如下根据病毒滴度和细胞数量计算出感染复数为5时，所需要的病毒体积，加入细胞培养基。感染时间的确定主要是根据细胞开始出现脱壁等晚期感染症状，本实验确定为72小时)的条件下感染1mL处于对数生长期的细胞密度如下的Sf9细胞(美国Invitrogen公司)1×105个细胞/mL、5×105个细胞/mL、9×105个细胞/mL、1×106个细胞/mL、2×106个细胞/mL、5×106个细胞/mL、9×106个细胞/mL、1×107个细胞/mL。用ELISA测定HWTX-I的表达量。结果表明在感染复数为5，感染时间为72小时的条件下宿主细胞密度为1-2×106个细胞/mL的HWTX-I的表达量最高(15μg/mg总蛋白)。
2)确定最佳感染复数将步骤2获得的重组杆状病毒在细胞密度为1-2×106个细胞/mL，感染时间为72小时的条件下用不同感染复数的病毒感染1mL处于对数生长期的Sf9细胞(美国Invitrogen公司)，如下1、2、5和10。结果如图4b所示，表明在宿主细胞密度为1-2×106个细胞/mL，感染时间为72小时的条件下，感染复数为5的HWTX-I的表达量最高(15μg/mg总蛋白)。
3)确定最佳感染时间将步骤2获得的重组杆状病毒在细胞密度为1-2×106个细胞/mL，感染复数为5的条件下一不同时间感染1mL处于对数生长期的Sf9细胞(美国Invitrogen公司)，如下24小时、48小时、72小时、96小时和120小时。结果如图4a所示，表明在宿主细胞密度为1-2×106个细胞/mL，感染复数为5的条件下，感染时间为72小时的HWTX-I的表达量最高(15μg/mg总蛋白)。
实施例3、HWTX-I表达蛋白的纯化及其生物学活性的检测一、HWTX-I表达蛋白的纯化采用固化Ni2+亲和层析柱法纯化重组HWTX-I，纯化流程如图5所示，具体方法为将实施例2获得的含有HWTX-I表达蛋白的细胞裂解液过滤后，加入装有Ni2+树脂的层析柱(Ni-NTA琼脂糖，30210，Qiagen公司)，4℃振摇2小时后，用洗涤缓冲液(50mMNaH2PO4、300mM NaCl、20mM咪唑，用NaOH调pH值至8.0)洗柱，直至流过液的A280＜0.01，再用洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mM咪唑，用NaOH调pH值至8.0)洗脱结合的蛋白，每份1mL分步收集，最后用CNBr去除组氨酸标签，获得经纯化的HWTX-I表达蛋白，序列分析结果表明该表达蛋白的氨基酸残基序列与天然HWTX-I的氨基酸残基序列一致。
二、HWTX-I表达蛋白的生物学活性检测将步骤一经纯化的HWTX-I表达蛋白用台氏液稀释成浓度为1×10-5g/mL的溶液，再用该蛋白稀释液浸泡小鼠膈肌-膈神经离体标本，然后给予电刺激，同时记录其阻断时间。结果如图6所示，表明HWTX-I表达蛋白具有与天然HWTX-I相同的阻断离体小鼠膈神经和膈肌接头传递的作用，生物活性与天然HWTX-I相同。
序列表<160>1<210>1<211>129<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atgcaccacc accaccacca ctccatggcc tgcaagggtg tgttcgacgc ctgcaccccc 60ggtaagaacg aatgctgccc caaccgggtg tgctccgaca agcacaagtg gtgcaagtgg120aagctgtga129
权利要求
1.一种虎纹捕鸟蛛毒素-I的专用表达载体，是含有虎纹捕鸟蛛毒素-I基因的重组杆状病毒表达载体。
2.根据权利要求1所述的专用表达载体，其特征在于所述虎纹捕鸟蛛毒素-I基因的5′端连接有组氨酸标签编码序列；所述带有组氨酸标签编码序列的虎纹捕鸟蛛毒素-I基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的专用表达载体，其特征在于用于构建所述专用表达载体的出发载体为pFastBac1、pFastBacHTA、pFastBacHTB、pFastBaC或pFastBacDual。
4.根据权利要求3所述的专用表达载体，其特征在于所述出发载体为pFastBac1，所述专用表达载体为pFastBac1-HWTX。
5.含有权利要求1或2或3或4所述的专用表达载体的工程菌和宿主细胞。
6.一种虎纹捕鸟蛛毒素-I的表达方法，是将权利要求1或2或3或4所述的专用表达载体转化含有杆状病毒质粒的大肠杆菌，获得重组杆状病毒，将该重组杆状病毒转染昆虫细胞，表达虎纹捕鸟蛛毒素-I。
7.根据权利要求6所述的表达方法，其特征在于所述方法中表达得到的虎纹捕鸟蛛毒素-I采用镍离子亲和层析柱法进行纯化。
8.根据权利要求6或7所述的表达方法，其特征在于所述含有杆状病毒质粒(Bacmid)的大肠杆菌为大肠杆菌DH10Bac。
9.根据权利要求6或7所述的表达方法，其特征在于所述转染昆虫细胞的方法为脂质体载体法、磷酸钙转染法、电穿孔转染法、基因显微注射法或DEAE-葡聚糖转染法；优选为脂质体载体法。
10.根据权利要求6或7所述的表达方法，其特征在于所述昆虫细胞可为Sf9细胞、Sf21细胞或Tn-5B1-4细胞，优选为Sf9细胞；所述脂质体载体法转染的条件为细胞密度为1-2×106个细胞/mL，感染复数为5，感染时间为72小时。
全文摘要
本发明公开了一种表达虎纹捕鸟蛛毒素－I的方法及其专用载体。该表达虎纹捕鸟蛛毒素－I的专用载体是含有虎纹捕鸟蛛毒素－I基因的重组杆状病毒表达载体。所述虎纹捕鸟蛛毒素－I基因的5′端连接有组氨酸标签编码序列；所述带有组氨酸标签编码序列的虎纹捕鸟蛛毒素－I基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。表达虎纹捕鸟蛛毒素－I的方法，是将专用表达载体转化含有杆状病毒质粒的大肠杆菌，获得重组杆状病毒，将该重组杆状病毒转染昆虫细胞，表达虎纹捕鸟蛛毒素－I。本发明具有蛋白表达量高(900ng/mL)，生物活性高的优点，具有重要的工业应用前景和实际意义。
文档编号C12N7/01GK1786177SQ200410096658
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月6日 优先权日2004年12月6日
发明者安成才, 姬文婕, 张新跃, 胡惠聪, 陈纪袁, 高音 申请人:北京大学