专利名称：少突胶质祖细胞和获得及培养它们的方法
技术领域：
本发明涉及获得自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群的方法，和涉及用本发明方法得到的细胞。
本发明进一步涉及维持自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群较长时期而不改变细胞特性的方法。
通过连续地应用细胞分离(通过消化试剂，如胰蛋白酶)，随后应用限定的培养条件，本发明的少突胶质祖细胞可以被去分化回到较早的发育阶段。因此，本发明也涉及获得具有同步发育阶段的分化的和去分化的同质少突胶质祖细胞群或少突胶质细胞群的方法。
最后，本发明涉及用本发明的细胞治疗患者的方法，和筛选候选药物的方法，所述药物用于治疗脱髓鞘和导致髓鞘减少的神经元变性疾病的方法。
背景技术：
许多脊椎动物神经元的轴突由髓鞘所隔绝，这大大增加了轴突传导动作电位的速度。少突胶质细胞(oligodendrocyte)负责中枢神经系统中髓鞘的形成。这些少突胶质细胞以环绕轴突的紧密螺旋层层包裹它们自身的浆膜，形成鞘，因而使轴突膜绝缘，以至于几乎没有电流漏过它。鞘在固定间隔的郎飞节处中断，在该处，集中了轴突中的几乎所有钠通道。由于轴突膜的鞘内部分具有优异的电缆性质，因此一个节处的膜去极化几乎立即被动地传播到相邻节。这样，通过从一个节到另一个节的跳跃，动作电位沿着有髓鞘的轴突传播。这种类型的传导具有两个主要优势动作电位传播较快，并且由于活性兴奋被限制在郎飞节处轴突浆膜的小区域，保存了代谢能量。
脱髓鞘病多发性硬化显著说明了髓鞘形成的重要性，在多发性硬化中，中枢神经系统中一些区域的髓鞘由于未知的机理遭到破坏。在许多神经变性疾病中，也强烈说明了髓鞘形成的重要性，在这种疾病中，有髓鞘的神经元受到损伤。在发生这些疾病的部位，神经冲动的传播被大大减慢，常常伴有毁坏性的神经学后果。
少突胶质细胞似乎是终末分化细胞，其不经历进一步的体内细胞分裂，因此，难于在体外长期培养(Verity等，J.Neurochem.，60577，1993)。少突胶质祖细胞，其具有增殖能力和分化潜能，提供了系统，通过该系统，可以在体外研究细胞分化和髓鞘形成/脱髓鞘/髓鞘再生的细胞机制和分子机制，并提供了促进体内髓鞘形成/髓鞘再生的来源。然而，在中枢神经系统(CNS)中，少突胶质细胞不同步地从少突胶质祖细胞发育，因此也认为，它们可能是表型上异质的细胞群(Skoff等，J.Comp.Neurol.169313-334，1976)。确实，起始于分离的围产期脑的培养物是遗传上异质的细胞群，具有非同步的发育成熟。因此，难于分离具有相同发育阶段的表型同质的原代少突胶质祖细胞群。
因此，在本领域中，存在着对自我更新的，表型同质的同步少突胶质祖细胞群的需求，所述细胞具有同步化的发育阶段，和存在着对获得、维持和保存该细胞的方法的需求。
发明概述 在一个方面，本发明提供了获得自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群的方法。方法包括，在包括有效量的成纤维细胞生长因子(FGF)，优选地是碱性FGF(bFGF)的培养基中，和在基本上不存在血小板源性生长因子(PDGF)下，培养具有非同步发育阶段的异质少突胶质祖细胞群。该方法产生自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群，其可以通过下列一种或多种能力而被表征(1)响应于bFGF的自我更新的增值，不伴有分化，(2)在促细胞分裂原或血清不存在时，终末分化为同质的少突胶质细胞群，(3)在BMP-2存在下，生成同质的2型星性胶质细胞群，(4)去分化，(5)在体外和体内促进髓鞘形成，(6)缺乏分化为1型星形胶质细胞的潜能，和(7)冷冻后融解时，高度生存而不改变细胞特性。
细胞特性的变化是根据这些细胞的具体性质确定的，例如自我更新的增殖能力，这与多潜能干细胞相同，和在被回收时具有高度生存而不改变细胞特性的情况下，储存具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群的能力，这基于这些细胞的具体性质，包括对冻融处理的高度耐受性。
本发明也包括，可以被限制在单一分化系中的自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质的少突胶质祖细胞群。例如，这种细胞可以被限制为，全部细胞群分化为单一谱系(single lineage)，如分化为成熟的少突胶质细胞或2型星形胶质细胞。
在本发明的另一方面，自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群也可以被无限期地维持在培养物中。因此，本发明也提供了获取、维持和在培养物中无限期地保存自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群的方法，包括，在包括有效量的FGF，优选地是bFGF的培养基中，和在基本上不存在PDGF下，培养具有同步发育阶段的同质少突胶质祖细胞群。
本发明也提供了保存可存活的、冷冻的、未分化的、和同质的少突胶质祖细胞的方法，这是通过在带有或不带有促细胞分裂剂的冷冻培养基中冷冻少突胶质祖细胞实施的。一旦融解，少突胶质细胞以高度生存被回收，并且保有它们冷冻之前拥有的相同的表型特征和发育特征。
本发明方法获得的少突胶质祖细胞可以被用来在不存在促细胞分裂剂或血清下，生成同质的和同步的成熟少突胶质细胞群，并具有髓鞘化神经元轴突的能力。本发明方法获得的少突胶质祖细胞也可以被用来生成同质的2型星形胶质细胞群，其在特殊促有丝分裂剂，如骨形态形成蛋白(BMP-2)和BMP-4的存在下，缺乏增殖能力。本发明的少突胶质祖细胞进一步地不生成1型星形胶质细胞。
本发明进一步提供了获得同质的去分化少突胶质祖细胞群的方法，所述细胞在发育上和表型上，其阶段早于最初被分离的少突胶质祖细胞。该方法包括，在含有促进去分化的至少一种因子的培养基中，培养少突胶质祖细胞，或具有同步发育阶段的同质少突胶质祖细胞群。促进去分化的因子可以是bFGF、PDGF、NT-3、或其它生长因子中的一种或多种。去分化的少突胶质祖细胞(或具有同步发育阶段的同质的去分化少突胶质细胞群)能够再分化为少突胶质细胞和2型星形胶质细胞。
本发明进一步提供了获得自我更新的，表型同质的增殖少突胶质祖细胞群的方法，所述细胞在发育上和表型上，其阶段晚于最初分离的少突胶质祖细胞。该方法包括，在含有至少一种促进向更分化阶段发育的因子的培养基中，培养少突胶质祖细胞，或具有同步发育阶段的同质少突胶质祖细胞群。该更分化阶段进一步由处于更分化阶段中的细胞的增殖能力所标志。促进更分化增殖阶段的因子，可以是较低剂量的bFGF或其它生长因子。
本发明的自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群提供了系统，用于筛选影响少突胶质细胞生物学功能和/或分化状态的化合物。因此，本发明进一步提供了筛选化合物的方法，方法包括，用检测化合物接触自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群，和检测少突胶质祖细胞和/或培养基的变化。变化可以是少突胶质祖细胞的任何特征和/或培养基中任意物质水平的增加或减少。该特征可以是，例如，下列中的一种或多种变化髓鞘形成，分化为少突胶质细胞或2型星形胶质细胞，增殖速度，细胞迁移，存活能力，基因表达，蛋白表达，培养基中的蛋白水平，去分化或细胞形态学。
本发明的自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群也用于治疗患者，如用于细胞治疗。患者可以患有或具有髓鞘退化或损伤引起的神经系统病理状态。本发明提供了治疗患者的方法，包括给予患者治疗有效量的本发明的少突胶质祖细胞。在本发明的一种实施方案中，少突胶质祖细胞可以含有指导所需基因在患者中表达的核酸载体或生物学载体。
附图简述
图1是中枢神经系统(CNS)中各种细胞类型的图示，由发育标记物和细胞形态学所标志。
图2是同质的和发育同步的大鼠少突胶质祖细胞群的相差照片。
图3是同质的和发育同步的人少突胶质祖细胞群的相差照片。
图4显示了O4(+)O1(+)少突胶质祖细胞的相差照片和荧光成像照片，所述细胞用Cy-3连接的抗-O4抗体或Cy-3连接的抗-O1抗体进行免疫组织化学染色。
图5A-5C是少突胶质细胞的照片。图5A和5B分别是大鼠和人少突胶质细胞的相差照片。图5C显示了人少突胶质细胞的相差照片，和用Cy-3连接的抗-O1抗体与FITC-连接的抗-MBP抗体双染色的同一少突胶质细胞。
图6A和6B是分化为2型星形胶质细胞的大鼠少突胶质祖细胞的照片。图6A是2型星形胶质细胞的相差照片，图6B是相同细胞的荧光成像照片，显示了胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达。
图7A-7D是从O4(+)O1(+)少突胶质祖细胞产生的细胞的照片。图7A显示了O4(+)O1(+)少突胶质祖细胞的相差照片，和与Cy3-连接的抗-GFAP接触的该细胞的荧光成像照片。图7B显示了从O4(+)O1(+)祖细胞去分化的O4(+)O1(-)细胞的相差照片(上部的图)，和与Cy3-连接的抗-O4抗体(左下图)和Cy3-连接的抗-O1抗体(右下图)接触的该细胞的荧光成像照片。图7C显示了从O4(+)O1(-)祖细胞去分化的O4(-)O1(-)细胞的相差照片(上部的图)，和与Cy3-连接的抗-O4抗体(左下图)和Cy3-连接的抗-O1抗体(右下图)接触的该细胞的荧光成像照片。图7D显示了从去分化的O4(-)O1(-)祖细胞生成的2型星形胶质细胞的相差照片，和与Cy3-连接的抗-GFAP接触的2型星形胶质细胞的荧光成像照片。
图8A-8C是大鼠少突胶质祖细胞的照片，其已分化为成熟的少突胶质细胞并且显示了围绕人脊髓背根神经节(DRG)神经元轴突的髓鞘形成。图8A是带有DRG的分化细胞的相差照片；图8B是相同细胞的荧光成像照片，用检测神经元的FITC-连接的抗-神经丝200KD抗体免疫组织化学染色；和图8C是相同细胞的荧光成像照片，用Cy3-连接的抗-O1抗体免疫组织化学染色，以检测少突胶质细胞。
发明详述
多能神经上皮干细胞(NSC)被认为生成中枢神经系统(CNS)的所有细胞。这些细胞被广义地归类为神经元或神经胶质细胞。神经胶质细胞进一步被细分为星形胶质细胞和少突胶质细胞。发育标志(developmental markers)的顺序表达，将该谱系分为不同的表型阶段，所述标志的表达由一组细胞特异性抗体鉴定。也通过其增殖能力、迁移能力和形态学的显著变化表征细胞。图1显示了发育标志和细胞形态学所表征的不同细胞类型的图示。这些标志物中的一些详述如下。
巢蛋白。巢蛋白是特异表达在神经上皮干细胞(NSCs)上的蛋白质，并从而将它们和神经管中的其它更分化的细胞区分开来(Lendahl等，Cell 60585-595，1990)。神经胶质祖细胞也表达巢蛋白。在培养物中，在增殖着的少突胶质细胞祖细胞中观察到高水平的巢蛋白，但是该蛋白在分化的少突胶质细胞中下调(Gallo等，J.Neurosci.15394-406，1995)。
A2B5。在体内，在神经元和神经胶质细胞上均表达单克隆抗体A2B5识别的抗原(Eisenbarth等，PNAS 764913-4917，1979)，并且所述抗原被用在少突胶质细胞培养物中，跟随少突胶质祖细胞的成熟。随着细胞分化为成熟的少突胶质细胞时，A2B5抗原开始下调。
O4。单克隆抗体O4(Sommer等，Dev Biol 83311-327，1981)标记少突胶质细胞成熟中的特殊的前少突胶质细胞阶段(preoligodendrocyte stage)。当细胞和单克隆抗体O4结合时，认为该细胞是O4(+)。当细胞和该单克隆抗体不结合时，认为细胞是O4(-)。O4标志的作用在下面详述。
糖脂。少突胶质细胞和髓鞘中存在特殊的糖脂，如半乳糖苷神经酰胺(GalC)(半乳糖脑苷脂)和硫酸半乳糖基酰基鞘氨醇(硫苷脂)。半乳糖苷神经酰胺和硫酸半乳糖基酰基鞘氨醇是少突胶质祖细胞上的早期标志物，它在培养物中和在体内，仍然存在于成熟少突胶质细胞的表面(Pfeiffer等，Trends Cell Biol 3191-197，1993；Raff等，Brain Res 174283-308，1979；Zalc等，Brain Res 211341-354，1981)。用于鉴定半乳糖脑苷脂的主要抗体是O1(Sommer等，Dev Biol 83311-327，1981)。因此，表达GalC的细胞通常被指定为O1(+)。
神经节苷脂GD3。在体外，GD3被高度表达在少突胶质祖细胞上，随着细胞成熟，GD3表达消失(Hardy等，Development 1111061-1080，1991)。在体内，GD3也被表达在其它神经胶质细胞类型中，如不成熟的神经外胚层细胞，神经元和星形胶质细胞亚群，休眠的阿米巴样小胶质细胞，和活性小胶质细胞。
PSA-NCAM。胚胎多唾液酸化形式的神经细胞粘附分子PSA-NCAM的表达被认为，对于调节和维持神经结构改变如迁移、轴突生长是重要的，对于可塑性也是重要的(Cremer等，Int.J.Dev.Neurosci.18213-220，2000)。PSA-NCAM的表达和GD3表达缺失共同表征了少突胶质祖细胞从其产生的前体阶段(Hardy等，Development 1111061-1080，1991；Grinspan等，J.Neurosci Res 41540-545，1995)。
髓鞘碱性蛋白(MBP)和蛋白脂质蛋白(PLP)。髓鞘蛋白，其构成髓鞘重量的30％，是髓鞘和少突胶质细胞的特异成分。主要的CNS髓鞘蛋白MBP和PLP是低分子量蛋白质并构成总髓鞘蛋白的大约80％。因此，MBP和PLP是表征成熟少突胶质细胞的特异标志物。
胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)。星形胶质细胞包含中间纤维，被称为胶质丝，它是GFAP聚合物，可以用抗GFAP抗体经免疫组织化学技术在组织切片中和CNS的培养物中容易地进行鉴定。已知存在两种不同类型的GFAP+星形胶质细胞1型星形胶质细胞(T1As)具有成纤维细胞样形态，在培养物中增殖，特别响应于表皮生长因子(EGF)，并且不结合于A2B5抗体；2型星形胶质细胞(T2As)在形态上类似于神经元或少突胶质细胞，在培养物中很少发生分裂，并且结合于A2B5抗体。2型星形胶质细胞似乎是从A2B5+，GFAP-祖细胞发育而来的，其在培养物中迅速获取GFAP(Raff等，J.Neurosci.31289-1300，1983)。星形胶质细胞的这两种类型在培养物中不从一种类型转变为另一种类型。出处同上。
许多特征将少突胶质细胞和星形胶质细胞区分开来。具体地，少突胶质细胞的体积更小，细胞质和细胞核均具有更高的密度，细胞质中缺乏中间纤维(原纤维)和糖原，和具有大量的微管(在Peters等，The Fine Structure of the Nervous Systemthe Neuronand the Supporting Cells.Oxford，UKOxford Univ.Press，1991中综述)。少突胶质细胞可以有许多细胞伸展或突起，每一伸展或突起接触并重复包绕一段轴突，该多螺旋的成膜髓鞘随后浓缩。在相同的轴突上，邻近的髓鞘片段属于不同的少突胶质细胞，每一髓鞘单位在郎飞节附近终止(Bunge等，J.Cell Biol.12448-459，1962；Bunge，Physiol Rev 48197-210，1968)。
在少突胶质细胞最终成熟为髓鞘形成细胞之前，少突胶质细胞经过许多发育阶段，这些发育阶段由特异细胞表面受体的表达和对不同生长因子的响应所限定。最确定的少突胶质祖细胞是A2B5(+)O4(-)少突胶质细胞2型星形胶质细胞(O-2A)祖细胞(Noble等，Glia 15222-230，1995；Raff，Science 2431450-1455，1989；Miller，Trends Neurosci 1992-96，1996；Richardson等，Semin.Neurosci.2445-454，1990)。O-2A祖细胞能够在体外分化为少突胶质细胞和2型星形胶质细胞，但不分化为1型星形胶质细胞。因此，O-2A祖细胞被认为是双潜能的(bipotential)。在生长因子存在下，O-2A祖细胞在体外可以被诱导，经历自我更新或增殖。例如，在PDGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)均存在下的生长刺激持续自我更新而不分化(Bogler等，PNAS 876368-6372，1990)，而在血小板源生长因子(PDGF)存在下的生长和少突胶质细胞的自我更新及产生均有关联(Richardson等，Cell53309-319，1988；Raff等，Nature 333562-565，1988；Noble等，Nature 333560-562，1988)。特别地，当在含有作为唯一加入的外源性生长因子bFGF的培养基中培养O-2A祖细胞时，O-2A细胞经历成熟前少突胶质细胞分化。出处同上。用10％胎牛血清处理时，O-2A祖细胞也可以被诱导分化为2型星形胶质细胞(Raff等，Nature 303390-396，1983)。
在形态学上，O-2A祖细胞通常是双极的(有两个主要的细胞伸展)。随着O-2A细胞的成熟，它们变为多极，运动减少，但仍然是和单克隆抗体O4反应的增殖细胞。这随后是短暂的发育阶段，前-GalC。这些O-2A-后(post-O-2A)但是少突胶质细胞前(pre-oligodendrocyte)的细胞被统称为A2B5(+)O4(+)O1(-)细胞。终末分化，即不成熟的少突胶质细胞阶段的发生，由半乳糖苷神经酰胺(GalC)的合成并转运至表面而确定，该半乳糖苷神经酰胺对单克隆抗体O1起反应。典型地延迟一天或两天之后，成熟的少突胶质细胞发育，伴随终末标志物如髓鞘碱性蛋白(MBP)和蛋白脂质蛋白(PLP)的可调型表达，以及髓鞘膜的合成。尽管大多数对O-2A祖细胞和它们更分化的少突胶质细胞的研究是从啮齿动物分离并研究的，但在人胎脑中也鉴定了双极O-2A细胞，多极A2B5(+)O4(+)细胞，和成熟的O(+)少突胶质细胞(Rivkin等，Ann Neurol 3892-101，1995)。
最近，其它少突胶质祖细胞得到鉴定。已经从大鼠脊髓分离出称作胶质限制前体细胞(GRP)的三潜能祖细胞，并且发现该细胞不同于双潜能O-2A祖细胞(Rao等，PNAS 953996-4001，1998；Rao等，Dev Biol 18848-63，1997)。类似O-2A祖细胞，GRPs是A2B5(+)免疫反应细胞并不能分化为神经元祖细胞或神经元。与O-2A细胞不一样，GFRs能够分化为少突胶质细胞和两种类型的星形胶质细胞，1型(A2B5(-)GFAP(+))和2型(A2B5(+)GFAP(+))。而且，新鲜分离的GRPs对PDGF无响应，这与O-2A细胞不同。然而，在含bFGF和PDGF的培养基中生长几天之后，GRP细胞可以获得响应于PDGF的能力。在形态学上，GRP细胞是单极或双极的。最近已经证明，在PDGF和甲状腺激素(TH)存在下生长时，GRP细胞可以产生O-2A祖细胞(Gregori等，J Neurosci 22248-256，2002)，并从而构成最早鉴定的胶质限制细胞。
称为寡球体(oligospheres)的另一类神经胶质祖细胞，已经被鉴定。寡球体是浮游的细胞集合体，该集合体被认为包括A2B5免疫反应细胞(Avellana-Adalid等，J Neurosci Res 1558-570，1996)。寡球体最初是从大鼠新生脑中分离的(Avellana-Adalid等，J Neurosci Res 1558-570，1996)，但后来也从成年大鼠(Zhang等，PNAS 964089-4094，1999)、犬科动物(Zhang等，JNeurosci Res 54181-190，1998)和胚胎干细胞(Brustle等，Science 285754-756，1999；Mujtaba等，Dev Biol 214113-127，1999；Liu等，PNAS 976126-5131，2000)分离。寡球体在培养中分裂，并作为未分化细胞的浮游球繁殖。寡球体通过离解和附着被诱导分化。一旦分化，寡球体产生少突胶质细胞和星形胶质细胞。出处同上。尽管这些星形胶质细胞的表型未被表征，但推测它们是1型星形胶质细胞(Lee等，Glia 30105-121，2000)。因此，这提示，寡球体和O-2A祖细胞是不同的细胞。
仅在神经细胞之外看，胚胎干(ES)细胞是哺乳动物中存在的最早的全能细胞，并也可以用作神经上皮干细胞来源，其随后可以产生神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。实际上，移植入创伤损害脊髓的ES细胞证明，移植的ES细胞生存并分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元(McDonald等，Nature Med.51410-1412，1999)。其它实验从ES细胞分离寡球体并将寡球体移植入髓鞘缺失突变小鼠的脊髓中。ES-来源的寡球体似乎迁移进入宿主组织，产生髓鞘，和髓鞘化宿主轴突(Liu等，PNAS 976126-6131，2000)。然而，胚胎组织的应用日益变得有争议。
从少突胶质祖细胞发育而来的少突胶质细胞是高度可调的，并且仍然是涉及各种环境因素的相对未定过程。实际上，多能细胞分化为胶质限制细胞(成神经胶质细胞)的能力，以及成神经胶质细胞进一步分化为少突胶质细胞或星形胶质细胞的能力，似乎由各种生长因子和转录因子所调节。在Collarini等，J Cell Sci(Suppl)15117-123，1991；McMorris等，Brain Pathol 6313-329，1996；Lee等，Glia 30105-121，2000；Baumann等，Physiol Rev81871-927，2001中综述了体内和体外的许多认为重要的分子。这些包括但不限于，血小板源生长因子(PDGF)，碱性FGF(bFGF)，胰岛素样生长因子I(IGF-1)，神经营养蛋白-3(NT-3)，神经胶质生长因子(GGF或神经调节蛋白)，睫状神经细胞营养因子(CNTF)，白介素-6(IL-6)，转化生长因子(TGF)，IL-2，三碘甲腺原氨酸(T3)，视黄酸(RA)，cAMP，生长可调的原癌基因-α(growth-regulated oncogene-alpha)(GRO-α)和各种激素。这些中的一些详细论述如下。
血小板源生长因子(PDGF)。PDGF已经被鉴定为神经胶质细胞增殖以及分化为少突胶质细胞的重要生长因子，由星形胶质细胞和神经元在发育期间产生。PDGF可能在发育期间起重要作用，因为PDGF-A无效小鼠显示了原始少突胶质细胞代的大的降低，尽管原始少突胶质细胞代并不完全缺失(Fruttiger等，Development 126457-467，1999)。然而，在多能神经上皮细胞和新鲜分离的GRP细胞中，均未观察到PDGF受体α(PDGRR-α)(Rao等，PANS 953996-4001，1998)。因此，PDGF可能在发育的较晚阶段起作用，而不是在多能神经上皮细胞产生更多限制胶质前体细胞的起始阶段。
在体外，PDGF增强O-2A细胞的增殖和运动性(McKinnon等，Glia 7245-254，1993；Noble等，Nature 333560-562，1988；Raff等，Nature 333562-565，1988；Richardson等，Cell 53309-319，1988)，并且在体内，用作新生成少突胶质细胞的存活因子(Barres等，Cell 7031-46，1993)。在PDGF和其它环境信号不存在时，祖细胞在成熟前停止分裂并唯一地分化为少突胶质细胞(Temple等，Nature 313223-225，1985；Raff等，Nature 333562-565，1988)。然而，尽管存在PDGF，在细胞内固有的计时机理引起O-2A祖细胞停止分裂之前，O-2A祖细胞仅分裂有限的次数并分化为少突胶质细胞(Raff等，Nature 333562-565，1988)。
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF或FGF-2)。bFGF刺激存培养物中发育的少突胶质细胞的增殖(Eccleston等，Brain Res 210315-318，1984；Saneto等，PNAS 823509-3515，1985；Besnard等，Neurosci Lett 73287-292，1987；Besnard等，Iht J Dev Neurosci 7401-409，1989；Behar等，J Neurosci Res 21168-180，1988)，也刺激少突胶质祖细胞增殖，所述祖细胞增殖在分裂数目或时期上具有限制的增殖能力，同时防止分化为少突胶质细胞(McKinnon等，Ann N.Y.Acad Sci 638378-386，1991；McKinnon等，Glia 7245-254，1993；Qian等，Neuron 1881-93，1997)。bFGF通过上调PDGF-α的表达并因而增加发育期起作用，在所述发育期内，少突胶质细胞祖先或前少突胶质细胞能够响应于PDGF(McKinnon等，Neuron 5603-614，990)。实际上，已经显示，单独暴露于bFGF时，O-2A细胞经历成熟前分化为少突胶质细胞，但不被诱导变成自我更新的少突胶质祖细胞。当暴露于bFGF和PDGF的组合时，O-2A细胞被诱导经历持续的自我更新(Bogler等，PNAS 876368-6372，1990)。相似地，在bFGF和PDGF存在下，三潜能神经胶质祖细胞被诱导经历自我更新(Rao等，PNAS 953996-4001，1998)。
神经营养蛋白-3(NT-3)。NT-3是神经生长因子家族成员，并且似乎仅当和高水平胰岛素、PDGF或其它组合一起加入时，刺激少突胶质祖细胞的增殖(Barde，Nature 367371-375，1994；Barres等，Neuron 12935-942，1994)。NT-3也促进少突胶质细胞的体外存活(Barde，Nature 367371-375，1994；Barres等，Cell 7031-46，1992)。
睫状神经细胞营养因子(CNTF)。CNTF是在结构上和功能上与造血细胞因子家族相似的细胞因子。用CNTF处理神经胶质祖细胞可以诱导少突胶质细胞的出现(Mayer等，Development 120143-153，1994；Barres等，Mol Cell Neurosci 8146-156，1996，Lachyankar等，Exp Neurol 144350-360，1997)。研究提示，为了刺激少突胶质细胞分化，CNTF需要PDGF存在(Engel等，Glia 1616-26，1996；Fruttiger等，Development 126457-467，1999)。
也存在CNGF可以刺激2型星形胶质细胞从O-2A祖细胞产生的证据。然而，CNGF本身不足以诱导2型星形胶质细胞的发育。实际上，可能通过模拟胎牛血清的效应，与细胞外基质相关的分子和CNTF协作(Lillien等，J Cell Biol 111635-644，1990)，这已显示为诱导2型星形胶质细胞在体外分化(Raff等，Nature 303390-396，1983；Temple等，Nature 313223-225，1985)。
三碘甲腺原氨酸(T3)。甲状腺素T3能够维持少突胶质祖细胞增殖以及刺激它们分化为成熟的少突胶质细胞(Barres等，Development 1201097-1108，1994；Ibarrola等，DevBiol 1801-21，1996；Baas等，Glia 19324-332，1997)。
生长可调的原癌基因-α(GRO-α)。(GRO-α)也是一种细胞因子，被显示为促进少突胶质祖细胞的增殖(Robinson等，JNeurosci 1810457-10463，1998)。
视黄酸(RA)和cAMP。cAMP和视黄酸似乎调节少突胶质祖细胞的分化(Raible等，Dev Biol 133437-446，1993；Noll等，Development 120649-660，1994)。
神经胶质生长因子(GGF或神经调节蛋白)。GGF是另一种生长因子，已经显示，其刺激少突胶质祖细胞的增殖和存活(Canoll等，Neuron 17229-243，1996)。
令人感兴趣的是，观察到更分化的细胞向较少分化的细胞的一些逆转，表明CNS的一些细胞拥有一些可塑性。例如，Canoll等观察到，通过用GGF(神经胶质生长因子)处理具有表型O1(+)MBP(+)的成熟少突胶质细胞，降低了表达成熟标志物O1和MBP的细胞数目(Canoll等，Mol Cell Neurosci.1379-94，1999)。这种表型逆转也被细胞形态学的变化、中间丝蛋白巢蛋白的再表达和肌动蛋白细胞骨架的重组所表征。也显示，碱性FGF降低培养基中成熟少突胶质细胞的数目(Fressinaud等，J.Neurosci.Res.40285-293，1995；Hoffman等，Glia 1433-42，1995；Grinspan等，J.Neurosci.Res.46456-464，1996)。然而，所有研究显示成熟少突胶质细胞的逆转而不是少突胶质祖细胞的逆转，并且也没能得到同质的去分化细胞群。而且，一些证据表明，bFGF可以触发成熟少突胶质细胞的细胞程序死亡(Muir等，J.Neurosci.Res.441-11，1996)。另一研究说明，2型星形胶质细胞可以回复为具有围产期少突胶质祖细胞双极形态特征的细胞(Kondo等，Science 2891754-1757，2000)。Gard和Pfeiffer观察到，在PDGF存在下，O4(+)O1(-)祖细胞可以短暂地回复为A2B5(+)O4(-)表型。然而，回复的表型不能维持，原因是细胞迅速地再分化为O4(+)O1(-)表型，并且在其后不久，分化为O1(+)少突胶质细胞(Gard等，Dev.Biol.159618-630，1993)。
尽管有体现在这些不同研究中的工作，但还未曾报道获得、维持和存储表型同质的自我更新少突胶质祖细胞群的方法，所述细胞在发育阶段上是同步的。由于它们能够自我更新，能够增殖，能够最终分化为少突胶质细胞，并且在表型上同质，发育阶段同步，因此这些细胞在治疗各种CNS疾病和病理状态中是有用的，并且在体外和体内研究该疾病和病理状态中是有用的，本发明提供了这些细胞。
在进一步描述本发明之前，应该理解，本发明不限于描述的具体实施方案。也应该理解，此处应用的术语仅是为了描述具体实施方案的目的，并不意欲限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求限制。
在提供数值范围处，应该理解，居间值包含在本发明中。这些较小范围的上下限独立地被包含在较小的范围内，也包含在本发明中，容易受到陈述范围中极限值的任何具体排除。在陈述范围包含一个或两个极限值时，排除了任意一个或两个所包含极限值的范围，也包括在本发明中。
如无另外定义，此处所用的所有技术术语和科学术语，具有本发明所属领域的普通技术人员普遍理解的相同意义。尽管在本发明实践或实验中，可以应用与此处描述相似或等价的任何方法和物质，但一些方法和物质在此被描述。此处提及的所有出版物在此引入，作为参考，以公开和描述与出版物引用的方法和物质有关的方法和/或物质。
必须指出，如此处和所附权利要求中所用，除非上下文清楚地另外指明，单数形式“一个(a)”、“或(or)”、和“那个(the)”包括复数指示物。
进一步地，如无另外指明，用在说明书和权利要求书中表示组分量、反应条件等的所有数值，将被理解为，在所有情况下由词语“大约”修饰。因此，如无相反指明，说明书和权利要求中阐明的数字参数是近似值，可以根据本发明欲获得的所需性质加以改变。
虽然阐明了本发明宽范围的数值和参数是近似值，但具体实施例中的数值尽可能精确地报道。然而，任何数值固有地包括一些从各实验测定中发现的标准误必然产生的误差。
如此处所应用，“表型同质群(phenotypically homogeneouspopulation)”和“具有同步发育阶段(having a synchronizeddevelopmental stage)”是指基本上显示相同表型和发育阶段的细胞群。这样的同质群可以包括多于大约90％的基本上相同的细胞，或至少大约92％、94％、96％、98％、99％、99.9％或100％的基本上相同的细胞。
“少突胶质祖细胞(oligodendrocyte precursor cell)”或“少突胶质祖细胞(oligodendrocyte progenitor cell)”在此用于描述一种细胞，其还未曾分化为成熟的少突胶质细胞，而具有分化为少突胶质细胞的潜能。在本发明的一种实施方案中，少突胶质祖细胞具有分化为2型星形胶质细胞的潜能。在另一种实施方案中，本发明的少突胶质细胞前体不分化为1型星形胶质细胞。在又一种实施方案中，少突胶质祖细胞可以由表型A2B5(+)O4(-)O1(-)；A2B5(+)O4(+)O1(-)；或A2B5(+)O4(+)O1(+)所表征。A2B5、O4和O1分别指与抗体A2B5、O4和O1反应的蛋白的表面标志表达。
相似地，在发育阶段的同质性或同步性，可以通过细胞产生更分化细胞所使用的时间值确定。例如，少突胶质祖细胞同质群可以被诱导分化为少突胶质细胞同质群。少突胶质祖细胞异质群可以在不同的期间内被诱导分化为表型上异质的少突胶质细胞群，或分化为另一种细胞表型，如2型星形胶质细胞。如果该群包括发育上同步的少突胶质祖细胞，则具有进一步发育阶段的少突胶质细胞或少突胶质祖细胞在相似的时间期间产生。如果该群包括发育上异步(或不同步)的少突胶质祖细胞，则少突胶质细胞可以在不同的时间期间产生。
可由此获得本发明的少突胶质祖细胞的组织或细胞可以是任何胎儿的，青少年的或成人的神经组织，包括来自海马、小脑、脊髓、皮质、纹状体、基底前脑、腹侧中脑、蓝斑和下丘脑的组织。也可以从胚胎干细胞获得本发明的少突胶质祖细胞。而且，可以从任何哺乳动物种类获得组织或细胞，包括啮齿动物、人、非人灵长类、马科动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊科动物、兔形动物，和类似物。
可以从上述任一来源和通过本领域已知的任意方法，获得包括少突胶质祖细胞的异质细胞群。例如，Gard等描述了间接免疫黏附分离法(immunopanning method)，通过该方法，可以获得各种发育阶段的A2B5(+)O4(+)O1(-)祖细胞(Gard等，Neuroprotocols 2209-218，1993)。可以改进间接免疫黏附分离法，以获得A2B5(+)O4(-)祖细胞。McCarthy等也描述了用于获得星形胶质细胞或少突胶质细胞培养物的细胞培养方法(McCarthy等，J.Cell Biol.85890-902，1980)。也可以应用本领域中已知的其它方法。
本发明提供了用于获得自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群的方法。方法包括，在含有有效量的成纤维细胞生长因子(FGF)的培养基中，培养具有非同步发育阶段的异质少突胶质祖细胞群，直至获得具有同步发育阶段的少突胶质祖细胞同质群。FGF可以是FGF家族成员，选自FGF1、2、4、5、6、8b、9、10和17。优选的家族成员包括FGF2、4、6、8b、9和17。最优选的是FGF2，也被称为碱性FGF(bFGF)。“有效量的FGF”是指有效诱导同步发育阶段并支持细胞存活、自我更新、和/或增殖的FGF家族成员的量。
在一种实施方案中，培养基可以包括浓度为大约0.1ng/ml至大约40ng/ml之间的FGF。优选地，FGF的浓度是至少大约0.1ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml、30ng/ml或40ng/ml。在本发明的实施方案中，培养基中的FGF浓度可以是大约0.1ng/ml至大约40ng/ml。在另一种实施方案中，FGF浓度可以是大约1至大约10ng/ml。在又一种实施方案中，FGF浓度可以是大约2.5至大约7.5ng/ml。优选地，FGF浓度是大约5ng/ml。优选地，培养基中应用的FGF是bFGF。当应用其它FGF家族成员替代bFGF或应用除bFGF外的其它FGF家族成员时，也可以使用与应用bFGF时相同的浓度。
在本发明的一种实施方案中，培养基包括有效量的FGF，基本上不存在血小板源生长因子(PDGF)。在本发明的优选实施方案中，培养基包括有效量的bFGF，基本上不存在血小板源生长因子(PDGF)。如上所解释，“有效量的FGF”是指，有效诱导同步发育阶段并足以支持细胞存活、自我更新、和/或增殖的FGF的量。
“基本上不存在PDGF”(substantial absence of PDGF)是指在培养基中不存在PDGF。优选地，培养基中的PDGF少于大约0.1ng/ml。更优选地，培养基中的PDGF少于大约0.01ng/ml。最优选地，培养基中的PDGF少于大约0.001ng/ml。应该理解，PDGF可以由培养细胞内源产生，因而，培养基完全不存在PDGF是不可能的。因此，在本发明的一种实施方案中，培养基可以包括有效量的bFGF和痕量的PDGF，所述痕量PDGF对存活、自我更新和/或增殖没有影响。选择地，培养基可以包括有效量的bFGF，其可以刺激内源性PDGF由培养细胞产生。
在本发明的一种实施方案中，获得自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群的方法包括一个或多个培养步骤，这发生在含有有效量bFGF并基本上不存在PDGF的培养基中，培养包括少突胶质祖细胞的异质细胞群之前。例如，间接免疫黏附分离法获得的A2B5(+)O4(-)细胞最初可以被培养在含有PDGF和bFGF，及任何其它生长因子的培养基中。当细胞被转换到包括bFGF、基本上不存在PDGF的培养基中时，细胞通常将仍是异质的，这在于它们在表型上和/或发育上是不同步的。
根据本发明方法获得的，自我更新的、具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群拥有下列特征中的一个或多个。例如，该细胞可响应于bFGF而增殖或自我更新，而没有可观察到的分化以及在培养基中没有加入的PDGF。对于少突胶质祖细胞，使用术语“增殖”(proliferate)和“自我更新”(self-renewing)，是指拥有持续细胞分裂能力而最终的细胞没有表型变化的细胞。实际上，如下面的实施例所显示，已经分离出独特的自我更新的、具有同步发育阶段的表型同质细胞群，所述细胞群单独响应于bFGF，能够无限增殖而不分化。本发明的细胞已经被持续培养多于一年。因此，如此处所应用，提及细胞在长期培养中增殖是指培养至少一年。
作为另一个例子，由于获得的少突胶质祖细胞是同质的，它们能够产生少突胶质细胞或2型星形胶质细胞的同质群。可以用本领域中已知的任何方法，诱导本发明的少突胶质祖细胞，产生少突胶质细胞，所述方法如，通过在没有任何外源加入的生长因子的无血清培养基中培养细胞，或在含有睫状神经细胞营养因子(CNTF)和/或甲状腺激素T3(3，3’，5’-三碘甲腺原氨酸)的培养基中培养细胞。当使用CNTF时，优选的浓度范围是大约1ng/ml至大约20ng/ml。当应用甲状腺激素T3时，优选的浓度范围是大约1μg/ml至大约30μg/ml。可以通过在含有骨形态形成蛋白2(BMP-2)、BMP-4、或10％胎牛血清的培养基中培养细胞，诱导本发明的少突胶质祖细胞，产生2型星形胶质细胞。当使用BMP-2或BMP-4时，优选的浓度范围是大约1ng/ml至大约20ng/ml。诱导少突胶质祖细胞分化的其它方法是本领域中已知的。
也因为通过本发明方法得到的少突胶质祖细胞是同质的，因此这种细胞群基本上被限制为单一的分化谱系。即，群中所有或基本上所有的少突胶质祖细胞被限制为，发育成少突胶质细胞或2型星形胶质细胞。如此处所应用，“基本上被限制”意味着群中多于大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的少突胶质祖细胞分化为相同的成熟细胞类型。
本发明的自我更新的、具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群也可以被冻融而具有高的存活率，并且在表型和发育变更上没有任何变化。如此处所应用，高存活率和高度的生存意味着在冷冻和融解之后，存活率大于大约60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。细胞可以被冷冻在含有或不含有bFGF的培养基或缓冲液中。一旦融解，细胞保持同质性以及其作为少突胶质祖细胞的状态。培养基也将包含冷冻保护剂，如5-10％的DMSO或甘油。
本发明的少突胶质祖细胞也可以在此处教导的培养基中，在基本上不存在生长因子如bFGF下被冷冻，和维持冷冻状态。普通技术人员将理解，本领域中的其它细胞冷冻缓冲液，对于本发明的细胞也会产生可接受的存活水平。
本发明的自我更新的、具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群也能够产生髓鞘。可以通过共同培养本发明的少突胶质祖细胞和从中枢神经系统得到的神经元而诱导髓鞘形成，所述神经元包括来自海马、小脑、脊髓、皮质、纹状体、基底前脑、腹侧中脑、蓝斑和下丘脑的神经元，或来自周围神经系统的神经元，包括来自脊髓背根神经节(DRG)的神经元。
自我更新的、具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群也可以以基本上相同的表型和发育状态，被无限期保持在培养基中。因此，本发明也涉及在培养基中保持自我更新的、具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群的方法。方法包括，在包括有效量FGF的培养基中，培养具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群。培养基可以包括FGF，浓度是大约0.1ng/ml至大约40ng/ml之间。优选地，FGF的浓度是至少大约0.1ng/ml、1ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、25ng/ml、30ng/ml或40ng/ml。在本发明的一种实施方案中，培养基中的FGF浓度可以是大约0.1ng/ml至大约40ng/ml。在另一种实施方案中，FGF浓度是大约1ng/ml至大约10ng/ml。在又一种实施方案中，FGF浓度可以是大约2.5至大约7.5ng/ml。优选地，FGF的浓度是大约5ng/ml。优选地，用于培养基中的FGF是bFGF。当使用其它FGF家族成员替代bFGF或使用除bFGF外的其它FGF家族成员时，也可以使用和应用bFGF时相同的浓度。
本发明也涉及将少突胶质祖细胞去分化为发育上或表型上较早状态的方法。例如，A2B5(+)O4(+)O1(+)祖细胞可以被去分化为A2B5(+)O4(+)O1(-)祖细胞，反过来，其可以被去分化为具有表型A2B5(+)O4(-)的O-2A-样细胞。能够分化为少突胶质细胞和2型星形胶质细胞的A2B5(+)O4(-)祖细胞，可以进一步去分化为胶质限制前体细胞样细胞，其可以具有分化为少突胶质细胞、1型星形胶质细胞和2型星形胶质细胞的能力。该方法包括，在含有至少一种促进去分化的因子的培养基中，培养少突胶质祖细胞。促进去分化的因子包括bFGF、PDGF、神经营养蛋白-3(neutrophin-3)(NT-3)或其它生长因子中一种或多种。
当A2B5(+)O4(+)O1(+)祖细胞被去分化为A2B5(+)O4(+)O1(-)祖细胞时，使用单独的bFGF，优选地，其浓度是大约0.1ng/ml至大约40ng/ml。
当A2B5(+)O4(+)O1(+)祖细胞被去分化为A2B5(+)O4(-)O1(-)祖细胞时，使用浓度大约0.1ng/ml至大约40ng/ml的bFGF，优选地在生长培养基中带有PDGF和NT-3。当包括PDGF时，PDGF的浓度优选地是大约1ng/ml至大约50ng/ml。当包括NT-3时，NT-3的浓度优选地是大约1ng/ml至大约10ng/ml。
当A2B5(+)O4(+)O1(-)祖细胞被去分化为A2B5(+)O4(-)祖细胞时，可以仅用PDGF，优选地，其浓度是大约1ng/ml至大约50ng/ml。优选地，将bFGF和NT-3包含在生长培养基中。当包含bFGF时，bFGF的浓度优选地是大约0.1ng/ml至大约40ng/ml。当包含有NT-3时，NT-3的浓度优选地是大约1ng/ml至大约10ng/ml。
本发明的方法能够产生去分化少突胶质祖细胞的同质群。因此，可以在包括至少上述一种促进去分化的因子的培养基中，培养具有同步发育阶段的同质少突胶质祖细胞群。在包括至少上述一种促进去分化的因子的相同培养基中，可以将去分化少突胶质祖细胞的同质群维持在基本上相同的表型和发育状态中。
本发明的去分化少突胶质祖细胞可以拥有或可以不拥有与天然发现的那些性质相似的性质。例如，本发明的去分化少突胶质祖细胞可以在表型上相似于O-2A祖细胞，其具有表型A2B5(+)O4(-)和双极形态。而且，去分化少突胶质祖细胞可以是双潜能的，如同O-2A祖细胞，这在于，它们都能够分化为少突胶质细胞和2型星形胶质细胞。另一方面，本发明的去分化少突胶质祖细胞对生长因子的反应与O-2A祖细胞不同。例如，通常已知O-2A祖细胞通过生成2型星形胶质细胞，对骨形态形成蛋白(BMP)2或4以及睫状神经细胞营养因子(CNTF)起响应。本发明的去分化少突胶质祖细胞可以通过生成2型星形胶质细胞对BMP响应，但是对CNTF不响应。
本发明的少突胶质祖细胞进一步涉及筛选化合物的方法，所述化合物影响少突胶质祖细胞的生物学功能和分化状态。该方法包括，用检测化合物接触本发明的少突胶质祖细胞，并检测少突胶质祖细胞和/或培养基的变化。该变化可以是少突胶质祖细胞任何特征的增加或减少，例如，髓鞘形成，分化为少突胶质细胞或星形胶质细胞，表面标志表达，生长特征如增殖速度、细胞迁移、存活率、表面标志表达、蛋白释放、去分化，或细胞形态。其它特征也可以随变化而检测。
检测化合物可以是任何化学品、蛋白、肽、多肽或核酸(DNA或RNA)。检测化合物可以是天然发生的或可以是通过本领域中的已知方法合成的。例如，检测化合物可以是模拟神经递质、激素或其它神经活化化合物的化合物。检测化合物也可以是抗体。在本发明的实施方案中，应用本发明的方法，筛选影响髓鞘形成的化合物。
促进髓鞘生成细胞生长和存活的试剂可以被用于各种治疗目的。由髓鞘生成细胞产生的髓鞘的退化或损伤所导致的神经系统疾病或病理状态是很多的。髓鞘丢失由于造成髓鞘的直接损伤而可作为第一事件，或由于造成轴突和神经元的损伤而作为第二事件。第一事件包括神经变性疾病如多发性硬化(MS)、人类免疫缺陷MS-相关的脊髓病、横贯性脊髓病/脊髓炎、进行性多灶性白质脑病、脑桥中央髓鞘溶解症和髓鞘损伤(如下面对第二事件的描述)。第二事件包括轴突或神经元的各种损害，由下述引起脑或脊髓的身体损害、缺血性疾病、恶性疾病、感染性疾病(如HIV、莱姆病、肺结核、梅毒或疱疹)、变性疾病(如帕金森病、阿尔茨海默病、亨延顿舞蹈病、ALS、视神经炎、感染后脑脊髓炎、脑白质肾上腺萎缩症和肾上腺脊髓神经病)、精神分裂症、营养性疾病/紊乱(如叶酸和维生素B12缺乏、韦尼克病)、系统疾病(如糖尿病、系统性红斑狼疮、癌症)、和毒物(如酒精、铅、溴化乙锭)；以及治疗过程如药物相互作用、放射治疗或神经外科治疗。
当在体内给予时，本发明的少突胶质祖细胞是安全的，并且能够迁移入宿主细胞，产生髓鞘和髓鞘化宿主轴突。而且，本发明的少突胶质祖细胞产生的少突胶质细胞能够生成髓鞘和髓鞘化宿主轴突。因此，本发明提供了治疗患者的方法，或为了患者利益的方法，其包括给予患者治疗上有效量的本发明的少突胶质祖细胞或少突胶质细胞。如此处所应用，“治疗上有效”是指足以减轻疾病症状的少突胶质祖细胞量，或足以维持或增加患者髓鞘形成的量。技术人员将理解，本发明少突胶质祖细胞的治疗有效量将根据被治疗的状态和患者的特征而不同。
此处的患者被定义为，需要用少突胶质祖细胞或少突胶质细胞治疗的任何人或非人动物，或对其治疗可能有益处的任何对象，包括人和非人动物。这种欲被治疗的非人动物包括所有驯养和野生的脊椎动物。在本发明的一种实施方案中，欲给予的少突胶质祖细胞或少突胶质细胞是从与接受治疗的种属相同的种属获得的。哺乳类的例子包括啮齿动物、人、非人灵长类、马科动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊科动物、兔形动物和类似物。
治疗中应用的少突胶质祖细胞或少突胶质细胞也包括核酸载体或生物载体，其量足以指导所需基因在患者中表达。常规重组核酸载体的构建和表达在本领域中是已知的，包括Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Vols 1-3(2d e d.1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press中的那些技术。这种核酸载体可以被包括在生物载体如病毒和细菌中，优选地，包括在非致病或减毒的微生物中，包括减毒的病毒、细菌、寄生虫和病毒样颗粒。
核酸载体或生物载体可以通过体外基因治疗方案被导入细胞，方案包括从患者切取细胞或组织，将核酸载体或生物载体引入切取的细胞和组织，以及将细胞或组织重新移植入患者(参见，例如，Knoell等，Am.J.Health Syst.Pharm.55899-904，1998；Raymon等，Exp.Neurol.14482-91，1997；Culver等，Hum.GeneTher.1399-410，1990；Kasid等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87473-477，1990)。核酸载体或生物载体可以通过例如，磷酸钙介导的转染导入切取的细胞或组织(Wigler等，Cell 14725，1978；Corsaro和Pearson Somatic Cell Genetics 7603，1981；Graham和Van der Eb.Virology 52456，1973)。也可以使用将核酸载体导入宿主细胞的其它技术，如电穿孔(Neumann等，EMBO J.1841-845，1982)。
给予含有核酸载体或生物载体的细胞，可以提供患者不足或无功能的所需基因的表达。这种基因的例子包括那些编码受体的基因，所述受体对多巴胺、GABA、肾上腺素、去甲肾上腺素、5-羟色胺、谷氨酸盐、乙酰胆碱和其它神经肽起响应，以及多巴胺、GABA、肾上腺素、去甲肾上腺素、乙酰胆碱、γ-氨基丁酸、5-羟色胺、L-DOPA和其它神经肽的基因。细胞也可被设计为产生生长因子，如神经生长因子(NGF)、bFGF、PDGF或CNTF。在另一种实施方案中，核酸载体或生物载体可以编码反义寡核苷酸。反义寡核苷酸是互补于给定基因“有义”链或编码链的小的核酸。它们因此能够和基因的RNA转录产物稳定并特异地杂交，并因而抑制RNA翻译和从而抑制下游事件。反义寡核苷酸的应用是本领域已知的。例如，Holt等，Mol.Cell Biol.8963-973，1988已显示，当与原癌基因c-myc的RNA转录产物特异杂交的反义寡核苷酸被加入培养的HL60白血病细胞时，其抑制增殖和诱导分化。相似地，Anfossi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 863379-3383，1989显示，与原癌基因c-myb的RNA转录产物特异杂交的反义寡核苷酸抑制人骨髓性白血病细胞系的增殖。已知一些脑肿瘤表达原癌基因，如sis、myc、src和n-myc。因此，本发明的细胞可以被设计为，产生靶向并抑制sis、myc、src或n-myc的反义寡核苷酸。然而，上述基因列举不意欲是穷尽的。本领域的技术人员可以确定用于在患者中表达的其它基因。
本发明的细胞可以通过脑内移植被给予。移植可以包括直接给予细胞进入中枢神经系统或脑室腔(ventricular cavities)，或硬膜下给予到宿主脑的表面上。具体过程可以包括，钻孔并刺穿硬脑膜，以允许微量调节注射器针插入。选择地，本发明的细胞可以被鞘内注射入脊髓。这种移植方法对本领域的普通技术人员是已知的，在例如Neural Grafting in the Mammalian CNS，Bjorklund和Stenevi，eds.，(1985)中有描述。实际上，培养基中生长的大鼠少突胶质祖细胞已经被移回动物并显示出迁移、移入、分化和髓鞘化受体神经纤维(Espinosa de los Monteros等，Dev.Neurosci.1498-104，1992)。
本发明的细胞也可以和其它制剂共同给予，如生长因子、神经节苷脂、抗体、神经递质、神经激素、毒素、神经突促进分子(neurite promoting molecules)、抗代谢物、和这些分子的前体如多巴胺、L-DOPA的前体。其它制剂可以由本领域的普通技术人员确定。
通过下列实施例说明本发明，但这并不意欲以任何方式加以限制。
实施例1纯化大鼠少突胶质祖细胞的同质群
首先，用皮氏培养皿通过连续分离方法，或通过Gard等，Neuroprotocols 2209-218，1993，和McCarthy等，J.Cell Biol.85890-902，1980中描述的间接免疫黏附分离法，从大鼠胚胎脊髓(E14-E19)获得A2B5(+)O4(-)或A2B5(+)O4(+)细胞。然后，在0.001％聚L-鸟氨酸(poly-L-ornitine)(Sigma)预包被的10cm培养皿(Falcon)上培养细胞，密度是大约20,000-50,000细胞/cm2，位于培养基A中(DMEM/N2(Gibco)；25ng/ml PDGF(R&D)；15ng/ml bFGF(R&D)；5ng/ml NT-3(R&D)；0.05％牛血清(Sigma))。每隔一天更换培养基A，每日补充bFGF。
大约一周后，当板变成分会合(sub-confluent)时，用培养基B(0.125％胰蛋白酶；0.26mM EDTA；Ca(-)Mg(-)汉克氏缓冲盐溶液(Hank’s Buffered Saline Solution)(Gibco))在37℃下胰酶消化细胞20分钟。在培养基C(DMEM/B27(Gibco)；10μM 3，3′，5′-三碘甲腺原氨酸(T3)(Sigma)；10ng/ml bFGF)中将胰酶消化的细胞重新铺板，持续大约一周。
在培养基C中温育一周的期间，细胞开始从双极形态(A2B5(+)O4(-))变化为多极形态，多极形态是A2B5(+)O4(+)细胞的特征。当几乎所有的细胞获得类似太阳的多极形态时，用培养基B胰酶消化细胞并在培养基D(DMEM/B27；15-30ng/mlbFGF)中重新铺板。大约每周胰酶消化细胞并重新铺板。在培养基D中传代培养的起始阶段期间，细胞中的一些产生2型星形胶质细胞，表明初始细胞群仍然是发育上异质的。尽管增殖的A2B5(+)O4(+)细胞甚至在下一步骤中被诱导，但这些非自我更新的细胞分化为少突胶质细胞或其它表型的细胞，并在有限的增殖数目后和在一个月期间内死亡。此后，一些自我更新的A2B5(+)O4(+)少突胶质祖细胞生成并开始在培养基D中增殖。随后的传代培养在培养基D中重复进行一年余。
在培养基D中传代培养大约两月之后，2型星形胶质细胞不再出现，并且，建立了含有多于99.99％(在十个独立研究中的范围是99.993-99.999％)的自我更新的、表型同质O4(+)O1(-)少突胶质祖细胞的群。通过在4％低聚甲醛的磷酸盐缓冲液中固定和用抗O4抗体(Chemicon)及抗O1抗体(Chemicon)染色，计数细胞。在显微镜下，每孔(well)八个随机视区中计数细胞。当细胞持续保持在培养基中时，它们持续增殖，并可以在培养基D中维持状态良好超过一年(图2)，而没有任何表型变化或分化。实际上，它们被传代培养超过50次并保持超过450天。这些细胞展示了独特的特征，正如下面实施例中进一步所说明。
按照布达佩斯条约中的条款，确立的大鼠A2B5(+)O4(+)O1(-)少突胶质祖细胞系被保藏在位于10801 University Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209的美国菌种保藏中心，保藏时间是2004年6月21日，指定的保藏编号是PTA 6093。
实施例2纯化人少突胶质祖细胞的同质群 首先，通过间接免疫黏附分离法和/或实施例1中描述的培养方法，从胎儿人脑组织和脊髓(9-10周)获得A2B5(+)O4(-)或A2B5(+)O4(+)细胞。然后，在0.001％聚L-鸟氨酸和0.01％层粘连蛋白预包被的10cm培养皿(Falcon)上培养细胞，密度是大约20,000-50,000细胞/cm2，位于培养基A中(DMEM/N2(Gibco)；25ng/ml PDGF；5ng/ml NT-3)。每日更换培养基A。
大约一周后，当板变得分会合时，用培养基B(0.125％胰蛋白酶；0.26mM EDTA；Ca(-)Mg(-)汉克氏缓冲盐溶液(Gibco))在37℃下胰酶消化细胞20分钟。在培养基C(DMEM/B27(Gibco)；10μM 3，3′，5′-三碘甲腺原氨酸(T3)；10ng/ml bFGF)中将胰酶消化的细胞重新铺板，持续大约一个月。
在培养基C中温育一个月的期间，细胞开始从双极形态(A2B5(+)O4(-))变化为多极形态，多极形态是A2B5(+)O4(+)细胞的特征。当几乎所有的细胞获得类似太阳的多极形态，并且增殖的集落响应于bFGF产生时，应用微柱(microcylinder)，用培养基B胰酶消化这些细胞集落并在培养基D(DMEM/B27；15-30ng/ml bFGF)中进行重新铺板。大约每周，胰酶消化这些细胞并重新铺板，在培养基D中无限重复传代培养。在培养基D中传代培养的起始阶段期间，细胞中的一些产生2型星形胶质细胞，表明初始细胞群仍然是发育上异质的。尽管增殖的A2B5(+)O4(+)细胞甚至在下一步骤中被诱导，但这些非自我更新的细胞分化为少突胶质细胞或其它表型的细胞，并在有限的增殖数目后和在一个月期间内死亡。此后，一些自我更新的A2B5(+)O4(+)少突胶质祖细胞生成并开始在培养基D中增殖。随后的传代培养在培养基D中重复一年以上。
在培养基D中传代培养大约一个月之后，2型星形胶质细胞不再出现，并且，建立了含有多于99.99％的O4(+)O1(-)少突胶质祖细胞同质群(图3)。人少突胶质祖细胞同质群与来自大鼠的少突胶质祖细胞同质群显示了相似的特征。
实施例3少突胶质祖细胞可以被冻融 分别根据实施例1和2获得的大鼠和人少突胶质祖细胞，被冷冻在5-10％DMSO的DMEM/B27培养基中，所述培养基补充有或未补充15ng/ml的bFGF。当细胞被融解并在培养基D中进行培养时，细胞以平均90％的存活率被恢复，在五个独立实验中，最大存活率范围是97-99％。而且，细胞在其物理或功能特征上，未显示任何明显变化，例如同质性、形态、增殖能力、分化能力和去分化能力。当在培养基D中培养时，细胞维持其同质性并持续增殖而不分化。
在基本上不存在生长因子或补充物如bFGF或B27补充物时，在此处教导的培养基中，也可以将根据实施例1和实施例2获得的少突胶质祖细胞冷冻和维持在冷冻状态。在融解和培养后，这种细胞也具有高度的生存率(结果未显示)。技术人员将理解，本领域中已知的其它细胞冷冻缓冲液，对本发明细胞也会产生可接受的存活水平。
实施例4少突胶质祖细胞可以被诱导为增殖的O4(+)O1(+)祖细胞 当在补充有5ng/ml CNTF(R&D)和0.5ng/ml bFGF(R&D)的DMEM/B27(Gibco)中培养时，分别根据实施例1和2获得的大鼠和人少突胶质祖细胞，以几乎100％的效率被诱导为O4(+)O1(+)细胞。图4显示，通过用Cy3-连接的抗O4抗体染色，这些细胞是O4(+)，以及通过用Cy3-连接的抗O1抗体染色，这些细胞是O1(+)。正如加入15μg/ml BrdU后，用抗BrdU抗体和抗O1抗体双染色20小时所测定，O4(+)O1(+)细胞中的大约98％持续增殖而不完全成熟为少突胶质细胞。因此，本发明的方法也提供增殖的O4(+)O1(+)祖细胞同质群。
实施例5少突胶质祖细胞能够分化为少突胶质细胞 分别根据实施例1和2获得的大鼠和人少突胶质祖细胞，也能够分化为少突胶质细胞。将细胞培养在无血清的条件培养基中(补充有N2的DMEM)(Gibco)。一周之后，几乎所有细胞表达O1和髓磷脂碱蛋白(MBP)(Chemicon)，其为表达在成熟少突胶质细胞上的标志物(图5A、5B和5C)。因此，获得的少突胶质祖细胞能够以大约100％的效率被诱导为少突胶质细胞，这提供了以下证据在实施例1和2中分别获得的大鼠和人少突胶质祖细胞在其发育阶段上是完全同步的。
实施例6少突胶质祖细胞能够分化为星形胶质细胞 根据实施例1获得的大鼠少突胶质祖细胞，能够分化为2型星形胶质细胞。当在补充有10ng/ml骨形态形成蛋白(BMP-2)或BMP-4(R&D)的DMEM/N2(Gibco)中培养根据实施例1获得的细胞时，几乎所有的细胞分化为表达表面标志胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和A2B5的细胞，GFAP和AB25都是2型星形胶质细胞的特征(图6A和6B)。这进一步证明，实施例1获得的少突胶质祖细胞在其发育阶段上是完全同步的。
实施例7少突胶质祖细胞能够去分化 本发明人惊奇地发现，根据实施例4获得的O4(+)O1(+)祖细胞可以被诱导，去分化为具有双极形态的O-2A-样细胞(O4(-)O1(-))。这些去分化的细胞是双潜能的，能够再分化为少突胶质细胞和2型星形胶质细胞(T2As)。
最初，在补充有20ng/ml BMP-2或BMP-4的DMEM/N2中，培养根据实施例4获得的O4(+)O1(+)祖细胞两周，但是由于缺乏Cy3-连接的抗-GFAP抗体(Sigma)染色，它们没有给出任何所示的GFAP(+)-星形胶质细胞(图7A)。然后，进行胰酶消化细胞并在补充有15ng/ml bFGF的DMEM/N2中进行传代培养。如细胞染色所证明，一周之后，几乎所有的细胞回复为O4(+)O1(-)细胞，所述染色是用Cy3-连接的抗-O4抗体进行的，但缺乏Cy3-连接的抗-O1抗体染色(图7B)。然后，将培养基改变为，补充有25ng/ml PDGF，15ng/ml bFGF和5ng/ml NT3的DMEM/N2并进行培养，在大约一周内，几乎所有细胞进一步回复为具有双极形态的O4(-)O1(-)细胞(图7C)。为了确认O4(-)O1(-)细胞仍然具有双潜能以再分化，将O4(-)O1(-)细胞放置在通常产生少突胶质细胞或2型星形胶质细胞的条件下。当按照实施例5，在无血清的条件培养基(补充有N2的DMEM)中培养O4(-)O1(-)细胞时，几乎100％的细胞分化为表达MBP的成熟少突胶质细胞。当在含有10ng/ml骨形态形成蛋白(BMP-2)、10ng/ml BMP-4或10％胎牛血清(FBS)的培养基中培养O4(-)O1(-)细胞时，O4(-)O1(-)细胞以几乎100％的效率生成2型星形胶质细胞，正如用Cy3-连接的抗-GFAP抗体染色所证明(图7D)。这对照于O4(+)O1(+)祖细胞，O4(+)O1(+)祖细胞对BMP无响应并仅分化为少突胶质细胞。因此，去分化的O4(-)O1(-)细胞类似于O-2A细胞，在于它们都是双潜能的，都能够生成少突胶质细胞和2型星形胶质细胞。
然而，去分化的O4(-)O1(-)细胞不同于O-2A细胞，原因是它们不仅缺乏O4表面标志，而且它们对至少一种环境因子的响应也不同。例如，已知O-2A细胞响应于CNTF并分化为2型星形胶质细胞。与之对照，本发明的去分化的O4(-)O1(-)细胞对CNTF不起响应。因此，获得的O4(-)O1(-)细胞可以是不同于O-2A祖细胞的新特征化的少突胶质祖细胞群。
实施例8少突胶质细胞能够形成髓鞘 分离人DRG神经元(9-10周)并在补充有10ng/ml CNTF和10ng/ml NGF的DMEM/B27中培养一周。加入根据实施例1获得的少突胶质祖细胞，神经元∶少突胶质祖细胞的比率是1∶2，共培养两周以上。用4％低聚甲醛的磷酸盐缓冲液固定共培养的细胞，然后，用Cy3-连接的抗-O1抗体和FITC-连接的抗-神经丝200kD抗体(Sigma)进行双染色，其中抗-O1抗体检测髓鞘，抗-神经丝200kD抗体检测轴突。多于99％的少突胶质祖细胞分化为成熟的少突胶质细胞，而一些细胞围绕人DRG神经元的轴突形成髓鞘(图8A-8C)，与之对照，不和任何少突胶质祖细胞共培养的对照DRG培养物不生成任何O1(+)少突胶质细胞，DRGs也不髓鞘化(结果未显示)。
根据说明书中引用的参考文献的教导，本说明书被最全面地得以理解，所有参考文献以其整体在此并入，作为参考。说明书中的实施方案提供了本发明实施方案的示例，不应理解为限制本发明的范围。技术人员将认识到，许多其它的实施方案被包含在所要求权利的发明中，并且其意图是，说明书和实施例仅被认为是示例性的，本发明的真正范围和精神由所附权利要求指明。
权利要求
1.获得自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群的方法，所述方法包括，在含有有效诱导同步发育阶段的成纤维细胞生长因子(FGF)量的培养基中，培养具有不同步发育阶段的异质少突胶质祖细胞群，其中所述培养是在基本上不存在血小板源生长因子(PDGF)下进行的，从而获得所述自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群。
2.权利要求1所述的方法，其中所述自我更新的同质少突胶质祖细胞群包括，在培养基可以培养至少大约一年而没有表型变化的少突胶质祖细胞，所述培育基包括有效防止所述表型变化的成纤维细胞生长因子(FGF)量并基本不存在PDGF。
3.权利要求1所述的方法，其中所述异质少突胶质相细胞群的细胞在不同分化方法中具有不同的发育速度，在分化时产生不同表型的细胞，或对周围的培养条件响应不同。
4.权利要求1所述的方法，其中所述同质少突胶质祖细胞群在不同分化方法中具有相同的发育速度，在分化时产生相同表型的细胞，或对周围的培养条件响应方式相同。
5.权利要求1所述的方法，其中所述少突胶质祖细胞的不同步群包括至少两个少突胶质祖细胞的群，每一群具有不同的发育阶段，其中所述发育阶段选自A2B5(+)O4(-)O1(-)发育阶段，A2B5(+)O4(+)O1(-)发育阶段和A2B5(+)O4(+)O1(+)发育阶段。
6.权利要求1所述的方法，其中所述少突胶质祖细胞的同步群是具有A2B5(+)O4(-)O1(-)发育阶段，A2B5(+)O4(+)O1(-)发育阶段或A2B5(+)O4(+)O1(+)发育阶段的少突胶质祖细胞群。
7.权利要求1所述的方法，其中所述同质少突胶质细胞群被限制为少突胶质细胞系。
8.权利要求1所述的方法，其中所述FGF选自FGF1、FGF2(碱性FGF或bFGF)、FGF4、FGF6、FGF8b、FGF9和FGF17。
9.权利要求1所述的方法，其中所述FGF是bFGF。
10.权利要求1或9所述的方法，其中所述FGF的量是大约0.1ng/ml至大约40ng/ml。
11.权利要求10所述的方法，其中所述FGF的量是大约1ng/ml至大约10ng/ml。
12.权利要求11所述的方法，其中所述FGF的量是大约5ng/ml。
13.权利要求1所述的方法，其中所述基本上不存在PDGF是指PDGF的量少于0.1ng/ml。
14.权利要求1所述的方法，其中所述基本上不存在PDGF是指PDGF的量少于0.01ng/ml。
15.权利要求1所述的方法，其中所述基本上不存在PDGF是指PDGF的量少于0.001ng/ml。
16.权利要求1所述的方法，其中所述异质少突胶质祖细胞群是从哺乳动物获得，所述哺乳动物选自啮齿动物、人、非人灵长类、马科动物、犬科动物、猫科动物、牛科动物、猪科动物、绵羊科动物和兔形动物。
17.权利要求1所述的方法，其中所述异质少突胶质祖细胞群是从选自下列的成员分离的海马、小脑、脊髓、皮质、纹状体、基底前脑、腹侧中脑、蓝斑和下丘脑。
18.权利要求1所述的方法，其中所述同质少突胶质祖细胞群具有至少一种特征，所述特征选自(i)生成同质少突胶质细胞群的能力；(ii)生成同质2型星形胶质细胞的能力；(iii)去分化的能力；和(iv)缺乏分化为1型星形胶质细胞的能力。
19.自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群，其通过权利要求1的方法得到。
20.自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群，其通过权利要求1的方法得到，其中所述同质少突胶质祖细胞群被限制为少突胶质细胞系。
21.获得分化的同质少突胶质细胞群的方法，包括在培养基中培养自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群，所述培养基选自(a)缺乏任何促有丝分裂剂的培养基，(b)包括睫状神经细胞营养因子(CNTF)的培养基，所述CNTF的量足以诱导所述少突胶质祖细胞分化，(c)包括3，3’，5’-三碘甲腺原氨酸(T3)的培养基，所述T3的量足以诱导所述少突胶质祖细胞分化，和(d)包括睫状神经细胞营养因子(CNTF)和3，3’，5’-三碘甲状腺原氨酸(T3)的培养基，所述CNTF和T3的量足以诱导所述少突胶质祖细胞分化。
22.权利要求21所述的方法，其中所述CNTF的量是大约1ng/ml至大约20ng/ml。
23.权利要求21所述的方法，其中所述T3的量是大约1μg/ml至大约30μg/ml。
24.在培养物中维持未分化的少突胶质祖细胞群的方法，包括在培养基中培养未分化的少突胶质祖细胞群，所述培养基包括成纤维细胞生长因子(FGF)，所述成纤维细胞生长因子的量能有效维持未分化的发育阶段，其中所述培养是在基本上不存在血小板源生长因子(PDGF)下进行的，从而在培养物中维持未分化的少突胶质祖细胞群。
25.权利要求24所述的方法，其中所述FGF选自FGF1、FGF2(碱性FGF或bFGF)、FGF4、FGF6、FGF8b、FGF9和FGF17。
26.权利要求24所述的方法，其中所述FGF是bFGF。
27.权利要求24或26所述的方法，其中所述FGF的量是大约0.1ng/ml至大约40ng/ml。
28.权利要求27所述的方法，其中所述FGF的量是大约1ng/ml至大约10ng/ml。
29.权利要求28所述的方法，其中所述FGF的量是大约5ng/ml。
30.权利要求24所述的方法，其中所述基本上不存在PDGF是指PDGF的量少于0.1ng/ml。
31.权利要求24所述的方法，其中所述基本上不存在PDGF是指PDGF的量少于0.01ng/ml。
32.权利要求24所述的方法，其中所述基本上不存在PDGF是指PDGF的量少于0.001ng/ml。
33.去分化自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群的方法，包括在培养基中培养自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群，所述培养基包括至少一种生长因子，所述生长因子的量有效促进去分化。
34.权利要求33所述的方法，其中所述同质少突胶质祖细胞群具有A2B5(+)O4(+)O1(+)发育阶段，以及所述至少一种生长因子是bFGF，其量为大约0.1ng/ml至大约40ng/ml。
35.权利要求33所述的方法，其中所述同质少突胶质祖细胞群具有A2B5(+)O4(+)O1(-)发育阶段，以及所述至少一种生长因子是PDGF，其量为大约1ng/ml至大约50ng/ml。
36.权利要求34所述的方法，其中所述培养基进一步包括PDGF，其量为大约1ng/ml至大约50ng/ml，和神经营养蛋白-3，其量为大约1ng/ml至大约10ng/ml。
37.权利要求35所述的方法，其中所述培养基进一步包括bFGF，其量为大约0.1ng/ml至大约40ng/ml，和神经营养蛋白-3，其量为大约1ng/ml至大约10ng/ml。
38.权利要求33所述的方法，其中所述同质少突胶质祖细胞群是具有A2B5(+)O4(-)O1(-)发育阶段、A2B5(+)O4(+)O1(-)发育阶段或A2B5(+)O4(+)O1(+)发育阶段的少突胶质祖细胞群。
39.权利要求33所述的方法，其中所述同质少突胶质祖细胞群去分化为具有A2B5(+)O4(-)O1(-)发育阶段或A2B5(+)O4(+)O1(-)发育阶段的同质少突胶质祖细胞群。
40.权利要求33所述的方法，其中所述去分化的少突胶质祖细胞可以分化为少突胶质细胞或分化为2型星形胶质细胞。
41.权利要求33所述的方法，进一步包括，在所述培养步骤期间，通过用消化试剂进行细胞分裂，转移所述少突胶质祖细胞至少一次。
42.去分化的少突胶质祖细胞群，其由权利要求33的去分化方法获得。
43.自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群，其响应于骨形态形成蛋白(BMP-2)或BMP-4的处理，分化为2型星形胶质细胞，但是不响应于任何量睫状神经细胞营养因子(CNTF)的处理，所述BMP-2或BMP-4的量能有效诱导分化为2型星形胶质细胞。
44.去分化的同质少突胶质祖细胞群，其响应于骨形态形成蛋白(BMP-2)或BMP-4的处理，分化为2型星形胶质细胞，但是不响应于任何量睫状神经细胞营养因子(CNTF)的处理，所述BMP-2或BMP-4的量有效诱导分化为2型星形胶质细胞。
45.权利要求43或44所述的方法，其中BMP-2和BMP-4的量是大约1ng/ml至大约20ng/ml。
46.筛选化合物的方法，所述化合物影响同质少突胶质祖细胞群、少突胶质细胞群或2型星形胶质细胞群的生物学功能，方法包括(a)用检测化合物接触通过权利要求1方法获得的自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群、或从权利要求1的方法获得的所述同质群分化而来的少突胶质细胞群、或从权利要求1的方法获得的所述同质群分化而来的2型星形胶质细胞群；和(b)检测少突胶质祖细胞、少突胶质细胞或2型星形胶质细胞生物学功能的变化。
47.权利要求46所述的方法，其中所述同质少突胶质祖细胞群是选自A2B5(+)O4(-)O1(-)发育阶段的少突胶质祖细胞、A2B5(+)O4(+)O1(-)发育阶段的少突胶质祖细胞和A2B5(+)O4(+)O1(+)发育阶段的少突胶质祖细胞的群。
48.权利要求46所述的方法，其中所述变化是至少一种特征的增加或降低，所述特征选自髓鞘形成、分化为少突胶质细胞或2型星形胶质细胞、增殖速度、细胞迁移、存活能力、基因表达、蛋白表达、培养基中的蛋白水平、去分化、生长特征和细胞形态学。
49.治疗患者的方法，所述患者患有影响中枢神经系统的疾病或状况，所述方法包括，给予患者治疗有效量的自我更新的、具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群，所述细胞群是通过权利要求1的方法获得的。
50.权利要求49所述的方法，其中所述少突胶质祖细胞在给予所述患者之前被分化或去分化。
51.权利要求49所述的方法，其中所述疾病或状况是脱髓鞘疾病或神经变性疾病。
52.权利要求51所述的方法，其中所述脱髓鞘疾病选自脊髓损伤(SCI)、多发性硬化(MS)、人类免疫缺陷MS-相关的脊髓病、横贯性脊髓病/脊髓炎、进行性多灶性白质脑病、和脑桥中央髓鞘溶解髓鞘损伤。
53.权利要求51所述的方法，其中所述神经变性疾病选自阿尔茨海默病、阿尔茨海默型老年痴呆(SDAT)、帕金森病、亨延顿舞蹈病、缺血、失明、和有髓神经元损伤造成的神经变性疾病。
54.大鼠A2B5(+)O4(+)O1(-)自我更新的少突胶质祖细胞的基本纯化培养物，其ATCC保藏编号是PTA6093。
55.基本上纯化、自我更新的具有同步发育阶段的同质少突胶质祖细胞群。
56.权利要求55所述的少突胶质祖细胞，其中所述同步发育阶段是A2B5(+)O4(-)O1(-)。
57.权利要求55所述的少突胶质祖细胞，其中所述同步发育阶段是A2B5(+)O4(+)O1(-)。
58.权利要求55所述的少突胶质祖细胞，其中所述同步发育阶段是A2B5(+)O4(+)O1(+)。
59.权利要求55所述的少突胶质祖细胞，其中所述同步发育阶段是bFGF依赖的。
60.基本上纯化、自我更新的同质少突胶质祖细胞群的混合物，其由至少两种不同的同步发育阶段组成，其中所述发育阶段选自A2B5(+)O4(-)O1(-)发育阶段、A2B5(+)O4(+)O1(-)发育阶段和A2B5(+)O4(+)O1(+)发育阶段。
全文摘要
本发明描述了自我更新的，具有同步发育阶段的表型同质少突胶质祖细胞群和获得自我更新的表型同质少突胶质祖细胞群的方法。其它方法包括维持和保存同质的少突胶质祖细胞群较长时期而不改变细胞特征的方法，和去分化少突胶质祖细胞的方法。自我更新的，表型同质少突胶质祖细胞群或同质少突胶质细胞群可以用于治疗患有中枢神经系统疾病或病理状态的患者。
文档编号C12N5/02GK1833021SQ200480019375
公开日2006年9月13日 申请日期2004年7月19日 优先权日2003年7月18日
发明者H·冈崎 申请人:大冢制药株式会社