专利名称：：基因联合化疗药共同治疗恶性脑瘤和乳腺癌的药物及制备的制作方法基因联合化疗药共同治疗恶性脑瘤和乳腺癌的药物及制备
技术领域：
：本发明属于生物医药
技术领域：
，涉及以树形大分子聚酰胺-胺为载体，运用反义微小RNA-21基因治疗联合紫杉醇化疗共同治疗恶性脑瘤和乳腺癌的药物系统。
背景技术：
：脑胶质瘤(脑胶质细胞瘤)成人中最常见的原发性恶性脑瘤，约占颅内肿瘤的46%，侵袭性强，可无限制增生，缺乏凋亡。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，据资料统计，发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10%，在妇女仅次于子宫癌，是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一.化疗是综合治疗脑胶质瘤和乳腺癌的重要步骤之一，化学治疗对于消灭某种癌症的远处转移，特别是对消灭手术后残留肿瘤细胞或防止复发有其独到之处，是癌症治疗方法中不可缺少的组成部分。紫杉醇作为治疗乳腺癌的常用一线化疗药物，已在临床上应用多年。目前，运用紫杉醇载药纳米微粒抑制恶性脑胶质瘤的生长也受到了更多的关注。但由于水溶性低及全身毒性的问题而限制了其抗癌的临床应用。此外，相当一部分肿瘤对药物耐药而大大影响了化疗效果。因此，如何增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性是临床上化学治疗的关注焦点。
发明内容本发明目的是解决传统单一化疗治疗恶性脑瘤和乳腺癌由于水溶性低及全身毒性而限制了其抗癌的临床应用的问题，提供一种基因治疗联合化疗共同治疗恶性脑瘤和乳腺癌的药物及其制备方法。本发明开发以反义微小RNA-21基因治疗联合紫杉醇传统化疗，树形大分子聚酰胺-胺(PAMAM)为载体，共同治疗脑胶质瘤和乳腺癌的新型治疗药物系统，有效抑制肿瘤生长。本发明提供的基因治疗联合化疗共同治疗恶性脑瘤和乳腺癌的药物，是以聚酰胺-胺树状分子为载体，运用反义微小RNA-21基因联合化疗药物紫杉醇构成的共同治疗脑胶质瘤和乳腺癌细胞生长的药物。该药物的粒径小于100nm。一、上述药物的制备方法，包括第一、将l100重量份的聚酰胺-胺溶解于缓冲溶液中，配成质量浓度为0.01~卯％的溶液，得溶液A;第二、将1~64重量份的治疗性基因as-miR-21溶解于缓冲溶液中，配成质量浓度为0.220%的溶液，得溶液B;第三、将0.05500重量份的紫杉醇溶于缓冲溶液中，配成质量浓度为0.01~90%的溶液，得溶液C;第四、室温条件下，10重量份的溶液A与1重量份的溶液B混合均匀，孵育20分钟后，再加入5重量份的溶液C，即可得反义microRNA-21基因联合紫杉醇化疗共同治疗脑胶质瘤和乳腺癌细胞生长的药物。所述的缓冲溶液包括PBS缓冲溶液或TE缓冲溶液。所述的聚酰胺-胺是指聚酰胺-胺树状分子，其代数为第5代。二、脑胶质瘤和乳腺癌细胞的反义微小RNA-21基因治疗和传统化疗联合治疗技术技术方案1:以U251人脑胶质瘤细胞和MCF-7人乳腺癌细胞为模型，考察单独紫杉醇药物化疗治疗及采用反义微小RNA-21基因和紫杉醇化疗联合治疗后，细胞半数抑制浓度(IC50)的变化。技术方案2:以U251人脑胶质瘤细胞和MCF-7人乳腺癌细胞为模型，考察紫杉醇药物化疗治疗，反义微小RNA-21基因治疗，及采用反义微小RNA-21基因和紫杉醇化疗联合治疗后，细胞生存率的变化。技术方案3:以U251人脑胶质瘤细胞和MCF-7人乳腺癌细胞为模型，考察紫杉醇药物化疗治疗，反义微小RNA-21基因治疗，及采用反义微小RNA-21基因和紫杉醇化疗联合治疗后，细胞凋亡比率的变化。技术方案4:以U251人脑胶质瘤细胞和MCF-7人乳腺癌细胞为模型，考察紫杉醇药物化疗治疗，反义微小RNA-21基因治疗，及采用反义微小RNA-21基因和紫杉醇化疗联合治疗后，细胞周期的变化。技术方案5:以U251人脑胶质瘤细胞和MCF-7人乳腺癌细胞为模型，考察紫杉醇药物化疗治疗，反义微小RNA-21基因治疗，及采用反义微小RNA-21基因和紫杉醇化疗联合治疗后，细胞迁移能力的变化。本发明的优点和积极效果本发明与单独紫杉醇化疗和单独反义微小RNA-21基因治疗相比，运用反义微小RNA-21基因治疗联合紫杉醇化疗共同治疗联合药物治疗可以明显增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，细胞生存率降低，凋亡百分比例增加，S期细胞数明显增多，细胞迁移能力显著下降，能更好的抑制脑胶质瘤和乳腺癌细胞的生长。图1是聚酰胺和反义微小RNA-21复合以及与紫杉醇共同复合后的透射电子显微镜照片，其中图l(a)是聚酰胺和反义微小RNA-21复合，放大倍数为19万倍；图l(b)是聚酰胺和反义微小RNA-21及紫杉醇共同复合后，放大倍数为10万倍；图2是流式细胞仪检测PAMAM在单独基因治疗及联合治疗中的转染效率(ODN由FITC标记)；图2(a)是聚酰胺和反义微小RNA-21复合后，PAMAM的转染效率，图2(b)是聚酰胺和反义微小RNA-21及紫杉醇共同复合后，PAMAM的转染效率；图3是单紫杉醇化疗，反义微小RNA-21基因和紫杉醇化疗共同治疗后紫杉醇药物半数抑制浓度(IC50)的测定图a是U251脑胶质瘤细胞紫杉醇药物半数抑制浓度(IC50)的测定；图b是MCF-7乳腺癌细胞紫杉醇药物半数抑制浓度(IC50)的测定；图4是MTT法检测单紫杉醇化疗，单反义微小RNA-21基因治疗及反义微小RNA-21基因联合紫杉醇化疗共同治疗后，细胞生存率的测定图4(a)是U251脑胶质瘤细胞生存率的测定；图4(b)是MCF-7乳腺癌细胞生存率的测定；图5是流式细胞仪检测不同治疗系统U251人脑胶质瘤细胞凋亡的变化，其中图5(a)空白对照组；图5(b)紫杉醇药物单独治疗组；图5(c)反义微小RNA-21单独治疗组，图5(d)反义微小RNA-21联合紫杉醇共同治疗组；图6是流式细胞仪检测不同治疗系统MCF-7乳腺癌细胞凋亡的变化，图6(a)是空白对照组；图6(b)紫杉醇药物单独治疗组；图6(c)反义微小RNA-21单独治疗组；图6(d)反义微小RNA-21联合紫杉醇共同治疗组；图7是流式细胞仪检测不同治疗系统U251人脑胶质瘤细胞周期的变化，图7(a)是空白对照组；图7(b)是紫杉醇药物单独治疗组；图7(c)是反义微小RNA-21单独治疗组；图7(d)是反义微小RNA-21联合紫杉醇共同治疗组；图8是流式细胞仪检测不同治疗系统MCF-7乳腺癌细胞周期的变化，图8(a)是空白对照组；图8(b)是紫杉醇药物单独治疗组；图8(c)是反义微小RNA-21单独治疗组；图8(d)是反义微小RNA-21联合紫杉醇共同治疗组；图9是tranwell实验检测不同治疗系统U251人脑胶质瘤细胞迁移能力的变化，图9(a)是空白对照组；图9(b)是紫杉醇药物单独治疗组；图9(c)是反义微小RNA-21单独治疗组；图9(d)是反义微小RNA-21联合紫杉醇共同治疗组；图10是tranwell实验检测不同治疗系统MCF-7乳腺癌细胞迁移能力的变化，图10(a)是空白对照组；图10(b)是紫杉醇药物单独治疗组；图10(c)是反义微小RNA-21单独治疗组；图10(d)是反义微小RNA-21联合紫杉醇共同治疗组。具体实施方式实施例1:(1)将2mg聚酰胺-胺树形大分子溶于lmL缓冲溶液中，得溶液A。(2)将0.1mg寡核苷酸溶于lmL缓冲溶液中，得溶液B。(3)将0.05mg紫杉醇溶于lmL缓冲溶液中，得溶液C。室温条件下，IO重量份的溶液A与I重量份的溶液B混合均匀，孵育20分钟后，再加入5重量份的溶液C，即可得反义微小RNA-21基因治疗联合紫杉醇化疗共同治疗恶性脑瘤的新型治疗系统。其透射电子显微镜照片如图l。具体制作条件列表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>实施例2分别接种U251人脑胶质瘤细胞和MCF-7乳腺癌细胞于6孔培养皿中，培养细胞至80%覆盖率时。在无血清状态下，以PAMAM为载体，将FITC标记的反义微小RNA-21分别转染U251细胞和MCF-7细胞，反义微小RNA-21的最终质量浓度为5mg/L，PAMAM的氨基和反义微小RNA-21的磷酸根比例为16:1。流式细胞仪计数检测转染率，如图2。图(a)是聚酰胺和反义微小RNA-21复合后，PAMAM的转染效率，图(b)是聚酰胺和反义微小RNA-21及紫杉醇共同复合后，PAMAM的转染效率；实施例3在将lx104/mlU251人脑胶质瘤细胞和MCF-7乳腺癌细胞接种于96孔细胞培养板，每孔500pl，置37'C、5%的<:02孵箱培养24h。待细胞贴壁后，分别加入8个浓度不同的紫杉醇单药对照组，反义微小RNA-21+紫杉醇为联合药物组(0.025，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.(Himol/L)。按说明书进行寡核苷酸的转染，反义微小RNA-21寡核苷酸的最终质量浓度为5mg/L。每种浓度组合重复6孔.转染48h后，每孔加入20ixlMTT(5mg/mL),37。C孵育4小时。弃去培养基，加入150^1二甲基亚砜(DMSO)振摇溶解15分钟，酶标仪测定570nm处的吸光值(A)，根据吸光值测定细胞的存活率=实验组细胞吸光值/对照组细胞吸光值。在U251人脑胶质瘤细胞中，紫杉醇单药的半数抑制浓度IC50为420nmol/L，，联合治疗组为60nmol/L如图3(a),在MCF-7乳腺癌细胞中，紫杉醇单药的半数抑制浓度IC50为600nmol/L,，联合治疗组为80nmol/L如图3(b)。和传统化疗和单独基因治疗相比，联合药物治疗组的半数抑制浓度显著降低，可以明显增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，对肿瘤实现更有效的抑制。实施例4将U251人脑胶质瘤细胞和MCF-7乳腺癌细胞每孔5xl03接种于96孔细胞培养板，置37'C、5%的0)2孵箱培养24h。以不加药组作为空白对照，单用反义微小RNA-21和单用紫杉醇为单药对照组，反义微小RNA-21+紫杉醇为联合药物组。按说明书进行寡核苷酸的转染，反义微小RNA-21的最终质量浓度为5mg/L。紫杉醇浓度取实施例3中IC50的浓度。每种浓度组合重复5孔。分别于转染前，转后24、48、72、96小时行MTT检测将浓度为5mg/ml的MTT(Sigma)以每孔20pl加入待测的96孔板内，37'C培养4小时，弃培养基，每孔加DMSO20(HU并振荡15分钟，最后用紫外分光光度计570nm波长测定各孔的吸光度(A值)，取每组8孔的均值。以570nm处吸光度值A计算细胞增殖抑制率，细胞的存活率=实验组细胞吸光值/对照组细胞吸光值。在观察的5天内，U251胶质瘤细胞(图4a)和MCF-7乳腺癌细胞(图4b)，其联合治疗组较单独化疗组和单独基因治疗组都有更好的肿瘤抑制效果。和传统化疗和单独基因治疗相比，联合药物治疗可以明显降低细胞生存率，对肿瘤实现更有效的抑制。实施例5将U251人脑胶质瘤细胞和MCF-7乳腺癌细胞(3x105)分别接种于6孔培养皿，实验设计空白对照，单用反义微小RNA-21及单用紫杉醇为单药对照组，及联合药物组，细胞培养48h后，经消化离心后，PBS(O.OIM，pH7.4)漂洗2次，用RNase(50mg/L)作用30min，以AnexinV,碘化丙锭(60mg/L)综合染液染色30min后，FACSCaliber(BD，USA)流式细胞仪检测凋亡率。如图5,U251人脑胶质瘤细胞中联合治疗组的凋亡数为24.68%(图d)，单独紫杉醇化疗组6.24%(图b)，单独基因治疗组21.75%(图c),联合治疗组的凋亡数明显提高。在MCF-7乳腺癌细胞中，如图6，相比较单独紫杉醇化疗组6.07。/。(图b)，单独基因治疗组20.98%(图c)，联合治疗组的凋亡数为25.27%(图d)，凋亡比例也明显提高。和传统化疗和单独基因治疗相比，联合药物治疗可以明显增强肿瘤细胞凋亡百分比例，可以实现对肿瘤更有效的抑制。实施例6将U251人脑胶质瘤细胞和MCF-7乳腺癌细胞(3xlO"分别接种于6孔培养皿，实验设计空白对照，单用反义微小RNA-21及单用紫杉醇为单药对照组，及联合药物组，细胞培养48h后，经消化离心后，PBS(O.OIM，pH7.4)漂洗2次，75%乙醇lml、4。C固定大于18小时。4°C、1000rpmx5min去除乙醇，PBS、4"C、1000rpmx5min洗涤细胞2次，200nlRanseA(lmg/ml)、37。C孵育30分钟，800WPI染色液混匀后4'C避光染色30分钟。FACSCaliber(BD，USA)流式细胞仪，在FL2为横坐标的直方图上，以鳖血(天津医科大学外科研究所提供)细胞的G0/G1为内对照，分别测定待测细胞的细胞周期时相分布，计算DNA指数和各期细胞的百分数。如图7，U251人脑胶质瘤细胞中联合治疗组(图d)的G0/G1期为50.4%,S期为47.4。/。，较对照组，单独化疗组和单独基因治疗组G0/G1期增加，S期显著提高，起到更好的肿瘤抑制效果。如图8,MCF-7乳腺癌细胞中也得到相同的结果，联合治疗组(图8d)的G0/G1期为44.4。/。，S期为52.5M。因此，和传统化疗和单独基因治疗相比，联合药物治疗可以明显增加G0/G1和S期细胞数目，对肿瘤实现更有效的抑制。实施例7在Transwell上室的聚碳酸酯膜(直径6.5mm)上先加入稀释后的Matrigel(3.9|xg/ul)60~80W(注意体积不可太大，以刚把聚碳酸酯膜浸湿为最好)，置37。C30min使Matrigel聚合成凝胶。在Transwdl下室中加入趋化因子600ml;待检细胞无血清培养基制成单细胞悬液，每种细胞做三孔；在上室孔中分别准确加入U251人脑胶质瘤细胞和MCF-7乳腺癌细胞细胞，lx105个/孔，细胞悬液体积100200ml，置于5%C02培养箱于37'C培养24h。待培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上面未穿过膜的细胞。倒置显微镜直接下(200x)观察穿过膜的细胞数。如图9(d)，U251人脑胶质瘤细胞中联合组透过细胞数仅为24.721±1.896，明显低于对照组(45.764±1.940)，单独紫杉醇化疗组(36.243±2.131)和单独反义微小RNA-21基因治疗组(27.311±1.268)透过细胞数。MCF-7乳腺癌细胞中也得到相同的结果，如图IO，联合组透过细胞数仅为27.721±1.675，明显低于对照组(59.182±1.234)，单独紫杉醇化疗组(45.233±1.989)和单独反义微小RNA-21基因治疗组(32.131±1.834)。和传统化疗和单独基因治疗相比，联合药物治疗可以明显降低细胞迁移能力对肿瘤实现更有效的抑制。权利要求1、一种基因治疗联合化疗共同治疗恶性脑瘤和乳腺癌的药物，其特征在于该药物以聚酰胺-胺树状分子为载体，运用反义微小RNA-21基因联合化疗药物紫杉醇构成的共同治疗脑胶质瘤和乳腺癌细胞生长的药物。2、根据权利要求1所述的药物，其特征在于该药物的粒径小于100nm。3、一种权利要求1所述的药物的制备方法，其特征在于包括第一、将l100重量份的聚酰胺-胺溶解于缓冲溶液中，配成质量浓度为0.01~90%的溶液，得溶液A;第二、将l64重量份的治疗性基因as-miR-21溶解于缓冲溶液中，配成质量浓度为0.2~20%的溶液，得溶液B;第三、将0.05500重量份的紫杉醇溶于缓冲溶液中，配成质量浓度为0.01~卯％的溶液，得溶液C;第四、室温条件下，将10重量份的溶液A与1重量份的溶液B混合均匀，孵育20分钟后，再加入5重量份的溶液C，即可得反义microRNA-21基因联合紫杉醇化疗共同治疗脑胶质瘤和乳腺癌细胞生长的药物。4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的缓冲溶液是PBS缓冲溶液或TE缓冲溶液。5、根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述的聚酰胺-胺是指聚酰胺-胺树状分子，其代数为第5代。全文摘要一种基因治疗联合化疗共同治疗恶性脑瘤和乳腺癌的药物及制备方法。本发明药物是以聚酰胺-胺树状分子为载体，运用反义微小RNA-21基因联合化疗药物紫杉醇构成的共同治疗脑胶质瘤和乳腺癌细胞生长的药物。其制备包括将聚酰胺-胺溶解于缓冲溶液中配成溶液A，将治疗性基因as-miR-21溶解于缓冲溶液中配成溶液B，将紫杉醇溶于溶液中配成溶液C，室温条件下，将溶液A与溶液B混合均匀后，再加入溶液C，即得。和传统化疗和单独基因治疗相比，联合药物治疗可以明显增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，细胞生存率降低，凋亡百分比例增加，S期细胞数明显增多，细胞迁移能力显著下降，对肿瘤实现更有效的抑制。文档编号A61K48/00GK101507821SQ20091006819公开日2009年8月19日申请日期2009年3月20日优先权日2009年3月20日发明者玉任,原续波,旋周,康春生,浦佩玉,王广秀,贾志凡,磊韩申请人:天津医科大学总医院