水稻呼吸爆发氧化酶基因OsRboh(LOC_Os01g25820)的载体及其应用
【专利说明】水稻呼吸爆发氧化酶基因0sRboh(L0C_0s01g25820)的载体及其应用
技术领域
[0001 ] 本发明涉及一种水稻呼吸爆发氧化酶基因0SRboh(L0C_0S01g25820)的载体及应用，属于基因工程技术领域。
【背景技术】
[0002]活性氧(reactive oxygen species，R0S)是生物体一类有氧代谢的副产物，除作为有毒分子伤害细胞外，还作为一类重要的信号分子参与生物体的生长和发育。
[0003]研究发现，ROS的来源包括质膜NADPH氧化酶、过氧化物酶及胺氧化酶，其中由NADPH氧化酶介导产生的ROS最受关注。NADPH氧化酶以定位于细胞质边缘的NADPH为电子供体，催化O2生成超氧阴离子(02一.)，随后超氧阴离子歧化生成H2O2,H2O2再经芬顿反应生成.0Η。植物NADPH氧化酶又称呼吸爆发氧化酶(Respiratory burst oxidasehomologue，Rboh)，所有植物Rboh蛋白都包含约300个氨基酸大小的N端区，该区存在一对保守的Ca2+结合EF手性结构域。植物中的呼吸爆发氧化酶(Respiratory burst oxidasehomologue，Rboh)主要由呼吸爆发氧化酶基因(Respiratory Burst Oxidase Homologue,Rboh)所控制。
[0004]植物Rboh基因的功能主要集中于两个方面:参与胁迫反应和调控生长发育。当病原菌侵染拟南芥细胞时，AtRbohD和AtRbohF基因表达产生大量的ROS来增强组织的抗病性。拟南芥atRbohD/atRbohF双突变体中，Ca2+通道的ABA活化与气孔关闭不能正常进行，通过外源施加H202可以部分修复这些缺失的功能。拟南芥AtRbohC基因的突变导致根和根毛生长受抑制，其突变体rdh2内ROS的水平较野生型有大幅度的降低，用NADPH氧化酶的抑制剂二亚苯基碘(DPI)处理可抑制其活性，产生与突变体相同的情况，而ROS处理突变体根部则可部分恢复表型。番茄反义Rboh植侧枝增加，花序和花数量为野生型的2-3倍，大多数花表现不育。菜豆PvRbohB干扰植株中侧根的密度降低，根瘤的形成受影响，从而影响植株的固氮能力。
[0005]水稻(Oryzasativa L.)是最主要的粮食作物之一，也是一种重要的模式生物，对相关基因进行功能研究具有重要作用。随着水稻功能基因组研究的不断深入，许多重要农艺性状相关基因相继被分离。Respiratory Burst Oxidase Homolog (Rboh)基因直接参与ROS的形成，但在水稻中的功能并不清楚，值得进一步的研究。我们的研究发现OsRboh(L0C_0s01g25820)的过量表达的水稻植株中叶片变黄，育性降低，利用这一特性可以应用在水稻分子育种和遗传改良上。
[0006]
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种水稻0sRboh(L0C_0s01g25820)基因载体及在叶色和育性改变中的应用，该载体含有水稻0sRbOh(L0C_0s01g25820)基因的上游连有双35S启动子。
[0008]本发明的上述植物表达载体为PHB-0sRboh(L0C_0s01g25820)，由下述方法构建而成:
(I)根据NCBI上公布的OsRboh (L0C_0s01g25820)全长cDNA (AK065117)序列，设计两端引物:
OsRboh-OE-F: AGATCTATGGCTGACCTGGAAGCAGGCATGG (Bam HI)
OsRboh-OE-R: CACGTGTTAGAAGTTCTCCTTGTGGAAATCA (Xba I)
以日本水稻基因组研究中心(RGRC)购得的质粒AK065117为模板进行PCR扩增，获得0sRboh(L0C_0s01g25820)全长。
[0009](2)回收0sRboh(L0C_0s01g25820)的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-0sRboh(L0C_0s01g25820)-0Eo
[0010](3)使用Bam HI和酶切pMD18-0sRboh(L0C_0s01g25820)_0E，回收OsRboh(L0C_0s01g25820)片段，同时用Bam HI和XbaI酶切PHB，回收后连接，转化感受态细胞，获得植物表达载体 PHB-OsRboh (L0C_0s01 g25820) -OE。
[0011]本发明的另一目的是公开水稻0sRboh(L0C_0s01g25820)-0E在叶色和育性改造中的基因工程应用。在水稻中过量表达0sRboh(L0C_0s01g25820)-0E的转基因植株的叶色变黄、过氧化氢含量升高、育性明显降低。该载体可作为一种潜在的工具应用在水稻分子育种和遗传改良上。
[0012]
【附图说明】
[0013](I)图1为PMD18T-0sRboh(L0C_0s01g25820)-0E的BamH I和Xba 頂每切图。
[0014](2)图2为PHB-0sRboh(L0C_0s01g25820)-0E的BamH I和Xba 頂每切图。
[0015](3)图3为转基因水稻植株的PCR鉴定图。
[0016](4)图4为转基因水稻植株呈现黄化苗表型;其中A为野生型，B为转基因水稻。
[0017](5)图5为转基因水稻植株呈现育性降低表型;其中A为野生型，B为转基因水稻。
[0018](6)图6为转基因水稻植株叶片中过氧化氢的染色，其中A为野生型，B为转基因水稻。
[0019]
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
[0021]实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、Ta qDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其余试剂均为国产分析纯;仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0022]实施例1:水稻PHB-0sRboh(L0C_0s01g25820)-0E载体的构建 (l)0sRboh(L0C_0s01g25820)基因的扩增
根据NCBI上公布的0sRboh(L0C_0s01g25820)全长cDNA (AK065117)序列，设计两端引物:
OsRboh-OE-F: AGATCTATGGCTGACCTGGAAGCAGGCATGG (Bam HI)
OsRboh-OE-R: CACGTGTTAGAAGTTCTCCTTGTGGAAATCA (Xba I)
以日本水稻基因组研究中心(RGRC)购得的质粒AK065117为模板，高保真酶KOD-PIus进行PCR 扩增获得0sRboh(L0C_0s01g25820)全长。PCR 反应条件为:94°C 5 min；94°C 30 s；56°C 30 s；68°C 3.0 min，35个循环;68°C 5 minoPCR产物用1.2%琼脂糖进行电泳检测，扩增片段大小约2718bp，与预期大小一致(图1)。
[0023](2)0sRboh(L0C_0s01g25820)片段的胶回收
对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。
[0024](3)0sRboh(L0C_0s01g25820)片段加尾
取1.5 ml灭菌的eppendorf管，依次加入回收的PCR产物14μ1、10Χ Taq DNA聚合酶缓冲液2yl、10mM dNTP 2yl、Taq DNA聚合酶2μ1;72°C处理45 1^11;先加0.18 mL无菌水，再加20μ1 3Μ醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，-20°C沉淀60 min，12，000rpm，4°C离心1min。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20yL无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于-20°C保存备用。
[0025](4)0sRboh(L0C_0s01g25820)片段的 T/A 克隆和测序
将回收片段连接到PMD18载体上，其具体步骤为:向1.5 ml离心管中分别加入= OsRboh(L0C_0s01g25820)片段的cDNA 5μ1、pMD18载体0.5μ1、10 X T4 DNA连接酶缓冲液 Ιμ?，Τ4DNA连接酶Ιμ?，加无菌水至ΙΟμΙ，用封口膜封好;置于16°C连接4-6h。将ΙΟΟμΙ感受态肠杆菌Ε.coli DH5a加入连接体系中混匀；混合液冰浴30 min，42°C热刺激90 s后，冰浴5 min；加入800μ1 LB液体培养基，37°C、200 rpm摇床培养45min使菌体复苏;培养结束后，常温3，
000rpm离心2 min收集菌体;在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时，使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养;挑取菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，收集菌体，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒口]\?)18-081^011(11)(:_0801825820)，具体方法为:向0.5 ml的离心管中分别加入:质粒DNA(50ng/yl)2yl、