专利名称：一种扩增水稻t－dna插入位点侧翼序列的方法
技术领域：
本发明涉及一种扩增水稻T-DNA插入位点侧翼序列的方法。
背景技术：
水稻是世界上一半以上人口的主要食物，是有代表性的谷类作物。因其相对较小的基因组，成熟的转化技术体系，构建的很好的物理图谱，大量的cDNA序列以及indica和japonica两个亚种接近完成的基因组测序计划，水稻已成为单子叶植物基因组学研究的模式系统。
一般用来研究基因功能的途径是创建DNA插入突变体群体，再利用对突变体筛选和表型鉴定来鉴别基因。T-DNA插入突变体库是水稻功能基因组学研究的重要平台之一，T-DNA插入位点侧翼序列的分离有利于T-DNA插入方式和水稻重要农艺性状基因的功能分析。水稻T-DNA插入位点侧翼序列的扩增方法有质粒挽救法，cDNA末端快速扩增法(分为5-端RACE和3-端RACE法)，反向PCR法(iPCR)，热不对称PCR法(TAIL-PCR)等。传统的方法如反向PCR法，其扩增效率受限于插入位点的序列和基因组DNA的酶切位点数目，而且其所扩增得到的序列片段大小不够大，有时不能从基因数据库获得足够的同源序列信息。质粒挽救法受菌种培养的限制而且时间漫长。TAIL-PCR必须在不同温度下进行多步PCR。这些方法操作步骤繁琐，侧翼序列扩增效率底，费时费力，不适合于高通量序列扩增分析。
目前，模式植物拟南芥可用PCR-walking方法来分析T-DNA插入片段旁侧的植物基因组DNA信息。如图1所示，其主要步骤如下首先用平端限制性内切酶对植物基因组DNA进行酶切消化，然后将接头退火复性到切割出来的平端片段上。一个步测的引物(WP)是根据T-DNA的左边界序列(LB)的3’侧设计的，另一个引物是根据接头的序列设计(AP)的。用WP和AP就可以扩增出T-DNA插入片段侧翼的植物DNA序列或有可能插入进去的载体骨架序列。一般设计2-3套嵌套的WP和AP引物，进行2-3轮的巢式PCR，就可以得到可以进行进一步研究所需量的PCR产物。但目前，没有一套适合于水稻的PCR-walking技术体系。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速特异扩增水稻T-DNA插入位点侧翼序列的方法。
本发明所提供的扩增水稻T-DNA插入位点侧翼序列的方法，包括以下步骤
1)酶切连接在同一反应体系中，利用平端限制性内切酶酶切水稻基因组DNA并利用T4DNA连接酶将得到的酶切片段与不对称接头序列连接，得到酶切连接液；所述不对称接头序列为由一条长链和一条短链组成的双链接头，长链和短链互补，应有较高的GC含量，并且在水稻基因组中无同源序列，长链具有至少两个嵌套引物的结合位点；2)以步骤1中的酶切连接片段为模板，以根据所述不对称接头序列和T-DNA的左边界序列设计的嵌套引物进行两轮嵌套引物PCR扩增，得到T-DNA插入位点侧翼序列。
为了提高扩增的特异性，所述不对称接头序列的短链的3′端修饰有NH2基。
为了确保充分酶切，步骤1)中的酶切连接反应体系可为10μl，所述酶切连接反应体系的组成及反应条件为水稻基因组DNA 40-100ng，平端限制性内切酶3U，T4DNA连接酶70U，1×T4DNA连接酶缓冲液，不对称接头序列50μM，加双蒸水到l0μl，25℃反应6-16个小时。其中，所用试剂均购自大连宝生物工程有限公司。
所述反应体系的组成及反应条件优选为水稻基因组DNA 82.5ng，平端限制性内切酶3U，T4DNA连接酶70U，T4DNA连接酶缓冲液1×，不对称接头序列50μM，加ddH2O到10μl，25℃，反应6-16个小时。
所述平端限制性内切酶可为Dra I、EcoR V、Bal I、Pvu II、Sma I、Sna I或Stu I。
所述不对称接头序列具体可为由具有序列表中序列1的单链寡核苷酸序列(ADA1)和具有序列表中序列2的单链寡核苷酸序列(ADA2)加热到80℃，然后在室温下冷却，退火而成的双链接头。
步骤2)中所述两轮嵌套引物PCR扩增中，第一轮PCR扩增的引物对可为具有序列表中序列3的单链寡核苷酸序列和序列4的单链寡核苷酸序列；第二轮PCR扩增的引物对可为具有序列表中序列5和序列6的单链寡核苷酸序列。
为了便于DNA回收和序列测定，两轮嵌套引物PCR扩增的反应体系均可为40μl。其中，所述第一轮PCR扩增的反应体系可为酶切连接液2μl，rTaq酶4U，正反向引物各0.3μM，dNTP 175μM，1×PCR缓冲液(可购自大连宝生物工程有限公司，TaKaRa)，加双蒸水到40μl；所述第二轮PCR扩增的反应体系可为第一轮PCR产物50倍稀释液3μl，rTaq酶1.5U，正反向引物各0.5μM，dNTP 115μM，1×PCR缓冲液，加双蒸水到40μl。
所述两轮嵌套引物PCR扩增的反应条件均可为94℃下预变性3min；然后94℃下变性30s，67℃下退火45s，72℃下延伸2.5min，循环35次；72℃下充分延伸5min。
本发明的扩增水稻T-DNA插入位点侧翼序列的方法，具有如下特点1)酶切与连接在同一反应体系中常温下进行，简洁快速，大大节省了反应试剂和反应时间；2)不对称性接头和嵌套的PCR保证了扩增的特异性；不对称性接头由于短链3’端具有NH2基团，防止了接头引物的结合位点产生，接头引物的结合位点只有在T-DNA引物下扩增出来；即使扩增出两端具有接头序列的片段，也会由于末端反向重复序列在退火时形成手性结构而抑制扩增；3)平端限制性内切酶(如Dra I或EcoR V)在T4连接酶缓冲液的10μl体系中能够充分酶切；4)在单酶切条件下，仅用左边界引物和接头引物就能达到扩增效率85％，远高于一般方法的扩增效率；5)第二次PCR反应体系达到40μl大大提高了产率，利于DNA回收和序列测定。该方法适用于高通量水稻基因组分析。
图1为PCR-walking技术扩增T-DNA侧翼序列原理示意2为增强子捕捉质粒pFX-E24.2-15R的物理图谱具体实施方式
以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、水稻T1代T-DNA插入突变体的侧翼序列扩增1、水稻T1代T-DNA插入突变体的获得水稻遗传转化所用的T-DNA双元载体为含有GAL4-VP16-GUS增强子捕获元件的增强子捕获载体pFX-E24.2-15R(购自澳大利亚CAMBIA研究中心)。载体的物理图谱如图2所示，T-DNA右边界内有由基础35S启动子驱动的GAL4-VP16元件。GAL4的结合位点在长度上是UAS的六倍。UAS的下游是GUS基因。T-DNA区携带有质粒挽救所需的pUC-ori和氨苄青霉素抗性基因。植物转化体的选择标记基因——潮霉素-3’NOS——连在T-DNA左边界邻接的地方，由35S启动子驱动。细菌中的选择抗性基因——氯霉素抗性基因在T-DNA左边界(LB)外边。图2中，T BORDER(L)T-DNA区左边界；T BORDER(R)T-DNA区右边界；CAM RESISTANCE氯霉素抗性基因；CAMV35S35S启动子；HYG(R)潮霉素抗性基因；POLY A SITEPoly A位点；Amp氨苄青霉素抗性基因；BoGUS葡糖醛酸酶基因；GFP绿色荧光蛋白基因；EGFP增强的绿色荧光蛋白基因；6xUAS6段重复的上游激活序列；GAL4/VP16酵母转录激活蛋白GAL4DNA结合域和单纯疱疹病毒激活域的融合基因。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105超毒力菌株。EHA105是EHA101的衍生菌，删除了EAH101中的pTiB0542的T-DNA及kan抗性基因。以A136为染色体背景，琥珀碱型(Suc)。这种菌株具有侵染能力比较强，生长快，不结球等优良特性。
用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105介导的基因转化方法将pFX-E24.2-15R导入粳稻品种日本晴(O.sativa spp.Japonica)的愈伤组织，经筛选培养得到水稻粳稻品种日本晴(O.sativa spp.Japonica)T1代转化体325株。
2、扩增水稻T1代T-DNA插入突变体的侧翼序列取水稻粳稻品种日本晴(O.sativa spp.Japonica)T1代转化体325株抽穗期前的叶片，用CTAB法提取水稻基因组DNA，酶切连接后，用作PCR反应模板。
接头双链序列分别为ADA15′-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCGGGGAGGT-3′(序列1)ADA25′P-ACCTCCCC-NH23′(序列2)ADA1和ADA2加热到80℃，然后在室温下冷却，退火成双链接头。
WP15′-CGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGC-3′(序列3)AP15′-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3′(序列4)WP25′-GTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTG-3′(序列5)AP25′-CTATAGGGCTCGAGCGGC-3′(序列6)。
WP1和WP2是根据T-DNA左边界设计的嵌套引物。AP1和AP2是根据接头设计的嵌套引物。接头和引物均由上海生工公司合成。
PCR试剂rTaq酶和dNTP混合物，均为大连宝生物工程有限公司产品。
限制性内切酶DraI为大连宝生物工程有限公司产品。
连接酶T4DNA连接酶及其缓冲液购自大连宝生物工程有限公司。
分子量标准SD300购自鼎国生物技术有限责任公司。
水稻T-DNA插入位点侧翼序列PCR扩增法操作步骤1)酶切连接水稻DNA的酶切及其与接头的连接在同一体系中进行。反应体系的组成及反应条件为水稻基因组DNA 82.5ng，平端限制性内切酶3U，T4DNA连接酶70U，T4DNA连接酶缓冲液1×(购自大连宝生物工程有限公司)，不对称接头序列50μM，加ddH2O到10μl，25℃，反应6-16个小时。
2)第一轮PCR反应体系为步骤1)获得的酶切连接液2μl，rTaq酶4U，正反向引物各0.3μM，dNTP 175μM，1×PCR缓冲液(购自大连宝生物工程有限公司)，加双蒸水到40μl；3)第二轮PCR反应体系为第一轮PCR产物50倍稀释液3μl，rTaq酶1.5U，正反向引物各0.5μM，dNTP 115μM，1×PCR缓冲液，加双蒸水到40μl。反应条件为94℃下预变性3min；然后94℃下变性30s，67℃下退火45s，72℃下延伸2.5min，循环35次；72℃下充分延伸5min。
4)PCR产物检测将第二轮PCR产物2μl与加样缓冲液混匀，加入含25ng/ml溴化乙锭的1.2％琼脂糖凝胶样孔中，在100V电压下电泳20min。结果表明有276个样品扩增出1个或多个产物，扩增效率为85％，各样品条带数不同，条带位置不同。将每条带切胶，参照上海生工玻璃珠(silver beads)胶回收试剂盒操作步骤回收，详细步骤按照试剂盒使用说明书。
5)PCR回收产物的DNA测序按照常规方法使用ABI3730基因分析仪对所回收产物中的部分产物(80个)进行测序。结果如表1所示，有7个样品未测出结果，有8个样品测出的结果与载体序列和水稻基因组序列用BLASTN比对后没有任何同源性，这两项占测序样品总数的18.7％。有81.3％的PCR-walking产物的测序结果表明含有T-DNA区的序列，其中46.2％的序列包含有水稻序列，即可以初步确定转化元件的插入位点。
表1.部分PCR-walking产物测序结果
测序的结果表明T-DNA插入位点处有多种多样的情况。有的T-DNA序列与水稻序列之间没有其它的填充序列；有的填充有长度不一的不明来源的序列；还有的通读了T-DNA左边界序列，有大量的T-DNA区外的载体骨架序列(27.7％)；3个产物中只有水稻序列，找不到载体序列。
利用BLASTN比对工具(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对确定了插入位点的30个序列在水稻基因组中的分布进行初步分析，结果显示，所测序列的同源序列除了在第7条染色体外，别的染色体中都有分布(表2)。如D2174有两个插入片段，分别插入到第二和第十一条染色体中。
表2.所测插入位点在水稻各条染色体上的分布
实施例2、水稻GUS基因胚乳特异表达突变体基因组的T-DNA侧翼序列扩增1、水稻GUS基因胚乳特异表达突变体的获得参照实施例1的方法构建水稻GUS基因胚乳特异表达突变体库，在水稻灌浆期取突变株的未成熟种子，叶和根进行GUS组织化学染色，根据染色结果筛选出水稻GUS基因胚乳特异表达突变体。
2、扩增水稻GUS基因胚乳特异表达突变体基因组的T-DNA侧翼序列接头、引物、PCR试剂、限制性内切酶、连接酶和操作步骤均同实施例1。按照常规方法使用ABI3730基因分析仪对所回收产物中的部分产物(260个)进行测序。结果如表3所示，有29个样品未测出结果，有2个样品测出的结果与载体序列和水稻基因组序列用BLASTN比对后没有任何同源性，这两项占测序样品总数的11.9％。有88.1％的PCR-walking产物的测序结果表明含有T-DNA区的序列，其中52.8％的序列包含有水稻序列，即可以初步确定转化元件的插入位点。
表3.部分PCR-walking产物测序结果
利用BLASTN比对工具(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对确定了插入位点的121个序列在水稻基因组中的分布进行初步分析，结果显示，所测序列的同源序列在各条染色体中都有分布(表4)。
表4.所测插入位点在水稻各条染色体上的分布
序列表<160>6<210>1<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>1acctcccc 8<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>2cgatggctgt gtagaagtac tcgc 24<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列
<220>
<230>
<400>3ggatcctaat acgactcact atagggc 27<210>4<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>4ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgccgggga ggt43<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>5gttcctatag ggtttcgctc atgtgttg 28
<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<230>
<400>6ctatagggct cgagcggc18
权利要求
1.一种扩增水稻T-DNA插入位点侧翼序列的方法，包括以下步骤1)酶切连接在同一反应体系中，利用平端限制性内切酶酶切水稻基因组DNA并利用T4DNA连接酶将得到的酶切片段与不对称接头序列连接，得到酶切连接液；所述不对称接头序列为由一条长链和一条短链组成的双链接头，长链和短链互补，并且在水稻基因组中无同源序列，长链具有至少两个嵌套引物的结合位点；2)以步骤1中的酶切连接片段为模板，以根据所述不对称接头序列和T-DNA的左边界序列设计的嵌套引物进行两轮嵌套引物PCR扩增，得到T-DNA插入位点侧翼序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述不对称接头序列的短链的3′端修饰有NH2基。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述酶切连接反应体系的组成及反应条件为水稻基因组DNA 40-100ng，平端限制性内切酶3U，T4DNA连接酶70U，T4DNA连接酶缓冲液，不对称接头序列50μM，加双蒸水到10μl，25℃反应6-16个小时。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述反应体系的组成及反应条件为水稻基因组DNA 82.5ng，平端限制性内切酶3U，T4DNA连接酶70U，T4DNA连接酶缓冲液1×，不对称接头序列50μM，加ddH2O到10μl，25℃，反应6-16个小时。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述平端限制性内切酶为Dra I、EcoRV、Bal I、Pvu II、Sma I、Sna I或Stu I。
6.根据权利要求1、2、3或4所述的方法，其特征在于所述不对称接头序列是由具有序列表中序列1的单链寡核苷酸序列和具有序列表中序列2的单链寡核苷酸序列加热到80℃，然后在室温下冷却，退火而成的双链接头。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述两轮嵌套引物PCR扩增中，第一轮PCR扩增的引物对为具有序列表中序列3和序列4的单链寡核苷酸序列；第二轮PCR扩增的引物对为具有序列表中序列5和序列6的单链寡核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述第一轮PCR扩增的反应体系为酶切连接液2μl，rTaq酶4U，正反向引物各0.3μM，dNTP 175μM，1×PCR缓冲液，加双蒸水到40μl；所述第二轮PCR扩增的反应体系为第一轮PCR产物50倍稀释液3μl，rTaq酶1.5U，正反向引物各0.5μM，dNTP115μM，1×PCR缓冲液，加双蒸水到40μl。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述两轮嵌套引物PCR扩增的反应条件均为94℃下预变性3min；然后94℃下变性30s，67℃下退火45s，72℃下延伸2.5min，循环35次；72℃下充分延伸5min。
全文摘要
本发明公开了一种扩增水稻T－DNA插入位点侧翼序列的方法。本发明所提供的扩增水稻T－DNA插入位点侧翼序列的方法，包括以下步骤1)酶切连接在同一反应体系中，利用平端限制性内切酶酶切水稻基因组DNA并利用T
文档编号C12N15/63GK1782074SQ20041009645
公开日2006年6月7日 申请日期2004年12月1日 优先权日2004年12月1日
发明者路铁刚, 彭昊, 杨永智, 吴金霞, 黄红梅, 宛淑艳 申请人:中国农业科学院生物技术研究所