专利名称：Nalp3-asc炎症复合体及其激活抑制剂在制备朊病毒病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及NALP3-ASC炎症复合体及其激活抑制剂的制药用途，具体地，涉及NALP3-ASC炎症复合体及其激活抑制剂在制备朊病毒相关疾病的药物中的用途。
背景技术：
朊病毒(Prion)病，又称为传染性海绵状脑病(TSEs)，是ー种致死性神经退行性疾病，以脑空泡化、神经元死亡和神经小胶质细胞增生为主要特征。该病是由于细胞朊蛋白 (PrPc)构象发生了变化，转为病理型(PrPse)而引起的。PrPse具有蛋白酶抗性，含有更多的β折叠，而替代了正常的α螺旋结构。现已证实异常形态朊蛋白(PrPse)的累积是引起该病的主要原因。近年来，国内外学者针对Prion疾病靶向药物的筛选做了许多研究。如，有研究报道，阿司匹林和ERK抑制剂PR98059可以抑制PrP106_126诱导的PrPG和ERK1/2的表达，进而减轻了其对神经元的损伤作用；还有报道，根据PrP序列人工合成的ー些单克隆抗体，如anti-PrP219-232、Fab D18等，通过体内外试验发现有抑制PrPG与PrPse结合及转变的作用，进而降低PrPse的聚集；另有研究报道，由于缺乏脯氨酸的蛋白质易于形成β折叠，因此，人工合成了ー个含有3个脯氨酸残基的13肽(iPrP13)，用于细胞和小鼠试验后发现，不仅可抑制PrPG的折叠，还可阻止PrPG变成PrPse,该13肽被称为“ β折叠破坏剤”，有一定的治疗前景。还有很多Prion疾病治疗方面的研究，但探寻更有效的靶向位点与治疗手段一直是Prion疾病研究的热点与方向。在Prion感染的脑内，PrPse聚集的周围常出现激活的神经小胶质细胞，而且神经小胶质细胞的激活在朊病毒病的发病机制中起着关键性的作用。大量研究表明，PrPse积聚可导致神经小胶质细胞活化，多种细胞因子和趋化因子的表达上调，包括白介素1β (IL-Ιβ)、肿瘤坏死因子(TNF)和趋化因子(C-C motif)配体3 (CCL3)等。其中IL-1 β在免疫调控和炎性反应中发挥着重要作用。IL-I β是由胞质中无生物活性的IL-I β前体产生的，而多种刺激可以导致pro-IL-Ιβ更高水平的表达。无活性的IL-Ιβ前体可通过蛋白酶caspase-Ι的催化,转变为成熟而有活性的IL-I β。ー些研究表明，体外合成的朊蛋白神经毒性片段可激活鼠神经小胶质细胞，并导致IL-I β的生成増加。IL-I β已经证明在prion疾病中起着重要作用，尽管PrPse可以导致小胶质细胞产生IL-1 β，但是目前PrP106-126诱导释放IL-I β的机制还不清楚。炎症复合体是存在于细胞质基质中的多蛋白复合体，作为通过caspase-Ι催化激活促炎因子IL-I β和IL-18的平台。炎症复合体在天然免疫途径中发挥着重要作用，并在炎症疾病中发挥激活作用。到目前为止，确定了ー些炎症复合体，其中研究最多的是NALP3炎症复合体(NACHT，LRR和PYD结构域-含蛋白3)或者CIASl (家族性冷致的炎症综合征
I)。复合体包括Nod样受体(NLR)NALP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和pro-caspase-Ι，病原相关分子模型和内源性的危险信号可以激活复合体。
虽然有大量文献报道了 Prion诱导神经小胶质细胞释放IL-I β，但是没有阐明朊病毒使神经小胶质细胞呈激活状态，并释放IL-I β的机制。若能探明朊病毒诱导释放IL-I β的机制，则有助于调节朊病毒感染神经细胞后释放IL-I β的过程，筛选prion或其它神经退行性疾病中的药物治疗靶位点，为进一步制备预防或控制朊病毒病或其它神经退行性疾病的药物提供指导。
发明内容
本发明的目的在阐明朊病毒诱导释放IL-I β的机制，提供NALP3-ASC炎症复合体及其抑制剂的制药用途。
本发明的另一目的在于提供一种筛选抗Prion疾病药物的方法。本发明通过以下实验方案阐明朊病毒诱导小鼠神经小胶质细胞(BV2)释放IL-I β的机制。技术路线见图I。(I)无菌分离小鼠原代或传代小胶质细胞进行培养。(2)朊病毒攻毒小鼠原代小胶质细胞以及传代细胞，分别于3h、6h、12h、24h取细胞上清，然后用ELISA的方法检测不同时间段上清中的IL-I β的含量。(3)朊病毒攻毒细胞后提取细胞胞浆蛋白，用Western blot的方法检测有无pro-caspasel的活化产物caspaselp20片段产生。(4)用荧光定量PCR的方法检测朊病毒攻毒小胶质后，不同时间点细胞内NALP3蛋白和ASC蛋白表达量的变化。(5)分别设计针对NALP3和ASC蛋白的特异性siRNA，摸索最佳的干扰条件，以及最佳的干扰条件下NALP3基因和ASC基因的干扰效率，分别采用荧光定量PCR和westernblot的方法。(6)分别在两种SiRNA干扰效果最佳的情况下用朊病毒攻毒干扰后的细胞，然后在特定的时间点提取细胞上清进行IL-I β的ELISA检测，确定干扰这两种蛋白以后是否会引起细胞分泌IL-I β的变化。(7)干扰Nalp3和ASC蛋白后，用朊病毒攻毒，然后用荧光定量的方法检测细胞内TNF- α以及趋化因子CCL3和CXCLlO的变化情况。(8)综合以上数据，阐明NALP3-ASC炎症复合体在朊病毒引起小鼠microglia产生IL-I β中的作用，并证明NALP3-ASC炎症复合体与其它促炎因子以及趋化因子的关系。IL-I β是由caspasel活化pro-IL-l β产生的活性片段，caspasel是一种半胱氨酸蛋白酶，正常情况下以pro-caspasel的无活性形式存在于细胞质中，激活时，pro-caspasel会活化为两个活性片段ρ10和p20。IL-I β的产生需要由pro-IL-l β的存在，而pro-IL-Ιβ的产生需要另外一个通过NF-κ B的途径来产生。实验结果表明，NALP3-ASC炎症复合体能够导致pro-caspasel活化产生caspasel,活化的caspasel进而催化pro-IL-Ιβ产生IL-I β释放到细胞外，引起一系列的炎性反应。NALP3-ASC炎症复合体在prion疾病中作为一个调控因素可以影响机体炎症的发生，其在PrP106-126诱导释放IL-I β的过程中发挥促进作用，当PrP106-126刺激神经小胶质细胞时，NALP3-ASC炎症复合体促进了 caspase-Ι和IL-I β的激活。本发明利用SiRNA技术分别沉默NALP3和ASC蛋白后，发现IL-I β的产生显著降低。虽然基因沉默后仍有可检测到IL-I β存在，但是这可能是由于沉默不能代表完全不表达，或者是另外有别的途径导致IL-I β的产生。本发明还发现抑制NF-K B的激活可以抑制PrP106-126引起的NALP3和ASC表达量上升，这也证实了 NF-κ B可能作为NALP3炎症复合体的上游调节环节，对该过程起着控制性作用。在prion疾病中，已经证明感染的脑组织中促炎因子表达量增多，并不断向淀粉样物质沉积处聚集，引起局部的免疫反应。本发明利用siRNA技术沉默NALP3和ASC蛋白后，可以显著降低由PrP106-126引起的TNF和CCL3两种细胞因子的表达水平。进ー步地，本发明提供了 NALP3-ASC炎症复合体在制备调节朊病毒神经毒性片段PrP106-126诱导神经小胶质细胞释放IL-I β过程的药物中的用途。进ー步地，本发明提供了 NALP3-ASC炎症复合体在制备激活caspase-Ι和IL-1 β过程的药物中的用途。 进ー步地，本发明提供了 NALP3-ASC炎症复合体在制备引起BV2细胞激活过程的药物中的用途。本发明提供了 NALP3-ASC炎症复合体激活抑制剂在制备预防和/或治疗朊病毒病药物中的应用。其中，所述的NALP3-ASC炎症复合体激活抑制剂通过如下机制来实现其治疗和预防功效，朊病毒感染引起神经小胶质细胞激活，进而通过形成NALP3-ASC炎症复合体，增强了 caspase-Ι和IL-I β的激活，所述NALP3炎症复合体激活抑制剂阻断或抑制了NALP3-ASC炎症复合体的形成，从而起到预防、治疗或控制朊病毒疾病的作用。其中，所述的NALP3-ASC炎症复合体激活抑制剂选自NF- κ B激活抑制剂、钾离子溶液和/或N-こ酰半胱氨酸(NAC)。所述的NF-K B激活抑制剂为Bay 11-7082。本发明还提供了 NALP3-ASC炎症复合体在筛选抗Prion疾病药物中的应用。本发明提供了ー种筛选抗Prion疾病药物的方法，是将待测样品与朊病毒共刺激神经细胞，提取处理后细胞总RNA，用qPCR方法检测NALP3-ASC炎症复合体，根据PCR扩增结果判断样品对NALP3和ASC的mRNA表达抑制情况，筛选能够抑制NALP3和ASC表达即抑制NALP3-ASC炎症复合体的待测样品，即为抗Prion疾病药物。上述方法，还包括在待测样品与朊病毒共刺激细胞前处理神经细胞的步骤，具体为用300ng/ml的脂多糖(LPS)预刺激细胞3h,然后再进行攻毒实验。在本发明的一个实施例中，使用的朊病毒为朊病毒神经毒性片段PrP106_126，攻毒用终浓度为100 μ M ;使用的神经细胞为BV2细胞。上述筛选抗Prion疾病药物的方法所述的qPCR方法检测NALP3和ASC所使用的引物为NALP3，上游5，-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3，，下游5，-TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3，；ASC，上游5 ’ -GCAACTGCGAGAAGGCTAT-3 ’，下游5，-CTGGTCCACAAAGTGTCCTG-3，。反应体系为荧光定量dNTP Mix，10 μ 1，上下游引物各0.5 μ 1，模板I μ 1，加水补充到20 μ I。
在本发明的一个实施例中，所用的待测样品为KCL溶液和NAC溶液，经过筛选发现130mM的KCL和IOmM的NAC能够抑制NALP3和ASC的表达。本发明阐明了朊病毒诱导释放IL-I β的机制，指出NALP3-ASC炎症复合体在调节朊病毒感染神经细胞后释放IL-I β的过程中发挥重要促进作用。NALP3-ASC炎症复合体在朊病毒病中作为ー个调控因素影响机体炎症的发生，当朊病毒刺激神经小胶质细胞吋，NALP3-ASC炎症复合体促进了 caspase-Ι和IL-1 β的激活。通过筛选能够抑制NALP3-ASC炎症复合体激活的靶位点，为进一歩制备预防或控制朊病毒病或其它神经退行性疾病的药物提供指导。本发明方法通过考察样品对NALP3-ASC炎症复合体的抑制作用来筛选获得抗朊病毒病的药物。结果表明，利用本发明方法筛选得到的3种化合物均对NALP3-ASC炎症 复合体的激活具有抑制作用的物质。
图I为本发明研究NALP3-ASC炎症复合体对朊病毒诱导IL-I β释放作用的技术路线图。图2显示PrP106_126攻毒可以导致小鼠小胶质细胞IL-Ιβ的释放。细胞先用300ng/ml 的 LPS 预刺激 3h，然后用 PrP106-126 或 Scr-PrP(100 μ Μ)刺激 6h, IL-I β 的释放浓度用ELISA方法进行检测；a代表原代小鼠小胶质细胞，b代表BV2传代细胞系，*P< O. 05，代表差异显著。图3显示PrP106_126攻毒可以导致caspasel的激活。细胞先用300ng/ml的LPS预刺激3h，然后用PrP106-126或Scr-PrP (100 μ Μ)刺激6h，caspasel的活化片段(p20)采用western blot的方法检测，a代表BV2传代细胞系，b代表小鼠腹腔巨噬细胞系ANAl。图4为PrP106-126刺激BV2细胞导致NALP3和ASC的表达量升高。PrP106_126刺激细胞后，于不同的时间段收集细胞总RNA，用qPCR的方法检测NALP3和ASC两种蛋白mRNA水平的变化，*P < O. 05，代表差异显著。图5为PrP106-126引起BV2细胞产生IL-Ιβ的过程需要NALP3炎症复合体的参与。BV2细胞分别用si_NALP3和si_ASC进行沉默，a代表沉默后qPCR的检测結果，b代表沉默后western blot的检测结果；c代表分别沉默后，用PrP106_126进行攻毒,然后用ELISA的方法检测上清中IL-I β的含量，*P < O. 05，代表差异显著。WT :正常细胞；N_i :阴性感染对照；NALP3-i NALP3干扰；ASC_i :ASC干扰。图6为NALP3炎症复合体对TNF和CCL3的表达变化起着调控作用。NALP3和ASC沉默后，用PrP106-126攻毒，然后收集细胞总RNA，检测促炎因子TNF和趋化因子CCL3的mRNA变化，*P < O. 05,代表差异显著。图7表明PrP106_126弓丨起NALP3炎症复合体的激活需要NF- κ B的參与。a，PrP106-126刺激BV2细胞，然后分别于6h、12h和24h取细胞质和细胞浆蛋白，用westernblot的方法检测活化的NF- κ B p65片段。b，BV2细胞先用不同浓度的NF- κ B的特异性抑制剂Bayl 1-7082预处理lh，然后用PrP106_126攻毒，6h后取细胞总RNA，用qPCR的方法检测NALP3和ASC蛋白mRNA水平的变化情況，*P < O. 05，代表差异显著。图8为130mM的K+和10 μ M的NAC可以抑制PrP106_126引起的IL-1 β分泌。LPS预刺激的BV2分别与KCL和NAC共刺激细胞，6h后取细胞上清和总RNA分别检测IL-I β (a)和NALP3炎症复合体的表达(b)，*P < O. 05，代表差异显著。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例I NALP3-ASC炎症复合体在朊病毒诱导细胞释放IL-I β中的作用I、材料与方法I. I 试剂兔抗鼠caspasel、NALP3 和 ASC 抗体分别购于 BioVision, Abcam 和 Santa Cruz 公司；兔抗鼠NF-kappaB p65抗体，β actin和Max抗体购自碧云天公司；LPS和N-乙酰半胱氨酸(NAC)购自Sigma, IL-I β检测试剂盒和蛋白快速沉淀浓缩试剂盒购自武汉博士德公司；羊抗兔二抗、Bay 11-7082购自碧云天生物公司。I. 2小胶质细胞的分离与培养原代细胞的分离参照已有的文献(Kingham PJ, Cuzner ML, Pocock JM. 1999.Apoptotic pathways mobi-lized in microglia and neurones as a consequence ofchromogranin A-induced microglial activation. J Neurochem73 :538-547)进行操作。BV2细胞系和小鼠腹腔巨噬细胞系(ANA1细胞系)购自协和医科大学，细胞用DMEM-F12培养基在37°C含5% CO2的温箱中培养。I. 3Prion 多肽PrP106-126 氨基酸序列为 KTNMKHMAGAAAAGAVVGGLG (SEQ ID NO. I)。Scr-PrP 序列为AVGMHAGKGLANTAKAGAMVG (SEQ ID NO. 2)，由上海生工合成，多肽的纯度达到95%。多肽在O. IM的PBS中溶解成ImM浓度，然后再37°C放置12h，实验用终浓度为100 μ M。I. 4多肽处理小胶质细胞先用300ng/ml浓度的LPS刺激3h，之后弃去细胞上清，用PrP106_126进行攻毒，Scr-PrP作为阴性对照每个实验做3次重复。K离子抑制和NAC抑制实验中，细胞先用LPS处理3h，然后用终浓度为130mM的KCL和PrP或者15mM的NAC和PrP进行共处理。1.5SiRNA 干扰NALP3和ASC采用siRNA的方法进行沉默，干扰序列以及试剂购自QIAGEN。细胞在12孔板中铺入O. 8 X IO5个细胞，过夜培养。干扰时的siRNA终浓度为ΙΟηΜ，干扰方法按照QIAGEN公司的操作说明进行。NALP3和ASC的干扰效率分别用荧光定量PCR和Westernblot的方法检测。I. 6细胞上清中IL-I β的检测细胞攻毒后的上清用ELISA的方法检测上清中IL-I β的含量。I. 7RNA的提取、cDNA的合成和定量PCR细胞总RNA的提取使用Promega公司的RNA提取试剂盒,使用Fermentas公司的反转录试剂盒合成cDNA，荧光定量PCR采用SYBERGreen I的方法，实验所涉及到的引物包括NALP3，上游5，-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3，，下游5’-TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3’ ；ASC，上游5 ’ -GCAACTGCGAGAAGGCTAT-3 ’，下游5，-CTGGTCCACAAAGTGTCCTG-3，；β -actin，上游5，-GCTTCTTTGCAGCTCCTTCG-3，，下游5，-CCTTCTGACCCATTCCCACC-3，； CCL3，上游 5，-TCCCAGCCAGGTGTCATTT-3，，下游5，-GGCATTCAGTTCCAGGTCAG-3，；TNF，上游5，-CCCTTCCTCCGATGGCTAC-3，，下游5，-CGCCTCCTTCTTG TTCTGG-3，。反应体系为dNTP Μ χ，10μ 1，上下游引物各O. 5μ 1，模板1μ 1，加水补充到20 μ 1，最后结果处理采用2_“ct的方法。I. 8细胞核与细胞质蛋白的提取及western blot细胞处理过以后，弃去上清，收集细胞分别提取细胞质和细胞核内的蛋白，然后用所提取的蛋白做western blot。2、结果2. lPrP106_126 可以激活 caspasel 并导致 IL-1 β 的释放为了研究PrP106_126在诱导小胶质细胞产生炎症反应方面的作用，用PrP106-126和Scr分别处理原代小胶质细胞和BV2。由于IL-I β的前体需要不同的途径进行刺激，因此在攻毒前用LPS(300ng/ml)处理3h，使得pro-IL-1 β能够足够产生。结果表明，PrP106-126可以刺激原代及BV2胶质细胞产生IL-I β，与对照组相比，PrP106_126引起IL-I β的释放有着显著性升高(图2);同吋，PrP106-126也能导致细胞内caspasel的激活，产生活化的caspasel p20片段(图3)，而Scr处理组和PBS处理组并没有出现活化的P20片段。说明PrP106-126能够引起IL-I β的释放和caspasel的激活。2. 2PrP106-126刺激细胞可以导致细胞内NALP3和ASC基因mRNA水平上调为了研究NALP3和ASC蛋白是否參与到PrP106_126引起小胶质细胞激活的过程，本发明用PrP106-126刺激BV2细胞，于不同的时间段提取细胞总RNA，然后进行反转录PCR,之后用qPCR的方法对NALP3和ASC的mRNA表达水平进行检测。结果表明，NALP3在所有检测时间段都有着显著的升高，而ASC的表达在PrP106-126刺激后24h和36h表达量增加最为明显(图4)。结果说明NALP3和ASC两个蛋白均參与到PrP106_126引起BV2细胞激活的过程中。2. 3PrP106-126弓丨起IL-I β的释放需要NALP3炎症复合体的激活NALP3炎症复合体是由NALP3、ASC蛋白组成复合体，为了研究NALP3复合体是否在PrP 106-126引起BV2产生IL-I β的过程中起作用，本发明设计了针对NALP3和ASC两种蛋白的基因沉默，利用siRNA的方法对两种蛋白的表达量分别进行沉默，然后检测沉默前后IL-I β的变化情況。NALP3和ASC的干扰效率用qPCR和western blot进行检测，结果显示，NALP3和ASC的干扰效率分别达到76%和80%。基因沉默后，细胞先用300ng/ml的LPS刺激3h，然后用PrP106-126攻毒，6h后取细胞上清进行IL-I β的ELISA检测，结果显示，NALP3和ASC分别干扰后，IL-I β的产生均有显著地下降(图5)，说明NALP3炎症复合体在PrP106_126引起小胶质细胞产生IL-I β的过程中起着重要的作用。2. 4NALP3炎症复合体的激活能够促进TNF和CCL3的表达研究表明，prion干扰的小鼠脑匀浆中，可见许多趋化因子以及炎性因子的大量表达，为了验证促炎因子和趋化因子的表达变化是否和NALP3炎症复合体有关，本发明对NALP3和ASC沉默的细胞进行攻毒，然后检测TNF和CCL3两种典型的促炎因子和趋化因子。结果表明，NALP3和ASC沉默之后，与未沉默组相比，PrP106-126攻毒后TNF和CCL3的表达量均有显著下降(图6)，而且TNF的下降程度比CCL3的下降程度更为明显。这些结果说明NALP3炎症复合体在调控促炎因子和趋化因子方面起着重要作用。2. 5NF- κ B对于NALP3和ASC的表达起着调控作用细胞在攻毒之前，先用15 μ M NF- κ B的特异性抑制剂Bay 11-7082预处理lh，然后再用100 μ M ΡΓΡ106-126攻毒，收集细胞总RNA，用qPCR的方法检测NALP3和ASC基因mRNA水平的表达量变化。结果表明，抑制NF- κ B的活性以后，PrP106_126攻毒的细胞NALP3和ASC的表达量有了明显的下降(图7)，这说明NF- κ B可能是NALP3和ASC的上游调控因素。实施例2 K+溶液和活性氧簇(ROS)抑制剂NAC通过抑制NALP3和ASC的表达减少IL-I β的分泌用高浓度(130mM)的KCL，和ROS的抑制剂NAC、浓度为10 μ Μ，分别作用于细胞，检测BV2细胞分别在这两种试剂的作用下，PrP106-126攻毒后对NALP3炎症复合体的影响。100 μ M的PrP106-126分别与130mM的KCL和10 μ M的NAC共刺激细胞，6h后取细胞上清检测IL-I β，ELISA结果显示KCL和NAC均可以明显抑制IL-I β的产生(图8)，另外取处理后的细胞总RNA，用qPCR的方法检测NALP3和ASC的变化。所用的引物为NALP3，上游5，-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3，，下游5，-TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3，；ASC，上游5 ’ -GCAACTGCGAGAAGGCTAT-3 ’，下游5，-CTGGTCCACAAAGTGTCCTG-3，；荧光定量PCR反应条件为95°C预变性30sec ;95°C变性5sec，53°C退火20sec，72°C延伸30sec，共40个循环；72°C延伸IOmin ;70°C到90°C每O. 2°C读取溶解曲线，读取时间 Isec。结果显示，KCL可以显著抑制NALP3和ASC的mRNA表达，NAC可以显著抑制NALP3的mRNA表达，而对ASC的表达量没有影响，说明NAC是通过对NALP3的抑制来减少IL-I β的释放。实施例3 NALP3-ASC炎症复合体激活抑制剂的筛选I、待测样品处理取KCL和NAC化学分析纯级粉末，用PBS稀释至工作浓度，分别为130mM和10 μ Μ。2、筛选方法建立 将待测样品与朊病毒神经毒性片段PrP106-126共同刺激BV2细胞，提取处理后细胞总RNA，用qPCR方法检测NALP3-ASC炎症复合体，根据PCR扩增结果判断样品对NALP3和ASC的mRNA表达抑制情況，筛选能够抑制NALP3和ASC表达的待测样品，即为抗Prion疾病药物。qPCR方法检测NALP3和ASC所使用的引物为NALP3，上游5，-ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3，，下游5’-TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3’ ；ASC，上游5，-GCAACTGCGAGAAGGCTAT-3，，下游5，-CTGGTCCACAAAGTGTCCTG-3，。取130mM 的 KCL 和 10 μ M 的 NAC 与 100 μ M 的 PrP106_126 共刺激 BV2 细胞，6h 后提取处理后的细胞总RNA，用qPCR的方法检测NALP3和ASC的变化，见图8b和图8c。结果显示，KCL可以显著抑制NALP3和ASC的mRNA表达，NAC可以显著抑制NALP3的mRNA表达，而对ASC的表达量没有影响，说明NAC可能是通过对NALP3的抑制来减少IL-I β的释放。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.NALP3-ASC炎症复合体在制备调节朊病毒神经毒性片段PrP106_126诱导神经小胶质细胞释放IL-I β过程的药物中的用途。
2.NALP3-ASC炎症复合体在制备激活caspase-Ι和IL-I β过程的药物中的用途。
3.NALP3-ASC炎症复合体在制备引起BV2细胞激活过程的药物中的用途。
4.NALP3-ASC炎症复合体激活抑制剂在制备预防和/或治疗朊病毒病药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的NALP3-ASC炎症复合体激活抑制剂通过如下机制来实现其治疗和预防功效，朊病毒感染引起神经小胶质细胞激活，进而通过形成NALP3-ASC炎症复合体，增强了 caspase-Ι和IL-1 β的激活，所述NALP3炎症复合体激活抑制剂阻断或抑制了 NALP3-ASC炎症复合体的形成，从而起到预防、治疗或控制朊病毒疾病的作用。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述的NALP3-ASC炎症复合体激活抑制剂选自NF- K B激活抑制剂、钾离子溶液和/或N-乙酰半胱氨酸。
7.NALP3-ASC炎症复合体在筛选抗Prion疾病药物中的应用。
8.一种筛选抗Prion疾病药物的方法，其特征在于，将待测样品与朊病毒共刺激细胞，提取处理后细胞总RNA，用qPCR方法检测NALP3-ASC炎症复合体，根据PCR扩增结果判断样品对NALP3和ASC的mRNA表达抑制情况，筛选能够抑制NALP3和ASC表达的待测样品，即为抗Prion疾病药物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述朊病毒为朊病毒神经毒性片段PrP106-126，所述细胞为BV2细胞。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述qPCR方法检测NALP3和ASC所使用的引物为NALP3，上游5’ -ATTACCCGCCCGAGAAAGG-3’，下游5’ -TCGCAGCAAAGATCCACACAG-3’ ；ASC，上游5’ -GCAACTGCGAGAAGGCTAT-3’，下游5’ -CTGGTCCACAAAGTGTCCTG-3’。
全文摘要
本发明公开了NALP3-ASC炎症复合体及其激活抑制剂在制备朊病毒病药物中的应用。实验表明，朊病毒感染神经小胶质细胞，形成NALP3-ASC炎症复合体增强caspase-1和IL-1β的激活。炎症复合体NALP3抑制剂能够抑制NALP3和ASC表达，进而抑制caspase-1和IL-1β的激活和释放。本发明提供了NALP3-ASC炎症复合体抑制剂在筛选朊病毒病药物中的应用，通过将待测样品与朊病毒共刺激细胞，提取处理后细胞总RNA，用qPCR方法检测NALP3和ASC，根据PCR扩增结果判断样品对NALP3和ASC的mRNA表达抑制情况，从而筛选出抗Prion疾病的药物，起到预防、治疗或控制朊病毒疾病的作用。
文档编号A61K45/00GK102641501SQ20121011972
公开日2012年8月22日 申请日期2012年4月17日 优先权日2012年4月17日
发明者周向梅, 姚皓, 尹晓敏, 师福山, 杨利峰, 王继红, 赵化粉, 赵德明 申请人:中国农业大学