带有一个可移动的检测模件的荧光检测系统和方法

专利名称：带有一个可移动的检测模件的荧光检测系统和方法
技术领域：
一般来说，本发明涉及荧光检测系统，更具体地说，涉及这样一种荧光检测系统，它具有一个用来与热循环器一起使用的可移动的激发/检测模件(module)。
背景技术：
在本技术领域中已经知道热循环器。在研究领域，医学领域和工业领域中，在产生和检测各种感兴趣的分子例如核酸序列的多种过程中采用这样的装置。可以与传统的热循环器一起进行的过程包括但不限于采用比如聚合酶链反应(PCR)的步骤的核酸的放大。采用这样的放大过程增加在核酸样品中存在的靶(或目标)序列的数量。
也已经知道用来检测在由热循环器处理的样品中靶分子的存在和/或浓度的多种技术。例如，可以使用荧光标记。荧光标记(或者荧光探针)一般是一种物质，当通过一种适当的电磁信号或辐射激励它时，它吸收该辐射，并且发出一种信号(通常是辐射，这种辐射例如通过波长可以与激励的辐射区分开)，当激励的辐射继续时，持续地发出该信号，即该物质发出荧光。一般将某些类型的荧光探针设计成仅只在靶分子存在(例如一种特别的核酸序列)时能起作用，使得来自一个样品的荧光响应表示靶分子的存在。其它类型的荧光探针与在反应中存在的双链(double-stranded)DNA的数量成比例地增加它们的荧光。典型地在放大反应设计成仅只在靶分子上进行的情况下使用这些类型的探针。
荧光检测法包括将包含荧光标记或探针的样品暴露给激励的辐射(也称为激发辐射)，比如适当波长的光源，从而激发该探针，并且产生荧光。采用一种适当的检测器比如光电二极管、光电倍增器、电荷耦合装置(CCD)，或者类似装置检测所发出的辐射。
在本技术领域中已经知道与带荧光标记的样品一起使用的荧光计。一种类型的荧光计是光学阅读器，比如Andrews等人在美国专利No.6043880中描述的光学阅读器。把一个包含样品阵列的样品板插入该光学阅读器中，光学阅读器将样品暴露给激发光，并且检测所发出的辐射。需要把样品板由热循环器移开限制了这种光学阅读器的使用，使得它很难监测放大过程的进展。
一种改进是把光学阅读器与热循环器集成在一起，从而可以分析样品板，而不用把它由热循环器移开或者中断PCR过程。在美国专利No.5928907，美国专利No.6015674，美国专利No.6043880，美国专利No.6144448，美国专利No.6337435和美国专利No.6369863中描述了这样的组合装置的示例。这样的组合装置在多种应用中是有用的，如例如在美国专利No.5210015，美国专利No.5994056，美国专利No.6140054，和美国专利No.6174670中描述的那样。
现有的荧光计有多种缺陷。例如，在某些已有的设计中，对于在阵列中的不同样品凹坑设置了不同的光源和检测器。光源和/或检测器之间的变化导致所检测的荧光响应由一个凹坑到下一个凹坑会有变化。替代地，可以将光源和/或检测器布置成与凹坑中的一个以上的凹坑处于光学连通状态，到每个凹坑和/或离开每个凹坑有不同的光学路径。由于有不同的光学路径，所检测的荧光响应由一个样品凹坑到下一个样品凹坑会有变化。为了补偿这样的变化，必须单独地对每个样品凹坑的响应进行校正。随着在阵列中样品凹坑的数目增加，这成为一件越来越耗费时间的任务，并且校正中的误差会在后来的测量中引入显著的误差。
此外，一般将已有的荧光计设计成光源和检测器是该仪器的固定部分。这限制了使荧光计适应于不同应用的实验能力。例如，检测不同的荧光标记通常要求使用不同的光源和/或检测器。许多已有的荧光计使得实验人员很难重新布置光源或检测器，因此限制了可以使用的荧光标记的种类。
也很难同时进行在一个样品中(或者在不同样品中)存在的多个不同的荧光标记的测量。如上所述，为了使在一次化验中获得的数据达到最大化，实验人员常常采用多个产生荧光标记的试剂，这些试剂有不同的激发和/或发射波长。适宜于将每种形成标记的试剂设定到一个不同的靶序列上，从而原则上可以在同一样品中检测多个靶序列。然而，现有的荧光计不能容易地进行这样的多标记的实验。许多荧光计设计成用于激发和发射波长的单一组合。其它的荧光计设有多个光源和检测器，从而可以检测多个标记；然而，这些构形常常一次只能探查一个标记，这是因为一个标记的激发波长可能与另一个标记的发射波长重叠；进入检测器的激发光可能产生不正确的结果。通常不能平行地检测多个标记，从而减慢了数据收集过程。
因此，希望有一种可以克服这些缺点的用于热循环器的改进的荧光计。

发明内容
本发明的实施例提供了在热循环设备中的荧光检测。按照本发明的一个方面，一种用来分析位于热循环器中的多个凹坑中的样品的荧光检测设备包括安装到该热循环器上的支承结构，以及可移动地安装在该支承结构上的检测模件。该检测模件包括激发光发生器和发射光检测器，它们两个都设置在检测模件内。当把支承结构安装到热循环器上、并且把检测模件安装在支承结构上时，检测模件可移动，从而使它的位置与多个凹坑中不同的凹坑处于光学连通状态。
按照本发明的另一方面，检测模件可以包括两个或多个激发光发生器和两个或多个发射光检测器，它们布置成形成两个或多个激发/检测对。在一个实施例中，激发/检测对布置成可以同时使得每个激发/检测对的位置与多个凹坑中不同的凹坑处于光学接触状态。在一个替代的实施例中，激发/检测对布置成使得当把激发/检测对中的第一对的位置与多个凹坑中任何一个凹坑处于光学接触状态时，激发/检测对中任何其它对的位置不与多个凹坑中任何一个凹坑处于光学接触状态。在某些实施例中，检测模件可拆卸地安装在支承结构上，从而使得使用者可以用不同的检测模件替换该检测模件。
按照本发明的又一方面，提供了一种用来检测靶分子在溶液中存在的方法。制备多个样品，每个样品中包含适宜于结合到靶分子上的荧光探针。把每个样品放置在热循环设备的多个样品凹坑中的相应的一个凹坑中，该热循环设备有可移动地安装在其中的检测模件，该检测模件包括激发/检测通道，该激发/检测通道包括设置在检测模件内部的激发光发生器，以及设置在检测模件内部的发射光检测器。采用该热循环设备激发反应，并且，对多个样品凹坑进行扫描，通过移动检测模件、并且启动激发/检测通道检测荧光响应。在进行扫描的过程中，使得检测模件移动，从而顺序地使激发/检测通道的位置与多个凹坑中每个凹坑处于光学连通状态。在检测模件包括多个激发/检测对或通道的情况下，可以平行地或者顺序地激活这些通道。
下面的详细描述与附图一起将使得对本发明的本质和优点有更好的理解。


图1是按照本发明的一个实施例的热循环设备的透视图；图2是用于按照本发明的一个实施例的热循环设备的盖组件的部件分解图；图3是用于按照本发明的一个实施例的热循环设备的荧光计组件的底视图；图4是按照本发明的一个实施例的检测模件的顶视图；图5A-B是按照本发明的另一个实施例的检测模件的底视图；图6是用于按照本发明的一个实施例的检测模件的激发/检测对的示意图；图7是一个框图，示出了用于按照本发明的一个实施例的热循环设备的盖组件的电路连接；以及图8是使用有按照本发明的一个实施例的荧光检测系统的热循环器的过程的流程图。
具体实施例方式
现将参考着附图描述本发明的一个示例性设备的实施例，在这些图中相同的附图标记表示相对应的部件。也将描述使用该设备的方法。应当理解，在这里示出和描述的实施例是说明性的，并且对本发明不构成限制。
I.示例性设备图1是按照本发明的一个实施例的热循环设备100的透视图。设备100包括一个底座单元110和一个盖组件112。底座单元110可以是传统的设计，通过传统的电子部件(未示出)比如可编程的处理器，时钟以及类似件提供对于热循环过程的供电和控制功能。底座单元110也提供一个用户接口116，它可以包括一个键盘118和一个LCD显示屏120，使得使用者可以控制和监视热循环器的运行。通过一个电源电缆121把底座单元110连接到外部电源(例如标准的120伏交流电源)上。底座单元110的某些示例包括由本申请的受让人MJ Research，Inc.公司销售的DNA Engine，DyadTM，TetradTM热循环器。
盖组件112包括设置在盖122内的一个样品单元和一个荧光检测设备；下面将描述这些部件。盖122有一个把手124，以帮助把它放在底座单元110上以及由底座单元110移开，而且盖122还有通气孔126。盖122对在盖组件112内部的部件提供光学隔离和热隔绝。
图2是盖组件112内部的部件分解图。示出了一个样品单元202，一个盖加热器204，以及一个荧光计组件206。样品单元202包括布置在规则的阵列中的多个样品凹坑210(例如8×12格点)。在一个实施例中，每个样品凹坑210保持一个可移去的反应容器(未示出)，比如一个管，它包含要被检验的核酸样品，连同适当的PCR反应物(缓冲剂，引发剂(primers)和探针，核苷酸，以及类似物)，包括适宜于设定到靶核酸序列上或者以其它方式对靶核酸序列的存在作出响应的至少一种荧光标记或探针。反应容器最好设有透明的样品帽盖(未示出)，这些帽盖牢固地配装在容器的顶部上，以防止在处理过程中样品的交叉污染或者溢出。也可以以其它方式密封反应容器，包括使用薄膜比如MicrosealB(由MJ Research，Inc.公司制造)，腊产品比如Chill-outTM(由MJ Research，Inc.公司制造)，或者矿物油。在一种替代的构形中，使用一个可移去的样品盘(未示出)，该样品盘在与样品凹坑210相对应的位置保持一个或多个不同的样品。也可以以上述的方式中任何一种方式把样品盘密封。
样品单元202也包括加热件(例如Peltier效应热电装置)，热交换件，用于把加热件连接到底座单元110上的电连接件，以及机械连接件。这些部件(未示出)可以是传统的设计。样品单元202也通过多股线的电缆212为盖加热器204和荧光组件206提供电连接，该电缆可拆卸地连接到连接器214上。
盖加热器204具有从中穿过的孔220，与样品凹坑210的尺寸和间隔相匹配，还有以电子学方式控制的加热件(未示出)。盖加热器204连接到盖122上。连接机构(未示出)最好是可移动的(例如可以通过一个铰链把盖加热器204装接到盖122上)，为的是当把盖122由样品单元202移去时，可以接近荧光计组件206。当盖122处于样品单元202上的位置时，支承件224将盖加热器204保持在其位置。最好支承件224的下部226设计成朝向样品单元202对盖加热器204施加压力，从而减小在设备100运行过程中样品蒸发的可能性。这种加压也使得可以使用有不同尺寸的反应容器。使用盖加热器204控制反应容器的样品凹坑210的样品帽盖(或其它密封件)的温度，为的是防止在热循环器的运行过程中在帽盖上形成凝结。
盖加热器204最好包括定位在孔220中的选定的孔之间或者设置在离开孔的其它位置比如靠近盖加热器204的周边的位置的一个或多个校准件222。校准件222提供已知的荧光响应，并且可以使用它们校准在荧光计组件206中的荧光检测器。可以例如将校准件222做成在玻璃或塑料基底上一层荧光涂层，或者它们可以包括一种带有在其中浸渍了染料的塑料，荧光玻璃，或者荧光塑料比如聚醚酰亚胺(PEI)构成。可以将中密度或者其它类型的滤光器放置在荧光材料上，为的是避免使荧光检测器饱和。一般说来，可以使用任何材料，只要它的荧光特征在光照射(光漂白)和加热的时间内足够稳定就可以。在实用的范围内，最好使温度对荧光响应的影响减到最小。在设置多个校准件222的情况下，对于校准件中的不同件可以使用不同的材料。在一个替代的实施例中，可以省去盖加热器204，并且可以将校准件222设置在样品单元202的表面上。
样品单元202和盖加热器204可以是传统的设计。适用的设计的示例包括由本申请的受让人MJ Research，Inc.公司销售的多种AlphaTM模件的样品单元和盖加热器部件。
荧光计组件206包括固定地安装在盖122内部的一个支承框架或平台230。将一个往复移动件232可移动地安装在支承框架230的下侧面上，该往复移动件保持一个检测模件234。往复移动件232可以在两个方向上移动，从而将检测模件234定位，通过盖加热器204中对应的孔220与样品单元202中的样品凹坑210中的不同的凹坑在光学上连通。最好支承框架230和支承件224的尺寸确定成当把盖122放置在底座单元110中并且把盖关闭起来时，检测模件234保持在紧靠着盖加热器204的位置；本领域技术人员将理解，这样的布置减小了样品凹坑与检测模件之间的光损失。
图3是荧光计组件206的底视图，示出了往复移动件232和检测模件234的可移动的安装。在这个实施例中，采用由步进马达驱动的平移台使往复移动件232运动到所要求的位置，其中检测模件234可拆卸地连接到此往复移动件上。具体地说，支承平台230有一个x轴线的步进马达302和一个安装到其上的丝杠304。步进马达302运行使丝杠304转动，从而使平移台306沿着x方向运动(由箭头表示)。最好设置限位开关308，以将平移台306的运动限制在一个适当的范围以内，此运动范围足够大，容许检测模件234的位置可与凹坑中的任何一个凹坑处于光学接触状态，同时防止平移台306与其它的系统部件比如步进马达302接触。
平移台306有一个y轴线的步进马达316和一个安装到其上的丝杠318。步进马达316使丝杠318转动，从而使平移台306沿着y方向运动(由箭头表示)。最好设置限位开关320，将平移台306的运动限制在一个适当的范围以内，此运动范围足够大，容许检测模件234的位置可与凹坑中的任何一个凹坑处于光学接触状态，同时防止平移台306与其它的系统部件比如步进马达316接触。
步进马达302、316，丝杠304、318，以及限位开关308、320可以是大致传统的设计。将会认识到，可以用其它的可移动安装件替代。例如，替代直接把马达连接到丝杠上，可以使用间接的连接，比如链驱动或者皮带驱动。也可以使用链驱动，皮带驱动，或者其它的驱动机构而不用丝杠，例如通过把平移台装接到链，皮带，或者其它的驱动机构上使检测模件定位。也可以使用其它类型的马达比如伺服马达或线性马达。对于不同程度的自由度可以使用不同的驱动机构。
往复移动件232通过连接器330，331固定住检测模件234。连接器330，331的设计可以变化，这些连接器构形成把检测模件234支承在往复移动件232的下侧面上，并且使检测模件234在往复移动件232的下侧面上对准。最好使得连接器适宜于容易地插入检测模件234，并且将检测模件234移开，从而可以容易地更换检测模件。在一个实施例中，连接器330为一个圆柱部件(未示出)提供安装，圆柱部件可枢转地保持住检测模件234的边缘，而连接器331包括安装在往复移动件232上的球柱塞，这些球柱塞可插入到检测模件234上的对应的插座中。也可以在往复移动件232与检测模件234之间设置电连接件(未示出)，如下面将描述的那样。
图4是检测模件234的顶视图。检测模件234包括连接到往复移动件232的下侧面上的对应的连接器330上的配装件420，从而把检测模件234固定在其位置，使得它与往复移动件234一起作为一个单元移动。检测模件234也包括一个连接到往复移动件232的下侧面上的对应的电连接器上的电连接器424，从而可以将控制信号和读出信号提供给检测模件234，并且由检测模件234获得控制信号和读出信号。
图5A是检测模件234的一个实施例的底视图，示出了四个开孔502，504，506，508，这些开孔用于设置在检测模件234的本体内部的四个独立控制的荧光激发/检测通道(也被称为“激发/检测对”)。下面将描述激发/检测通道的示例。开孔502，504，506，508的间隔与样品凹坑210的间隔相对应。因此，当开孔502位于与样品凹坑210中的一个凹坑处于光学连通状态时，开孔504，506和508中的每个开孔与样品凹坑210中的不同的一个凹坑处于光学连通状态。开孔502，504，506，508可简单地是穿过检测模件234的底表面的孔，或者它们可以由对于它们相应的通道的激发光和检测光的波长高度透明的任何材料构成。
图5B是按照本发明的另一个实施例的检测模件234’的底视图。在这一实施例中，设置了四个开孔512，514，516，518，但是，它们以交错的方式布置，从而一次仅只有一个开孔可以与样品凹坑中的任何一个处于光学连通状态。这种构形对于减少激发/检测对之间的交叉影响是有用的。
图6是一个示意图，示出了一种按照本发明的一个实施例用于一个激发/检测通道(或激发/检测对)600的光学部件的构形。检测模件234可包括一对或者多对激发/检测对600，每一对提供一个独立的荧光检测通道。激发/检测对600设置在不透明的壁602的内部，这些不透明的壁提供与可能包括在检测模件234中的其它激发/检测对的光学隔绝，也提供与外部光源的光学隔绝。一个激发光路604包括发光二极管(LED)或者其它的光源606，滤光器608，透镜610，以及分光器612。检测光路620包括分光器612，滤光器624，透镜626，以及光二极管或其它的光检测器628。最好将分光器612选择成对于激发光的波长高度透明，而对检测(荧光响应)波长的光高度反射。
激发光路604设置成把所希望波长的激发光引导进入保持在样品块体202的样品凹坑210中的一个反应容器616中。所希望的波长取决于在反应容器616中包括的具体的形成荧光标记的试剂，并且通过选择适当的LED 606和滤光器608控制该波长。由不透明的壁602中的开孔502和穿过盖加热器204的孔220提供激发/检测对600与反应容器616之间的光学连通，如上面描述过的那样。为了传输到激发/检测对600的光和由激发/检测对600传输出的光达到最强，在运行过程中最好使得开孔502与盖加热器204之间的距离较小。
进入反应容器616的激发光激发其中的荧光标记或探针，这些标记或探针发出荧光，从而产生不同波长的光。这些光中的某些光沿着检测光路620离开反应容器616，并且通过开孔502。分光器612引导荧光中的相当一部分通过滤光器624和透镜626，其中，滤光器把激发频率过滤掉，而透镜把光聚焦到光二极管628的活性表面上。光二极管628对入射的光作出响应产生电信号。通过读出信号路径630将这个电信号传输到电路板634，线路板将信号发送到电连接器424，以便读出。线路板634和/或信号路径630也可以包括其它部件，比如前置放大器，为的是对来自光二极管628的电信号进行整形和加工。
可以通过经过连接器424接收到的信号控制LED606和光二极管628，如由相应的控制信号路径636，638表示的那样。用于LED606的控制信号可以在要求的时刻激活LED606和使LED606停止工作；用于光二极管628的控制信号可以在要求的时刻激活光二极管628和使光二极管628停止工作，调节增益参数，等等。
尽管图6示出了一对激发/检测对600，但是应当理解，检测模件234的一个实施例可以包括任何数量的这样的激发/检测对，每一对最好与其它的对处于光学隔绝的状态，并且有它自己的开孔，用来与样品凹坑实现光学连通(例如图5的开孔504，506，508)。独立控制多个激发/检测对，并且独立读出这些对，但是，可以把它们各自的控制和读出路径耦合到电路板634上。
激发/检测对的构形可以与所示出的不同，激发和检测光路可以包括附加的部件，包括较少的部件，或者包括所要求的部件的任何组合。可以改变光学系统使它适合特定的应用(例如在不包括盖加热器204的实施例中，光学路径可以较短)，并且可以使用任何数目的部件和部件的组合，包括但不限于透镜，分光器，反光镜，以及滤光器。尽管LED提供了一种紧凑和可靠的光源，但是不排除使用其它类型的相干光源或者非相干光源，比如激光二极管，闪光灯，等等。类似地，检测器不限于光二极管；且可以用任何类型的光探测器替代，这包括光电倍增管，以及电荷耦合装置(CCD)。最好每个激发/检测对构形成一个独立的组件，为了使它工作仅只需要外部的电连接。因为由一个实施例到另一个实施例不能改变激发和检测光路的长度，所以希望在制造过程中把每个激发/检测对600的各种光学部件固定地安装在检测模件234内部，并且使它们达到最佳，从而在使用过程中不需要作进一步的调节。
图7是一个方框图，示出了盖组件112的电连接。在盖组件112中安装一个主处理板702。主处理板702包括一个主信号处理器704，一个步进马达驱动单元706，一个用于电源的连接件708，以及一个用于外部计算机(例如个人计算机，或者PC)的连接件710。主处理板702也提供用于电缆212的连接器214，其将电信号传输到盖122、并且传输来自盖122的电信号。
盖122包括一块次处理板720，其使主处理板702与步进马达302，316之间以及与往复移动件232之间的连通变得容易。次处理板720包括用于电缆212的连接器722，把电缆726连接到往复移动件232上的连接器724，以及用于电缆736，738的连接器732和734，这些电缆将控制信号提供给x和y方向的步进马达302，316。在次处理板720中的传输路径(未示出)各种连接器之间建立适当的信号连接。
使用电缆726连通用于检测模件234的控制信号，比如启动单个的光源或者使单个的光源停止工作，并且接收来自包括在检测模件234中的光检测器的信号。在往复移动件232上设置电连接器730，用来把信号通到检测模件234、并且传输来自检测模件234的信号。当把检测模件234安装在往复移动件232上时，电连接器730接受在检测模件234的顶表面上的配接的连接器424。在一个替代的实施例中，电缆726可以直接装接到检测模件234上。
如上面提到过的那样，主处理板702提供了到外部计算机(未示出)的连接件710。可以使用外部计算机控制往复移动件232的运动和检测模件234的工作，以及用来读出和分析由检测模件234获得的荧光数据。
如上面提到过的那样，检测模件234设计成独立整装式的，并且可以从往复移动件232拆下。这可考虑一种可改变构形的荧光系统，在这种系统中，实验人员可以如所想要的那样改变检测模件，以进行不同的测量。例如，可以使得不同的检测模件对于不同的形成荧光标记的试剂(或试剂的组合)达到最佳。如果实验人员希望研究一种不同的试剂，她可简单地安装适当的检测模件。安装是一件把所想要的检测模件234的顶部上的电连接器424和机械连接器420装接到往复移动件232的底侧面上的对应的连接器上的事情。在某些实施例中，连接器设计成使得当把机械连接接合起来时自动地实现电连接。如上面注意的那样，最好可移动地安装盖加热器204，从而可以接近荧光组件230，使得实验人员可以改变检测模件。
将可理解的是，在这里描述的装置是说明性的，变化和改进是可能的。例如，底座和样品单元可设计成一个集成系统，或者进一步把它们分成较小的模块部件。荧光计组件不需要安装到盖中或者以另外的方式集成到盖中，只要可以把它安装在相对于样品凹坑的一个固定位置即可。可以使用任何机构使检测模件可移动，从而使它的位置与样品凹坑中的不同的凹坑处于光学连通状态，而不限于平移台或者步进马达。检测模件可以包括可作为独立的检测通道操作的任何数目(一对或多对)的激发/检测对，并且不同的对可设计成检测同一个荧光探针或者检测不同的荧光探针。在一个替代的实施例中，检测模件包括一排激发/检测对，它们带有布置成与一排样品阵列对应的光学窗口，并且使得检测模件可以在一个方向上移动，以访问阵列中不同的列。
外部计算机也是可选的，可以将外部计算机功能中的任何功能集成到热循环器装置中；相反，可以通过在外部计算机上操作实现热循环器的控制功能，从而对于整个设备提供一个单一的控制装置。在一个实施例中，使用外部计算机控制检测模件234相对于样品凹坑的位置以及光源和检测器的工作。此外，任何外部计算机可以是特殊目的的控制和信号处理装置，也可以是通用目的的计算机，比如PC。
II.使用方法可以通过检测荧光的大小使用在这里描述的设备，以检测在放大反应中产生的放大产物的量。可以使用多种放大技术确定在DNA或RNA样品中存在的靶序列的数量。在本技术领域中已经很好地知道、并且广泛地使用这样的技术，这样的技术包括核酸扩增子(拷贝)的酶合成，这些核酸拷贝包含与被放大的序列互补的序列。这些技术包括但不限于聚合酶链反应(PCR)，RT-PCR，链置换扩增(SDA)，基于放大反应的转录，连接酶链反应(LCR)，以及其它技术(例如见Dieffenfach & Dveksler，PCR PrimerA Laboratory Manual，1995；美国专利4683195和4683202；PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications，Innis等人，eds，1990；Walker，等人，Nucleic Acids Res.20(7)1691-6，1992；Wa1ker，PCR MethodsAppl 3(1)1-6，1993；Phyffer，等人，J.Clin.Microbiol.34834-841，1996；Vuorinen，等人，J.Clin.Microbiol.331856-1859，1995；Compton，Nature 350(6313)91-2，1991；Lisby，Mol.Biotechnol.12(1)75-99，1999；Hatch等人，Genet.Anal.15(2)35-40，1999；以及Iqbal等人，Mol.Cell Probes13(4)315-320，1999)。当在样品中存在的靶序列的数量非常少时，核酸放大特别有利。通过放大靶序列并检测所合成的扩增子，可以显著地改进检验的灵敏度，这是因为在检验的开始只需要靶序列的较少的拷贝，从而更好地确保在属于器官和感兴趣的病毒的样品中核酸的检测。
可以在反应完成之后或者实时地(即，基本上连续地)进行放大产物的测量。如果在放大反应完成之后进行累积的放大产物的测量，那么，可以在放大反应之后添加检测试剂(例如，荧光探针)。替代地，可以在放大反应之前或者在放大反应期间添加荧光探针，因此可以或者在放大反应完成之后或者实时地进行放大产物的测量。如果实时地测量放大产物，可以通过在假设指数放大的条件下确定信号超过一定阈值、并且返回到初始的拷贝数的循环数估计出初始的拷贝数。
A.荧光探针有很多使用荧光探针的格式可供使用。这些格式常常以荧光共振传能(FRET)为基础，并且包括分子信标，以及TaqMan探针。FRET是供体分子与受体分子之间的一种与距离有关的相互作用。供体分子和受体分子是荧光团。如果荧光团有相互重叠的激发和发射光谱，那么，在非常近的距离内(典型地大约10-100埃)施主荧光团的激发可以传递到受体荧光团。结果，供体分子的寿命缩短，并且它的荧光猝灭，而受体分子的荧光强度会增强，并且荧光会去偏振。当供体分子的激发态的能量传递到非荧光团的受体分子上时，供体分子的荧光猝灭，而后面没有跟着产生受体分子的荧光发射。在这种情况下，受体分子的功能是作为一种猝灭反应物。
用于实时的PCR的一种以PRET为基础的格式采用被称为“分子信标”的DNA探针(见例如Tyagi等人，Nat.Biotech.1649-53，1998；美国专利No.5925517)。分子信标有一种发夹结构，其中猝灭染料和报导基因染料在发夹的柱的端部彼此紧密接触。当与一种互补的序列杂化时，发夹结构的环变成双链的，并且迫使猝灭染料与报导基因染料分离开，因此产生荧光信号。一种有关的检测方法采用发夹的引发剂作为荧光探针(Nazarenko等人，Nucl.Acid Res.252516-2521，1997；美国专利No.5866336；美国专利No.5958700)。可以以这样的方式设计PCR的引发剂仅只当引发剂有线性结构即可以结合进PCR产物中时，才有荧光信号产生。
也可以使用一种荧光团的5′核酸酶化验，一种TaqMan化验在溶液中检测放大产物。见Holland等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.887276-7280，1991；美国专利No.5538848，5723591，以及5876930。将TaqMan探针设计成与所要求的PCR产物内的一个序列杂化。TaqMan探针的5′端部包含荧光报告基因染料。把该探针的3′端部阻挡，防止探针伸展，并且该端部包含一种染料，此染料将使5’荧光团的荧光猝灭。在后来的放大过程中，如果在反应中存在带有5’外切核酸酶活性的聚合酶，会使5’荧光标记分裂。5’荧光团的激发会导致荧光增强，可以检测到这种增强。
除了发夹和5′核酸酶PCR化验以外，也已经发展了采用FRET机制的其它的格式。例如，通过连接到两种染料上形成供体/受体染料对已经对单链的信号引发剂实现了改进，其方式使得第一种染料的荧光被第二种染料猝灭。这种信号引发剂包含一个限制部位(美国专利No.5846726)，这使得当被杂化到一个靶上时适当的限制酶在引发剂上形成刻痕。这种分裂将两种染料分开，并且由于猝灭的减弱将观测到荧光的变化。也已经描述了把低聚核苷酸耦合到配位体上的非核苷酸连接反应剂(美国专利No.5696251)。
可以采用荧光测量读数监测的其它放大反应包括通过测量结合到放大产物上的结合DNA的染料的量进行定量的那些反应。这样的化验使用荧光染料例如溴化乙锭或者SYBR Green I(MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR；美国专利No.5436134和5658751)，当把它们添加进DNA中时荧光增强(例如见美国专利No.5994056和6171785)。在Morrison等人(Biotechniques 24，954-962，1998)的文章中也描述了为了这样的目的使用SYBR Green I。荧光的增强反映出放大反应产生的双链DNA的数量的增加。
其它的荧光探针包括无机分子，有机分子和/或无机分子的多分子混合物，晶体，杂聚合物，以及类似物。例如，为了耦合到生物分子上可以很容易地衍生出被包封在一个硅壳体中的CdSe-CdS芯壳纳米晶体(Bruchez等人(1998)Science，2812013-2016)。类似地，为了在超灵敏生物检测中使用，已经把高荧光量子点(用硫化锌盖住的硒化镉)共价地耦合到生物分子上(Warren and Nie(1998)Science，2812016-2018)。
也可以采用设备100进行多重化验(multiplexassays)。多重PCR造成在同一反应中多个聚核苷酸碎片的放大。例如见PCRPRIMER，A LABORATORY MANUAL(Dieffenbach，ed.1995)Cold SpringHarbor Press，157-171页。例如，可以在同一反应容器中平行地添加和放大不同的靶模板。多重化验典型地包括使用不同的荧光标记检测被放大的不同靶序列。
B.PCR条件和部件示例性PCR反应条件典型地包括两步骤循环或者三步骤循环。两步骤循环有一个变形步骤，接着一个杂化/加长步骤。三步骤循环包括一个变形步骤，接着一个杂化步骤，再接着一个单独的加长步骤。在把引发剂杂化到靶序列上并且用一种聚合酶延长引发剂的条件下进行聚合酶反应。选择放大反应循环的条件使得引发剂专门杂化到靶序列上并且被延长。
成功的PCR放大要求高产率，高选择性，以及在每一步骤的可控的速率。产率，选择性和反应速率一般取决于温度，且最佳的温度取决于聚核苷酸，酶和在反应系统中其它的成分的组成和长度。此外，不同的温度可能对于不同的步骤是最佳的。最佳的反应条件可以变化，这取决于靶序列和引发剂的组成。热循环器比如设备100提供了对反应条件的必要控制，从而对于一种特定的化验使PCR过程达到最佳。例如，可以通过选定要保持的温度，每个循环的时间长短，循环的数目，以及类似参数对设备100进行编程。在某些实施例中，可以对温度梯度进行编程，从而可以将不同的样品凹坑保持在不同的温度，等等。
在本技术领域中已经很好地知道包含碱基连接的或者终端连接的荧光剂和猝灭剂的荧光低聚核苷酸(引发剂或探针)。例如可以由Life Technologies(Gaithersburg，MD)，Sigma-Genosys(TheWoodlands，TX)，Genset Corp.(La Jolla，CA)，或者SyntheticGenetics(San Diego，CA)等公司获得这类低聚核苷酸。通过对与连接到基上的反应团合成的低聚核苷酸的合成后的改性把连接碱基的荧光剂结合到低聚核苷酸中。本领域技术人员将认识到，有大量不同的荧光团可供使用，包括可以由市场比如可以由MolecularProbes，Inc.，Eugene，OR公司获得的，以及本领域技术人员知道的其它荧光团。有用的荧光团包括荧光素，异硫氰酸酯荧光素(FITC)，羧基四氟荧光素(TET)，NHS-荧光素，5和/或6-羧基荧光素(FAM)，5-(或6-)碘乙酰氨基荧光素，5-{[2(和3)-5-(乙酰巯基)-琥珀酰]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)，以及其它的荧光素衍生物，若丹明，Lissamine若丹明B硫酰氯，Texas红硫酰氯，5和/或6羧基若丹明(ROX)，以及其它的若丹明衍生物，香豆素，7-氨基-甲基-香豆素，7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)，以及其它的香豆素衍生物，BODIPYTM荧光团，Cascade BlueTM荧光团，比如8-甲氧基苯-1，3，6三磺酸三钠盐，Lucifer黄荧光团，比如3，6-二磺酸-4-氨基-萘亚酰胺，藻胆蛋白衍生物，Alexa荧光染料(可以由Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR公司获得)，以及本领域技术人员知道的其它荧光团。对于有用的荧光团的一般目录也参见Hermanson，G.T.，BIOCONJUGATE TECHNIQUES(Academic Press，San Diego，1996)。
按照已经知道的方法设计用于放大反应的引发剂。例如，可以使用在可以由市场获得的软件或者用户软件中实现的方法设计用于放大靶序列的引发剂。典型地，引发剂的长度至少有12个碱基，更经常有15，18或20个碱基。典型地把引发剂设计成使得参加特定反应的所有引发剂的熔化温度彼此在5℃以内，最可取地在2℃以内。进一步把引发剂设计成避免在它们自己身上实现引发或者彼此引发。引发剂的浓度应该足以结合到要被放大的所有靶序列上，从而可以精确地测量被放大的序列的数量。本领域技术人员将认识到，将按照引发剂的结合亲和力以及要被结合的序列的数量改变引发剂的浓度大小。典型的引发剂浓度的范围将由0.01微摩尔到0.5微摩尔。
本领域技术人员还将认识到，希望设计缓冲条件，以满足所有感兴趣的反应的功能。因此，可以将缓冲条件设计成支持放大反应以及与由探针产生信号有关的任何酶反应。可以通过单独地以及结合起来检查反应对一种具体的反应缓冲液检查它支持各种反应的能力。反应的成分比如盐或者镁的浓度也可能影响引发剂或者检测探针处理靶核酸的能力。这些可以按照在技术中众所周知的指导例如Innis等人(见上文)进行调节。
C.示例性的PCR过程图8是使用设备100进行核酸放大和测量过程800的流程图。在这个示例中，设备100控制一个PCR放大过程，并且在核酸样品中检测多个靶序列的存在。
在步骤802，准备反应容器616。准备包括将反应成分放入容器中，并且将容器密封，以防止溢出或交叉污染。反应成分包括缓冲液，靶核酸，适当的引发剂和探针，核苷酸，聚合酶，以及可选的附加成分。在一个实施例中，包括四个荧光探针，每个探针适宜于检测一种不同的靶序列，并且一个具体的反应容器可以包括任何一个或者多个荧光探针。每个荧光探针最好对不同入射波长的光作出响应，并且发射出不同波长的光。
在步骤806，检测模件234安装在往复移动件232上。如上面所要求的那样，检测模件234可以包括任何数目的检测通道(即，激发/检测对)。在一个实施例中，检测模件234包括四个检测通道。使每个通道对于在反应容器616中包括的荧光探针中不同的一个探针达到最佳。
在步骤808，将反应容器616放置到样品单元202的样品凹坑210中。在步骤810，关闭盖组件112，并且将盖组件放置在底座单元110中。
在步骤812，校准检测模件234的每个通道。通过使步进马达302，316工作将检测模件234定位，使得它的通道中的至少一个通道与校准位置222处于光学连通状态进行校准。如上面描述过的那样，每个校准位置提供已知的荧光响应。因此，可以使用校准测量对于检测器响应的变化或起伏校正后来的样品测量。在本技术领域中已经知道大量的校准技术。在检测模件234有多个通道的情况下，可以独立地对每个通道进行校准。
在步骤814，进行PCR循环。一般说来，步骤814包括使底座单元110工作，以调节样品单元202的温度，从而将反应容器在所要求的温度保持所要求的时间长度，完成两步骤或者三步骤PCR循环。可以通过接口116或者通过一台外部计算机控制底座单元110。
在步骤816，荧光计组件206扫描并访问反应容器616。最好由一台外部计算机控制荧光计组件206的工作，并且与底座单元110的工作同步，从而可以将测量确切地与PCR过程中特定的时间相对应。
更具体地说，在步骤816a，使步进马达302，316或者其它的运动装置工作，以将检测模件234定位，使得四个检测通道中的每个通道通过各自的光学窗口502，504，506，508与样品凹坑210中一个不同的凹坑处于光学连通状态。在步骤816b，启动对于每个通道的LED或者其它的光源(闪光一个很短的时间)，激发荧光。在一个实施例中，使不同通道的LED平行地工作；在一个替代的实施例中，使它们顺序地工作，从而避免由一个通道反射的LED光在另一个通道的光探测器中产生错误的信号。
在步骤816c，用对应的光二极管或者通道中其它的检测器检测产生的荧光，把荧光信号读出到外部计算机中。可以以多种方式读出检测器。例如，可以检测峰值信号，可以在一定的时间间隔内将信号积分，或者可以测量在LED已经关断后荧光信号的衰减。
最好重复步骤816a-c，每次改变检测模件的位置，从而检测模件234的每个通道逐渐地访问样品凹坑210中的每个凹坑。在一个实施例中，对于样品凹坑96中的每个凹坑扫描、并访问四个通道花费大约15秒钟。外部计算机最好执行一个程序(例如由MJResearch，Inc.公司销售的the Opticon Monitor程序)，这使得使用者在收集数据时可以以图像的形式和/或数据表格的形式看到测量数据。在本技术领域中已经知道这样的程序。一个示例包括由MJ Research，Inc.公司销售的the Opticon MonitorTM程序。
可以对于任何数目的反应循环重复步骤814和816。本领域技术人员将认识到，可以使用过程800的实时荧光测量检测每种靶序列的存在，并且将它们定量。也可以使用这样的测量用于一些目的，比如确定反应速率和为了改进效率调节反应参数，以及在一种特别的实验中(例如当已经产生出足够数量的靶序列时)确定什么时间不再需要附加的反应循环。
将会认识到，过程800是说明性的，它的变化和改进是可能的。被描述为顺序进行的步骤可以平行地进行，步骤的次序可以改变，可以改变这些步骤，或者把它们结合起来。例如，可以在PCR循环期间的任何一点进行荧光测量，也可以在每个PCR循环期间进行多次测量(包括基本上连续地对样品凹坑进行扫描)，或者一直到某个数目的PCR循环之后不进行测量。在单一的反应容器中可以使用任何数目的可以区分的荧光探针，并且，可以使得检测模件适宜于至少包括与使用的探针数目那样多的通道。在某些实施例中，检测模件包括对于同一探针达到最佳的多个通道。这样可以缩短扫描时间，这是因为为了访问一个特定的样品凹坑仅只需要使用这些通道中的一个通道。
此外，如上面提到过的那样，在一个替代的实施例中，可以把检测模件234的各个通道布置成当它的通道之一与一个样品凹坑210处于光学连通状态时，其它通道不处于这种状态。这种安排可以实现运行的一种“跨过(flyover)”模式，在这种模式中，在凹坑上描述通过期间检测模件234基本上连续地运动。因为一次仅只一个样品凹坑能够接收到激发光，所以减小了通道之间的交叉干扰。
结论尽管已经关于具体的实施例描述了本发明，但是，本领域技术人员将认识到，大量的改型是可能的。例如，可以使得在这里描述的荧光检测组件适宜于与范围广泛的热循环系统一起使用，并且可以按照特定仪器的设计由任何方向(例如由上面或者由下面)访问样品凹坑。此外，可以使得系统适宜于检测很宽范围的有生物兴趣的分子，这些分子可以被一种荧光标记或探针鉴别；不限于核酸，也不限于任何特定的放大过程。
因此，虽然已经关于具体的实施例描述了本发明，但是将会认识到希望本发明覆盖在下面的权利要求书的范围以内的所有改型和等价物。
权利要求
1.一种用来分析位于热循环器中的多个凹坑中的样品的荧光检测设备，所述设备包括可安装到所述热循环器上的支承结构；以及可移动地安装在所述支承结构上的检测模件，所述检测模件包括设置在所述检测模件内部的激发光发生器；以及设置在所述检测模件内部的发射光检测器；其中，当所述支承结构安装到所述热循环器上、并且所述检测模件安装在所述支承结构上时，所述检测模件可移动，从而使它的位置与多个凹坑中的不同的凹坑处于光学连通状态。
2.按照权利要求1所述的荧光检测设备，其特征在于，所述检测模件包括多个所述激发光发生器和多个所述发射光检测器，把它们布置成形成多个激发/检测对。
3.按照权利要求2所述的荧光检测设备，其特征在于，每个所述发射光检测器构形成检测不同的波长范围。
4.按照权利要求2所述的荧光检测设备，其特征在于，每个所述激发光发生器构形成产生不同波长范围的光。
5.按照权利要求2所述的荧光检测设备，其特征在于，多个所述激发/检测对布置成使得可以同时使每个所述激发/检测对的位置与多个凹坑中的不同的凹坑处于光学接触状态。
6.按照权利要求2所述的荧光检测设备，其特征在于，多个所述激发/检测对布置成使得当把所述激发/检测对中的第一对的位置与多个凹坑中的任何一个凹坑处于光学接触状态时，所述激发/检测对中的任何其它对的位置不与多个凹坑中的任何一个凹坑处于光学接触状态。
7.按照权利要求1所述的荧光检测设备，其特征在于，所述检测模件可拆卸地安装在所述支承结构上，从而使得使用者可以用一个不同的检测模件替换所述检测模件。
8.按照权利要求1所述的荧光检测设备，其特征在于，其还包括校准件，它设置成使得所述检测模件可移动，从而使它的位置与校准件处于光学连通状态，其中，所述校准件提供已知的荧光响应。
9.按照权利要求8所述的荧光检测设备，其特征在于，所述校准件设置在多个凹坑中的两个凹坑或多个凹坑之间。
10.按照权利要求1所述的荧光检测设备，其特征在于，由一台外部计算机控制所述检测模件关于凹坑的定位。
11.按照权利要求8所述的荧光检测设备，其特征在于，所述校准件设置在多个凹坑的周边区域。
12.按照权利要求1所述的荧光检测设备，其特征在于，由一台外部计算机控制所述激发光发生器和所述发射光检测器的工作。
13.一种用来检测靶分子在溶液中存在的方法，所述方法包括制备多个样品，每个所述样品包含适宜于结合到靶分子上的荧光探针；把每个所述样品放置在热循环设备的多个样品凹坑中的相应的一个凹坑中，所述热循环设备有可移动地安装在其中的检测模件，所述检测模件包括激发/检测通道，所述激发/检测通道包括设置在所述检测模件内部的激发光发生器，以及设置在所述检测模件内部的发射光检测器；采用所述热循环设备激发反应；并且对多个样品凹坑进行扫描，通过移动所述检测模件、并且启动所述激发/检测通道检测荧光响应，其中，在进行扫描步骤的过程中，使得所述检测模件移动，从而顺序地使所述激发/检测通道的位置与多个凹坑中的每个凹坑处于光学连通状态。
14.按照权利要求13所述的方法，其特征在于，所述靶分子是核酸序列。
15.按照权利要求14所述的方法，其特征在于，所述反应是一种聚合酶链反应(PCR)。
16.按照权利要求13所述的方法，其特征在于，进行扫描的步骤包括将所述检测模件定位，使得所述激发/检测通道的位置与样品凹坑中的一个凹坑处于光学连通状态；短时间地启动所述激发/检测通道的所述激发光发生器；采用所述激发/检测通道的所述发射光检测器检测荧光响应；并且将所述检测模件重新定位，使得所述激发/检测通道的位置与样品凹坑中的一个不同的凹坑处于光学连通状态。
17.按照权利要求16所述的方法，其特征在于，所述检测模件包括至少两个所述激发/检测通道。
18.按照权利要求17所述的方法，其特征在于，当将所述检测模件定位，使得它的激发/检测通道中的第一通道的位置与样品凹坑中的一个凹坑处于光学连通状态时，它的激发/检测通道中的第二通道的位置与样品凹坑中的一个不同的凹坑处于光学连通状态。
19.按照权利要求17所述的方法，其特征在于，当将所述检测模件定位，使得它的激发/检测通道中的第一通道的位置与样品凹坑中的一个凹坑处于光学连通状态时，它的激发/检测通道中的第二通道的位置与样品凹坑中的任何一个凹坑处于光学连通状态。
20.按照权利要求16所述的方法，其特征在于，在进行所述扫描步骤的过程中，所述检测模件基本上处于连续运动的状态。
全文摘要
一种用来分析位于热循环器中多个样品凹坑中的样品的荧光检测设备和使用该设备的方法。在一个实施例中，该设备包括可以安装到该热循环器上的一个支承结构，以及可移动地安装在该支承结构上的一个检测模件。该检测模件包括一个或多个通道，每个通道有一个激发光发生器和一个发射光检测器，它们两个都设置在检测模件内。当把支承结构安装到热循环器上、并且把检测模件安装在支承结构上时，检测模件可移动，从而使它的位置与多个凹坑中不同的凹坑处于光学连通状态。检测模件可以由支承结构移开，使得可以容易地进行替换。
文档编号C12P19/34GK1820082SQ200480019572
公开日2006年8月16日 申请日期2004年5月10日 优先权日2003年5月8日
发明者I·科顿斯基, J·A·戈德曼, M·J·芬尼 申请人:生物-拉德实验室公司