绵羊重组朊蛋白、其单克隆抗体及应用的制作方法

专利名称：绵羊重组朊蛋白、其单克隆抗体及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别地，涉及绵羊重组朊蛋白
PrPe51-216、其单克隆抗体及应用。
背景技术：
痒病(scrapie)是绵羊的一种缓慢发展的致死性中枢神经系统退 行性疾病，病羊具有中枢神经系统变性、空泡化、星形胶质细胞增生 等特点，表现为共济失调、痉挛、麻痹、衰弱和严重的皮肤搔痒，病 畜100%死亡，人们称之为羊痒病。羊群感染后，很难清除病原体。 羊痒病早在1732年在英格兰发现，1920-1950年曾在英国严重流行， 现已广泛分布于欧洲、亚洲和美洲多数养羊业发达国家。更为严重的 是，1986年发生于英国的疯牛病，其病原因子后来被证实与羊痒病 的病原因子一致，而人类变异性克雅氏病(vCJD)是由食入感染了 BSE的食物而传播。因此，羊痒病发生或流行对于人类社会公共卫 生造成严重威胁，目前我国尚未见到发生羊痒病的报道，为了防患于 未然，国家投入大量资金和力量预防和控制这类疾病的发生，目前该 病的诊断主要依据病理学检查及用免疫组化、免疫印迹试验(Western Blot)检测神经组织中的病原因子PrPSe，这些方法大多需要高度灵 敏、特异的抗体。由于单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强、成分均 一的优点，已成为羊痒病检测技术中的核心试剂。国外有商品化单克 隆抗体出售，但未见有使用去除N端信号肽、C端GPI锚定位点的 核心片段绵羊PrPSl-216重组蛋白制作的单克隆抗体。
目前我国羊痒病的检测主要在O正的指导下，在专业实验室进 行，包括病理组织学检测、免疫组织化学检测和Western Blot检测， 其中免疫组织化学检测和Western Blot检测是检测羊痒病的"金标准"，这两种方法的关键技术或核心试剂就是单克隆抗体，国内尚没 有商品化的产品。国际上商品化的羊痒病检测试剂盒，每头份的检测 费用约为0.04万，如果用自主研制的试剂盒代替进口产品，我国羊 痒病的监测工作每年仅试剂费用就可节约百余万，并打破国际在疯牛 病等重大外来动物疫病检测技术方面的技术壁垒，从而保障我国畜牧 业的健康发展以及人民的公共卫生。

发明内容
本发明的目的是提供一种绵羊重组朊蛋白Prpe51-216及其体外
制备方法。
本发明再一个目的是提供绵羊重组朊蛋白PrPe51-216。 本发明另一个目的是提供用于制备绵羊重组朊蛋白PrPe51-216 的基因工程菌。
本发明还有一个目的是提供采用绵羊重组朊蛋白PrPe51-216制 备的单克隆抗体。
为实现上述目的，本发明克隆和表达了绵羊朊蛋白PrPe51-216, 这段蛋白去除N端的信号肽，C端的GPI锚定位点，包含蛋白酶K 抗性片段，更有利于制备单克隆抗体。
本发明提供绵羊重组朊蛋白PrP^l-216，该蛋白具有序列表SEQ N0.2所示的氨基酸序列，或者是该序列经替换、缺失或添加一个或 几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。该蛋白分子大小为 27kD。
本发明还提供编码所述绵羊重组朊蛋白PrPe51-216的基因，优 选地，该基因为PRNP,其核苷酸序列如序列表SEQNO.l所示。
本发明进一步提供所述绵羊重组朊蛋白PrPe51-216的制备方法， 包括如下步骤
利用所述PRNP基因构建表达载体，转化宿主菌，经过筛选得到 阳性转化体；阳性转化体经发酵培养后，破碎菌体，分离纯化PrPe成熟蛋白，经复性，得到活性蛋白PrPe51-216。
本发明还提供由所述PrPe51-216作为免疫原制备得到的抗 PrP^l-216抗体。优选地其为单克隆抗体。
上述抗体可由下述步骤得到釆用所述绵羊重组朊蛋白 PrPe51-216,免疫Balb/c小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，经融合筛 选出杂交瘤细胞株，该细胞株能稳定分泌针对绵羊朊蛋白PrPe 51-216 特异单克隆抗体。
本发明还提供含有上述抗体的诊断试剂。
具体地说，本发明包括如下步骤
1、 基因工程菌的构建
根据绵羊朊蛋白基因序列，截去PrNP部分N端信号肽(150bp) 和C端GPI锚定位点(123bp )形成PrNPq (其核苷酸序列如序列表 SEQNO.l所示)，设计合成扩增这段多肽的PCR引物(末端分别带 有EcoR I和Hind III的酶切位点)，以绵羊全血DNA为模板，进行 PCR扩增；扩增产物经琼脂糖电泳，回收500bp左右DNA片段， 与pGEM-Teasy载体连接，转化DH5a感受态细胞；纯化重组质粒， 用///双酶切鉴定，并测序，测序正确的阳性质粒经 ￡coR /////^////双酶切后，与用经过五co/ //历/^///双酶切的pET30a (+ )连接后，转化至BL21 (DE3)菌株，用上述引物做菌落PCR, 筛选阳性克隆，得到含有表达载体的宿主菌。
2、 重组蛋白的表达及纯化
将含有表达载体的宿主菌接种到LB液体培养基，经扩大培养， 加入IPTG诱导表达，取出菌液离心，菌体用裂解缓冲浪重悬，在冰 浴条件下超声破碎，离心，沉淀即为包涵体。将获得的包涵体蛋白用 结合缓冲液溶解，离心，取上清，加入经pH值为7.4的结合缓冲液 平衡的HisTrap镍琼脂糖凝胶柱，结合10min,结合缓冲液冲洗3min, 然后用pH值为7.4洗脱缓冲液冲洗7min，分管收集。本发明还提供了一种可高效表达绵羊朊蛋白PrPe51-216的基因 工程菌Esherichia coli PET30/ovine-PrPe。该菌具有Kana抗性，对 人体无害，且在IPTG的诱导下，能够大量表达绵羊朊蛋白PrPe 51-216。
本发明将获得的绵羊朊蛋白PrPc51-216按《分子克隆》所述方 法进行Western-blotting。 一抗为鼠PrP单克隆抗体AH6， 二抗为辣根 过氧化酶标记兔抗鼠IgG， ECL化学发光曝光。结果显示绵羊朊蛋白 PrPc 51-216能与鼠PrP单克隆抗体AH6发生特异性血清学反应。
本发明将获得的绵羊朊蛋白PrPSl-216免疫Balb/c小鼠，利用 淋巴细胞杂交瘤技术，经融合共筛选出3株能稳定分泌针对绵羊朊蛋 白PrPc 51-216特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株。免疫印迹试验表明 腹水单抗可特异识别重组绵羊朊蛋白PrPe51-216和绵羊脑组织朊蛋 白。
本发明具有以下有益效果
1 )本发明首次在体外表达并获得了具有活性的绵羊朊蛋白 PrPG51-216，并且建立了纯化的方法，该蛋白能与鼠PrP单克隆抗体 AH6发生特异性血清学反应。PrPc成熟蛋白的表达量可达20 mg/L 培养基。
2) PrP^l-216蛋白去除N端的信号肽，C端的GPI锚定位点， 包含蛋白酶K抗性片段，更有利于制备单克隆抗体。
3) 本发明利用绵羊朊蛋白PrPgi-216免疫Balb/c小鼠，获得了 针对绵羊朊蛋白PrpC 51-216的特异单克隆抗体，从而可以利用该单 克隆抗体作为诊断试剂用于疯牛病、羊痒病诊断和研究。


图1绵羊朊蛋白PrPe51-216的PCR扩增产物的电泳图；M: Mark, 1:扩增产物；
图2 PGEM-T easy- PrPc51-216重组载体的￡coA //历"^////双酶
6切电泳图；M: Mark, 1:双酶切产物；
图3菌落PCR鉴定重组质粒PET30a-PrpC51-216; M: Mark, 1: PCR产物；
图4转化子经IPTG诱导PET30a - PrPc51-216蛋白表达的电泳 图；1、 2:转化空质粒的对照；3: 37'C诱导1.5h; 4: 37'C诱导2h; 5: 37。C诱导3h; M:蛋白Marker;
图5纯化后的PrPSl-216电泳图；1:终末洗脱液中的产物；2、 3:纯化洗脱后的产物；M:蛋白Marker;
图6 PrPc51-216经Western blotting显影后的图；1 、纯化后的样 品；2、 37。C诱导3h的样品；M、蛋白Marker;
图7间接ELISA检测免疫小鼠血清抗体效价；
图8腹水单抗特异性鉴定Western-blotting检测；1、细胞克隆 3G11; 2、细胞克隆4E1; 3、阳性对照(抗体AH6) ; Marker:低分 子量蛋白标准
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 实施例l基因工程菌的构建
根据已发表的绵羊朊蛋白基因(PrNP, GenBank accession EF189729 )序歹寸设计特异性引物1对。P1 5'- gga gaa ttc cgc tat cca cct cag gg -3'(下划线为EcoR I酶切位点),P2 5'- ggg aag ctt aca ttt get cca cca etc -3'(下划线为Hind III酶切位点)；提取绵羊全血基因组 DNA，以全血DNA为模板，以P1、 P2为引物，参照TaKaRaEx Taq PCR试剂盒说明书对PrPe51-216进行PCR扩增。PCR反应总体积 为20 jaL:上下游引物、模板各lnL, PCRmix 10 ML,水7mL。 PCR程序94°C热变性5min;加入Ex Taq酶；再94°C热变性50s ， 然后60。C退火lmin, 72。C延伸50s, 33个循环；72°C延伸8min; 4 °C保存。扩增片段命名为ovine-PrP 51-216,即截去PRNPN端的信号肽和C端的GPI锚定位点，大小约498bp，编码165aa (PrPc 51-216)。
反应产物经1°/。琼脂糖凝胶电泳(图1),用OMEGA的GEL EXTRACTION KIT回收500bp左右DNA片段后，与pGEM-T easy 载体连接，转化DH5oc感受态细胞；再用博大泰克的B型质粒提取 试剂盒纯化重组质粒，用EcoR I/Hind III双酶切鉴定(图2),并测 序，测序正确的阳性质粒经EcoRl/Hind III双酶切后，与用经过 EcoR I /Hind III双酶切的pET30a( + )连接过夜，转化到BL21( DE3 ) 菌株，用上述PCR引物做菌落PCR,快速筛选克隆，所得克隆再经 菌落PCR (图3 )及DNA测序鉴定。经上述筛选获得Esherichiacoli PET30/ PrPc51-216。 实施例2重组蛋白的表达及纯化
将含有表达载体的宿主菌接种到LB液体培养基，待菌生长到 A600约0.8时,加终浓度为100jig/mLIPTG， 37。C诱导表达3h,取 出菌液离心，菌体用裂解缓冲液(Tris-base0.6056g, EDTA0.0186g， NaC10.2925g，甘油5 mL,加入去离子水95 mL至总体积为100mL， 调pH值至8.0，常温保存)重悬，在冰浴条件下超声破碎，10000 rpm/min，离心10min，沉淀即为包涵体，上清和沉淀用SDS-PAGE电 泳检测(图4)。结果在预期的27 KD处出现特异的、大量表达的蛋 白条带，表达量占菌体总蛋白48%。
将获得的包涵体蛋白依次加入10ml结合缓冲液(Na2HP04. 12H20 3.58g, NaH2P04 . 2H201.56g, NaCl 29.22g, 2g咪唑，6M尿 素，混合后，加入去离子水定容为lOOOml，调pH值至7.4，常温保 存)，用枪吹打混合，超声5min,条件同上。再加入5ml结合缓冲液， 吹打，超声5min。再加入5ml吹打，超声10min。最终体积20ml。 10000 rpm/min离心10min,弃沉淀，取上清用0.45um的滤膜过滤。 用蛋白纯化仪纯化，设定参数为用带有His-标签的镍柱纯化蛋白，结合缓冲液平衡10min;进样10min，结合缓冲液冲洗3min,洗脱缓 冲液(Na2HP04 . 12H20 3,58g, NaH2P04 . 2H201.56g， NaCl 29.22g, 34g咪唑，6M尿素，混合后，加入去离子水定容为1000ml,调pH 值至7.4，常温保存)冲洗7min。取280nm第二次出现波峰时的液体， 即为纯化蛋白，如图5所示，纯化的蛋白在27KD处出现单一的条 带，纯化率在95%以上。PrPc 51-216的表达量可达20 mg/L培养基。 实施例3 Western-blotting鉴定
Western-blotting按《分子克隆》所述方法进行。 一抗为鼠朊蛋 白单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠的抗体，显色 剂为3, 3-二氨基联苯胺(DAB)。结果发现PrpC 51-216能与鼠朊蛋 白单克隆抗体发生特异性血清学反应。如图6所示。具体操作步骤如 下
SDS-PAGE结東后，取出凝胶，在转移缓冲液中浸泡30min,将 浸泡过的与胶同样大小的NC膜和滤纸，按纤维垫-滤纸-凝胶-NC膜 -滤纸-纤维垫的结构，装入转印夹。转印时凝胶恻接负极，NC膜侧 接正极，电泳槽冰浴，200mA恒流转印lh。转印结束后，剪下分子 量标准的膜条用氨基黑染色。其余部分置于封闭液中室温振摇封闭 lh;取出NC膜置于用封闭液稀释好的鼠朊蛋白单克隆抗体内，4°C 过夜；TBS洗涤3次，每次5min;置于用封闭液稀释好的辣根过氧 化物酶标记的山羊抗鼠的抗体溶液中，室温振摇lh; TBS洗涤3次， 每次5min;最后将NC膜ECL化学发光曝光X-光片，显影，定影。 实施例4绵羊重组蛋白PrPe 51-216单克隆抗体制备
1、用绵羊重组蛋白PrPc 51-216免疫Balb/c小鼠(见表1 ) 表1 Balb/c小鼠免疫方案
免疫时间 抗原类型 免疫途径 _(ug/只)_
首免 纯化的绵羊重组蛋白PrP (用适100 颈背部皮下多点间隔2周 二免
间隔2周 三免
融合前3天 四免
量生理盐水稀释)+完全福式佐剂 纯化的绵羊重组蛋白PrP (用适 量生理盐水稀释)+不完全福式佐100 剂
纯化的绵羊重组蛋白PrP (用适 量生理盐水稀释)+不完全福式佐100 剂
纯化的绵羊重组蛋白PrP (用适 量生理盐水稀释)
100
注射
颈背部皮下多点 注射
颈背部皮下多点 注射
腹膜内注射
三免后7~ IO天釆血用建立的ELISA法测效价，选择效价最高者 用于细胞融合
2、检测方法的建立
健康和三免后10d的Balb/c小鼠尾部釆血O.lml,室温静置lh, 4 。C放2h, 3000rpm离心10min,收集血清，4。C保存。用间接非竟争性 ELISA法测定血清效价并建立单抗筛选方法。
(1 )包被抗原用包被缓冲液将包被用绵羊重组蛋白Prpe 51-216 作倍比稀释向微孔中每孔加100ul， fC过夜；然后弃去孔内的液体。
(2) 封闭用封闭液向微孔中每孔加100ul， 37。C湿盒在温箱中 孵育30min，同时用洗涤缓冲液(PBST)洗3次，每次卯s(简称洗涤， 下同)，拍干。
(3) 加待测血清样品将血清样品按倍比稀释后顺序加入，每 孔100ul;每块板同时设空白对照、阴性对照和阳性对照各2孔。37°C 湿盒在温箱中孵育lh，然后洗涤、拍干。
(4) 加酶标羊抗鼠IgG:先用稀释液将酶标羊抗鼠IgG作倍比稀 释，每孔加入100ul，置37。C湿盒在温箱中孵育lh;然后洗涤、拍干。
(5) 加底物液各孔加新鲜配置的底物使用液100ul， 37'C湿盒 10 ~ 15min。
(6) 终止反应每孔加终止液50ul。
10(7)判定结果阴性对照孔应无色或接近无色，阳性对照孔应
明确显色。测定OD值，以空白孔调零，若待测孔OD值大于或等于阴 性对照孔的2.1倍，即为阳性，这样可以得出血清的效价，同时选择 OD值在1.0 1.5之间的包被抗原浓度，酶标兔抗鼠IgG浓度等，建立 单抗筛选方案。 3、细胞融合
(1) 收集全部SP2/0细胞，1000rpm离心6分钟，去上清，反复用 无血清培养基洗2次，最后悬浮于10ml无血清培养基中，取0.1ml至住 0.9ml无血清培养基中，混匀，细胞计数。
(2) 取全部脾细胞，将三免后效价较高的免疫Balb/c小鼠脾细 胞，与SP2/0细胞按5: 1~10: l的比例充分混匀，1000rpm离心5分钟， 弃上清。
(3) 轻弹离心管管底，使沉淀细胞疏松，吸取lml DMEM液加 入lg灭菌的PEG2000 (预先要加热融化)中，并用7.5。/。NaHC03调PH 值至7.5~7.8，混匀。 一手句速转动离心管，另一手吸取lml上述调好 的PEG2000液，沿转动的离心管壁缓缓加入，控制在60s加完。然后 将悬液吸入移液管(时间控制在30s左右)，静置30s,再将其吹入离 心管(时间也控制在30s左右)。融合时间共约2分钟。
(4 )缓慢小心地加入25ml预温的20。/。完全培养基以终止 PEG2000的作用，2分钟完成，第一分钟加入lml DMEM液，第二分 钟缓缓加入4ml DMEM液，然后在3min内缓慢加入剩余的20。/。完全培 养基。
(5 )将融合细胞8000rpm离心7min，弃上清，加入20ml 1%HAT
培养液轻轻吹吸，使沉淀细胞混合均勻，将悬浮细胞液加入有饲养细 胞的96孔板中，每孔100ul，置37'C，含5。/。C02培养箱中培养过夜。
(6)融合后，每天在倒置显微镜下注意观察杂交瘤细胞的生长 情况，7 10天用HAT培养基半量换液。(7) 2周后换HT选择培养基，3周后可换完全培养基。
4、 杂交瘤细胞的筛选
釆用间接非竟争性ELISA方法检测。
(1)包被抗原用包被液将包被用绵羊重组蛋白Prpe 51-216稀 释至适当的工作浓度(由建立的筛选方法确定)，向微孔中每孔加 100ul， 4。C过夜，然后弃去孔内的液体。
(2 )封闭用封闭液向微孔中每孔加1 OOul, 3 7 °C湿盒孵育3 Omin, 然后用洗涤缓冲液(PBST)洗3次，每次90s (简称洗涤，下同)， 拍干。
(3) 加待测培养上清液将上清液顺序加入，每孔100ul，每块 板同时设空白对照、阴性对照和阳性对照各2孔。37'C湿盒在温箱中 孵育lh，然后洗涤5次、拍干。
(4) 加酶标第二抗体:先用稀释液将酶标羊抗鼠IgG作倍比稀释， 每孔加入100ul，置37'C湿盒温箱中孵育lh;然后洗涤5次、拍干。
(5) 加底物液各孔加新鲜配置的底物使用液100ul， 37'C在温 箱中孵育10-15min。
(6) 终止反应每孔加终止液50ul。
(7) 判定结果阴性对照孔(适当稀释SP2/0上清和阴性血清) 应无色或接近无色。
阳性对照孔(免疫小鼠血清)应明确显色。测定OD值，以空白 孔调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性。
5、 杂交瘤细胞的克隆
杂交瘤的克隆化的方法一有限稀释法，即将细胞悬液连续稀释， 至一定浓度时就有可能得到含单个细胞的悬液，将其接种到培养板 中，就可由此单个细胞繁殖形成同源性的细胞克隆。釆用有限稀释法 克隆，具体方法如下
(l)制备饲养细胞。可于克隆化前一天制备，也可于克隆化当天制备。
(2 )将待克隆化的杂交瘤细胞用加样器或弯头吸管反复吹打均 勾后取少许细胞悬浮至另一无菌青霉素小瓶中，作10倍稀释。
(3) 取上述无菌小瓶中的细胞准确计数。
(4) 根据细胞计数结果，对细胞悬液做适当稀释。因计数误差，
为保险起见，可稀释成不同梯度，如每孔5个，l个，0.5个细胞梯度， 这样总会有一个梯度其细胞真实浓度在l个/孔附近。具体方法如下
取250个活细胞悬浮于4.6ml培养液中，此时平均每0.1ml溶液中含 5个细胞，接种96孔培养板，每孔0.1ml，共36孔。这样就用去3.6ml。 余下l.Oml,再加入4ml培养液，共5ml(此时平均每0.1溶液中含l个细 胞)，接种此细胞液至其次的36孔，每孔0.1ml，最后剩余细胞悬液 1.4ml，再补加培养液1.4ml (此时平均每0.1ml溶液中含细胞0.5个)， 接种最后的24孔，每孔0.1ml.这样共以三种不同的细胞浓度进行克隆 化，第一组36孔，平均每孔5个细胞，第二组36孔。平均每孔l个细胞， 第三组24孔，平均每孔0.5个细胞。
(5) 将培养板置5%(302, 37。C温箱中培养。 一般5d左右(在此 之前不换液)即可在倒置显微镜下观察细胞克隆生长，注意记录各孔 细胞生长情况并确定单克隆细胞株。
(6) 适时进行换液及检测。有多孔阳性时，应尽可能取单克隆 孔进行再次克隆化，同时转入24孔板，继而转入培养瓶中进行扩大培 养，直至所有细胞孔的培养上清液均为阳性，克隆方算成功。
6、单克隆抗体的大量制备
釆用动物体内诱生单克隆抗体的方法。取健康Balb/c雌性小鼠10 只，每只腹腔注射液体石蜡lml， 1 2周后备用。将培养的阳性克隆 杂交瘤细胞吹下来，1000rpm离心10min收集细胞，弃上清液。用不完 全培养基将细胞悬浮，混匀，并将细胞数调至106个/1111，每只预处理 的小鼠腹腔注射lml阳性克隆杂交瘤细胞；7 ~ 9d后收集腹水，3000rpm离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，纯化后小管分装， -2(TC冻存。
7、单抗特异性鉴定
使用本实验室建立的Western-blot方法进行，釆用BioRad微型 垂直板电泳转印系统，分别将正常羊脑组织、绵羊重组朊蛋白上样于 15%SDS-PAGE进行电泳分离。电泳后，4°C， 100V条件下转印lh， 将蛋白转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上。转印后的NC膜用含5% 脱脂奶粉的PBS封闭lh,加入l: 1000稀释的腹水单抗，室温轻摇 作用2h,随后与按l: 2000稀释的辣根过氧化酶标二抗反应lh。最 后用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显示印迹结果。
具体实验步骤如下
(1) 样品脑匀浆处理和消化
匀浆从脑干的脑闩部位(obex区)称取0.45 0.70g组织，放 入10ml的勻浆器中，加入10倍的勻浆缓冲液，然后手动匀浆45s lmin， 800转/秒离心lmin,取上层脑匀浆分装，-20°0保存。
消化每个Eppendorf管中加入10pl消化缓冲液，再加入100 jil脑匈浆，混匀；加入10jiL蛋白酶K，充分混合均匀；水洛48'C， 消化40分钟，然后迅速加入10 ji 1的终止缓冲液终止消化。
(2) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
样品变性上样前每管中加入100juL电泳上样缓冲液，混合均 匀；水洛96'C,煮沸5分钟(已变性样品可在使用前65匸温育5分 钟)。
上样将10pL对照样品加入右边泳道，其余样品分别为lOjiiL 按顺序加入其它泳道。内槽和外槽加入电泳缓冲液。
电泳恒定电压180V电泳40-45分钟，直到溴酚兰指示剂到 达底端约1-2亳米处。
14(3) 电转
准备步骤将PVDF膜在1007。的甲醇中浸泡数秒，然后在蒸馏 水中洗涤数秒，再置于电转缓冲液中平衡IO分钟；滤纸在电转液中 平衡5分钟。(PVDF膜和滤纸大小应与凝胶基本一致)
电转组装打开电泳槽，将凝胶的梳子部分切去，取出凝胶。然 后按照纤维垫-两层滤纸-凝胶-PVDF膜-两层滤纸-纤维垫的顺 序组装(注意滤纸与凝胶、PVDF膜务必对齐；每层接触面都尽量赶 走气泡)，将该"三明治"装置装入转印夹，近胶的一面朝向阴极(黑)， 近PVDF膜的一面朝向阳极(红)，确保该装置全部浸入电转缓冲液。
蛋白转印 4'C恒定电压IOOV转印75分钟(内槽加冰盒，外槽
可置于冰水混合物中)。
(4) 免疫检测
封闭将PVDF膜从转印夹中取出，做好标记，然后把两张膜分 别置于自封带中，各加入25ml封闭液，于摇床室温封闭50min,摇 床转速约为60转/min。封闭结東后用TBST洗液洗涤2次，每次5 分钟。
一抗孵育将3.75 ji 1 —抗(AH6 )加入到15ml的TBST中(稀 释倍数k 4000)，混匀，装入自封袋中；作为阳性对照；腹水用 TBST稀释(稀释倍数k 1000)，然后两张膜凸面相对放置，置于 同一自封袋中，于摇床室温孵育2小时，转速约为65转/min;孵育 结東后用TBST洗液洗涤5次，每次5分钟。
二抗孵育将15 ja 1 二抗(羊抗鼠)加入到15mL的TBST溶液 中(稀释倍数l: 2000)，混勻，装入自封袋中；然后两张膜凸面相 对放置，置于同一自封带中，于摇床室温孵育1小时，转速约为65 转/min;孵育结東后用TBST洗液洗涤5次，每次5分钟。
曝光将PVDF膜置入暗盒中曝光5-10分钟，取出放入显影液中4 分钟，然后再放入定影液中作用l分钟。实验结果
本发明应用基因工程技术，首次在体外表达并获得了具有活性的
绵羊朊蛋白PrPc 51-216，并且建立了纯化的方法；利用本发明的方 法，绵羊朊蛋白PrPe 51-216的表达量可达20 mg/L培养基。
本发明利用绵羊朊蛋白PrPe 51-216免疫Balb/c小鼠，获得了针 对绵羊朊蛋白PrPe 51-216和绵羊脑组织朊蛋白的特异单克隆抗体， 从而可以利用该单克隆抗体作为诊断试剂用于疯牛病、羊痒病诊断和 研究。序列表
〈110>中国农业大学
〈120〉绵羊重组朊蛋白、其单克隆抗体及应用
〈130〉 KHP09112351.2
〈■ 2
<170〉 Patentln version 3.5
<210> 1
<211〉 499
〈212〉 DNA
<213〉 羊(Ms aries)
<220>
<221〉 CDS
<222> (1). (498)
〈400〉 1
cgc tat cca cct cag gga ggg ggt ggc tgg ggt cag ccc cat gga ggt 48 Arg Tyr Pro Pro Gin Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly 15 10 15
ggc tgg ggc c肌cct cat gga ggt ggc tgg ggt cag ccc cat ggt ggt % Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly 20 25 30
ggc tgg gga cag cca cat ggt ggt gga ggc tgg ggt caa ggt ggt age 144 Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gin Gly Gly Ser 35 40 45
cac agt cag tgg aac aag ccc agt aag cca aaa acc aac atg aag cat 192 His Ser Gin Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His 50 55 60
gtg gca gga get get gca get gga gca gtg gta ggg ggc ctt ggt ggc 240 Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly 65 70 75 80
tac aag ctg gga agt gcc a/tg age agg cct ctt ata cat ttt ggc aat 288 Tyr Lys Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu lie His Phe Gly Asngac tat gag gac cgt tac tat cgt gaa aac atg tac cgt Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg 100 105
caa gtg tac tac aga cca gtg gat cag tat agt aac cag Gin Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gin Tyr Ser Asn Gin 115 120 125
teic ccc幼c
Tyr Pro Asn 110
eiEic aeic ttt
Asn Asn Phe
gtg cat Val ms 130
Thr Thr 145
cga gtg Arg Val
gac tgt gtc Asp Cys Val
aag ggg gag Lys Gly Glu
33C 3tC 3C3 gtC 33g C33 C3C 3C3
Asn lie Thr Val Lys Gin His Thr
135 140
aac ttc acc gaa act gac ate aag
Asn Phe Thr Glu Thr Asp lie Lys 150 155 160
gtc acc 3cc Val Thr Thr
ata atg gag lie Met Glu
gtg gag c肪 Val Glu Gin 165
3tg
Met
<210〉 2 〈211> 166 <212〉 PRT
<213> 羊(^.s a"'es) <400> 2
Arg Tyr Pro Pro Gin Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly
1
5
10 15
Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly
20
25 30
Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gin Gly Gly Ser
35
40 45
His Ser Gin Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
336
384
432
480
499
50
55 60Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly 65 70 75 80
Tyr Lys Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu lie His Phe Gly Asn 85 90 95
Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn 100 105 110
Gin Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gin Tyr Ser Asn Gin Asn Asn Phe 115 120 125
Val His Asp Cys Val Asn lie Thr Val Lys Gin His Thr Val Thr Thr 130 135 140
Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp lie Lys lie Met Glu 145 150 155 160
Arg Val Val Glu Gin Met 165
19
权利要求
1、绵羊重组朊蛋白PrPC51-216，其特征在于，该蛋白具有序列表SEQ NO.2所示的氨基酸序列，或者是该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2、 编码权利要求1所述绵羊重组朊蛋白PrPe51-216的基因。
3、 如权利要求2所述的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序 列如序列表SEQNO.l所示。
4、 权利要求l所述蛋白的制备方法，包括如下步骤 利用权利要求2或3所述的基因构建表达载体，转化宿主菌，经过筛选得到阳性转化体；阳性转化体经发酵培养后，破碎菌体，分离 纯化Prpe成熟蛋白，经复性，得到活性蛋白PrPe51-216。
5、 由绵羊重组朊蛋白PrPe51-216作为免疫原制备得到的抗 PrPc51-216抗体。
6、 如权利要求5所述的抗体，其为单克隆抗体。
7、 含有权利要求5或6所述抗体的诊断试剂。
全文摘要
本发明涉及绵羊重组朊蛋白PrP^C51-216及其制备方法，该蛋白具有序列表SEQ No.2所示的氨基酸残基序列，或者是该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本发明还涉及编码该蛋白的基因及利用该蛋白制备得到的单克隆抗体。本发明获得的针对绵羊朊蛋白PrP^C51-216的特异单克隆抗体，可以作为诊断试剂用于疯牛病、羊痒病诊断和研究。
文档编号C12N15/12GK101550186SQ20091008422
公开日2009年10月7日 申请日期2009年5月14日 优先权日2009年5月14日
发明者琦 余, 周向梅, 尹晓敏, 奥 张, 李丽好, 杨利峰, 杨建民, 赵德明 申请人:中国农业大学