专利名称：端脑胶质限制性细胞群和相关组合物及方法
端脑胶质限制性细胞群和相关组合物及方法 相关申请的交叉引用
本申请要求2007年4月17日提交的美国临时申请第60/912,387号的 优先权，其通过引用的方式全文并入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明在美国国立卫生研究院授予的资助号为NS042800251和 1T32NS051152-01的政府支持下进行。政府对本发明享有某些权利。
背景
中枢神经系统(CNS)的损伤与多种损害类型相关，它们都对组织修 复提出相当大的挑战。
概述
本文提供了端脑胶质限制性前体细胞群和相关组合物。进一步提供了 使用和产生端脑胶质限制性前体细胞群的方法和相关化合物。例如，公开 的方法包括治疗受治疗者CNS损伤的方法，其包括向受治疗者施用端脑胶 质限制性前体细胞或衍生自端脑胶质限制性前体细胞的细胞。
附图被引入并组成本说明书的 一部分，其阐明了所公开的方法和组合 物中的若干种，且和说明书一起用于解释所公开方法和组合物的原理。图1A、 1B、 1C和1D是显示端脑中的A2B5+细胞的显微图。图1A 显示E15端脑的发育中的紋状体和背外侧新皮层冠状切片中的A2B5+细 胞。图1B显示发育中的海马区中不存在A2B5+细胞。图1C和1D显示背 侧的A2B5+区不是01ig2+(图1C)而腹侧的A2B5+区部分地与发育中的紋状 体的01ig2+域重叠(图1D)。图1E显示A2B5VPSA-NCAM-染色的细胞的 FACS数据，显示三种细胞群，包括PSA-NCAM+、 A2B5"7PSA-NCAM+和 A2B5+。比例尺100 pm。
图2A、 2B和2C是显微图，显示E15端脑背侧中的A2B5+细胞子集 也是卩III微管蛋白+。图2A-C显示从端脑背侧分离的A2B5+/PSA-NCAM-细胞群，包括(3III微管蛋白+群，见于分离后1小时(图2A)、 12小时(图 2B)和4天(图2C)。图2D是柱状图，显示在E13和E20之间分离的 A2B5+ZPSA-NCAM-细胞被染色并分析卩III微管蛋白的存在。确定E15是 分离A2B5VPSA-NCAM7卩III微管蛋白-细胞的峰时间，因为21%的E15 A2B5+ZPSA-NCAM-群是卩III微管蛋白-。DAPI核染色。比例尺100 pm。
图3A、 3B和3C显示用于表征推定的胶质限制性前体群的分离程序 的概述。由MACS选择A2B5"7PSA-NCAM-细胞，产生细胞的异质混合物。 对于大量培养研究(图3A)和克隆分析(图3B),将细胞在培养中保持两次细 胞传代以选择增殖性细胞并除去A2B5+神经元群。随后将所得的推定胶质 限制性前体群以大量培养或克隆密度铺板，并接触包括促少突胶质细胞条 件、促星形胶质细胞条件或促神经元条件的分化条件。选择地，将从MACS 选择获得的细胞异质混合物以克隆密度铺板，将所得的克隆选择性地传代 并分到分化条件(图3C)。
图4A、 4B、 4C、 4D、 4E和4F是显微图，显示推定的背侧胶质限制 性前体群可在大量培养中产生大胶质细胞亚型。接触合适的分化条件6天 后，推定的胶质限制性前体细胞产生GalC+细胞(图4A)和GFAP+细胞(图 4C)但不产生神经元(图4D)。图4B显示在促少突胶质细胞条件生长4天后， 04+细胞易于辨认。图4E和4F显示推定的胶质限制性前体群接触BMP-4 直到10天时才足以导致才企测到已知的星形胶质细胞标志物GFAP(图4E)， 但在6天后确实诱导星形胶质细胞前体细胞标志物CD44 (图4F)。 DAPI核染色(图4D和4F)。比例尺100 |am。
图5A和5B显示从E15未分类的背侧和腹侧的端脑细胞产生神经元 的显微照片。为了确认所使用的促神经元条件，在MACS选择前将El5 背侧的(图5A)和腹侧的(图5B)端脑中存在的细胞接触用于胶质限制性前体 表征的促神经元条件，发现其培养6天后产生(3 ni微管蛋白+细胞。比例 尺100|im。
图6A、 6B和6C是显微图，显示对推定的背侧的胶质限制性前体的 克隆分析进一步指示胶质限制性。为了区分可能存在的APC/OPC细胞混 合物和存在的胶质限制性前体群，将推定的胶质限制性前体群以克隆密度 培养并接触分化条件，导致^r测到包含GalC+细胞的克隆(图6A)、包含 GFAP+细胞的克隆(图6B)，但没有包含神经元的克隆(图6C)。 DAPI核染 色。比例尺100 pm。
图7A、 7B和7C是显微图，显示克隆分开(splitting)证实推定的胶 质限制性前体细胞产生少突胶质细胞和星形胶质细胞两者的能力。 A2B5+ZPSA-NCAM-生成细胞的分开的克隆可产生GalC+细胞(图7A)、 GFAP+细胞(图 7B)、 但不产生神经元(图 7C), 并允许将 A2B5+/PSA-NCAM-/J3 III微管蛋白-细胞分类为胶质限制性前体细胞。DAPI 核染色。比例尺100|im。
图8A、 8B、 8C、 8D、 8E、 8F、 8G、 8H和81是显微图，显示端脑背 侧具有独立于腹侧细胞浸润而产生胶质限制性前体细胞的潜能。图8A、 8B 和8C显示具有对背侧的胶质限制性前体群所述的类似抗原谱(profile)的细 胞从体外生长两天的背侧外植块分离，并在大量培养中可产生GalC+细胞 (图8A)、 GFAP+细胞(图8B)但不产生神经元(图8C)。图8D、 8E和8F显 示外植块衍生的推定的胶质限制性前体当接触分化条件时可产生包含 GalC+细胞的克隆(图8D)、包含GFAP+细胞的克隆(图8E)，但不产生包含 神经元的克隆(图8F)。图8G、 8H和8I显示外植块衍生的推定的胶质限制 性前体生成细胞的分开的克隆可产生GalC+细胞(图8G)、GFAP+细胞(图8H) 但不产生神经元(图81)。 DAPI核染色。比例尺100(xm。
图9A、 9B、 9C、 9D、 9E、 9F、 9G、 9H、 9I和9J是显微图，显示可从E15端脑腹侧分离胶质限制性前体群细胞。图9A、 9B和9D显示从AEP 和MGE组成的E15端脑腹侧分离共有背侧的胶质限制性前体群的类似抗 原谱的推定的胶质限制性前体细胞。该细胞群在大量培养中产生GalC+细 胞(图9A)和GFAP+细胞(图9B)，但不产生神经元(图9D)。图9C显示推定 的胶质限制性前体细胞不能使A2B5+/GFAP+ II型星形胶质细胞响应于 CNTF。为了区分存在的APC/OPC和存在的胶质限制性前体，将腹侧的推 定的胶质限制性前体细胞以克隆密度培养，并当在克隆水平检查时产生 GalC+细胞(图9E)和GFAP+细胞(图9F)但不产生神经元(图9G)。腹侧推定 胶质限制性前体生成细胞的分开的克隆产生GalC+细胞(图9H)和GFAP+细 胞(图91)但不产生神经元(图9J)。 DAPI核染色(图9A、 9C-9J)。比例尺 100 fxm。
图IO是柱状图，显示从背侧、腹侧和外植块衍生的胶质限制性前体 产生的克隆的概述，包含星形胶质细胞和包含少突胶质细胞的克隆数目之 间没有显著差异(pX).05; Student's t-检验)。
图11A、 11A，、 11B、 11B，、 IIC、 IIC，是电镜照片，11D、 IIE、 IIF、 IIG、 IIH和lll是荧光显微图，显示背侧的胶质限制性前体和外植块衍生 的背侧的胶质限制性前体产生紧凑髓鞘，除了腹侧的和背侧的胶质限制性 前体两者在体内制造星形胶质细胞的能力之外。图IIA-C，显示移植的
shiverer前脑对侧半球的EM图像，显示在纵切的(图IIA)和横切的(图IIA，) 神经元纤维缺失致密、紧凑的髓鞘，这与shiverer突变表型一致。从E15 端脑背侧分离并移植到出生后18天(P18)的shiverer前脑的背侧的胶质限制 性前体能够形成髓鞘，如纵切的(图IIB)和横切的(图IIB，)神经元纤维中可 见的。将从体外生长两天的E13背侧的端脑外植块衍生的背侧的胶质限制 性前体细胞移植到P18 shiverer突变前脑产生紧凑髓鞘，如纵切的(图11C) 和横切的(图IIC，)神经元纤维可见的。图11D-F显示移植到P0大鼠幼畜 前脑的hPAP+背侧的胶质限制性前体10天后产生hPAP+ZGFAP+细胞以及 01ig2+少突胶质细胞(图IIG-I)。 DAPI核染色(图IIF)。 IIA-C，的比例尺如 所示，IID-I的比例尺100 pm。
图12显示经由端脑胶质限制性前体(tGRP)群产生胶质亚型的模型。端
7脑背侧和端脑腹侧产生主要发育命运为分别产生星形胶质细胞和OPC的 胶质限制性前体群。使用其分离和体外表征以除去促进背侧的星形胶质细
胞产生和腹侧的OPC形成的正常发育暗示，将这两群分类为真正的tGRP 群。由于端脑腹侧和端脑背侧继续发育，各tGRP群具有参与腹侧朝向星 形胶质细胞或背侧朝向OPC的第二发育命运的可能性。在体外揭示各群的 发育可塑性，并且其证实从共同前体细胞类型发育少突胶质细胞和星形胶 质细胞的可能性。
图13A是显微图，显示脊髓GDASP，(CNTF诱导的)星形胶质细胞表 达GFAP和01ig2两者。细胞在生长因子存在下生长4天。
图13B是显微图，显示基于缺失01ig2/GFAP共定位，CNTF诱导的 衍生自tGRP的GFAP+星形胶质细胞不类似scGDAgbpl3Q。
图14显示腹侧和背侧的tGRP的胞内氧化还原状态。如由氧化的染料 荧光的几何平均值所测量的，与腹侧的tGRP相比，背侧的tGRP具有更高 胞内氧化还原水平。
图15A、B和C是显微图，显示tGRP经由PSA-NCAM/PDGFRa/01ig2+ 中间物产生GalC+少突胶质细胞的迹象。经由通常描述的OPC (PSA-NCAM/PDGFRa/01ig2+)中间物的tGRP传代，提供tGRp负责体内产 生OPC的证据，并增加通过使用tGRP作为起始群可实现的可能的中间细 胞命运数目。
详述
本公开涉及来自端脑的i普系限制性胶质前体细胞。例如，本文提供了 端脑胶质限制性前体(tGRP)细胞群。还提供了相关的组合物并包括但不限 于，衍生自端脑胶质限制性前体细胞群的任何细胞或细胞群。相关组合物 的一个实例是衍生自端脑胶质限制性前体细胞的1型星形胶质细胞或其 群。相关组合物还可包括联合tGRP细胞或群、或衍生自tGRP细胞或细胞 群的细胞或细胞群的其它化合物、药剂或分子。还提供了 01ig2l交质限制 性前体(GRP)细胞和细胞群。任选地，该OligrGRP是从端脑背侧分离的。进一步提供使用和产生端脑胶质限制性前体细胞群的方法和相关组 合物。这些方法包括但不限于，治疗受治疗者CNS损伤，包括向受治疗者 施用端脑胶质限制性前体细胞、或衍生自端脑胶质限制性前体细胞的细 胞。细胞可联合本文所述的其它化合物、药剂或分子施用。
端脑胶质限制性前体细胞群包括在端脑腹侧的和背侧的产生星形胶 质细胞和少突胶质细胞的前体群。背侧的胶质前体细胞可从端脑背侧从头 产生，并且在移植于受治疗者后，它们可用于体内产生形成髓鞘的少突胶 质细胞和星形胶质细胞。
在中枢神经系统(CNS)中，鉴定发育中牵涉的具体细胞群的最大的进 展在脊髓中实现。在大鼠脊髓中，胚胎第10.5天(E10.5)的细胞已经显示呈 现能够产生神经元和胶质谱系两者的细胞的多能神经上皮干细胞(NEP)的 均一群。
通过能够长期增殖并产生神经元或胶质的i普系限制性中间前体群从 这些NEP细胞产生分化细胞类型。包含限制于少突胶质细胞和星形胶质细 胞形成的最早的中间前体群的细胞，称为胶质限制性前体细胞(GRP)，其 可从胚胎脊髓早在E12分离。已在体外和体内确证其产生两种抗原上不同 的星形胶质细胞群和少突胶质细胞群的能力。
以A2B5抗体鉴定GRP细胞，GRP细胞不表达多聚唾液酸化形式的 神经细胞粘连分子(PSA-NCAM)。新分离的GRP细胞依赖于碱性成纤维细 胞生长因子(bFGF)以存活和增殖，但不同于少突胶质细胞祖细胞(OPC)， 不受血小板衍生的生长因子受体-a (PDGFR-a)或01ig2表达的限定。OPC 已显示在体内在晚于GRP的时间点产生，且已在体外证实从GRP群产生 少突胶质细胞发生在OPC中间阶段。
形胶质细胞(称为1型和2型)和体内产生少突胶质细胞和星形胶质细胞两 者的能力。1型和2型星形胶质细胞都是GFAP+,但只有2型星形胶质细 胞具有A2B5抗体共标记。认为1型星形胶质细胞从GRP细胞经由中间的 星形胶质细胞祖细胞(APC)产生，而2型星形胶质细胞可需要先产生OPC 作为中间步骤。不同于OPC， GRP细胞在移植到成人CNS后易于产生星
9形胶质细胞，而原代OPC在这种移植中只产生少突胶质细胞。
鉴定脊髓中的GRP细胞导致获得胶质发生(gliogenesis)的普遍化模型。 该胶质发生模型包括从多能NEP细胞发展到谱系限制性多能前体细胞群 (如，GRP)，其反过来产生更具限制性的胶质前体细胞类型(如，OPC和可 能的APC)和最终的CNS成熟胶质细胞(如，少突胶质细胞和星形胶质细 胞)。
已经通过遗传和克隆体外实验确定，来自端脑腹侧区的细胞子集分化 为PDGFR-a+和/或01ig2+少突胶质细胞祖先，从其腹侧来源迁移出，并遍 及脑产生成熟的少突胶质细胞。看起来表达Oligl/2的这些细胞注定会成 为少突胶质细胞，因为复合破坏Oligl和01ig2导致完全丧失少突胶质细胞。
本文提供能够产生少突胶质细胞和星形胶质细胞，但在通常促进神经 元谱系产生的条件下不能产生神经元的端脑前体细胞群。通常在体外促进 神经元谱系产生的条件的实例包括接触神经营养蛋白-3 (NT-3)(如，以10 ng/ml)加全反式视黄酸(RA)(如，以100 nM)、接触胶质生长因子(GGF)(如， 以10ng/ml)、或接触脑源性神经营养因子(BDNF)(如，以10ng/ml)。提供 的tGRP细胞在这些示例条件下不产生神经元。
基于脊髓中预先鉴定的限制性前体细胞的抗原表型，从端脑背侧分离 细胞群。以大量培养并在克隆水平表征这些端脑细胞，发现其产生所有大 胶质细胞亚型但在通常促进神经元谱系产生的条件下不能产生神经元。
通过在其中存在的细胞群全部是背侧来源的时间点分离端脑背侧，确 定端脑背侧能够从头产生该胶质限制性群。平行地检测腹侧的胶质限制性 细胞群。
证实了在缺少髓鞘的背景中背侧的细胞群移植后分化为产生髓鞘的 少突胶质细胞的能力，以及移植到产期前脑时分化为GFAP+星形胶质细胞 的能力。因此，本文描述从胚胎端脑分离的前体细胞群，其能够产生少突 胶质细胞和星形胶质细胞两者，但在通常促进神经元镨系产生的条件下不 能产生神经元后代。还提供限定的细胞群，其在端脑背侧面从头产生并是背侧衍生的胶质 细胞的来源。进一步提供端脑中的可腹侧地以及背侧地作为星形胶质细胞 来源的细胞群。因此，本文公开了胶质发生模型，胶质细胞借助该模型以 及时和有序的方式在发育中的端脑中起源。
本文提供了用于治疗CNS损伤(包括CNS的创伤或退行性病症)、促 进轴突再生、遏制星形胶质增生、重新排列宿主组织以及延緩轴突生长抑
制性蛋白聚糖表达的组合物和方法。因此，提供了治疗受治疗者CNS损伤 的方法，包括向受治疗者施用包含端脑胶质限制性细胞群和/或衍生自端脑 胶质限制性细胞的细胞(包括tGRP后代或其组合)的组合物。tGRP后代 包括从tGRP衍生的或产生的任何GFAP+细胞。例如，tGRP后代包括tGRP 衍生的星形胶质细胞、GDA和APC。任选地，该GDA是1型GDA。任 选地，该星形胶质细胞是1型星形胶质细胞。tGRP后代还包括从tGRP衍 生的或产生的任何GalC+细胞。例如，tGRP后代包括少突胶质细胞。还提 供治疗受治疗者CNS损伤的方法，包括向受治疗者施用OligZ细胞。所描 述的细胞或其组合可联合如本文所述的其它组合物施用。
所述方法可用于治疗脊髓损伤或其它CNS损伤。该方法还可用于其中 期望促进宿主组织再生和/或重新排列、调节CNS结疤应答以及拯救神经 元以免萎缩和死亡，或其任意组合的CNS病变。
用在本文时，术语GDA(胶质限制性前体衍生的星形胶质细胞)指胶质 原纤维酸性蛋白(GFAP)+ZA2B5-细胞，其在此也称为1型GDA,除非明 确指2型GDA (GFAP十/A2B5+细胞)。
干细胞和神经前体细胞的移植成功有限可能是由于成年CNS损伤的 炎性环境，其指引未分化的神经干细胞或胶质前体成瘢疤星形胶质细胞样 表型。瘢疤星形胶质细胞不能很好地支持轴突生长。
本文描述的方法和组合物可以提供替代方案，以允许病变环境指引干 细胞或前体细胞分化而仍旧保留以未分化的细胞开始的益处。本文提供了 治疗受治疗者CNS病变的方法，包括对受治疗者施用包含端脑胶质限制性 前体细胞或衍生自tGRP细胞的细胞的组合物。术语病变用于本文指CNS 损伤的位点、CNS疾病发展、退行性损害或结疤的位点，在该位点中促进
ii再生将提供益处。
端脑胶质限制性前体(tGRP)群可产生少突力交质细胞、APC，并可优先
地产生1型GDA和1型星形胶质细胞(相对于2型星形胶质细胞)。由于 tGRP细胞在体内神经原性环境不能产生神经元表型，tGRP细胞在体内受 限制于胶质谱系。tGRP细胞在新生儿和成人脑中存活并迁移。移植的tGRP 细胞可在缺乏髓鞘的背景下分化为形成髓鞘的少突胶质细胞，还可在正常 的新生儿脑中产生不成熟的少突胶质细胞。当施用于CNS病变时，移植的 tGRP细胞还可分化为1型GDA和1型星形胶质细胞。在一些方面中，这 种移植的tGRP细胞不产生2型星形胶质细胞。
细胞培养技术可以用于制备tGRP、 APC、 GDA、星形胶质细胞和少 突胶质细胞。作为实例，可使用标准方法(例如流式细胞术或免疫淘选) 从胚胎端脑的解离的细胞悬液分离A2B5+ tGRP。
tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞或少突胶质细胞可 以利用本领域已知的程序永生，以便保存tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、 星形胶质细胞或少突胶质细胞的持续来源。永生的tGRP或tGRP衍生的 APC、 GDA、星形胶质细胞或少突胶质细胞可以在体外无限地维持。各种 永生方法是本领域已知的，包括但不限于，病毒转化(例如使用SV40、 多瘤病毒、RNA或DNA肿瘤病毒，埃巴病毒(Epstein Barr Virus )、牛乳 头瘤病毒、或其基因产物)以及化学诱变。细胞系可以利用复制缺陷的病 毒永生，或者仅仅利用转化病毒基因产物的表达永生。例如，tGRP或tGRP 衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞或少突胶质细胞可以通过用于表达复制 缺陷的转化病毒或其基因产物的重组表达载体转化。这些程序是本领域已 知的。
tGRP可以在适合的培养基中于培养物中维持。例如，tGRP可以维持 于在混合的层粘连蛋白/纤连蛋白基质上具有约0.1-100 ng/ml bFGF和 SATO补充物的培养物中。为了使tGRP分化为GDA, tGRP可以接触例如
还公开了 BMP家族其它成员，或者在1型星形胶质细胞的抗原性范围内 沿星形胶质细胞途径诱导分化的其它信号转导分子的使用。
12tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞或少突胶质细胞可 以被冷藏。冷藏活细胞的各种方法是已知的且可以被使用(参见例如， Mazur， 1977, Cyrobiology 14:251-272; Livesey和Linner, 1987, Nature 327:255; Linner等人,1986， J. Histochem. Cytochem. 34(9): 1123-1135; Senkan等人的美国专利第4,199,022号；Schwartz的美国专利第3,753,357 号；Fahy的美国专利第4,559,298号，至少为了其中所述的方法而通过引 用将这些文献并入本文)。
用于本文所述方法的GDA可以利用下述方法产生，其包括从受治疗 者分离端脑细胞、纯化A2B5阳性tGRP、以及用BMP培养所述细胞。
为了保证用于移植的GDA悬液不含有未分化的tGRP或具有2型星形 胶质细胞表型的细胞，污染的细胞类型可以从悬液中利用诸如用A2B5抗 体的免疫淘选而除去。小量获得的悬液可以覆在玻璃盖玻片上并用A2B5 和GFAP抗体标记以验证均一的1型星形胶质细胞表型。对于移植，GFAP 阳性/A2B5阴性GDA可以103-106细胞/pL密度悬浮于诸如Hanks平衡盐 溶液的适合的培养基中。
tGRP ^f汙生的GDA可通过接触BMP来产生，并落入由其作为1型星 形胶质细胞的抗原性表型定义的细胞群内。对从出生后CNS中纯化的细胞 的体外研究显示，出生后来源的1型星形胶质细胞在体外促进神经突从多 种神经元广泛生长、表达高水平的轴突生长支持性分子，例如层粘连蛋白 /纤连蛋白以及NGF/NT-3，并且还在体外显示出最小的硫酸软骨素蛋白聚 糖免疫反应性。然而，尽管未成熟的皮质星形胶质细胞移植入成年脑损伤 或急性成年脊髓损伤已显示出遏制星形胶质增生，但只观察到了有限的内 源性轴突出芽，而轴突没能穿透移植体(graft)中心或者再进入损伤位点 外的白质。
因此，尽管GDA显示像1型星形胶质细胞的抗原性表型，但GDA是 独特细胞类型，当被移植入CNS病变位点时促进前所未有水平的组织重 整、轴突再生和运动复原。
GDA在移植入CNS病变位点后促进可靠的轴突再生和功能复原。 GDA填充损伤位点、遏制星形胶质增生、重新排列宿主组织以及延緩轴突生长抑制性蛋白聚糖表达的能力表明，这些细胞具有有效地提供轴突再生
环境的能力。结合其明显地降低轴突切断的(axotomized ) CNS神经元萎 缩以及支持可靠的行为复原的能力，这些性质使得GDA成为修复损害的 或病态的CNS的高效细胞类型。因此，GDA可以促进轴突再生、遏制星 形胶质增生、重新排列宿主组织、延緩轴突生长抑制性蛋白聚糖表达，或 其任意组合。
本文提供分离的tGRP细胞或分离的tGRP细胞群。如本文所使用，术 语分离的指从其天然环境中被分离的细胞或细胞群，例如，从供体动物(如 人或胚胎)中取出。分离的细胞或细胞群可以是组织样品的形式，例如完 整的细胞片层(例如细胞单层)，或者其可以在细胞悬液中。术语分离的 不排除其它细胞的存在。术语群意图包括两个或更多个细胞。群中的细胞 可以从相同或不同来源获得。
端脑胶质限制性前体细胞可从哺乳动物(包括胚胎)分离，该哺乳动 物选自人类和非人类灵长类、马科、犬科、猫科、牛科、猪科、绵羊科动 物、大鼠和兔形目动物组成的组。
本文提供分离的细胞群，其包含至少约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99。/0或100%的 纯tGRP群或介于10%至100%的任何百分比。因此，例如，分离的细胞群 可包括至少90%的tGRP。分离的群还可包括至少95%的tGRP或至少99% 的tGRP。还提供包含相同百分比OligZ GRP细胞的细胞群。Oligr GRP 细胞任选地是从端脑背侧分离的。
任选地，分离的细胞群不包括2型星形胶质细胞。任选地，分离的细 胞群不包括全能或多能干细胞，诸如ES细胞或神经上皮干细胞。然而， 分离的细胞群还可包括约0.01%、 0.05%、 0.1%、 0.5%、 1%、 2%、 3%、 4%、 5%、 6%、 7%、 8%、 9%或10%的2型GDA、 2型星形胶质细胞、APC、 全能干细胞、多能细胞、未分化的胶质前体、或其任何组合。因此，例如， 分离的细胞群可包括少于10%的2型GDA。分离的细胞群还可包括少于
型特异性的标志物和通过视觉观察确定群中细胞类型的百分数来确定。还提供了与包括化合物、药剂或分子的其它组合物联合的包含分离的细胞群的纟且合物。
纯化的细胞群可生长在基质(substratum)上独立于伺养细胞的培养物中并在设置为支持端脑胶质限制性前体细胞或其衍生物的粘附生长的培养基中，并在有助于所述前体细胞和其衍生物生长的温度和气氛下。端脑胶质限制性前体细胞和衍生物可使用诸如特异性抗体捕获、荧光活化的细胞分选、磁珠捕获和类似程序等程序纯化。
本文提供分离的tGRP衍生物或后代细胞、或分离的tGRP衍生物或后代细胞的群。任选地，tGRP衍生物或后代细胞是GFAP+。例如，衍生物或后代细胞可为APC、 1型GDA或1型星形胶质细胞。另一方面，tGRP衍生物或后代细胞是GalC+。例如，tGRP衍生物或后代细胞可为少突胶质细胞。
因此，本文提供衍生自tGRP、或分离的tGRP群的分离的APC、 GDA、星形胶质细胞或少突胶质细胞、或分离的APC、 GDA、星形胶质细胞或少突胶质细胞群。tGRP衍生的分离的APC 、 GDA 、星形胶质细胞或少突胶质细胞群可包括至少约10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、 99%或100%的各种相应细胞类型的纯的群或介于10%至100%的任何百分比。因此，例如，分离的细胞群可以包括至少90%的APC、 GDA、星形胶质细胞或少突胶质细胞。分离的群还可以包括至少95%的APC、 GDA、星形M^质细胞或少突胶质细胞或至少99。/。的APC、 GDA、星形胶质细胞或少突胶质细胞。在某些方面，分离的细胞群不包括2型星形胶质细胞或2型GDA。任选地，分离的细胞群不包括全能或多能干细胞，例如ES细胞或神经上皮干细胞。然而，本文方法中分离的细胞群可以包括至多约0.01%、 0.05%、 0.1%、 0.5%、 1%、 2%、3%、 4%、 5%、 6%、 7%、 8%、 9%或10%的2型GDA、 2型星形月交质细胞、全能干细胞、多能细胞、未分化的胶质前体(例如GRP)，或其任何组合。因此，例如，分离的细胞群可以包括少于10%的2型GDA。分离的细胞群还可以包括少于5%的2型GDA。
细胞群的纯度可以利用诸如检测对培养物中不同细胞类型特异的标志物和通过视觉观察确定群中细胞类型的百分数来测定。本文还提供了与包括化合物、药剂或分子的其它组合物联合的包含分离的细胞群的组合物。
可使用本领域已知的标准方法施用tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合，以用于促进CNS神经再生和/或瘢疤减少。可施用tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合，以治疗期望促进CNS再生和/或减少瘢疵形成的受治疗者。因此，tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合可以任何常规制剂施加到病变区域。
病变位置没有限制。因此，脑或脊髓的任何部位可被治疗。例如脑皮质、中脑、丘脑、下丘脑、紋状体、黑质、脑桥、小脑、髓质或任何颈、胸、腰、或骶骨脊髓节段。该方法可用于任何神经系统病变，包括例如脊髓损伤造成的那些(例如，导致呼吸麻痹、四肢麻痹和下身麻痹)。
tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合也可以施用于神经系统已因创伤、手术、缺血、感染、代谢疾病、营养缺乏、恶性肺瘤、毒剂、副肺瘤综合征和神经系统退行性病症所损害或损伤的患者。这些病症的实例包括但不限于阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化症、进行性核上眼神经麻痹症(progressive supranuclear palsy )以及神经病变。tGRP或tGRP衍生的APC、GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合可施用于伤口以减少瘢疤形成。因此，手术后可施用tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合，以便减少因诸如动-静脉畸形、坏死、出血以及开颅术引起的来自病变的瘢疤形成(其可以导致继发性癫痫)。tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合也可以通过稳定癫痫灶并减少瘢疱形成用于治疗癫痫。
治疗可以在病变发病后例如24小时内或者可选地例如1周、5年或甚至超过10年进行。在可以预测病变的情况下(例如手术过程中)，tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合可以在发生前或者期间递送。
16tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合可以通过直接施用而递送，例如，通过直接注射tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合的样品入神经组织损害位点。例如脊髓可以利用推板切除术暴露，以及使用微量注射器在手术显微镜下注射细胞悬液。当获得高分辨率MRI图像时，细胞悬液可以在推骨间注射(例如利用腰推穿刺技术)而不进行推板切除术。
治疗神经病学或神经变性损伤的方法包括向需要这种治疗的哺乳动物施用有效量的端脑胶质限制性前体细胞或其衍生物。可致使tGRP细胞或其衍生物(l)在被施用前体外增殖和分化，或(2)在被施用前体外增殖并在被施用后进一步体内增殖和分化，或(3)在被施用前体外增殖并随后在被施用后体内分化而不进一步增殖，或(4)新分离后直接注射后体内增殖和分化。tGRP细胞或其衍生物可来自异种供体或自体供体。供体可为胎儿、青少年或成人。待治疗的损伤可为多发性硬化、脊髓损伤、CNS创伤、其中期望轴突再生的疾患、其中期望控制或减少胶质瘢疤形成的疾患、任何髓鞘形成障碍病症或酶病症。tGRP细胞、其衍生物或组合可在CNS中局部或普遍地施用。
任选地，tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合在部分地妨碍其移动性以便将tGRP或tGRP衍生的APC、GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合定位到病变位点的介质中递送。作为实例，tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合可以糊剂或凝胶递送，其包括例如生物可降解的凝胶样聚合物(例如纤维蛋白或水凝胶)。这种半固体介质可妨碍不希望的间充质组分(例如成纤维细胞)迁移(瘢疤产生)入所述位点。
任选地，可使用聚合物植入物(polymer implants )和手术分流技术施用tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合。聚合物植入物和手术技术的应用是本领域技术人员已知的。例如，tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合可以以所述tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合接种(seeded)或包覆到聚合物植入物上的形式施用于病变位点。具有各种组成、孔径以及几何结构的各种类型的聚合物植入物可用于本文。这些聚合物包括但不限于由硝酸纤维素、聚酐和丙烯酸类聚合
物所制造的那些(参见例如，在欧洲专利公布第286284号；Aebischer等人，1988, 5ra/" / 仏454:179-187; Aebischar等人，1988,W仏78:599-603; Winn等人，1989， Exp. A^wra/. 105:244-250中所述的那些，至
聚合物可用作合成桥，通过施用tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合至桥末端或附近可以在其上促进神经再生并可以减少瘢疤形成。例如，在一个或多个末端，或者整个管具有tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合的丙烯酸类聚合物管可被用于在。彖侧桥接(例如脊髓)病变或绕过病变，在其上可诱导再生。可以例如在背柱或背传入神经(dorsal afferents )内使用半渗透管，该管可以含有营养因子或抗炎剂并提供该营养因子或抗炎剂的释放。可使用的管的类型是本领域技术人员公知的。
表现出再生生长或旁枝出芽(collateral sprouting)的轴突纤维遇到抑制性环境以及需要容许性桥接物质的物理间隙。因此，合成桥可以用于本文描述的方法。生物基质材料领域的进展提供了以可促进再生的人工材料(例如生物可降解的水凝胶、或水凝胶与细胞的组合)桥接该间隙的机会。合成桥需要的特性是同时提供轴突附着和生长的物理基质而不引发抗原性宿主反应。
任选地，tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合，可联合包括治疗或药理化合物、药剂和分子的其它组合物施用。例如， 一些药剂已被用于急性脊髓损伤(SCI)处理和CNS病变，所述药剂可与所述组合物和方法组合使用。这些药剂包括减少水肿和/或炎性应答的药剂。示例性药剂包括但不限于，类固醇，例如甲基强的松龙；脂质过氧化抑制剂，例如甲磺酸替拉扎特(拉扎类固醇(lazaroid));和抗氧化剂，例如环孢菌素A、 EPC-K1、褪黑素以及高剂量纳洛酮。因此，包含tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合的组合物可以进一步包括曱基强的松龙、曱磺酸替拉扎特、环孢菌素A、EPC-K1、褪黑素或高剂量纳洛酮或其任意组合。
包含tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细 胞或其组合的组合物也可以包括谷氨酸受体拮抗剂，包括但不限于非竟争 性vV-曱基-D-天冬氨酸(NMDA)离子通道阻断剂MK-801 (地佐环平， Merck & Co " Inc ., Whitehouse Station , NJ )、 1,2,3,4國四氢-6-硝基画2,3-二氧 代苯并[/]喹喔啉-7-磺酰胺(NBQX )、加环利定(GK-ll， Beaufour-Ipsen, Paris France)和胍丁胺。
抗炎剂(例如CM101、细胞因子IL-IO)和选择性环氧合酶(COX)-2 抑制剂可以与tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶 质细胞或其组合结合使用。因此，该组合物可以进一步包括CM101、 IL-10 或选择性COX-2抑制剂或其任意组合。
tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或 其组合也可以与凋亡抑制剂结合使用，例如胱天蛋白酶(caspase)抑制剂 (例如Bcl-2 )和4丐激活中性蛋白酶抑制剂。
包含tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细 胞或其组合的组合物还可包括外源性神经营养蛋白，包括但不限于神经生 长因子(NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、睫状神经营养因 子(CNTF)、神经营养因子-3和4/5(NT-3、 NT-4/5 )、成纤维细胞生长因子 (FGF)及脑源性神经营养因子(BDNF)或其任意组合。
导蛋白、脑信号蛋白、肝配蛋白、生腱蛋白、整联蛋白及硫酸软骨素 蛋白聚糖(CSPG)的抑制剂可以与tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星 形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合联合使用。例如软骨素酶可用于除去 CSPG。因此，该组合物可以进一步包括导蛋白、脑信号蛋白、肝配蛋白、 生腱蛋白、整联蛋白或CSPG的抑制剂。因此，该组合物可以进一步包括 软骨素酶。
包含tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细 胞或其组合的组合物还可包括中和NoGo (髓鞘源性生长抑制性蛋白)的 抑制性蛋白活性的IN-1抗体、髓鞘相关糖蛋白(MAG)或其任意组合。可以联合tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形月交质细胞、少突胶
突生长的药剂。因此，可以在本文的组合物和方法中使用肌苷(一种噪呤 核苷)和cAMP以及化合物AIT-082 (—种合成的含有对氨基苯曱酸部分 的次黄噪p令书亍生物)(例如Neotrofm; NeoTherapeutics, Newport Beach, CA)。因此，该组合物可以进一步包括AIT-082。
基因治疗使得能改造细胞，这结合了细胞与基因递送系统的治疗优 点。例如，如果需要递送神经营养蛋白，形成髓鞘和分泌神经营养蛋白的 细胞可以被改造以促进神经突生长并修复神经功能。
来自患者自身血液的巨噬细胞(自体巨噬细胞)可以被活化并联合 tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组 合植入损伤位点。患者自身的活化巨噬细胞可以清除退变髓鞘碎屑(富含 非容许性因子(non-permissive factor)),并因此促进再生生长而不引起免疫 应答。
包含tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细 胞或其组合的组合物可以进一步包括免疫抑制药物，例如环孢菌素、他克 莫司(FK505 )、环磷酰胺(cyclophosamid )、碌^坐嘌呤、曱氨蝶呤、咪唑 立宾(mizoribin)，单独或者以其任意组合或应用。因此，组合物可以进一 步包括环孢菌素、他克莫司(FK505 )、环磷酰胺、硫唑嘌呤、曱氨蝶呤或 咪唑立宾。
联合tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细 胞或其组合施用的任何组合物的施用可在施用tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合之前、同时或之后进行。因 此，本文描述的方法可进一步包括在施用tGRP或tGRP衍生的APC、GDA、 星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合之前、期间或之后施用包含药剂、 化合物或分子的组合物。本文描述的组合物和方法可包括以任意组合包含 药剂、化合物或分子的组合物。作为实例，本文所述的含有tGRP或tGRP 衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合的组合物也可 包括谷氨酸受体拮抗剂和神经营养蛋白。包含药剂、化合物或分子的一种或多种组合物可以与含tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、 少突胶质细胞或其组合的组合物一起配制或者可与本文所述含tGRP或 tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合的组合 物分开施用。如果分开施用，包含药剂、化合物或分子的一种或多种额外 组合物可以视情况在含tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、 少突胶质细胞或其组合的组合物之前、之后或同时施用。
包含药剂、化合物或分子的組合物或疗法的任何组合可以与本文所述 的tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其 组合组合，即使没有明确地提及作为组合。例如，免疫抑制药物和tGRP 或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合的组 合可以进一步包括本文提及的任何其它药剂(例如，桥、神经营养因子和 /或抗炎剂)。
待施用的tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶 质细胞或其组合的数量可取决于物种、年龄、体重和病变程度。任选地， 对于成年患者，总计施用的剂量在约103-108的范围，包括103-105、 105-108、 104-107细胞或在这些范围内的任何量。
所施用的tGRP细胞或其衍生物或其混合物的有效量是指足以获得所 选的效果的细胞的量或数目。例如，治疗瘢疤形成的tGRP细胞的有效量 可为足以获得瘢疤形成量可测量的减少的细胞量。tGRP细胞可通常以约 5-50,000细胞/微升的浓度施用。任选地，施用可以每注射部位达约15微 升的体积进行。然而，向中枢神经系统的施用可包括为该体积许多倍的体 积。
如本文所使用，治疗(treating)或治疗(treatment)并非必须指彻底 治愈。其也可指潜在疾病的一种或多种症状减少，和/或造成症状的潜在的 细胞、生理或生物成因或机制中的一种或多种的减少。应理解的是在上下 文中使用的减少指相对于疾病状态，包括疾病的分子状态，而不仅仅是疾 病的生理状态。
当术i吾予贞防(prevent )、予贞防(preventing )和予贞防(prevention )连同 对特定疾患的特定治疗用于本文(例如预防CNS病变)时，它们指被治疗的受治疗者根本没有发展可观察水平的疾患，或者与他/她缺乏该治疗相比 发展得更加緩慢和/或发展至更低程度。这些术语不仅仅限于受治疗者没有 经历该疾患的任何方面的情况。例如，如果受治疗者暴露于剌激(其被预 测将产生该疾患的特定表现)时加以处理，导致受治疗者经历比以其它方 式预期的更少和/或更轻的疾患症状，那么该处理可以被说成预防了疾患。
处理可以预防CNS病变，例如，通过导致受治疗者仅显示轻度外显的病变症状。
包含药剂、化合物或分子的组合物可以有效量或浓度递送。物质的有
效浓度或量是导致治疗或预防CNS病变、促进轴突再生、遏制星形胶质增 生、重新排列宿主组织并延緩轴突生长抑制性蛋白聚糖表达的浓度或量。 术语治疗上有效的指所用组合物的量是足够改善疾病或病症的一种或多 种起因或症状的量。这种改善只需要减少或改变，而不必是消除。
施用组合物的有效剂量和进程可以凭经验确定。组合物的施用剂量范 围是大到足以产生影响病症症状的所需效果的那些剂量范围。剂量不应过 大以致造成不良副作用(例如不希望的交叉反应、过敏性反应及类似作 用)。需要的组合物的确切量将随着受治疗者的不同而变化。通常，剂量 可随患者年龄、健康状态(condition)、性别和疾病程度、给药途径，或者是 否有其它药物包括在方案中而变化，并且可以由本领域技术人员确定。如 果发生任何配伍禁忌，可以由具体医生调节剂量。剂量可以变化，并且可 以每日给药一剂或多剂施用，持续一天或若干天。在文献中可以找到对于 特定类药物产品的适宜剂量的指导。
通过在培养基或药学可接受载体中制备培养的tGRP或tGRP衍生的 APC、 GDA、星形胶质细胞或少突胶质细胞的细胞悬液，可以制备提供的 tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组 合。施用的细胞密度可以从约103-106细胞/^。因此，本文提供了药物组 合物，其在药学可接受栽体中包含有效量的公开的tGRP或tGRP衍生的 APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合。
术语载体指化合物、组合物、物质或结构，当与化合物或组合物组合 时，其帮助或促成化合物或组合物用于其意图的用途或目的的制备、储存、施用、递送、有效性、选纟奪性或者任何其它特征。例如，载体可以;陂选择 以使活性成分的任何降解最小化以及使对受治疗者的任何不良副作用最 小化。这种药学可接受载体包括无菌的生物相容性药学载体，包括但不限 于盐水、緩冲盐水、葡萄糖和水。
包含药剂、化合物或分子的、与tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、 星形胶质细胞或少突胶质细胞或其组合一起使用的组合物可以并入微粒、 脂质体或细胞。包括tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、 少突胶质细胞或其组合的任何微粒、脂质体或细胞可以通过抗体、受体或 受体配体而靶向特定细胞类型。耙向可以通过本领域技术人员已知的各种
方法完成，包括例如通过遗传工程。
适合的载体和其制齐寸描述于Remington: The Science and Practice of Pharmacy (雷氏药学理论和实践)(第21版)Lippincott Williams & Wilkins (2005)。药学可接受栽体的实例包括但不限于盐水、林格氏溶液和葡萄糖 溶液。溶液的pH可以是约5至约8或者约7至约7.5。进一步的载体包括 緩释制剂，例如固体疏水聚合物的半渗透基质，该基质是成形制品的形式， 例如，膜、脂质体或微粒。肠胃外施用的制剂包括无菌的含水或非含水溶 液、悬液和乳液。含水载体包括水、醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和 緩冲介质。肠胃外运载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化 钠、乳酸林格氏或不挥发油。静脉内运载体包括流体和营养补充剂以及电 解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)。也可存在防腐剂和其它添 加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、鳌合剂和惰性气体。
其它任选组合物(例如神经营养因子)的递送系统包括通过连接到留 置渗透泵的导管，通过遗传改造的生物递送系统(例如转导的成纤维细胞 或永生细胞系)的直接注射和通过直接注射基因或蛋白到病变位点处或其 附近的脊髓实质而施用。
肠胃外施用组合物可通过注射实现。注射物可以常规形式制备，或者 作为液体溶液或悬液、适于注射前在液体中悬浮或溶解的固体形式，或者
作为乳液。最近提出用于肠胃外施用的方法包括使用緩慢释放或持续释放 体系以便保持恒定剂量。参见，例如美国专利第3,610,795号，其通过引用引入本文。
本文公开了集合了 ( drawn to)可用于实践本文公开的方法的试剂的试 剂盒。试剂盒可包括将被理解为实践所公开的方法所需的或有益的任何试 剂或试剂组合。例如，试剂盒可包括tGRP或tGRP衍生的APC、 GDA、 星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合，以及用于使用它们的緩冲液和组
星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合，以及神经营养因子(例如NGF), 以及用于使用它们的緩冲液和组合物。任选地，试剂盒包括tGRP或tGRP 衍生的APC、 GDA、星形胶质细胞、少突胶质细胞或其组合和在本文所述 方法中使用它们的说明书。
公开的方法和组合物可用于众多领域，包括但不限于治疗CNS病变。
据公开内容是清楚的，和/或将被本领域技术人员理解。
公开了材料、组合物和组分，它们可被用于所公开的方法和组合物、 可与其结合使用、可用于制备它们，或者为本发明所公开方法和組合物的 产品。本文公开了这些和其它材料，并且应理解的是，当公开了这些材料 的组合、子集、相互作用及组时，虽然对这些化合物的每个不同个体及全 体的组合及排列的具体提及可能没有明确地公开，但每个都具体地在本文 考虑并描述。例如，如果公开并讨论了细胞，并且讨论了可以包括该细胞 在内进行的许多改变，那么除非特别指明为相反，否则明确考虑细胞的每 个组合和排列以及可能的改变。因此，如果公开了细胞类型A、 B和C以 及细胞类型D、 E和F，并公开了示例性细胞组合A-D，那么即便没有单 独列举每个，每个都单独且全部地被考虑。因此，在这个实例，组合A-E、 A-F、 B-D、 B-E、 B-F、 C-D、 C-E和C-F中的每个被具体的考虑并且应被 理解为由A、 B和C; D、 E和F;以及示例性组合A-D实例的公开内容所 公开。同样地，其任何子集或组合也被明确考虑和公开。因此，例如A-E、 B-F和C-E的亚组-故具体的考虑，并且应4皮理解为由A、 B和C; D、 E和 F;以及示例性组合A-D的公开内容所公开。这一概念用于本申请所有方有大量可以进行的附加步骤，应理解的是这些附加步骤中每个可以用公开 的方法的任意具体要素或要素组合进行，并且每种该组合是具体考虑的并 且应被理解为已公开。
范围在本文可以表示为从约一个特定值和/或到约又一个特定值。当表 示了该范围时，其包括从一个特定值和/或到另一特定值的范围。应进一步 理解的是，每个范围的端点都很重要，无论是与另一端点有关，还是与另 一端点无关。还应理解的是，本文公开了许多值，并且每个值也作为除了 该值本身以外的大约该值在本文公开。例如，如果公开了数值IO，那么也 公开了约10。也应理解的是也公开了在两个特定单元之间的每个单元。例
如，如果公开了10和15，那么也公开了 11、 12、 13和14。
如全文所使用，受治疗者指个体。因此，受治疗者可以包括，例如家 养动物，例如猫和狗，家畜(例如牛、马、猪、绵羊和山羊)，实验动物 (例如小鼠、兔、大鼠和豚鼠)，哺乳动物、非人类哺乳动物、灵长类、 非人类灵长类、啮齿类、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类和任何其它动物。 受治疗者可以是哺乳动物，例如灵长类或人类。
任选的或任选地指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并 且指本说明书包括所述事件或情况发生的情形及不发生的情形。
整个申请中，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容在此作为整 体通过引用并入本申请，以便更全面地说明与此有关的最新技术状态。为 了在依赖于参考文献的文句中讨论的包含在这些文献中的材料，公开的参 考文献也被单独地且具体地通过引用并入本文。
组合物所属领域技术人员通常理解相同的含义。并非承认任何参考文献都 构成现有技术。对参考文献的讨论陈述了其作者的主张，并且申请人保留 质疑所引证文件的准确性和相关性的权利。应清楚地理解，尽管本文参考 了一些公开出版物，但是这些引用不构成承认任意这些文件形成本领域公 知常识的一部分。实施例
实施例1 材料和方法
叙應潜#。使用A2B5和识别多聚唾液酸化形式的神经细胞粘连分子 (PSA-NCAM)的抗体(Rao等人，/WAS 95:3996-4001 (1998); Rao和 Mayer-Proschd, Dev. 5z'o/. 188:48-63 (1997);和Mayer-Proschel等人，A^wraw 19:773-785 (1997)),联合使用Miltenyi MACS细胞分离柱(Miltenyi Biotech: Auburn, CA)的磁性分离，从胚胎第15天(E15)的Sprague Dawley大鼠端脑 分离A2B5+ZPSA-NCAM-细胞。对于外植块研究，在如上免疫纯化之前， 从E13 Sprague Dawley大鼠取出背侧的端脑，并放在Millicdl培养板垫 (culture plate insert)中以在力口入2 mM GIBCO Glutamax (Invitrogen, Carlsbad, CA)和GIBCO⑧无AO的B27补充物(Invitrogen, Carlsbad, CA) 的GIBCO⑧神经基础培养基(Invkrogen， Carlsbad, CA)中体外生长两天。将 细胞在纤连蛋白/层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片上培养，以1000细胞每孔 的24孔板用于大量培养实验，或以500细胞每T25烧瓶和/或40细胞每孔 的24孔板用于克隆分析。对于繁殖，将培养物在补充如所述添加剂 (Bottenstdn和Sato, /WAS 76:514-7 (1979))和碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF: 10ng/ml)的DMEM-F12中培养。在所示时间，以A2B5抗体染色 细胞(Schnitzer和Schachner， CW/ r^sweT " 224:625-36 (1982))以检测前体 细胞，以抗半乳糖脑苷脂(GalC) (Bansal等人，TVewra",. Wes. 24:548-57 (1989))染色以鉴定少突胶质细胞，以抗-GFAP抗血清染色以鉴定星形胶质 细胞(Bi gnami和Dahl, 5raz7z 49:393-402 (1973),牙口 Norton和Farooq， 5ra^ Dev. 5ra/" 72: 193-202 (1993))和抗-卩III微管蛋白(Caccamo 等人，ZW/"ve" 60:390-8 (1989))染色以检测神经元，随后以适合的轭合荧 光染料的二抗(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)染色。
媒/波举^义#潜#;^^;發为、伊。大量培养和克隆分化分析分别用于证 实细胞群和单独前体细胞的分化潜能，如此前从脊髓表征GRP细胞所用的 (Rao等人，/WAS195:3996-4001 (1998); Herrera等人，jVewra/. 171:11-21 (2001);和Mayer-Proschel等人,TVewraw 19:773-785 (1997))、以及表征OPC
26所用的(Ibarrola和Rodriguez-Pena, 5raw 7 仏752:285-293 (1997)和Smith等 人,iWAS97:10032-7 (2000))。在重新铺板用于大量培养或克隆密度之前， 如上述地分离细胞并在bFGF中培养1周。细胞在bFGF中繁殖2天随后 接触以下条件之一10 ng/ml bFGF(对照增殖)、10 ng/ml骨形态发生蛋 白4 (BMP-4:诱导星形胶质细胞)、P/。胎牛血清(FBS:诱导星形胶质细胞)、 1 ng/ml血小板衍生的生长因子(PDGF-AA)加49 nM三碘曱腺原氨酸和45 nM曱状腺素的混合物(PDGF-AA+T3/T4:诱导少突胶质细胞)、或10ng/ml 神经营养蛋白-3力。100 nM视黄酸(NT3+RA:诱导神经元)。
劍务勿^。将来自各发育年龄的胚胎浸入冷异戊烷(Sigma-Aldrich, St. Louis， MO)并储存在-8(TC直到切片。使用Shandon低温切片机(Shandon Cryotome Cryostat)切10 |im的切片并收集到Superfrost Plus载玻片(VWR, West Chester, PA)。在室温空气干燥载玻片过夜并加工用于一抗染色或储存 在-80。C。通过在室温浸入4%多聚曱醛10分钟随后在-20。C接触丙酮2分 钟而固定切片。所有洗涤步骤在Tris緩沖盐水中进行。封闭緩沖液由含5% 山羊血清和4%牛血清白蛋白的0.5 MTBS组成。
處龙活化的勿應分逸为、浙。将新解离的细胞以一抗染色，所述一抗包 括具有抗-IgM-PE 二抗轭合物的抗-PSA-NCAM、以及直接轭合荧光素的 A2B5 。在4。C以以下顺序进行FACS染色PSA-NCAM —抗、IgM-PE 二 抗、A2B5-FITC —抗。以Becton Dickinson FACSCaliburTM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)进行流式细胞术，并使用CELLQuestTM软件(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)进行分析。
勿v敏和勿,^^瘦染g。所有一抗染色在4。C过夜进行，随后以适合 的二抗染色30分钟。A2B5、 PSA-NCAM、 04、 Ran2和GalC杂交瘤上清 液(美国典型培养物保藏中心，Manassas, VA)以1: 10稀释度使用。3CB2 和RC2杂交瘤上清液(Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA) 以1: 50使用。GFAP兔多克隆抗体(Dako, Denmark)和(3 III微管蛋白 (BioGenex, San Ramon, CA)以1:400使用。Sox2 (Millipore, Temecula, CA)、 SoxlO (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、巢蛋白(Nestin)(大鼠401; Millipore, Temecula, CA)、 NG2 (Millipore, Temecula, CA)和PDGFR a (Santa CruzBiotechnology, Santa Cruz, CA)抗体以1: 500使用。CD44抗体(Accurate Chemical, Westbury, NY)和人类胎盘碱性磷酸酶抗体(Sigma-Aldrich， St. Louis, MO)以1: 1000使用。01ig2抗体(Takebayashi等人，Mec/m"^ms o/ Deve/o; me"f 99:143-8 (2000))以1: 40,000使用。所有二抗购自Molecular Probes并包括辄合于Alexa-488、 Alexa-350、 Alexa-546或Alexa-568的山 羊抗-小鼠IgG3、 IgM、 IgG2a和山羊抗-兔Ig(重链和轻链)。
^矛乂/^W^-發。将免疫纯化细胞以克隆密度铺板，并在10 ng/ml bFGF中生长直到检测到克隆包含大约200个细胞。随后将这些克隆选择 性地传代并分到包含以下之一的四个单独的孔10 ng/ml bFGF、 1%FBS、 1 ng/ml PDGF-AA力口 45 nM T3和49 nM T4混合物、或10 ng/ml NT-3力口 100nMRA。每隔一天更换培养基持续六天，且如上所述地加工细胞用于 免疫染色。
移兹。移植前以25 的100吗/pl氯胺酮溶液麻醉出生后18天的纯合 shiverer小鼠。0.34 mm的针用于注射包含lxl05 A2B5十/PSA-NCAM-细胞 的1.5 |il PBS到左半球皮质边(cortical hem)侧面的四个注射部位。将针插入 3 mm深并在移出前于注射部位保持1分钟。移植后三周处死经历移植程 序的Shiverer小鼠以分析。通过低体温麻醉出生后0天的Sprague Dawley 大鼠幼畜用于表达hPAP、端脑细胞移植。每注射部位27.6nl、以1 mm的 深度注射到左半球的8-9个部位。在出生后10天处死接受细胞移植的大鼠 幼畜并如上述地加工用于免疫荧光。
^裙法。对经历细胞移植的动物灌注加热至38。C的多聚曱醛和戊二醛 (gluteraldehyde)的混合物。取出脑并使用Braintree Scientific (Braintree, MA) 1 mm小鼠丙烯酸基质切成l mm冠状切片。将各切片在多聚曱醛/戊二醛 混合物中固定过夜，以磷酸盐緩冲液pH7.4漂洗，并在磷酸盐緩冲的1.0% 四氧化锇中后固定1.5小时。在梯度的系列乙醇(ETOH)直到100%中脱水1 mm切片，转移到100yo环氧丙烷并浸入Epon/Araldite (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA)环氧树脂过夜。以新鲜树脂将切片包埋到模 具中并在70。C聚合两天。切下半薄的两微米切片并以1。/o硼酸钠中的0.5% 曱苯胺蓝染色，在光显微镜下检查以确定将被薄切片的区域。以钻石刀切下薄切片并放在200目的铜载网上，以乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。以
Hitachi 7100透射电镜(Tokyo， Japan)检查载网并使用MegaView III数码相 机(AnalySIS， Lakewood, CO)捕捉数码图片。
结果
在腹侧的01ig2域之外的端脑背侧中可检测到A2B5+细胞。
端脑背侧用于进4亍端脑中胶质限制性前体的最初鉴定，因为该区比端 脑腹侧提供用于细胞鉴定的两个主要益处首先，在端脑背侧中直到E15 后才4企测到OPC (基于PDGFR-a表达)，而已报道端脑腹侧早在E12.5时 就包含OPC (定义为PDGFR-a+细胞)。由于GRP和OPC两者都是A2B5+， 这两种细胞类型之间最初的区别要求从区中的特定发育窗分离细胞，该发 育窗诸如已知具备胶质细胞生成潜能但缺乏OPC的E15端脑背侧。其次， 端脑背侧完全由背侧产生的细胞组成，直到在大鼠大约E13.5时腹侧的细 胞浸润，这提供了探究已鉴定的前体群来源的机会。
首先表征了 A2B5+细胞在胚胎端脑中的分布，如图1A和B所示，A2B5 标记的细胞存在于E15端脑背侧和腹侧，而发现OPC的标志物01ig2只存 在于端脑腹侧(图1C和D)。为了确定在广泛A2B5阳性的端脑中存在胶质 限制性前体群，使用定义脊髓GRP细胞的抗原表型进行细胞分离和分选 A2B5+/PSA-NCAM-。由于A2B5和抗-PSA-NCAM都是IgM抗体，使用直 接辄合于荧光素的A2B5 —抗，其允许同时标记A2B5和抗-PSA-NCAM免 疫反应性细胞。FACS分析揭示三种不同的细胞群仅PSA-NCAM+细胞、 仅A2B5+细胞、和以抗-PSA-NCAM和A2B5共标记的细胞(图1E)。这些 结果证实在位于01ig2域之外的端脑背侧中存在A2B5VPSA-NCAM-细胞 群。仅A2B5+群是进一步分析的焦点，因为该抗原表型是此前鉴定的脊髓 GRP细胞共有的。然而，重要的是注意到A2B5+/PSA-NCAM+和仅 PSA-NCAM+群两者包含能够产生胶质细胞的至少一个细胞子集，如在初 步大量培养实验所见的。
A2B5标记端脑背侧中的神经元子集
从E15端脑背侧纯化A2B5VPSA-NCAM—细胞产生推定的胶质前体和神经元的异质群体。早在E13至晚在E20从端脑背侧分离的 A2B5+ZPSA-NCAM-群包含表达神经元标志物卩III微管蛋白的A2B5+细胞， 如在解剖后4小时、12小时和4天由免疫荧光^r测的(图2A-C)。缺少以 A2B5进行的胶质前体限制性标记提示检查A2B5+ZPSA-NCAM-细胞群联 合卩III微管蛋白以确定将产生特异性地A2B5+/PSA-NCAM7|3 III微管蛋白 —细胞的适合发育时间点。解剖后直接快速染色细胞指示，分离最佳数目的 A2B5+/PSA-NCAM7(3 III微管蛋白—细胞的峰时间是E15，此时A2B5+/(3 III 微管蛋白-细胞占A2B5+/PSA-NCAM-E15背侧的端脑细胞亚群的大约21% (图2D)。该时间点作为分离鉴定为A2B5+/PSA-NCAM7(3 III微管蛋白-的推 定的胶质限制性前体群的峰时间。
定义A2B5+/PSA-NCAM7P III微管蛋白群
为了进一步表征A2B5VPSA-NCAM7(3 III微管蛋白-推定的胶质限制性 前体群的抗原谙，允许新分离并MACS分选的细胞经最多8小时粘附于 FN/LN包被的表面。随后将细胞以针对空间相关的和细胞类型特异性抗原 的抗体染色。表1提供所用抗体和推定的胶质限制性前体群中确定存在或 不存在其各自抗原的概述。
表1
体外生长前和体外生长后，A2B5+ZPSA-NCAM-群的抗原谱
抗原 新分离的 体外扩增的
_A2B5十/PSA-NCAM-细胞A2B5十/PSA誦NCAM-细胞
A2B5 + +
CD44 - -
GFAP - -
巢蛋白 + +
NG2 - -
04 - -
01ig2 - -
PDGFR a - -PSA-NCAM - -
Ran2 - -
S訓 - -
3CB2 - -
Sox2 + +
SoxlO - -
卩III微管蛋白 +_:_
如所预期地不存在更成熟的M^质标志物，包括OHg2、 PDGFR a、 NG2、 GFAP、 CD44和SOX10、 Ran2和04。未^r测与神经元和其前体相关的抗 原，包括NeuN和双肾上腺皮质激素(Doublecortin)。细胞对放射状胶质标 志物RCB2和RC2也是阴性的。
与不存在神经元标志物和更成熟的胶质谱系标志物相反，推定的胶质 限制性前体群对巢蛋白和Sox2是免疫反应性的，巢蛋白和Sox2是已经显 示存在于各种干细胞群和GRP细胞中的抗原。尽管A2B5+/PSA-NCAM7(3 III微管蛋白-细胞群的抗原谱与OPC不一致，但是巢蛋白和Sox2的表达不 允许区分干细胞和GRP细胞。由于干细胞的体外和体内分化潜能不同于 GRP细胞，进行了设置为鉴定A2B5+/PSA-NCAM7P III微管蛋白-细胞池的 分化潜能的大量实验。为了确定A2B5VPSA-NCAM-细胞群的可能的谱系 限制，在允许细胞扩增而不改变其表型的限定条件下计算定义的细胞池， 历时至少7天。
为了建立这种条件，将新分离的、MACS分选的A2B5+/PSA-NCAM— 细胞(包括A2B5十/PSA-NCAM7卩IH微管蛋白+和A2B5+/PSA-NCAM7(3 III 微管蛋白-的异质群体)铺板到补充bFGF的确定成分培养基并培养7天。在 该培养期间中，将细胞传代两次，这导致失去A2B5+/PSA-NCAM7|3 III微 管蛋白+神经元群。失去该神经元群可归于两种因素(i)培养基条件不允 许神经元A2B5VPSA-NCAM7(3 III微管蛋白+细胞存活，但足以允许非神经 元的A2B5VPSA-NCAM7卩III微管蛋白-群存活和增殖，和(ii)神经元和推 定的胶质前体群之间结合基质的差异。为了证实失去神经元群是由于细胞 死亡，在PDGF-AA存在下培养神经元A2B5+/PSA-NCAM7(3 III微管蛋白+细胞，PDGF-AA是已经显示支持神经元存活的因子。该条件支持 A2B5+ZPSA-NCAM7卩III微管蛋白+神经元存活(由免疫荧光确定)但不支持 非神经元的A2B5+/PSA-NCAM7|3^I微管蛋白-细胞池的存活。所观察到的 神经元A2B5VPSA-NCAM7卩III微管蛋白+细胞与非神经元的 A2B5+/PSA-NCAM7P III微管蛋白-细胞相比结合基质的差异导致神经元细 胞紧密结合于生长基质而非神经元的细胞可轻易除去，允许选择性传代。 作为上述观察结果的直接应用，新分离的A2B5+ZPSA-NCAM-群(包含推 定的胶质限制性前体和神经元)在仅10ng/ml bFGF中的生长导致非神经元 的A2B5+/PSA-NCAM7(3 III微管蛋白-群优先存活。
为了确定在体外生长期间细胞是否保持不变，将如上述地生长7天并 传代两次所得的群以表1所列抗体染色并与新分离的细胞比较。经历在 bFGF中体外生长和扩增的细胞群的抗原i普与新分离并MACS分选的细胞 的抗原语相同(参见表1)。重要的是，A2B5+/PSA-NCAM7(3 III微管蛋白-细胞群保持01ig2阴性(甚至在补充10 ng/ml bFGF的基础培养基中体外生 长3周后)。这一观察结果是重要的，因为Gabay等人已经表示，bFGF对 01ig2阴性的背侧衍生的脊髓细胞可能具有"腹侧化"效应。结果未显示 bFGF对背侧衍生的端脑A2B5+/PSA-NCAM7P III微管蛋白-细胞的这种作 用。此外，该体外生长期间没有自然出现的卩11I微管蛋白+细胞或细胞形 态学、生长速率、或存活的任何明显差异，进一步不支持Gabay等人2003 描述的响应于bFGF的"腹侧化"效应。
在大量培养中A2B5+/PSA-NCAM-群产生星形胶质细胞和少突胶质细 胞但不产生神经元
所鉴定的培养条件允许扩增细胞同时保持其抗原表型。该体外培养系 统用于确定A2B5+/PSA-NCAM7(3 III微管蛋白-群代表神经干细胞还是谱系 限制性前体细胞。尽管这两种细胞群共有类似抗原i普，但是其体外和体内 分化潜能在根本上不同。认为神经干细胞是多能的并能够产生胶质以及神 经元群。相反，谱系限制性细胞已经失去其多能性，并且它们的分化潜能 限制于胶质或神经元语系或任一谱系细胞的具体子集。为了确定来自E15 端脑背侧的八285+/ 5八^0八^/(3111微管蛋白-细胞群的分化潜能，进行大
32量培养分析(如图3A所示)、克隆分析(3B)、和分开克隆的分析(3C)。设计 各实验以确定分离的细胞群产生星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的 能力。用于这些分析的分化条件是基于我们此前对脊髓衍生的GRP的数据 和基于文献中的许多报道。作为促星形胶质细胞条件，将细胞接触1% FBS。 为了确定细胞是否能够产生少突胶质细胞，将培养物接触PDGF-AA加 T3/T4 (促少突胶质细胞(pro-oligodendrocye))。为了促进神经元分化细胞产 生，将培养物接触NT3加RA(促神经元)，该条件已经显示有效指引pill 微管蛋白+神经元从脊髓NEP细胞形成。对照培养物保持在bFGF中并表 示增殖条件。
从E15端脑背侧分离细胞，经MACS分选A2B5VPSA-NCAM—细胞并 在bFGF中扩增7天。随后将培养物转变到分化条件并在6-9天后(取决于 条件)以鉴定分化的后代的标志物来标记。如图4A、 C和D所示，细胞能 够在PDGF-AA加T3/T4中产生GalC+少突胶质细胞和在1% FBS中产生 GFAP+星形胶质细胞，但不能在NT3和RA中产生神经元。为了排除未能 从A2B5+/PSA-NCAM7P III微管蛋白-产生神经元是由于促神经元环境不适 当的可能性，将从E15背侧的端脑新分离的、未选择的细胞以克隆密度在 NT3和RA存在下培养6天并以抗-(3 III微管蛋白标记克隆。如图5A所示， 在促神经元条件中具备产生神经元的能力的克隆是易于鉴定的，表示使用 的该促神经元条件适于从感受态细胞S1发神经元形成。
与从脊髓衍生的GRP细胞产生少突胶质细胞一致，在接触PDGF-AA 加T3/T4 4天后观察到04+中间细胞类型(图4B)。此前显示增加星形胶质 细胞定型(commitment)并牵涉在端脑中从形成神经元到形成星形胶质细胞 的转变的BMP-4，直到开始BMP接触后10天才能够产生GFAP+细胞(图 4E)，但在体外6天后的确诱导已知的GRP衍生的星形胶质细胞前体细胞 标志物CD44表达(图4F)。总之，提供的结果证实A2B5"7PSA-NCAM—背 侧的端脑细胞群能够产生少突胶质细胞和星形胶质细胞但不产生神经元。
入285+^8厶-1>^^1\1-群产生类似数目的包含少突胶质细胞或星形胶质 细胞的克隆，但没有包含神经元的克隆。
尽管最初的体外分化实验表示A2B5"7PSA-NCAM-群限于胶质谱系，但是区别可产生少突胶质细胞和星形胶质细胞的双潜能的细胞的存在与 APC和OPC的异质群体的存在是必需的。为了区别这两种可能性，将在
培养中生长一周的A2B5VPSA-NCAM-细胞传代并以克隆密度重新铺板。 随后将克隆接触bFGF (增殖)、PDGF-AA加T3T4 (促少突胶质细胞)、1% FBS (促星形胶质细胞)、或NT3加RA (促神经元)以确定单独克隆的分化 潜能。在各条件下，通过每克隆存在至少一个少突胶质细胞、每克隆存在 至少一个星形胶质细胞、或每克隆存在至少一个神经元，认为克隆能够产
生具体类型的细胞。
接触分化条件六天后，来自端脑背侧的A2B5VPSA-NCAM-细胞产生 能够产生少突胶质细胞(图6A)、星形胶质细胞(图6B)但不能产生神经元 (图6C)的克隆。在四个独立实验中，分析接触PDGF-AA加T3/T4的共223 个克隆、接触1% FBS的共164个克隆、和接触NT3加RA的超过200个 克隆。接触PDGF-AA加T3/T4的克隆的79%包含至少一个GalC+少突胶 质细胞，接触1%血清的所有克隆的87% (115个克隆)包含至少一个GFAP+ 星形胶质细胞，而接触NT3加RA的克隆都不包含神经元。GFAP+和GalC+ 克隆的概述示于图10，并表示在各条件下，包含星形胶质细胞的克隆与包 含少突胶质细胞的克隆的百分比类似，这一结果与细胞能够产生少突胶质 细胞和星形胶质细胞两者 一致。
分开A2B5VPSA-NCAM-克隆揭示从单个生成细胞产生少突胶质细胞 和星形胶质细胞的潜能
对克隆数据的分析证明，八285+/ 3八^€八1^群包括在平行孔中当接触 适合的条件时能够产生少突胶质细胞和星形胶质细胞两者的细胞。由于沿 着具体谱系诱导细胞分化所需的目前已知条件不允许在单个克隆中同时 产生少突胶质细胞和星形胶质细胞两者，需要替代方法以确定来自单个 A2B5+/PSA-NCAM-细胞的后代是否能够产生少突胶质细胞和星形胶质细 胞。如图3C所示地开始"克隆分开"分析。将细胞以克隆密度铺板到100 mm盘，并允许在bFGF (10 ng/ml)中繁殖直到实现大约200细胞的克隆大 小。基于与前体细胞两极形态学一致的细胞的存在选择克隆。将选择的各 克隆传代并重新铺板到24孔板的四个孔中，接触此前使用的分化条件。以这种方式传代的克隆接触所示条件6天后在PDGF-AA加T3T4中产生 少突胶质细胞(图7A)、在1% FBS中产生星形胶质细胞(图7B)但在NT3 和RA中不产生神经元(图7C)。在各条件下各分开的克隆能够产生少突胶 质细胞和星形胶质细胞但不产生神经元，证实最初的A2B5+/PSA-NCAM-生成细胞产生少突胶质细胞和星形胶质细胞两者的潜能，并允许将其分类 为胶质限制性前体细胞。
背侧的胶质限制性前体细胞从端脑背侧从头产生
为了确定端脑背侧是否能够从头产生胶质限制性前体细胞，或是腹侧 的细胞浸润的结果，将端脑腹侧与E12.5端脑背侧机械分离且体外培养背 侧的外植块2天。端脑腹侧与端脑背侧的物理分离允许在不存在腹侧的细 胞类型下刺激端脑背侧发育，直到与E15端脑背侧相当的时间段。由于 E12.5是在已知的腹侧的细胞进入端脑背侧之前，因此两天培养期中存在 或产生的任何细胞绝对是背侧来源的。
不存在bFGF下在神经基础培养基中体外生长两天后收集外植块。这 对于将培养条件导致外植块"腹侧化"的可能性降到最小是重要的，尽管 在bFGF存在下培养解离的细胞时于体外并未观察到这种效应。
将外植块组织培养2天，之后通过MACS分离从解离的外植块选择 A2B5VPSA-NCAM-细胞，并在经受大量培养分化和克隆分析之前培养另外 7天。大量培养研究表示，外植块衍生的A2B5VPSA-NCAM-细胞群具备与 来自端脑背侧的胶质限制性前体群类似的体外分化能力。以PDGF-AA加 T3/T4诱导外植块细胞以产生GalC+少突胶质细胞(图8A)，以1% FBS诱导 以产生GFAP+星形胶质细胞(图8B)，且在NT3加RA中不产生神经元(图 8C)。以克隆密度生长的外植块衍生的A2B5VPSA-NCAM-细胞当接触 PDGF-AA加T3/T4时，得到190个克隆中的145个(76%)克隆包含至少一 个GalC+少突胶质细胞(图8D)。当接触1% FBS时，173个克隆中的144 个(84%)克隆包含至少一个星形胶质细胞(图8E)，且当接触NT3和RA时， 未能检测到包含至少一个神经元的克隆(图8F)。提供背侧的外植块 A2B5+/PS A-NCAM-细胞群产生的克隆的概述(图10)。
为了进一步表征外植块衍生的推定的胶质限制性前体群，将从2天体外生长外植块分离的A2B5VPSA-NCAM-细胞以克隆密度铺板且表征克隆 后代的分化潜能，如图3C描绘的。选择性传代六个克隆且将各克隆的细 胞分到24孔板的四个孔中以接触分化条件。来自分开的克隆的细胞能够 在PDGF-AA力口 T3/T4中产生GalC+少突胶质细胞(图8G),在1% FBS中 产生GFAP+星形胶质细胞(图8H),但在NT3和RA中不能产生神经元(图 81)。这些数据证实端脑背侧独立于从腹侧区的细胞迁移产生 A2B5VPSA-NCAM-胶质限制性前体群的能力，并指示体内端脑胶质限制性 前体群的可能背侧来源。
腹侧的胶质限制性前体细胞可从E15大鼠端脑分离
由于还未报道来自发育中的端脑的腹侧的端脑细胞能够产生星形胶 质细胞和少突胶质细胞但不产生神经元，进行分析以确定胶质限制性前体 细胞是否还存在于早期端脑的腹侧面。
由于OPC产生于多个来源，推定的腹侧的胶质限制性前体群的分析通 过解剖E15腹侧的端脑的中间神经节隆起(medial ganglionic eminence, MGE)和^卩内前区(anterior entopeduncular area, AEP)而开始。/Wgf-a表达研 究表示这些区域中存在OPC。分离胶质限制性前体细胞和OPC的异质群 体的可能的问题通过在10 ng/ml PDGF存在下培养新分离的 A2B5VPSA-NCAM-细胞而解决。此前该条件已经显示保持OPC但不能支 持GRP细胞存活。以这种方式生长的存活细胞是卩III微管蛋白+且检测到 很少(如果有的话)A2B5+细胞。总之，不存在PDGF响应性A2B5+群和已知 OPC不能产生I型星形胶质细胞(A2B57GFAP+)允许选择性地确定腹侧的 胶质限制性群。
使用与之前所述相同的实验方法分离A2B5+ZPSA-NCAM-细胞并体外 表征，且概述于图3。大量培养研究证实该腹侧的A2B5VPSA-NCAM-细胞 群在PDGF-AA力p T3/T4中产生GalC+少突胶质细胞(图9A)，在1% FBS 中产生GFAP+星形胶质细胞(图9B)和在NT3和RA中不能产生神经元(图 9D)的能力。克隆分析确证单独A2B5VPSA-NCAM-细胞在PDGF加T3T4 中产生包含至少一个GalC+少突胶质细胞的计数为共223克隆中的174个 克隆(78%)(图9E)、包含至少一个GFAP+星形胶质细胞的计数为共164个克隆中的115个克隆(70%)(图9F)的能力，但不能在NT3和RA中产生包 含至少一个神经元的克隆(图9G)。计数克隆的概述提供于图10。为了证实
NT3和RA诱导神经元细胞命运的效力，将新分离的未选择的腹侧的端脑 细胞以克隆密度铺板。来自端脑腹侧的未选择的细胞具备必需的分化潜 能，在接触NT3加RA 6天后产生可鉴定的卩III微管蛋白+细胞克隆(图5B)。
未在1% FBS中或接触睫状神经营养因子(CNTF;图9C)下检测到 A2B5VGFAP+细胞，睫状神经营养因子是已知从脊髓衍生的GRP诱导 A2B5+/GFAP+ II型星形胶质细胞的条件。目前认为II型星形胶质细胞产生 和少突胶质细胞产生是OPC的分化i普(profile)，而从限制性胶质前体产生 I型(A2B57GFAP+)和II型(A2B5VGFAP+)星形胶质细胞以及GalC+少突胶质 细胞的能力是仅GRP细胞的特征。
对于进一步体外表征，将新分离的腹侧的A2B5+ZPSA-NCAIvr细胞以 克隆密度铺板并选择性传代和分开，如图3C概述的。来自单独分开的克 隆的细胞在PDGF-AA加T3/T4中产生GalC+少突胶质细胞(图9H),在1% FBS中产生GFAP+星形胶质细胞(图91)，但在NT3加RA中不产生神经元 (图9J)。这些结果证实胶质限制性前体细胞存在于E15端脑腹侧。
通过端脑胶质限制性前体细胞体内产生成髓鞘少突胶质细胞和星形 胶质细胞
体外分析鉴定在E15端脑中存在于背侧和腹侧的A2B5+/PSA-NCAM— 胶质限制性前体群能够产生少突胶质细胞和/或星形胶质细胞，但在通常促 进神经元语系产生的条件下不能产生神经元。数据还指示，端脑背侧具备 在不存在腹侧的细胞成分时产生A2B5VPSA-NCAM-胶质限制性前体群的潜能。
从1) E15端脑背侧和2)体外生长两天的E12.5背侧的端脑外植块分 离A2B5+ZPSA-NCAM—胶质限制性前体细胞用于移植到出生后s/ 've r小 鼠前脑中。s/n'vewr小鼠包含MBP基因缺失，造成紧凑髓鞘形成4艮少至没 有。这种动物提供检查背侧的胶质限制性前体群产生功能性少突胶质细胞 的能力的手段，功能性少突胶质细胞可重要地有助于前脑的髓鞘组成。将 背侧的和外植块衍生的胶质限制性前体群移植到出生后18天的纯合
37WZvewr小鼠的左半球的皮层下的区。不注射每只小鼠的对侧半球，作为
基本髓鞘存在和表现的对照。移植后三周时，灌注动物并制备1.5 mm的 冠状切片用于电镜法。对未注射的半球拍摄的EM图像在存在于冠状切片 的轴突纤维的纵切面(图IIA)和横切面(图IIA，)显示薄的、非紧凑的髓鞘 片，这是W/vww前脑典型的。包含移植的E15背侧的胶质限制性前体群 的半球的EM图像显示皮层下的白质中许多致密的、紧凑的有髓鞘的纤维， 见于纵切纤维(图IIB)和横切纤维(图IIB，)，从注射部位延伸到背侧的前脑 的更侧面。致密的、紧凑的有髓鞘的纤维的纵切面和横切面在从包含移植 的外植块衍生的胶质限制性前体群的半球的冠状切片获得的EM图像中也 易于鉴定(图IIC和C，)。
脊髓衍生的GRP细胞的、使该细胞区别于OPC的一个特征是其移植 后产生星形胶质细胞的能力。为了确定背侧和腹侧的端脑胶质限制性前体 细胞的体内星形胶质细胞潜能，将从表达人类胎盘碱性磷酸酶(hPAP)的转 基因大鼠胚胎的E15端脑分离的胶质限制性前体群移植到P0 Sprague Dawley大鼠幼畜的前脑中，该时间点与峰值星形胶质细胞形成和背侧开始 产生少突胶质细胞前体吻合。出生后第10天，处死幼畜并对切片分析hPAP 和GFAP的共定位。在接受背侧的(图IID-F)胶质限制性前体的宿主脑的移 植的区到处可见双阳性细胞，尽管还观察到显示hPAP+细胞未与GFAP共 定位的区。在移植的区中也可见01ig27hPAP+细胞，表示存在少突胶质细 胞前体(02A)和/或少突胶质细胞(图IIG-I)。这些移植研究证实移植后，背 侧的胶质限制性前体群产生成髓鞘少突胶质细胞的能力，以及背侧的胶质 限制性前体群产生星形胶质细胞和少突胶质细胞语系细胞的能力。
鉴定了两种A2B5+ZPSA-NCAM-细胞群 一种从E15端脑背侧分离， 另一种从E15端脑腹侧分离。将细胞指定为GRP、 OPC或NSC可包括分 析细胞类型特异性分化潜能(回顾参见Noble等人2006)。尽管可预期NSC 可产生少突胶质细胞、星形胶质细胞和神经元，但谱系限制性细胞在分化 时不展示细胞类型的全部排列。
对A2B5+/PSA-NCAM7P III微管蛋白-端脑细胞群的大量培养分析、克 隆分析、克隆分开分析和体内移植实验证实其产生胶质谱系细胞的能力但不能分化为神经元。这种分化谦非常类似于此前描述的E13.5脊髓的GRP 群的分化谱。除了类似的分化谱，端脑胶质限制性前体群如同脊髓GRP 群一样响应于作为促分裂原和存活因子的bFGF，并且还可从相应组织的 背侧和腹侧面分离。该数据还确证不存在腹侧的细胞组织时，端脑背侧产 生端脑力交质限制性前体群的能力。
然而，端脑细胞和此前研究的脊髓细胞之间有可检测的差异，包括接 触BMP-4后产生星形胶质细胞，以及缺少响应于CNTF的II型星形胶质 细胞产生。后一特征尤其区分了该端脑前体细胞群与广泛研究的从出生后 大鼠脑分离的OPC。
鉴定tGRP还提供星形胶质细胞的确定来源。脊髓中已经显示，星形 胶质细胞在背侧和腹侧的区产生，并且星形胶质细胞和少突胶质细胞子集 来自具有腹侧来源并迁移和停留在背外侧室下区的细胞。还已经在发育中 的端脑的其它区鉴定星形胶质细胞群，但这些细胞的来源仍难懂。腹侧和 背侧产生的tGRP可解释发育中的端脑中星形胶质细胞的至少一个子集的 产生。
鉴定tGRP允许统一胶质来源的各种现有模型，且为此目的显示端脑 中胶质发生的以下模型(图12)。数据显示，在胚胎端脑的腹侧和背侧面中 独立地产生了至少两种tGRP群。背侧的tGRP群发育命运为在发育早期产 生APC和星形胶质细胞，而腹侧的tGRP群显示由于环境信号最初发育命 运为产生OPC。通过分离和体外培养除去环境暗示(如，背侧的BMP和腹 侧的Shh)允许出现各群的发育可塑性，如分别从腹侧和背侧的tGRP产生 星形胶质细胞和少突胶质细胞可见的。
后来在发育中，随着信号改变或被^f奮改以提供力交质细胞成熟的许可环 境，该模型提供各tGRP群有助于产生另一胶质细胞类型的潜能，揭示各 tGRP群的第二发育命运。重要地，无论时间点从腹侧的或背侧的区分离原 型tGRP群，提供能够产生少突胶质细胞和星形胶质细胞两者但不产生神 经元的细胞群。实施例2
A. 使用CNTF从tGRP衍生的星形胶质细胞不同于从scGRP衍生的 星形胶质细胞。
移植脊髓衍生的GDAgpl3° (使用经由gpl30起作用的信号转导分子， 被诱导以分化为星形胶质细胞的胶质限制性前体细胞)或未分化的GRP细 胞导致强的神经性疼痛。在背外侧索横断之前和之后测量对机械刺激的前 爪缩回阈值和任何爪从热源的缩回响应潜伏期。GDAgpl3G移植的动物在损 伤2周后显示对机械和热刺激的敏感性显著增加，该效应在第二周和第三 周之间加强并持续到测试的最后时间点即损伤后5周。接受未分化的GRP 纟田月包的内部损伤(intra-injury)移植物的动物也对机械和热刺激发展增加的
动物在损伤/移植3周后开始显示对两种检测的敏感性增加，该敏感性也持 续到损伤后5周。相反，与损伤前的响应相比，移植经过使用BMP诱导 从GRP细胞产生的星形胶质细胞(GDABMP)在直到损伤后5周的任何时间 点不显示任何对机械或热刺激的敏感性增加(2向重复测量ANOVA p > 0.05)，这一结果明显不同于移植GDA^，或GRP细胞的效应。
独立研究显示，GDABmp和GDAgpl3Q的主要差异之一是对转录因子 01ig2的表达。GDABMP表达GFAP但不表达01ig2+。相反，GDA卯，共表 达GFAP和01ig2。根据这些数据，在衍生自tGRP的星形胶质细胞中表征 01ig2的表达。
如图13所示，以CNTF诱导的tGRP细胞不表达01ig2,因此不同于 scGRP衍生的GDAgpl30。
B. 衍生自端脑背侧的tGRP相对于衍生自端脑腹侧的tGRP具有不同 的氧化还原状态。
使用二氢钙黄绿素(DHC)检测背侧和腹侧的tGRP的细胞内氧化还原 状态，二氢钙黄绿素是胞内氧化酶的细胞可渗透荧光量度。发现dtGRP比 vtGRP更氧化(图14)。作为比较，包括来自胼胝体(CC)和皮质(Cx)的OPC 的胞内氧化还原状态作为对比。
40C.从tGRP产生少突W细胞的中间物
此前，显示tGRP产生GalC+少突胶质细胞。进一步研究已经扩大了 该表征并指示tGRP经由PSA-NCAM/PDGFR a/01ig2+中间物产生GalC十 少突胶质细胞(图15)。通过除去bFGF和加入PDGF从tGRP培养物产生 的此中间细胞不同于tGRP,此前显示tGRP对PSA-NCAM、 PDGFR a和 01ig2为阴性。
权利要求
1.一种分离的端脑胶质限制性前体(tGRP)细胞群。
2. 根据权利要求1所述的群，其中所述tGRP细胞分离自端脑背侧。
3. 根据权利要求2所述的群，其中所述tGRP细胞分离自端脑腹侧。
4. 一种组合物，其包含根据权利要求1所述的群和培养基或药学载体。
5. —种治疗受治疗者CNS损伤的方法，其包括向所述受治疗者施用 包含分离的tGRP细胞的组合物。
6. 根据权利要求6所述的方法，其中所述CNS损伤是脱髓鞘疾病导 致的。
7. 根据权利要求7所述的方法，其中所述CNS损伤是创伤或中风导 致的。
8. —种增加受治疗者胶质发生的方法，其包括向所述受治疗者施用包 含分离的tGRP细胞的组合物。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述tGRP细胞分离自端脑背侧。
10. 根据权利要求8所述的方法，其中所述tGRP细胞分离自端脑腹侧。
11. 一种分离的01ig2-胶质限制性(GRP)细胞群。
12. 根据权利要求11所述的群，其中所述01ig2-GRP细胞是tGRP细胞。
13. 根据权利要求12所述的群，其中所述tGRP细胞分离自端脑背侧。
14. 一种组合物，其包含根据权利要求11所述的群和培养基或药学载体。
15. —种组合物，其包含根据权利要求13所述的群和培养基或药学载体。
16. —种治疗受治疗者CNS损伤的方法，其包括向所述受治疗者施用包含分离的OligZ GRP细胞的组合物。
17. 根据权利要求16所述的方法，其中所述Oligr GRP细胞是tGRP细胞。
18. 根据权利要求17所述的群，其中所述tGRP细胞分离自端脑背侧。
19. 一种治疗受治疗者CNS损伤的方法，其包括(a) 分离tGRP细胞群；(b) 从所分离的tGRP细胞群衍生GFAP+细胞或GFAP+细胞群；和(c) 向所述受治疗者施用包含所衍生的GFAP+细胞或所衍生的GFAP+ 细胞群的一种或多种衍生的GFAP+细胞的组合物。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中衍生自所分离的tGRP细胞群 的所述GFAP+细胞或GFAP+细胞群包含星形胶质细胞祖细胞(APC)。
21. 根据权利要求19所述的方法，其中衍生自所分离的tGRP细胞群 的所述GFAP+细胞或GFAP+细胞群包含GDA细胞。
22. 根据权利要求19所述的方法，其中衍生自所分离的tGRP细胞群 的所述GFAP+细胞或GFAP+细胞群包含1型星形胶质细胞。
23. 根据权利要求19所述的方法，其中所述tGRP细胞分离自端脑背侧。
24. —种治疗受治疗者CNS损伤的方法，其包括(a) 分离tGRP细胞群；(b) 从所分离的tGRP细胞群衍生GalC+细胞或GalC+细胞群；和(c)向所述受治疗者施用包含所衍生的GalC+细胞或所述GalC+细胞群 的一种或多种衍生的GalC+细胞的组合物。
25.根据权利要求24所述的方法，其中衍生自所分离的tGRP细胞群 的所述GalC+细胞或GalC+细胞群包含少突胶质细胞。
全文摘要
本文提供了端脑胶质限制性前体细胞群和相关组合物。相关组合物包括但不限于衍生自端脑胶质限制性前体细胞群的任何细胞或细胞群。进一步提供了使用和产生端脑胶质限制性前体细胞群的方法和相关化合物。
文档编号A61K35/30GK101679951SQ200880012443
公开日2010年3月24日 申请日期2008年4月16日 优先权日2007年4月17日
发明者F·G·斯特拉思曼四世, M·迈尔-普罗谢尔 申请人:罗切斯特大学