专利名称：人gdnf基因在牛β-casein基因座的定位整合载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物乳腺生物反应器，具体地说，涉及人gdnf基因在牛0-casein基 因座的定位整合载体及其在制备高效表达人GDNF蛋白的牛乳腺生物反应器中的应用。
背景技术：
胶质细胞系源性神经营养因子(glial cell line-direved neurotrophicfactor ；⑶NF)是大脑胶质细胞衍生的神经营养因子。⑶NF是一种分泌性糖 蛋白。GDNF前体由211个氨基酸构成，含信号肽19个氨基酸和前导区(pr印ro)58个氨基 酸，成熟多肽为134个氨基酸，其中含有两个N-糖基化位点。研究发现GDNF对多种神经元 具有营养作用，例如(1)⑶NF对多巴胺能神经元的作用Lin等最先发现⑶NF能够特异性地促进体外培养的大鼠中脑多巴胺能神经元存 活与分化，并能够增加这些细胞对多巴胺的摄取。体内实验研究也获得了同样的结果，即 GDNF对中脑多巴胺能神经元有特异性营养作用，是一种有效的多巴胺能神经元营养因子。 在多种帕金森病动物模型中，例如，用神经毒物MPTP导致黑质多巴胺神经元退化的小鼠和 猴子、单侧6-0HDA和手术切断导致黑质细胞损伤的大鼠，GDNF对多巴胺能神经元的保护和 修复作用得到进一步的证实。GDNF还可明显改善帕金森模型猴的运动徐缓、僵直及姿势不 稳定等运动功能障碍症状。目前的研究成果表明，GDNF是一种强效的，相对特异的多巴胺 能神经元保护因子，在帕金森病的治疗中显示出了巨大的潜在价值和应用前景。美国食品 与药品管理局(FDA)已经批准⑶NF用于帕金森的治疗研究已进入三期临床阶段。(2)⑶NF对运动神经元、自主神经元和感觉神经元的作用⑶NF也是一种运动神经元营养因子，将⑶NF基因转染载体细胞与含有脑和脊髓 运动神经元的培养液一起培养，能延长这些运动神经元轴索的长度，减少正常凋亡。⑶NF 基因缺失的小鼠，其脊柱运动神经元减少了 22%。切断新生鼠脊神经和面神经轴突后给予 ⑶NF，可以阻止运动神经元的退化。⑶NF对自主神经元和感觉神经元同样也有营养作用，能 促进培养的交感神经元和副交感神经元存活。在缺乏GDNF基因的家族中，感觉神经元的分 化受阻，表现为不能进行短暂的多巴胺羟化酶表达，受体的重组与转化明显减少。⑶NF对脑 内其他神经元同样有作用。它可促进蓝斑的去甲肾上腺能神经元存活，保护这些神经元免 遭6-0HDA的毒害；也能防止基底前脑胆碱能神经元损伤造成的死亡和萎缩；对小脑蒲肯野 神经元的存活及分化同样起重要作用。近来研究表明GDNF的功能远远不仅限于治疗帕金森病，尤其引人瞩目的是对神 经源性痛的抑痛或镇痛方面也显示出神奇的功效，对多种中枢神经系统疾病，如中风、脊髓 损伤、外科性脑损伤、神经元退行性疾病的治疗显示出了巨大的潜在价值和应用前景。出于科学研究和药用研究的目的，需要生产大量的GDNF。GDNF是糖基化蛋白，在 人和动物体中含量很低，从动物体中提取GDNF用于临床研究是不现实的。采用原核细菌发酵法生产基因重组蛋白虽然简便，但是不能糖基化，产生的蛋白质没有生理活性或活性很 低，没有药物功能。国外用真核细胞工程方法生产GDNF，产品的生理活性好，但是产量低，成 本高，价格昂贵，产品适合用于科学研究，不适合当药物使用。动物乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，将外源基因导入动物基因组中并定 位表达于动物乳腺，利用动物乳腺能够天然、高效合成并分泌蛋白的能力，所产出的蛋白质 能天然糖基化，而且具有生产效率高，成本低等优点。因而，动物乳腺生物反应器被国际上 公认为在人类疾病治疗和保健用的药用蛋白质生产中是最具有发展前景的技术方法之一。应用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白已成为生物高技术领域研究的热点，然 而，传统的基因随机整合方法制作乳腺生物反应器，外源基因的表达调控受到整合部位邻 近的DNA序列影响，表达水平差异大且大多停留在较低的表达水平。而用基因打靶方法制 作的转基因动物外源基因表达不受位置效应影响，能够显著提高表达水平。因此，用基因打 靶方法制作乳腺生物反应器是当前生产药用蛋白质的最佳选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种人gdnf基因在牛0 -casein基因座的定位整合载体。本发明的另一目的是提供上述载体在制备表达人GDNF蛋白的牛乳腺生物反应器 中的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种人gdnf基因在牛0-casein基因座的定位整 合载体，其包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，所述重组酶识别序 列的另一端分别与牛0-casein基因的5'同源臂和3'同源臂相连，人gdnf基因位于5‘ 同源臂下游，所述5'同源臂的内部具有启动正筛选基因表达的启动子，在所述同源臂的外 侧还具有负筛选基因。前述的载体，其中所述正筛选基因为编码新霉素磷酸转移酶的基因。前述的载体，其中所述负筛选基因为双负筛选因子，分别为HSV-tk基因和DsRed2 红荧光标记基因。前述的载体，其中所述重组酶识别序列为Cre酶识别序列。前述的载体，其中扩增所述牛0-casein基因5'同源臂的引物为上游引物5 ‘ _G ACGTCGACAAAACTTCCGTGTGTCCCAGC-3 ‘和下游引物 5 ‘ -GGCCTCGAGCTCCTGGGAATGGGAAGATGA -3'。前述的载体，其中扩增所述牛0-casein基因3'同源臂的引物为上游引物5‘-
AAAGGATCCAGCAACAGACTAACAAGAAGG-3 ‘和下游引物 5 ‘ -CTCAGGATCCAAACATCGGCTTACTTG-3 /
o前述的载体，其中扩增所述人gdnf基因的引物为上游引物5 ‘ -GACCTCGAGATGAAG TTATGGGATGTCGTGGCTGTC-3‘和下游引物 5' -GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3‘。前述的载体，其中所述人gdnf基因的下游连接有SV40 polyA序列。所述人gdnf基因在牛0-casein基基因座的定位整合载体在基因打靶中的应用。所述人gdnf基因在牛0-casein基因座的定位整合载体在制备表达人⑶NF蛋白 的牛乳腺生物反应器中的应用。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果
(1)本发明采用同源重组的方法，将目的基因gdnf定位整合到牛0-casein基因 启动子的下游，借助牛0 -casein基因天然启动子使得目的基因高效表达。(2)采用本发明方法制备得到的乳腺生物反应器能够在乳腺上皮细胞中高效表达 具有生物学活性的、糖基化的人GDNF蛋白因子。(3)采用DsRed2红荧光标记基因作为打靶的负筛选因子之一，有利于提高细胞打 靶的筛选效率。(4)本发明利用家畜动物乳腺生物反应器生产药用蛋白具有以下优点乳腺可以 不断分泌奶汁，长期收集不会对动物造成伤害；对动物的生理活动影响小，药物蛋白限制在 乳腺内生产，分泌到乳汁中，不会进入血液，不会对转基因动物的正常生理活动造成影响； 生物活性高，家畜乳腺可对表达的蛋白质进行糖基化、酯化、磷酸化和形成多聚体等一系列 翻译后加工，产品接近天然提取物，活性高，不易产生抗药性；产量大，易提纯；设备简单， 无环境污染；开发周期短；生产成本低。(5)与传统的基因随机整合方法制备乳腺生物反应器不同，其外源基因的表达调 控易受到整合部位邻近的DNA序列影响，表达水平差异大且大多停留在较低水平；本发明 采用基因打靶方法制备的转基因动物外源基因定位表达不受位置效应影响，能够显著提高 表达水平。
图1为本发明gdnf PCR产物凝胶电泳图，1为DNA分子量标准，lOObp DNA Ladder Marker，2 为人 gdnf cDNA PCR 产物；图2为本发明牛3-casein基因5'同源臂PCR产物电泳图，1为DNA分子量标准， 500bp DNA Ladder Marker，2 为 5'同源臂 PCR 产物；图3为本发明牛3-casein基因3'同源臂PCR产物电泳图，1为DNA分子量标准， 入DNA/EcoR 1，2-4为3'同源臂PCR产物；图4为本发明基因打靶载体pNRTCNbG的结构示意图；图5为本发明人乳腺肿瘤上皮细胞Bcap-37对不同浓度G418的耐受性实验结果 示意图；图6为本发明线性化载体pNRTCNbG转染Bcap-37细胞后在显微镜下观察到的转 基因细胞，a为相差显微镜观察结果，b为荧光显微镜观察结果；图7为本发明转基因细胞基因组DNA的PCR分析，1为DNA分子量标准，\ DNA/ Hindlll+EcoR 1，2为质粒pNTRCNbG阳性对照，3为正常细胞阴性对照，4为转染细胞 Bcap-37 ；图8为本发明RT-PCR分析转基因Bcap-37细胞重组人gdnf的转录，1为DNA分子 量标准DL2000 DNA Marker, 2-4为以诱导培养24hr，48hr和72hr非转基因细胞总RNA为 模板的PCR，5-7为以诱导培养24hr，48hr和72hr转基因细胞总RNA为模板的PCR，8-10为 诱导培养24hr，48hr和72hr非转基因细胞的RT-PCR，11-13为诱导培养24hr，48hr和72hr 转基因细胞的RT-PCR ；图9为本发明Western Blot检测重组⑶NF蛋白的分泌，M为蛋白Marker，1为诱 导培养48hr的正常Bcap-37细胞上清液，2为诱导培养48hr的转基因Bcap-37细胞上清液；图10为本发明获得的基因打靶克隆囊胚的PCR检测图，1为XDNA/Hindlll+EcoR 1，2为吐0(阴性对照)，3为孤雌囊胚(阴性对照)，4和5为基因打靶克隆囊胚，6为 pNRTCNbG(阳性对照)。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1人gdnf基因打靶0 -casein基因座的牛乳腺生物反应器高效表达载体 的制备1材料与方法1. 1 材料1. 1. 1菌株与质粒大肠杆菌DH5 a购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒pCMV-Red由 pDsRed2 (Clontech)在BamH I位点插入CMV启动子衍生而来；质粒pPGK-neoLoxP由美国 华盛顿医学院惠赠；质粒pUMVCl-tk购自美国密执根大学载体中心。1.1.2主要试剂及试剂盒质粒提取试剂盒、小量RNA提取试剂盒、DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒和DNA纯化试 剂盒购自QIAGEN、上海华舜生物工程有限公司及TIANGEN ;Taq Plus、Pfu DNA聚合酶购自 TIANGEN ；ExTaq DNA 聚合酶、T4DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶、M-MLV 反转录酶、oligo (dT)和 限制性内切酶均为TAKARA产品。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。1. 1. 3主要仪器设备电热恒温隔水式培养箱(DDHZ-300)，水浴恒温箱(上海一恒)，振荡器(海宁仪 器厂)，汽浴振荡摇床(THZ-C)，水平电泳槽(北京六一厂)，凝胶成像仪(BI0-RAD)，高速 离心机(EPPEND0RF)，高速低温离心机(BECKMAN)，大型低温离心机(BECKMAN)超净工作台 (AIRTECH)，超低温冰箱(SANYO)，基因电转仪(BI0-RAD)，核酸蛋白测定仪(BI0-RAD)，高压 自动灭菌锅(HIRAYAMA)。1. 1.4溶液配制(1)液体LB培养基酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，NaCl 10g，溶于800mL去离子水中，调pH至7. 0， 最后用去离子水定容至lOOOmL，高压灭菌，4°C保存备用；(2)固体LB培养基酵母提取物5g，胰化蛋白胨10g，NaCl 10g，琼脂15g，溶于800mL去离子水中，调 pH至7. 0，最后用去离子水定容至lOOOmL，高压灭菌，4°C保存备用；(3) S0B 培养基胰蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl 0. 5g，加去离子水至800mL，搅拌溶解，然后加 入250mmol/L KC1 10ml，调pH至7. 4，最后用去离子水定容至总体积1L，高压灭菌，使用前 加入5mL经高压灭菌的2匪gCl2 ；(4)细胞总DNA抽提缓冲液10mmol/L Tris CI (pH8. 0)，0. lmmol/L EDTA (pH8. 0)，20 ii g/mL 胰蛋白酶，0. 5%SDS ；(5)50XTAE 缓冲液242g Tris 碱，56. 7mL 冰乙酸，100mL 0. 5M EDTA (pH8. 0)。1. 2 方法1. 2. 1RT-PCR 扩增 gdnf 基因取4月龄人胎儿肾脏组织30mg，用购自上海华舜生物工程有限公司的RNA小量提 取试剂盒提取总RNA，并以oligo(dT)为引物合成cDNA第一链，然后以此为模板，分别以人 gdnf基因5'端和3'端两条引物进行PCR扩增，反应条件为94°C变性45s，58°C复性45s， 72°C延伸 lmin，共 35 个循环。gdnf PCR 引物为，上游引物 G1 -GACCTCGAGATGAAGTTAT GGGATGTCGTGGCTGTC-3 ‘，下游引物 G2 5 ‘ GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3 ‘；上、 下游引物5'端分别引入Xho I酶切位点。1.2. 25'同源臂和3'同源臂的PCR扩增根据Bonsing等发表的牛3 -casein基因序列(M55188)设计5 ‘同源臂和3 ‘ 同源臂的PCR扩增引物，使得产物长度分别为2264bp和5744bp。5'同源臂PCR上游引物 CNbl 5' -GACGTCGACAAAACTTCCGTGTGTCCCAGC-3 ‘，下游引物 CNb2 5 ‘ -GGCCTCGAGCTCCTG GGAATGGGAAGATGA-3'，上、下游引物两端分别引入Sal I和Xho I酶切位点；3'同源臂PCR 上游引物 CNb3 5 ‘ -AAAGGATCCAGCAACAGACTAACAAGAAGG-3 ‘，下游弓丨物 CNb4 5 ‘ -CTCAGGA ICCAAACATCGGCTTACTTG-3‘，上、下游引物两端分别引入BamH I酶切位点。以牛胎儿成纤 维细胞为材料，提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，用高保真ExTaq DNA聚合酶扩增5' 同源臂和3'同源臂。扩增5'同源臂的PCR反应条件为94°C变性45s，61.5°C复性45s， 72°C延伸2. 5min，共35个循环。扩增3'同源臂的PCR反应条件为94°C变性45s，58°C复 性45s，72°C延伸6min，共35个循环。1. 2. 3基因打靶载体pNRTCNbG的构建1. 2. 3. 1目的基因gdnf转录终止信号序列的插入用Not I、Ssp I酶切质粒pCMV-Red，回收264bp的SV40polyA转录终止信号序列； 用 Not I、EcoRV 酶切质粒 pPGK-neoLexP，将 SV40polyA 克隆到 pPGK-neoLoxP 载体上，命名 为 pP40。1. 2. 3. 2负筛选标记基因DsRed2的插入用BamH I、Ssp I酶切质粒pCMV-Red，胶回收1. 5kb的DsRed2红荧光蛋白基因； 用Kpn I酶切pP40载体，T4DNA聚合酶补平粘端，再用BamH I酶切后，将DsRed2基因克隆 到pP40载体上，命名为 。1. 2. 3. 3负筛选标记基因HSV-tk的插入用高保真Pfu DNA聚合酶以质粒pUMVCl-tk为模板扩增长度为2837bp的HSV_tk 基因；PCR 上游引物5 ‘ -GTTCTCGAGTGTCGGGGCTGGCTTA-3 ‘，下游引物5 ‘ -CCACACGTGATA GTCCTGTCGGGTTTCGC-3'；上、下游引物两端分别引入Xho I和PmaC 1(用于打靶载体线性 化)酶切位点；PCR反应条件为94°C变性45s，62°C复性45s，72°C延伸3min，共35个循环。 用Apa I酶切质粒pP40R，T4DNA聚合酶补平粘端，再用Xho I酶切后，胶回收PCR扩增的 HSV-tk基因，用Xho I酶切后，克隆到pP40R载体上，命名为pP40RT。1.2.3.4 5'同源臂的插入
用Sal I、Xho I酶切5'同源臂PCR产物，将5'同源臂克隆到pP40RT的Xho I 位点，命名为PP40RTC。1. 2. 3. 5目的基因gdnf的插入将gdnf PCR产物用Xho I酶切后克隆到pP40RTC载体的Xho I位点，命 名为pP40RTCG。用PCR法检测gdnf的插入方向；PCR上游引物(5 ‘ -ACTATTTC CTCATCTTCCCATTCCCAG-3')设计在载体的5'同源臂上，下游引物为gdnf 3 ‘端引物G2: 5' -GAGCTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3‘；反应条件为94°C变性 45s，62°C复性 45s， 72°C延伸lmin，共35个循环；如果是正向插入将获得598bp的特异产物，反向插入则无特 异PCR产物。1.2. 3.6 3'同源臂的插入将3 ‘同源臂PCR产物用BamH I酶切后克隆到pP40RTCG载体的BamH I位点。用 PCR法检测3 ‘同源臂的插入方向；PCR上游引物5 ‘ -TGCCTCTGAATGAACACTATCTTACC-3 ‘
(位于3 ‘同源臂上)，下游引物5 ‘ -GTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGG-3 ‘(位于3 ‘同源 臂5'端外侧骨架载体序列上)；反应条件为:94°C变性45s，58°C复性45s，72°C延伸lmin， 共35个循环；如果是正向插入将获得829bp的特异产物，反向插入则无特异PCR产物。1. 2. 4基因打靶载体的部分DNA序列测定通过对插入片段与骨架载体连接处及插入片段与插入片段连接处进行DNA序列 分析，进一步鉴定基因打靶载体构建是否正确。测序由上海生工生物工程技术服务有限公 司完成。测序引物及测定序列在pNRTCNbG载体中的位置如表1所示。表1 pNRTCNbG载体部分DNA序列测定位置 2 结果2. 1RT-PCR 扩增获得 gdnf 基因RT-PCR扩增产物，用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，特异条带与预期大小相符(576bp) (如图1所示)。结果表明，通过RT-PCR扩增获得了 gdnf cDNA。测序结果表明，gdnf序列 与GenBank公布的序列(AY052832)相一致。2.2PCR扩增获得5'同源臂和3'同源臂提取的牛基因组DNA，用0. 7%的琼脂糖凝胶电泳检测，其完整性大于21kb，符合 PCR要求。以此为模板，通过PCR扩增获得了 2246bp的5'同源臂(如图2所示)和5744bp 的3'同源臂(如图3所示)。2. 3基因打靶载体的鉴定
2. 3. 1重组质粒pP40的酶切鉴定用Not I、EcoR I双酶切重组质粒pP40，获得的小片段与预期大小相符，表明SV40 polyA插入到骨架载体的预期位置。2. 3. 2重组质粒pP40R的酶切鉴定用HindIII、BamH I双酶切重组质粒pP40R获得的大片段与pP40单酶切片段大小 相等，小片段约为1555bp，表明pP40R构建正确。2. 3. 3重组质粒pP40RT的酶切鉴定用PmaC I、Xho I双酶切重组质粒pP40RT获得的大片段与pP40R单酶切片段大小 相等，小片段约为2827bp，表明pP40RT构建正确。2. 3. 4重组质粒pP40RTC的酶切鉴定Sal I和Xho I为同尾酶，将5'同源臂插入到载体Xho I位点，5'端将形成Taq I酶切位点，3'端将形成Xho I酶切位点。用PmaC I、Xho I双酶切重组质粒，根据酶切片 段大小可判断5'同源臂的插入方向。2. 3. 5重组质粒pP40RTCG的鉴定用Xho I酶切5个重组质粒，均获得了 564bp的小片段。PCR检测gdnf的插入方 向，其中3个为正向插入，2个为反向插入。2. 3. 6重组质粒pNRTCNbG的鉴定用BamH I酶切2个重组质粒，均获得了 13kb的大片段和5. 7kb的小片段。PCR检 测3'同源臂的插入方向，其中一个为正向插入，另一个为反向插入。正向插入的，即为正确 构建的基因打靶载体PNRTCNbG，其结构示意图如图4所示。2. 4基因打靶载体pNRTCNbG的部分DNA测序分析 通过对pNRTCNbG载体部分DNA序列测序结果表明，插入片段与骨架载体的连接及 插入片段与插入片段的连接正确，进一步证明了所构建的打靶载体结构正确。实施例2人⑶NF牛乳腺生物反应器高效表达载体的生物学功能分析将pNRTCNbG载体转入人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37中，经激素诱导后，在细胞 培养上清液中检测到了人GDNF的特异表达，验证了该表达载体具有正确的生物学功能。1材料与方法1.1 材料1. 1. 1主要仪器设备生物洁净安全柜(BHRC-1300IIA/B3)，C02培养箱(BINDER)，倒置相差显微镜 (NIKON)，超低温冰箱(SANYO)，PCR 仪(BI0METR0)，凝胶成像仪(BI0-RAD)，DYY-6C 型电泳 仪及电泳槽(北京六一仪器厂)、高速台式离心机(EPPEND0RF)，低速台式离心机(上海安 亭，TGL-16G)，蛋白电泳仪及转膜仪(BI0-RAD)等。1.1. 2活体材料人乳腺肿瘤上皮细胞系Bcap-37购自中国科学院上海细胞所。1.1. 3主要试剂RPMI-1640培养基、G418、胰蛋白酶(Trypsin)、胰岛素(Insulin)、羊催乳素 (Prolactin)和氢化可的松(Hydrocortisone)均为Sigma产品；标准胎牛血清为TBD产品； Taq Plus DNA聚合酶购自TIANGEN ;ExTaq DNA聚合酶、M-MLV反转录酶、oligo (dT)和限制性内切酶均为TAKARA产品；无内毒素质粒大量提取试剂盒和DNA纯化试剂盒购自QIAGEN ； 小量RNA提取试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司；兔⑶NF多克隆购自Santa Cruz ；碱 性磷酸酶共价耦联的二抗(羊抗兔)及BCIP/NBT试剂盒购自博士德公司。1.1. 4主要溶液配制(1)0. 01M PBS(pH7. 4)称取Na2HP04 1. 1648g、NaH2P04 .2H20 0. 2825g、NaCl 9. 0g，加入超纯水定容至 1L, 高压灭菌后，4°C储存备用；(2) 1XTE (pH7. 6)100mM Tris CI (pH7. 6) lOmL, lOmM EDTA (pH8. 0) 2mL，加入超纯水定容至 1L，高压 灭菌后，4°C储存备用；(3) G418 浓储液(100mg/mL)称取G418粉末1. Og,加入超纯水10mL完全溶解后，0. 22 u m滤器过滤灭菌，-20 V
储存备用；(4)0. 25% 胰蛋白酶/EDTA称取胰蛋白酶0. 5g、EDTA 2H20 0. 084g，加入超纯水100mL，0. 22 u m滤器过滤灭 菌后分装入15mL离心管中，-20°C储存备用；1.1. 5 培养液人乳腺肿瘤上皮细胞培养液RPMI_ 1640+20% FBS人乳腺肿瘤上皮细胞诱导培养液RPMI-1640+Insulin 0. 4U/mL+Hydrocortisone 1u g/mL+Prolactin 4 u g/mL1.2 方法1. 2. 1人乳腺肿瘤上皮细胞Bcap-37对G418的耐受性检测将Bcap-37细胞以5X 104个细胞/孔的密度接种于12孔板中，当细胞生长至 80%汇合度时，更换培养液，同时在12孔中分别加入G418至终浓度为Oil g/mL、50 y g/mL、 100u g/mL、150u g/mL、200 u g/mL>250u g/mL、300 u g/mL、350 u g/mL>400u g/mL>450u g/ mL、500 u g/mL、550 u g/mL,每2天换液一次，每天观察细胞生长情况，记录培养在不同G418 浓度中的细胞全部被杀死的时间，以7-10天内杀死全部细胞的G418浓度作为筛选时的最 适合浓度。1. 2. 2脂质体介导法转染人乳腺肿瘤上皮细胞Bcap-37转染前一天，用胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，按3X 105个细胞/孔的密度接 种于六孔板中，每孔加2mL不含抗生素的培养基，使其在转染时达到50-80%的汇合度；将2 ii g线性化打靶载体加入到1. 5mL离心管中并用无血清培养液稀释至100 u L， 在另一离心管中加入10 y L lipofectmine并用无血清培养液稀释至100 u L，然后将两管 液体合并，温和混勻，室温放置30min，转染前，再加入200 y L无血清培养液，温和混勻； 六孔板细胞换液，代之以每孔400 u L无血清的培养液，然后向每孔加入400 y L质 粒脂质体复合物，用摇床温和地混勻；在37°C、5%饱和湿度的条件下培养6hr后，更换新鲜的完全培养液，继续培养。1. 2. 3稳定转染细胞的筛选与扩大培养转染48hr后，用胰蛋白酶消化每孔细胞接种于100mm培养皿中，并加入G418至终浓度300 u g/mL,继续培养，每3天换液一次，8-10天后，将表达红色荧光蛋白的细胞克隆分 离、扩培、冷冻保存备用。1. 2. 4PCR检测转染细胞提取稳定转染的细胞基因组DNA，以5'同源臂上游引物作为正义引物，在 SV40polyA序列外侧设计反义引物，PCR检测gdnf转录盒子(5'臂+gdnfcDNA+SV40polyA) 是否整合到细胞基因组DNA中。PCR反应条件为94°C变性45s，62°C复性45s，72°C延伸 3min，共35个循环。1. 2. 5转基因细胞的⑶NF表达检测1.2. 5. 1转基因细胞的诱导表达阳性转基因细胞生长至80%汇合度时，更换诱导培养液，分别诱导培养24hr、 48hr、72hr后，收集细胞及细胞培养上清液。1. 2. 5. 2RT-PCR 分析 gdnf 的转录表达以诱导培养的细胞为材料，用上海华舜生物工程有限公司小量RNA(无DNA)提取 试剂盒，按照说明书提取总RNA，以1. 0 y g RNA为模板反转录合成cDNA链。以cDNA为模板 PCR检测转基因细胞诱导培养后是否有gdnf在mRNA水平的表达。gdnf引物及PCR反应条 件同实施例1中1.2. 1。同时，用GAPDH基因作为RT-PCR内参对照。根据GAPDHmRNA序列(NM002046)设 计如下PCR引物上游引物5'-AACGGATTTGGTCGTATTGGGCG-3‘下游引物5'-CAAAGGTGGAGGAGTGGGTGTCG-3‘PCR反应条件为94°C变性45s，60°C复性45s，72°C延伸lmin，共35个循环。1. 2. 5. 3ffestern Blot 检测 gdnf 表达产物的分泌三氯乙酸法浓缩细胞诱导培养上清液，Lorry法测定蛋白浓度。取40iig蛋白， 12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封膜，一抗4°C浸泡过 夜，二抗室温孵育lhr，BCIP/NBT显色。2 结果2. 1人乳腺肿瘤上皮细胞Bcap-37对G418的耐受性实验结果(如图5所示)表明，G418浓度在100 ii g/mL时即对Bcap-37细胞有 明显毒害作用，随着G418浓度的增大，细胞全部被杀死的时间也随之缩短。G418浓度在 200-300 y g/mL的范围内时，细胞在培养7-9天内全部死亡。因而，筛选稳定转染外源基因 细胞的G418浓度应为200-300 u g/mL，在本发明中，用于筛选稳定转染细胞的G418浓度为 300y g/mL。2. 2转基因细胞的鉴定线性化载体转染Bcap-37细胞，G418筛选8_10天后，获得了表达红色荧光蛋 白的细胞克隆(如图6a和b所示，分别为相差显微镜和荧光显微镜下观察到的转基 因细胞)。分离扩培红色荧光细胞，提取基因组DNA，PCR扩增gdnf转录盒子(5'臂 +gdnfCDNA+SV40pOlyA)，未转染细胞无特异条带，而稳定转染的红荧光细胞获得了与阳性 对照同样大小的特异条带(如图7所示)，表明gdnf转录盒子已整合到细胞基因组之中。2. 3gdnf基因的诱导表达
2. 3. 1RT-PCR 检测阳性转基因细胞及未转染细胞诱导培养24hr、48hr、72hr后提取RNA，以RNA为模 板PCR扩增gdnfcDNA，无特异条带，表明RNA未受基因组DNA污染；以RNA为模板反转录合 成cDNA链，PCR扩增gdnfcDNA基因，诱导培养24hr、48hr、72hr的转基因细胞获得了 558bp 特异条带，而阴性对照无特异条带产生(如图8所示)。结果表明牛0-casein基因启动子 能够驱动gdnf cDNA基因转录为mRNA。2. 3. 2ffestern Blot 检测诱导培养48hr的转基因细胞上清液经Western Blot探测，有大约15kDa和18kDa 两条特异带形成，18kDa条带为GDNF的相应糖基化形式，而未转染细胞无特异带形成(如 图9所示)，表明转基因Bcap-37细胞经激素诱导后，牛0-casein基因启动子驱动的 gdnfcDNA基因能够表达翻译成⑶NF蛋白，而且能进行翻译后加工形成糖蛋白分泌到细胞 外。3 结论本发明将乳腺特异表达载体转入人乳腺肿瘤细胞系Bcap-37细胞中，获得了稳定 转染的转基因细胞。转基因细胞生长到80%汇合度时，经催乳素、氢化可的松及胰岛素诱导 表达，应用RT-PCR和WesternBlot检测到了重组人gdnf基因在mRNA和蛋白水平的表达； 且重组GDNF能够在进行糖基化后分泌到细胞外。该结果表明我们构建的基因打靶载体，基 因构件合理，能够在乳腺细胞中正确表达和分泌目的蛋白。实施例3人gdnf基因打靶载体稳定转染牛胎儿成纤维细胞及中靶克隆的筛选利用线性化打靶载体pNRTCNbG电击转染牛胎儿成纤维细胞，将转染细胞分为两 等份，分别加入G418和G418+GANC筛选获得抗性克隆后，在荧光显微镜下排除红荧光克隆， 富集中靶克隆。结果表明，GANC对富集的克隆细胞有毒性作用，而DsRed2蛋白对富集的克 隆细胞无毒性作用；HSV-tk和DsRed2富集效率分别为2倍和4倍。然后，利用线性化打靶 载体pNRTCNbG电击转染了 3. 2X107个牛胎儿成纤维细胞。用G418筛选8_10天后，共获 得了 3057个G418抗性克隆，在荧光显微镜下排除红荧光抗性克隆后，获得了 773个非红荧 光抗性克隆，经PCR扩增、PCR产物测序等方法鉴定，证实有5个单克隆为打靶克隆，相对打 靶效率为0.65% (5/773)，绝对打靶效率为1.6X10-7(5/3. 2 X107)。1材料与方法1.1 材料1.1.1主要仪器设备生物洁净安全柜(BHC-1300IIA/B3)，C02培养箱(BINDER)，倒置相差显微 镜(NIKON)，血细胞计数板(上海求精生化试剂仪器有限公司)，液氮罐(CRYOGENIC EQIPMENT)，超低温冰箱(SANYO)，基因电转仪(BI0-RAD)，PCR仪(BI0METR0)，凝胶成像仪 (BI0-RAD)，DYY-6C型电泳仪及电泳槽(北京六一仪器厂)、高速台式离心机(EPPEND0RF)， 低速台式离心机(上海安亭，TGL-16G)。1.1. 2活体材料雌性牛胎儿成纤维细胞。1.1. 3主要试剂及耗材DMEM/F12, GANC, bFGF，胰蛋白酶(Trypsin)购自 Sigma 公司；ExTaq DNA 聚合酶，LA Taq DNA聚合酶，PmaC I限制性内切酶购自TAKARA公司；标准胎牛血清为TBD产品； T25、T75培养瓶，60mm、100mm培养皿均为Corning公司产品；48孔细胞培养板、24孔细胞培 养板、12孔细胞培养板、6孔细胞培养板为Nunc产品。1.1. 4溶液配制(l)2mM GANC5. 2mg GANC 溶于 10mL 0. IN HC1 中，分装为每管 lmL, _20°C保存备用；(2) 1000 X 双抗青霉素0. 6993g，链霉素1. OOOOg，溶于10mL超纯水，分装为每管lmL，-20°C保存1.2 方法1. 2. 1电穿孔法转染牛胎儿成纤维细胞胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，用含10% FBS的DMEM/F12终止消化，离心收集 细胞，再用1/2终止液体积的无血清DMEM/F12培养液重悬细胞并计数，再次离心，用无血清 DMEM/F12培养液重悬细胞使其密度为1 X 107/mL ；取400 u L细胞悬液加入到间距4mm电击 杯中，加入用限制性内切酶PmaC I消化的线性化质粒pNRTCNbG12 u g使其终浓度为30 u g/ mL，轻轻敲击杯底使DNA和细胞混勻，550V电压、50 y F电容条件下电击转染，电击完成后， 电击槽中静置lmin，冰浴2min，然后将细胞以1 X 106密度接种于100mm培养皿中，于37°C、 5% C02、饱和湿度条件下培养。1.2. 2单克隆细胞的筛选转染后48hr的细胞，胰蛋白酶消化后，以3X 105个细胞密度接种于100mm培养 皿中，加入G418至终浓度500 u g/mL和GANC至终浓度2 u mol/L,或只加入G418至终浓度 500 u g/mL,继续培养，每2天换液一次，8-10天后，显微镜下观察细胞克隆，标出100个细胞 以上克隆，然后在荧光显微镜下标出红荧光细胞克隆和非红荧光细胞克隆，并做好数据统 计。1. 2. 3非红荧光单克隆细胞的挑取与扩大培养在无菌条件下，用自制的直径为8mm的不锈钢克隆杯沾取少量凡士林油，置于非 红荧光单克隆细胞上，加入胰蛋白酶消化液50 u L，37°C消化细胞3min左右，当轻轻振荡 下细胞能够脱壁时，加入含血清培养液150 u L终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞使其悬 浮，吸取细胞悬液转移至48孔中，添加培养液至500 ii L/孔，培养液为DMEM/F12+10% FBS+G418300 u g/mL+bFGF 5ng/mL(下同)。于37°C、5% C02、饱和湿度条件下培养细胞。每 3天换液一次。观察细胞生长情况，待细胞生长至80%汇合时，用PBS漂洗细胞2次，加入胰蛋白 酶消化细胞3min左右，用含血清培养液终止细胞消化，将1/5体积的细胞悬液转至新的48 孔中，继续培养至完全汇合后，提取基因组DNA用于PCR法筛选鉴定中靶克隆 ’另4/5的细 胞悬液转至24孔板继续扩大培养。待细胞生长至基本汇合时，冷冻保存或继续扩大培养。1.2. 4打靶细胞克隆的鉴定以基因组染色体定点整合序列为模板，PCR法检测同源重组事件。利用引物 Pla(5'同源臂外侧)和P2(gdnf基因上)以抗G418的非红荧光单克隆细胞基因组DNA为 模板进行PCR检测，鉴定同源重组克隆；为增加PCR检测的灵敏度和阳性结果的准确性，利用PCR产物为模板，用引物Plb(5'同源臂外侧，Pla内测)和P2进行巢式PCR进一步检测 阳性细胞克隆；胶回收阳性PCR特异条带，测序分析5'同源臂与基因座连接区域序列，判 断5'同源臂是否发生了同源重组。PCR引物序列和反应条件如表2所示。表2基因打靶细胞克隆鉴定的PCR引物 基因组DNA模板制备48孔板的细胞每孔加入40 y L的裂解缓冲液(pH8. 040mM Tris-HCl,0. 9% TritonX-100,0. 9 % Nonidet P-40,0. 4mg/mL 蛋白酶 K)，裂解后收集到 1. 5mL的离心管，在65°C水浴中消化30min，最后在95°C水浴中处理lOmin，使蛋白酶K失 活。20 ii L的PCR反应体系中加入2 u L基因组DNA作为模板。2 结果2. 1打靶载体的富集效率本发明构建的打靶载体为一正双负打靶载体，即用neo基因作为正筛选因子， HSV-tk和DsRed2作为负筛选因子。为了研究负筛选因子HSV-tk和DsRed2对同源重组的富 集效率，我们取8X106个细胞电击转染线性化打靶载体pNRTCNbG，电击后，将转染细胞分为 两等份培养，其中一份只加入G418 (500 u g/mL)筛选抗性克隆，另一份加入G418 (500 u g/ mL)和GANC(2iimol/L)筛选抗性克隆，8_10天后，显微镜下逐一检出抗性细胞克隆，并用 记号笔做好标记，在荧光显微镜下可以看到大部分克隆为红荧光克隆，少部分克隆不发红 荧光。红荧光克隆为随机整合克隆，非红荧光克隆中可能有同源重组克隆。对抗性细胞克 隆、红荧光克隆、非红荧光克隆数据进行统计(表3)，计算打靶载体的富集效率。数据分 析表明HSV-tk的富集效率约为2倍(397/201)，DsRed2的富集效率约为4倍(397/98或 201/52)，双负筛选因子的富集效率约为8倍(397/52或2X4)。在药物筛选抗性细胞克隆过程中，我们观察到用G418+GANC筛选到的抗性克隆细 胞比仅用G418筛选到抗性克隆细胞更容易衰老，且HSV-tk的富集效率仅为2倍，而DsRed2 基因的富集效率为4倍，且只需要在荧光显微镜下排除红荧光克隆便可起到富集作用，无 需添加抗性药物，对富集的克隆无毒害作用。因此，为了获得生长活力旺盛的同源重组克 隆，在随后抗性克隆药物筛选过程中，我们只用G418进行筛选。表3HSV_tk和DsRed2的富集作用 注DsRed2-是指经G418或G418+GANC筛选后不发红荧光的抗性克隆2. 6. 2非红荧光抗性细胞克隆的挑取与扩大培养利用线性化打靶载体pNRTCNbG电击转染了 3. 2X 107个牛胎儿成纤维细胞，用 G418筛选，共获得了 3057个G418抗性克隆，在荧光显微镜下排除红荧光抗性克隆后，获得 了 773个非红荧光抗性克隆。用克隆杯分离非红荧光抗性克隆，接种到48孔板中生长至 80%汇合度时，胰蛋白酶消化，1/5体积细胞接种到48孔板继续扩大培养至80%汇合后，提 取基因组DNA，用于PCR法鉴定打靶克隆；另4/5体积的细胞接种到24孔板，待细胞生长至 基本汇合时，冷冻保存。在抗性克隆的挑取和传代过程中，每次传代都有相当数量的克隆因 细胞衰老而失去了增殖能力。但也有一些细胞形态好的克隆能够扩大培养至6孔板，甚至 到60mm的培养皿，可是随着培养时间的延长，细胞逐渐变得衰老，表现为细胞体积增大、形 态改变、扁平化、有空泡出现等现象。2. 7中靶克隆的鉴定与分析以Pla和P2为引物，PCR检测非红荧光抗性克隆，有5个克隆扩增出2737bp的特 异条带；用这5个阳性PCR产物和引物Plb、P2进行巢式PCR，均扩增出2336bp的目的带， 胶回收目的带，由上海生工生物技术有限公司进行测序，结果表明5个克隆均为同源重组 克隆。本发明利用基因打靶载体pNRTCNbG电击转染了 3. 2X 107个牛胎儿成纤维 细胞，正负筛选后获得了 773个非红荧光抗性克隆，经PCR扩增、PCR产物测序等方法 鉴定，证实有5个克隆为打靶克隆，相对打靶效率为0. 65 % (5/773)，绝对打靶效率为 1. 6Xl(T7(5/3. 2X107)(表 4)。表4牛胎儿成纤维细胞基因打靶效率 注括号内数据表示相对打靶效率实施例4人gdnf基因打靶克隆囊胚的制备以实施例3获得的基因打靶牛胎儿成纤维细胞为核供体，去核卵母细胞为胞质受 体制作转基因克隆胚胎，获得了基因打靶克隆囊胚。1材料与方法1. 1 材料1. 1. 1主要仪器设备显微操作器(NARISHIGE)、微熔炉(NARISHIGE)、拉针仪(NARISHIGE)、磨针仪(NARISHIGE)、融合仪(澳大利亚，CRY0L0GIC)、体视显微镜(NIKON)等。1.1.2活体材料屠宰母牛卵巢。1.1. 3试剂及耗材M199 培养基为 Gibco 产品，DMEM/F12、6-DMAP、碘化丙啶(PI)、Hochest33342、透明 质酸酶(Hyaluroniidase)、细胞松弛素 B (Cytochalasin B)、D-PBS 为 SIGMA 公司产品，标 准胎牛血清为TBD产品，其余试剂为国产分析纯；35mm培养皿为Corning产品，4孔培养板 为Nunc产品，其余玻璃器皿及耗材均为国产。1.1. 4溶液配制(l)Hochest33342(1000X C液，5mg/mL)25mg粉剂全部加入50mL六蒸水中，溶解后分装成每管10 y L，_20°C冻存备用；(2)透明质酸酶溶液(2. 5mg/mL,贮液)100mg粉剂溶解于40mL PBS (pH7. 4)溶液中，4°C保存备用；(3)6_DMAP(100X 贮液，200mM)100mg 6-DMAP 溶解于 3. 06mL DMS0,分装成每管 10 ii L, -20°C冻存备用；(4) CCB 浓贮液(100 X 贮液，750 u g/mL)lmg粉末加入1333. 3uL DMS0，溶解后分装成每管20 u L，-20°C冻存备用；(5)卵母细胞成熟液M199+10 % FBS+10mM Hepes+0. 1 u g/mL 17 3 -雌二醇 +10 u g/mLFSH+50 u g/mL 青 霉素+60 U g/mL链霉素；(6)核移植操作液M199+25mM Hepes+10 % FBS+50 u g/mL 青霉素 +60 u g/mL 链霉素；(7)融合液0. 28M+0. 5 u M Hepes+0. ImM CaC12+0. ImM MgS04+0. 01% PVA ；(8)胚胎发育培养液SOFaa+BSA, SOFaa+4% FBS。1. 2 方法1. 2. 1卵巢卵母细胞的采集和体外成熟将采自屠宰场的牛卵巢置于生理盐水中，在2hr内运抵实验室后，用生理盐水仔 细清洗卵巢4-5次，室温放置5-8hr。采卵时，选取直径大小2-8毫米的卵泡，用带有18号 针头的20mL注射器吸出卵泡液置于90mm的培养皿中，在体视显微镜下，挑选出形态良好， 卵丘细胞完整、包裹致密并带有至少三层卵丘细胞的卵母细胞，在成熟培养液中洗3-4遍， 50-100个卵丘-卵母细胞复合体(COCs)置于含lmL/孔成熟培养液的4孔板中，在38.5°C、 5% C02和饱和湿度条件下成熟培养18hr。1. 2. 2成熟卵母细胞的预处理将成熟培养18hr的COCs置于含0. 1 %的透明质酸酶的D-PBS中，用200 y L移液 器反复吹打以去掉成熟卵母细胞表面的卵丘细胞，再用卵母细胞成熟液洗3次。将脱掉卵 丘细胞的卵母细胞置于40 y L的成熟液小滴中，在体视显微镜下挑选排出第一极体且胞质 均勻形态良好的卵母细胞用于核移植或孤雌激活。
1. 2. 3牛卵母细胞的孤雌激活1. 2. 3. 1卵母细胞的孤雌激活处理选择排出第一极体的卵母细胞置于含有7%乙醇的发育液中激活7min，然后转入 含2mM 6-DMAP的发育液(SOFaa+BSA)中，在38. 5°C>5% C02和饱和湿度条件下培养4hr， 用发育液(SOFaa+BSA)洗3次，放入40 y L的发育液(SOFaa+BSA)小滴中培养，激活后36hr 检查卵裂率。1. 2. 3. 2孤雌胚胎的体外培养将孤雌激活后培养36hr的胚胎在体视显微镜下挑选出卵裂胚胎转入SOFaa+4% FBS+卵丘细胞的共培养体系中。发育培养7-9天，统计囊胚发育率。1. 2. 4打靶体细胞的核移植1. 2. 4. 1供体细胞的准备从液氮罐中取出冷冻保存基因打靶牛胎儿成纤维细胞的冷冻管，37 °C水浴 l-2min,使其完全融化后，加入到盛有5mL培养液的离心管中，2000rpm离心5min收集细胞， 再加入5mL核移植操作液重悬细胞，离心，然后用50 y L核移植操作液重悬细胞，室温静置 30min后用于核移植。1. 2. 4. 2成熟牛卵母细胞的去核与注核将用于去核操作的卵母细胞在含有5 u g/mL Hochest33342荧光染料的卵母细胞 成熟培养液中处理3min后，用成熟液洗3次，然后将其置于含有7. 5 y g/mL的细胞松弛素 B(CCB)的核移植操作液中，再加入适量的已准备好的转基因核供体细胞，在显微操作仪下 进行去核和移核的操作。去核时先打开荧光激发器，将光栅置于UV处，确定核的位置后，立 即用光栅挡住荧光光路，用内径20-25 u m的去核针吸去核所在位置及第一极体，打开荧光 光路检查去核是否成功(荧光检查不超过5s)，然后挑选形态良好的打靶体细胞，从去核处 将其注射到去核后的卵母细胞透明带下。1.2. 4.3重构胚的融合将完成去核与注核操作后的卵母细胞_供体细胞复合体在成熟培养液中洗3次， 然后在成熟培养液中恢复培养lhr后进行融合操作。将待融合的卵母细胞_供体细胞复合 体在融合液中平衡2min，然后转入极间距为1mm覆盖融合液的融合槽中，用吸管调整方向， 使卵母细胞-供体细胞接触面与两极平行，施以2次电压为160V/mm、脉冲时长20ii s、脉冲 间隔为Is的方波电脉冲，每组30个完成后放入M199中洗3遍，放回成熟液中，置培养箱中 恢复30min后检查融合情况。1. 2. 4. 4重构胚的激活及体外培养将融合的重构胚置于含有7%乙醇的发育液中激活7min，然后转入含2mM 6-DMAP 的发育液(SOFaa+BSA)中，在38. 5 °C、5 % C02和饱和湿度条件下培养4hr，用发育液 (SOFaa+BSA)洗3次，转入40 y L的发育液(SOFaa+BSA)小滴中培养，激活后36hr检查卵 裂率，并挑选出卵裂胚胎转入SOFaa+4% FBS+卵丘细胞的共培养体系中。激活后培养7_9 天，统计囊胚发育率。1.2.5转基因克隆囊胚的PCR检测随机挑选2个克隆囊胚，分别放入装有10 ii L TE的PCR管中，应用液氮和37°C水 浴反复冻融3-5次，然后以冻融液为模板，以孤雌囊胚作为阴性对照，进行PCR反应。PCR引物与反应条件与实施例1中1. 2. 1的相同。2 结果2. 1卵巢卵母细胞的采集和体外成熟本发明采用抽吸法共回收牛卵丘-卵母细胞复合体2627枚，成熟培养18hr后，卵 母细胞周围的卵丘细胞明显扩散。以卵母细胞形态正常、细胞质均勻且排出第一极体的作 为成熟的标准，则有1844枚卵母细胞成熟，成熟率为70. 2%。2. 2牛卵母细胞的孤雌激活与体外发育培养排出第一极体的成熟牛卵母细胞置于含有7%乙醇的发育液中激活7min，然后转 入含2mM 6-DMAP的发育液(SOFaa+BSA)中，在38. 5°C、5 % C02和饱和湿度条件下培养4hr， 用发育液(SOFaa+BSA)洗3次，放入40 y L SOFaa+BSA的发育液小滴中培养36hr卵裂率为 74. 9% ；将卵裂胚胎转入SOFaa+4% FBS+卵丘细胞的共培养体系中，发育培养7-9天，囊胚 发育率为24. 9% (表5)。结果表明这一培养系统能够很好地支持牛卵母细胞的激活与体 外发育培养，核移植重构胚可以采用该方案进行激活和体外发育培养。表5牛孤雌胚胎的发育情况 2. 3重构胚的融合与体外发育培养本实验共进行去核和注核操作卵母细胞186枚，用于电融合操作154枚，融合了 134枚(融合率87. 0% )，进行发育培养134枚，激活后36hr卵裂46枚(卵裂率34. 3% )， 发育培养7-9天，获得囊胚5枚(囊胚率3. 7% )，结果见表6。表6转基因克隆胚胎的发育情况 2. 4转基因克隆囊胚的PCR检测随机挑选2枚转基因克隆囊胚，用PCR法检测外源基因人gdnf的整合情况。结 果2枚转基因克隆囊胚的PCR产物均在576bp处出现清晰明亮的单一条带，与预期PCR产 物的分子量大小相符，而孤雌囊胚的PCR产物则没有这一大小的条带出现，结果如图10所 示。该结果表明，我们所获得的囊胚为转基因克隆囊胚，而不是由于卵母细胞去核不彻底发 育而成的孤雌囊胚。所获得的囊胚经PCR检测证实为转基因囊胚，而我们使用的供体细胞 为经检测鉴定的单克隆打靶细胞，从而推断获得的转基因囊胚是基因打靶囊胚。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。参考文献Lin LF，Doherty DH，Lile JD，et al.GDNF:a glial cell line-derived neurotrophic factor formid-brain dopaminergic neurons. Science,1993,260(5111) 1130-1132Trupp M，Ryden M, Jornvall H, et al. Peripheral expression and biological activities of GDNF,anew neurotrophic factor for avian and mammalian peripheral neurons. J Cell Biol，1995，130 (1) :137_148Tomac A，Lindqvist E，Lin LF, et al. Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic systemby GDNF in vivo. Nature，1995，373 :335_339Schuchardt A，D' agati V，Larsson-Blomberg L,et al. Defects in the kidney and enteric nervoussystem of mice lacking the tyrosine kinase receptor Ret. Nature, 1994，367 :380_383Gash DM，Zhang Z，Ovadia A，et al. Functional recovery in parkinsonian monkeys treated withGDNF. Nature，1996，380 :252_25Tang XQ,Wang Y，Han JS，et al.Adenovirus-mediated GDNF protects cultured motoneurons fromglutamate injury. Neuroreport,2001,12(14) :3073_3076Moore M，Klein R，Farinas I，et al. Renal and neuronal abnormalities in mice lacking GDNF. Nature，1996，382 :76-79Patel NK,Bunnage M,Plaha P,et al.Intraputamenal infusion of glial cell line-derivedneurotrophic factor in PD :a two-year outcome study.Ann Neurol， 2005，57 298-30权利要求
人gdnf基因在牛β-casein基因座的定位整合载体，其包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，所述重组酶识别序列的另一端分别与牛β-casein基因的5′同源臂和3′同源臂相连，人gdnf基因位于5′同源臂下游，所述5′同源臂的内部具有启动正筛选基因表达的启动子，在所述同源臂的外侧还具有负筛选基因。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述正筛选基因为编码新霉素磷酸转移 酶的基因。
3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述负筛选基因为HSV-tk基因和DsRed2 红荧光标记基因。
4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述重组酶识别序列为Cre酶识别序列。
5.根据权利要求1-4任一项所述的载体，其特征在于，扩增所述牛0-casein基因5' 同源臂的引物为上游引物5' -GACGTCGACAAAACTTCCGTGTGTCCCAGC-3'和下游引物5' -GG CCTCGAGCTCCTGGGAATGGGAAGATGA-3‘。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，扩增所述牛日-casein基因3'同源臂的 引物为上游引物 5 ‘ -AAAGGATCCAGCAACAGACTAACAAGAAGG-3 ‘和下游引物 5 ‘ -CTCAGGATCC AAACATCGGCTTACTTG-3‘。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，扩增所述人gdnf基因的引物为上游引物 5' -GACCTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTC-3'和下游引物 5' -GAGCTCGAGTCAGATACA TCCACACCTTTTAG-3‘。
8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于，所述人gdnf基因的下游连接有 SV40polyA 序列。
9.权利要求1-8任一项所述载体在基因打靶中的应用。
10.权利要求1-8任一项所述载体在制备表达人GDNF蛋白的牛乳腺生物反应器中的应用。
全文摘要
本发明提供了人gdnf基因在牛β-casein基因座的定位整合载体，其包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，所述重组酶识别序列的另一端分别与牛β-casein基因的5′同源臂和3′同源臂相连，人gdnf基因位于5′同源臂下游，所述5′同源臂的内部具有启动正筛选基因表达的启动子，在所述同源臂的外侧还具有负筛选基因。本发明还提供了所述载体在制备表达人GDNF蛋白的牛乳腺生物反应器中的应用。采用本发明提供的载体制备动物乳腺生物反应器，能够高效表达具有生物学活性的人GDNF蛋白因子，产量大，易提纯，设备简单，对环境友好，开发周期短且生产成本低。
文档编号C12N15/85GK101851639SQ20101015833
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月28日 优先权日2010年4月28日
发明者吴应积, 张学明, 罗奋华 申请人:内蒙古大学