专利名称：一种低温碱性脂肪酶的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种海洋微生物分离纯化方法，特别是涉及一种新型低温碱性脂肪酶的分离纯化方法背景技术近年来随着生物技术的发展，寻找具有全新性质的酶已成为国际酶制剂研究的热点。海洋生物由于生长在海洋这一独特的环境中，特别是生活在极端环境下的海洋生物和微藻，能产生丰富的极端酶。与陆地微生物所产生的酶相比，海洋酶具有更为独特的酶学性质，因此引起了国内外研究人员的极大关注。脂肪酶(甘油酯水解酶，EC3.1.3)是一类特殊的酯键水解酶，它能催化天然底物油脂(甘油三酯)水解，产生脂肪酸和甘油。因此，脂肪酶在日用化工、海洋食品加工、化学工业以及利用海洋动物脂肪制备不饱和脂肪酸等领域具有广阔的应用前景。其中微生物产生的脂肪酶由于种类繁多，具有更广的作用PH、温度范围和对底物的专一性，又便于进行工业生产，获取高纯度制剂以及在酶理论研究和实际应用中的独特地位，而得到广泛的研究并成为最具有发展前途的酶。
国际上自九十年代初到现在，相继开发出中温脂肪酶、高温碱性脂肪酶、中温碱性脂肪酶等，但脂肪酶的酶学性质仍无法满足现代工业的需求。因此从海洋中筛选出具有独特酶学性质的海洋脂肪酶，实为微生物脂肪酶开发的一大进步，并将会对酶制剂工业带来新的生机和活力。从上世纪七十年代，国外就开始对产脂肪酶海洋细菌进行了筛选，但未见有关海洋微生物产脂肪酶制备和性质方面的报道。我国海洋微生物脂肪酶研究起步较晚，仅有杨从发等人从海水，海泥海洋生物的消化道分离到碱性脂肪酶产生菌(杨从发，2000)。但由于海洋微生物存在海水培养和脂肪酶分离纯化困难等问题，限制了海洋脂肪酶在制备与应用方面的进一步开发。
发明内容
本发明的目的在于提供一种打破传统脂肪酶纯化工艺、首次利用采取清除诱导剂对脂肪酶纯化的影响，大大简化了海洋微生物低温碱性脂肪酶的分离纯化方法。
本发明提供一种海洋微生物低温碱性脂肪酶的(简称低温碱性脂肪酶)分离纯化方法包括下列步骤1氯仿萃取脱脂适冷性海洋酵母菌株Bohai Sea-9145经发酵培养得发酵上清液中，加入三氯甲烷进行充分搅拌，于3-5℃，优选4℃静置30分钟，以转速4000rpm/min离心40分钟，去除杂蛋白并收集上清液。
2超滤浓缩取步骤1去除杂蛋白收集的上清液，经100KDa中空纤维柱超滤，再以10KDa中空纤维柱浓缩。
3阳离子交换柱层析以CM Sepharose F F阳离子交换层析柱对步骤2经浓缩的低温碱性脂肪酶柱层析，分步收集洗脱液，得电泳纯海洋微生物低温碱性脂肪酶。
本发明提供的海洋微生物低温碱性脂肪酶的分离纯化中，在所述氯仿萃取脱脂是为了保持低温碱性脂肪酶活力不受损失消除发酵残余橄榄油对低温碱性脂肪酶纯化影响，以氯仿为萃取剂对橄榄油萃取。氯仿与上清液体积比通常为1-10∶100，优选为4-10∶100，更优选为5∶100，萃取剂氯仿加入量对发酵液低温碱性脂肪酶活力的影响见图1。
低温碱性脂肪酶活性的测定采用中华人民共和国行业标准(中华人民共和国轻工业部，1993)。低温碱性脂肪酶的水解活力单位定义为以低温碱性脂肪酶水解油脂，每分钟产生1mol低温碱性脂肪酸的酶量，定义为一个脂肪酶活力单位。
蛋白质浓度的测定采用LOWRY法进行测定(LOWRY.OH，1951)。
SDS-PAGE垂直凝胶电泳按Laemmli法进行(Laemmli U K，1970)。
如图1所示，三氯甲烷加入量为5∶100(VCH3CL∶V上清液)时，低温碱性脂肪酶比活最高。低温碱性脂肪酶比酶活为15828u/g，纯度提高了1.2倍。
在所述超滤浓缩选取截留分子量为100KDa和10KDa的中空纤维柱对低温碱性脂肪酶进行初步纯化，其中中空纤维分别为100KDa及10KDa，为市售产品，例如瑞典Amersham bioscience公司出售的。SDS-PAGE电泳及表1数据表明，低温碱性脂肪酶发酵液经超滤，去除了高分子量杂蛋白，低温碱性脂肪酶比活为41288u/g，提高了3.3倍。
在所述阳离子交换柱层析以CM Sepharose F F阳离子交换层析柱对超滤浓缩低温碱性脂肪酶柱层析，见图2图2低温碱性脂肪酶的CM Sepharose FF阳离子交换树脂纯化图谱其中流速1ml/min上柱缓冲液pH3.8 10mmol/L柠檬酸-1mmol/L磷酸氢二钠缓冲液洗脱液pH3.8 10mmol/L柠檬酸-1mmol/L磷酸氢二钠缓冲液+1mol/LNaCl，检测波长280nm测定分步收集低温碱性液脂肪酶活性，24min开始检测到低温碱性脂肪酶活性，32min低温碱性脂肪酶活性达到最大值，此时紫外检测器检测到最大吸光值，因此图2中第三个峰为低温碱性脂肪酶洗脱峰。合并30～34min收集组分并测定低温碱性脂肪酶活性及蛋白质含量。表1显示，经柱层析低温碱性脂肪酶比活为206224u/g，纯度提高5.0倍。
表1.低温碱性脂肪酶纯化结果酶活蛋白质含量 活性回收率蛋白回收率 比活项目 纯化倍数U/mlug/ml (％) (％) U/g发酵上清液91.314.432100.0％ 100％ 12652 1.0氯仿处理液75.39.514 82.5％65.9％15828 1.210万超滤滤过液81.75.370 71.6％37.2％24342 1.93万超滤浓缩液 307.2 2.976 67.3％20.6％41288 3.3CM sepharose柱层析33.4161.9627.6％1.69％206224 16.3
本发明提供的海洋微生物低温碱性脂肪酶分离纯化中，突破了传统脂肪酶分离纯化工艺，采用萃取清除诱导剂对低温碱性脂肪酶分离纯化的影响，大大简化了低温碱性脂肪酶的纯化工艺，纯度高，酶纯化倍数为16.3。
图1萃取剂对发酵液低温碱性脂肪酶活力的影响。
图2低温碱性脂肪酶的CM Sepharose F F阳离子交换树脂纯化图谱。
具体实施例方式
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于实施例。
实施例1发酵培养基为豆饼粉4％(Wt)、米糠4％(Wt)、花生泊4％(Wt)、粗制花生油0.5％(Wt)、MgSO40.05％(Wt)、KH2PO40.2％(Wt)，PH5.0、培养温度26±1℃，培养时间20-26小时，接种本发明的适冷性海洋酵母菌侏BOhai-Sea-9145震荡培养，然后在培养基中高产的海洋微生物低温碱性脂肪酶的培养液于4℃下以1000rpm/min离心此培养物获得含有本发明海洋微生物低温碱性脂肪酶的上清液，上清液中脂肪酶的比活大约为12652U/ml。
将上述上清液以三氯甲烷与上清液体积比为5∶100加入三氯甲烷进行充分搅拌，于4℃静置30分钟，以4000rpm离心40分钟，去除杂蛋白并收集上清液。将得到的上清液经100KDa中空纤维柱超滤，再以10KDa中空纤维柱浓缩，然后将浓缩液以CM Sepharose FF，阳离子交换层析柱对低温碱性脂肪酶柱层析，流速1ml/min，上样缓冲液PH3.8 10mmol/L-柠檬酸-1mmol/L磷酸二氢钠缓冲液，洗脱液PH3.810mmol/L柠檬酸-1mmol/L磷酸二氢钠缓冲液-1mol/LNacl分步收集洗脱液得到电泳纯低温碱性脂肪酶，测定脂肪酶比活为206224u/g，纯化倍为16.3。
权利要求
1.一种低温碱性脂肪酶的分离纯化方法，包括下列步骤(1)在发酵上清液中加入三氯甲烷进行充分搅拌，于3-5℃静置30分钟，以转速4000rpm/min离心40分钟，去除杂蛋白并收集上清液；(2)超滤浓缩取步骤1的上清液，经100kda中空纤维柱超滤，再以10kda中空纤维柱浓缩；(3)阳离子交换柱层析以CM Sephanose FF阳离子交换层析柱对脂肪酶进行层析，分步收集洗脱液，得电泳纯低温碱性脂肪酶。
2.根据权利要求1的低温碱性脂肪酶的分离纯化方法，其特征在于三氯甲烷与发酵上清液体积比为1-10∶100。
3.根据权利要求2的低温碱性脂肪酶的分离纯化方法，其特征在于三氯甲烷与发酵上清液体积比为5∶100。
4.根据权利要求1的低温碱性脂肪酶的分离纯化方法，其特征在于所述阳离子交换柱层析中流速1-ml/min，上柱缓冲液PH3.8 10mmol/L柠檬酸-1mmol/L磷酸氢二钠缓冲液，洗脱液PH3.810mmol/L柠檬酸-1mmol/L磷酸氢二钠缓冲液+1mol/LNacl。
全文摘要
本发明涉及一种新型低温碱性脂肪酶的分离纯化方法，该方法包括用三氯甲烷萃取发酵上清液，用100kda中空纤维柱进行超滤，10kda中空纤维柱进行浓缩，然后用CM Sephanose FF阳离子交换层析柱进行层析，得电泳纯低温碱性脂肪酶，该方法消除诱导剂对酶纯化的影响，纯度高，大大简化分离纯化方法，是一种新型工业化分离纯化方法。
文档编号C12N9/20GK1614014SQ20041009666
公开日2005年5月11日 申请日期2004年12月3日 优先权日2004年12月3日
发明者王跃军, 孙谧, 王海英, 阎晓玲 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所