专利名称：甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株及构建方法
技术领域：
本发明属于酿酒酵母生物发酵领域，具体说是乙醇发酵工业。特别是涉及一种经基因工程修饰的酿酒酵母菌株及其菌株的构建方法。
背景技术：
乙醇已是人类部分或全部代替石油的可再生能源，对人类社会可持续发展具有重要意义。但是目前国内外工业发酵生产乙醇主要存在以下系列问题发酵副产物高、发酵周期长、乙醇转化率低和环境污染严重等主要问题。甘油是乙醇发酵过程中的主要副产品，大约要消耗可发酵性糖的10％左右。甘油副产物的产生直接影响糖-醇转化率。现已成为降低乙醇生产成本的主要障碍。
因此，采用基因工程技术缺失编码镶嵌在酿酒酵母细胞膜上的甘油通道蛋白FPS1基因。由于酿酒酵母细胞膜上没有甘油通道蛋白Fps1p的存在，细胞内产生的甘油无法分泌到细胞外而在细胞内积累，甘油合成途径将受到细胞内积累的甘油反馈抑制，这将极大地改善发酵液的物化性能，使细胞内的代谢平衡发生改变，甘油代谢向着乙醇代谢流方向转变。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种容易培养、适合大规模发酵生产并易于实现产业化的甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株。
本发明的第二个目的是一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株的构建方法。
本发明的技术方案概述如下一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤(1)酿酒酵母单倍体的获得及URA3基因的缺失酿酒酵母子囊孢子的形成取适量新活化的双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞均匀地涂在醋酸钾产子囊孢子培养基上，26℃～30℃培养2～3天，在所述培养基酵母涂层上刮取适量的酵母细胞，溶解到装有50μl无菌水的1.5ml离心管中，加入浓度为10～20mg/ml的蜗牛酶3～10μl，37℃消化子囊壁10～30min；酿酒酵母子囊孢子的拆分向上述离心管中缓缓加入1ml无菌水，倒置1～4min，取30～50μl液体，滴到YPD平板边缘上，倾斜平板使细胞液在平板边缘形成条形状，干燥后在显微操作仪上进行子囊孢子拆分，直接将玻璃针尖上的子囊孢子摆放到YPD培养平板上，30℃的条件下培养2～3天，将单个子囊孢子长出的菌落转接到YPD液体试管中培养，大约培养7-8小时左右收集菌体进行染色体提取、电泳进行单倍体验证，电泳图上仅出现一条544bp或404bp电泳带，证明是单倍体，再经过发酵挑选优良的出发酵母菌株KAM-19；KAM-19菌株URA3基因的缺失对质粒PJJ242中编码URA3基因的DNA片段用Nco I单酶消化，用Klenow大片段补平，再用T4连接酶进行平末端连接，得到含有失活URA3片段的PJJ242质粒；用HindIII限制性内切酶把所述失活的URA3基因切下，采用醋酸锂方法将所述失活的URA3基因转化到酵母细胞KAM-19中进行基因重组，使KAM-19染色体上的URA3基因由质粒PJJ242上失活的URA3基因取代，将转化的酵母细胞涂在5-氟乳清酸平板上，凡是在该平板上生长出的酵母菌株为URA3缺陷型菌株-KAM-20；(2)PUC18-FPS1-ORF质粒的构建酵母染色体的制备将双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)菌接种到含有5mlYPD培养液的试管中，30℃条件下振荡培养8-10小时，然后将培养液倒入1.5ml离心管中，12000rpm离心30sec后，弃掉上清液，沉淀用0.5ml无菌水重悬，然后12000rpm离心30sec，收集菌体；往装有菌体离心管中加入200μl破菌缓冲液重悬细胞，同时加入200μl体积玻璃珠和200μl PH＞7的苯酚或氯仿，振荡约3～4min；加200μlTE缓冲液振荡，12000rpm离心5min，室温下将水相转移到一个干净的离心管中，加1ml无水乙醇，颠倒混匀；室温下12000rpm离心3min，弃掉上清液，沉淀用0.4mlTE缓冲液重悬；加3μl的1mg/mlRNA分解酶，混和均匀，37℃条件下温育5min；加10μl 3mol/L乙酸铵、1ml无水乙醇，颠倒混匀，室温下高速离心3min，弃上清液，干燥沉淀，用100μlTE缓冲液重悬，得到酵母染色体；扩增FPS1-ORF基因根据酿酒酵母染色体上FPS1基因序列设计引物，FPS1-上引为5’-CCCGGGGAATTCTAGTAGGAGAGCAGAGTGTC-3’，FPS1-下引为5’-TATAGTAGGTGACCAGGCTG-3’；PCR反应体系为上、下引物均为1μl；200μM的d NTP 4μl；缓冲液5μl；所述酵母染色体为模板0.5μl；双蒸水38.25μl；聚合酶0.25μl，PCR反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30sec；58℃退火30sec；72℃延伸1min；得到PCR扩增产物FPS1-ORF基因；PUC18和FPS1-ORF基因的消化将扩增的FPS1-ORF产物4μl和载体PUC18 4-μl分别用EcoR I和HindIII各为0.25～0.5μl，10×酶缓冲液2μl；用无菌水将总体积补加到20μl，在37℃条件下消化1～2小时；试剂盒纯化回收DNA片段将扩增的FPS1-ORF和载体PUC18的双酶切产物分别从琼脂糖凝胶上切下，加2-5倍体积溶胶液，46～50℃水浴放置5～15min，300rpm振荡，使琼脂糖凝胶完全溶解，加到一个吸附柱中，13000rpm离心5min，倒掉收集管中的废液；加入700μl漂洗液中，13000rpm离心5min后弃废液，然后重复一次；取出吸附柱，放到离心管中，加入洗脱缓冲液22μl，室温放置1min，13000rpm离心3min；PUC18片段和FPS1-ORF基因片段的连接在20μl连接体系中，加入2μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl T4连接酶，FPSi-ORF基因片段和载体PUC18片段的加入量分别为5-71μl和6-8μl，加水至20μl体系，在16℃条件下连接2～3h，最后通过酶切验证得到PUC18-FPS1-ORF质粒；(3)PUC18-FUF质粒的构建通过引物对PUC18-FPS1-ORF质粒进行PCR扩增，引物PUC18-F-上引为5’-ATTTTTCTGCAGTGAGAAAACAGACAAGAAAAAGA-3’；引物PUC18-F-下引为5’-AGGCTGTCAAGATGCATTAGAATGTACCCTCG-3’，以质粒PUC18-FPS1 ORF为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物为PUC18-FF，其两端各带有FPS1的450bp和120bp碱基，以YEPLac195质粒上的URA3基因为模板，引物URA3-上引为5’-GTC GAC TCT AGA GTA GTC TAG TAC CTCCTG TG-3’；引物URA3-下引为5’-GTC GAC CTG CAG GAA AAG TGC CAC CTG ACG TC-3’，引物进行PCR扩增，得到的PCR产物为URA3-ORF，两套引物上都分别含有PST I和BamHI酶切位点；所述两套PCR产物分别用PST I和Xba I双酶消化，T4连接酶连接，然后转化到提前制备成感受态的大肠杆菌Top10中，提质粒进行酶切电泳验证，得到PUC18-FUF质粒；(4)KAM-21菌株的构建对PUC18-FUF质粒进行双酶消化将PUC18-FUF质粒用ECoR I和HindIII进行双酶消化得到两端分别带有FPS1同源片段和URA3标记基因，总长度为1.93kb DNA片段；1.93kb DNA片段转化到酵母细胞内与转化子的筛选将待转化的URA3缺陷型酵母菌株KAM-20转接到装有5ml YPD培养液的试管中，30℃200rpm 8-10小时培养，13000rpm30s离心收集菌体，用1ml无菌水清洗细胞；将一管SS-担体DNA沸水煮沸3-7min，放到冰上保持1-3min；往离心管中加入转化混合物，所述转化混合物为重量体积百分比为50％的3500PEG 240μl；1.0M醋酸锂36μl；浓度为2mg/ml的SS-担体DNA50μl；1.93kb DNA片段34μl；振荡混匀，置于预热的42℃水浴中30min；13000rpm离心30s收集菌体；用100μl无菌水重悬菌体，涂布于省却特定氨基酸成分的CM平板上，26-32℃培养，将2～3天后培养基上长出的菌落进行染色体提取通过PCR的方法进行验证，电泳后片段大小为1.93kb的转化子为正确的，即得到了一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株-KAM-21。
一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株，是上面所述的方法构建的。
大量实验证明经上述方法一定能构建出一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株KAM-21，无需进行保藏。
本发明的优点是依据代谢工程原理、采用基因工程技术缺失编码镶嵌在细胞膜上的甘油通道蛋白FPS1基因，丧失FPS1基因的表达。由于细胞膜上没有甘油通道蛋白Fps1p的存在，细胞内产生的甘油无法通过甘油通道蛋白Fps1p分泌到细胞外而在细胞内积累，甘油合成途径将受到细胞内积累的甘油反馈抑制，这将极大地改善发酵液的物化性能，使细胞内的代谢平衡发生改变，甘油代谢向乙醇代谢转换，大大地降低了甘油副产物的生成。增加了乙醇产量。因而从一定程度上解决乙醇生产成本高、发酵周期长、对环境污染严重等系列问题。
图1为FPS1-ORF基因2.7kb；图2为PUC18质粒；图3为PUC18-FPS1-ORF质粒；图4为PUC18-FUF质粒；图5为FUF片段1.93bp；图6为PUC18+FPS1单酶切电泳图5220bp；图7为转化前FPS1电泳图2.7kb；图8为转化后的电泳图1.93kb；图9为甘油生成量曲线图；图10为乙醇产量曲线图；具体实施方式
实施例1(1)酿酒酵母单倍体的获得及URA3基因的缺失酿酒酵母(S.cerevisiae)就是即能以单倍体也能以二倍体形式存在于自然界中，一般的情况下都以营养体状态进行出芽繁殖；营养体即能以单倍体(n)的形式存在，也能以二倍体(2n)形式存在；在特定的环境条件下才能进行有性繁殖，一个子囊中产生四个子囊包子，两个是a型的，两个是α型的。
酿酒酵母子囊孢子的形成取适量新活化的双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞均匀地涂在醋酸钾产子囊孢子培养基上，28℃条件下培养2天，在所述培养基酵母涂层上刮取适量的酵母细胞，溶解到装有50μl无菌水的1.5ml离心管中，加浓度为15mg/ml的蜗牛酶(zymolyase)5μl 37℃消化子囊壁20min，形成酿酒酵母子囊孢子溶液；酿酒酵母子囊孢子的拆分向装有形成酿酒酵母子囊孢子溶液的离心管中缓缓加入1ml无菌水，倒置2min 1min，取其中30μl液体，滴加到YPD平板边缘上(YPD液体培养基(g/L)酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20，PH自然)，倾斜平板，使细胞液在平板边缘形成条状，干燥后在显微操作仪上进行子囊孢子拆分，直接将玻璃针尖上的子囊孢子摆放到YPD培养平板上，30℃的条件下培养2天，将单个子囊孢子长出的菌落转接到YPD液体试管中培养，培养7小时，收集菌体进行染色体提取、电泳进行单倍体验证，电泳图上仅出现一条544bp或404bp电泳带，证明是单倍体，再经过发酵挑选优良的出发酵母菌株KAM-19；KAM-19菌株URA3基因的缺失URA3基因作为标记基因，所以必须将KAM-19菌株的URA3基因缺失，对质粒PJJ242(北京天为时代科技有限公司)中编码URA3基因的DNA片段用Nco I单酶消化，用Klenow大片段补平，再用T4连接酶进行平末端连接，得到含有失活URA3片段的PJJ242质粒；用HindIII限制性内切酶把所述失活的URA3基因切下，采用醋酸锂方法将所述失活的URA3基因转化到酵母细胞KAM-19中进行基因重组，使KAM-19染色体上的URA3基因由质粒PJJ242上失活的URA3基因取代，将转化的酵母细胞涂在5-氟乳清酸(5-FOA)平板上，凡是在该平板上生长出的酵母菌株为URA3缺陷型菌株KAM-20；(2)PUC18-FPS1-ORF质粒的构建酵母染色体的制备将双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)菌接种到含有5mlYPD培养液的试管中，30℃条件下振荡培养8小时，然后将培养液倒入1.5ml离心管中，12000rpm离心30sec后，弃掉上清液，沉淀用0.5ml无菌水重悬，然后12000rpm离心30sec，收集菌体；往装有菌体离心管中加入200μl破菌缓冲液重悬细胞，同时加入200μl体积玻璃珠和200μl PH＞7的苯酚或氯仿，振荡3min；加200μlTE缓冲液振荡，12000rpm离心5min，室温下将水相转移到一个干净的离心管中，加1ml无水乙醇，颠倒混匀；室温下12000rpm离心3min，弃掉上清液，沉淀用0.4mlTE缓冲液重悬；加3μl的1mg/mlRNA分解酶，混和均匀，37℃条件下温育5min；加10μl 3mol/L乙酸铵、1ml无水乙醇，颠倒混匀，室温下高速离心3min，弃上清液，干燥沉淀，用100μlTE缓冲液重悬，得到酵母染色体；扩增FPS1-ORF基因根据酿酒酵母染色体上FPS1基因序列设计引物，FPS1-上引为5’-CCCGGGGAATTCTAGTAGGAGAGCAGAGTGTC-3’，这32个碱基5’端前12bp是6个保护碱基与EcoR I的酶切位点；其3’端前20bp是酵母染色体FPS1座位-400bp-459bp的寡核苷酸序列，FPS1-下引为5’-TATAGTAGGTGACCAGGCTG-3’；这20个碱基是染色体上FPS1座位+2224bp--+2443bp的寡核苷酸序列反向互不序列PCR，(引物由上海博亚生物技术有限公司合成)，PCR反应体系为上、下引物均为1μl；200μM的d NTP 4μl；缓冲液5μl；所述酵母染色体为模板0.5μl；双蒸水38.25μl；聚合酶0.25μl，PCR反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30sec；58℃退火30sec；72℃延伸1min；得到PCR扩增产物FPS1-ORF基因(图1)(图7)；PUC18和FPS1-ORF基因的消化将扩增的FPS1-ORF产物4μl和载体PUC18(图2)(北京天为时代科技有限公司)4-μl分别用EcoR I和HindIII各为0.3，10×酶缓冲液2μl；用无菌水加到总体积为20μl，在37℃条件下消化1小时；试剂盒(北京天为时代科技有限公司)纯化回收DNA片段将扩增的FPS1-ORF和载体PUC18的双酶切产物分别从琼脂糖凝胶上切下，加3倍体积溶胶液，48℃水浴放置10min，300rpm振荡，使琼脂糖凝胶完全溶解，加到一个吸附柱CB中，13000rpm离心5min，倒掉收集管中的废液；加入700μl漂洗液PW中，13000rpm离心5min后弃废液，然后重复一次；取出吸附柱，放到离心管中，加入洗脱缓冲液22μl，室温放置1min，13000rpm离心3min；PUC18片段和FPS1-ORF基因片段的连接在20μl连接体系中，加入2μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl T4连接酶，FPS1-ORF基因片段和载体PUC18(图2)片段的加入量分别为5μl和6μl，加水至20μl体系，在16℃条件下连接3h，最后通过酶切验证得到PUC18-FPS1-ORF质粒(图3)、(图6)；(3)PUC18-FUF质粒的构建通过引物对PUC18-FPS1-ORF质粒进行PCR扩增，引物PUC18-F-上引为5’-ATTTTTCTGCAGTGAGAAAACAGACAAGAAAAAGA-3’；引物PUC18-F-下引为5’-AGGCTGTCAAGATGCATTAGAATGTACCCTCG-3’，以质粒PUC18-FPS1 ORF为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物为PUC18-FF，其两端各带有FPS1的450bp和120bp碱基，以YEPLac195(北京天为时代科技有限公司)质粒上的URA3基因为模板，引物URA3-上引为5’-GTC GAC TCTAGA GTA GTC TAG TAC CTC CTG TG-3’；引物URA3-下引为5’-GTC GAC CTG CAG GAA AAGTGC CAC CTG ACG TC-3’，引物进行PCR扩增，得到的PCR产物为URA3-ORF，两套引物上都分别含有PST I和Xba I酶切位点；所述两套PCR产物分别用PST I和Xba I双酶消化，T4连接酶连接，然后转化到提前制备成感受态的大肠杆菌-E.coli Top10中，提质粒进行酶切电泳验证，得到PUC18-FUF质粒(图4)；(4)KAM-21菌株的构建对PUC18-FUF质粒进行双酶消化将PUC18-FUF质粒用ECoR I和HindIII进行双酶消化得到两端分别带有FPS1同源片段和URA3标记基因，总长度为1.93kb DNA片段(图5)；1.93kb DNA片段转化到酵母细胞内与转化子的筛选将待转化的URA3缺陷型酵母菌株KAM-20转接到装有5ml YPD培养液的试管中，30℃200rpm 8小时培养，13000rpm30s离心收集菌体，用1ml无菌水清洗细胞；将一管SS-担体DNA(Sigma-Aldrich公司)沸水煮沸3min，放到冰上保持1min；往离心管中加入转化混合物，所述转化混合物为重量体积百分比为50％的3500PEG 240μl；1.0M醋酸锂36μl；浓度为2mg/ml的SS-担体DNA50μl；1.93kb DNA片段34μl；振荡混匀，置于预热的42℃水浴中30min；13000rpm离心30s收集菌体；用100μl无菌水重悬菌体，涂布于省却特定氨基酸成分的CM*平板上，26℃培养，将2天后培养基上长出的菌落进行染色体提取通过PCR的方法进行验证，电泳后片段大小为1.93kb的转化子为正确的，即得到了一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株-KAM-21(图8)。
*13完全极限(CM)省却成分培养基(g/L)YNB6.7；葡萄糖20，Dropout Power0.83Dropout Power成分如下腺嘌呤 50mg/L 亮氨酸 100mg/L精氨酸 20 赖氨酸 30天冬氨酸100甲硫氨酸20谷氨酸 100苯丙氨酸50组氨酸 100丝氨酸 150异亮氨酸30 苏氨酸 150色氨酸 100酪氨酸 30尿嘧啶 50 颉氨酸 150省却特定的氨基酸成分，液培PH5.6，固体培养基加1.5％琼脂PH调到6.5。
注以上培养基的灭菌条件均为121℃，15min，其中葡萄糖需单独在115℃，30min条件下灭菌，配制成40％储存液，使用时按比例加入。
说明将2～3天后在省却特定氨基酸成分的CM平板上长出的菌落后，进行染色体提取通过PCR的方法进行验证，电泳片段大小为1.93kb的转化子为我们所要的一种甘油通道蛋白基因-FPS1缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株-KAM-21，而FPS1基因没有缺失的菌株的PCR产物的长度为2.7kb。
实施例2(1)酿酒酵母单倍体的获得及URA3基因的缺失酿酒酵母子囊孢子的形成取适量新活化的双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞均匀地涂在醋酸钾产子囊孢子培养基上，26℃条件下培养3天，在所述培养基酵母涂层上刮取适量的酵母细胞，溶解到装有50μl无菌水的1.5ml离心管中，加浓度为10mg/ml的蜗牛酶(zymolyase)10μl 37℃消化子囊壁10min，形成酿酒酵母子囊孢子溶液；酿酒酵母子囊孢子的拆分向装有形成酿酒酵母子囊孢子溶液的离心管中缓缓加入1ml无菌水，倒置4min，取其中50μl液体，滴加到YPD平板边缘上，倾斜平板，使细胞液在平板边缘形成条状，干燥后在显微操作仪上进行子囊孢子拆分，直接将玻璃针尖上的子囊孢子摆放到YPD培养平板上，30℃的条件下培养3天，将单个子囊孢子长出的菌落转接到YPD液体试管中培养，培养8小时，收集菌体进行染色体提取、电泳进行单倍体验证，电泳图上仅出现一条544bp或404bp电泳带，证明是单倍体，再经过发酵挑选优良的出发酵母菌株KAM-19；KAM-19菌株URA3基因的缺失步骤同实施例1(2)PUC18-FPS1-ORF质粒的构建酵母染色体的制备将双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)菌接种到含有5mlYPD培养液的试管中，30℃条件下振荡培养10小时，然后将培养液倒入1.5ml离心管中，12000rpm离心30sec后，弃掉上清液，沉淀用0.5ml无菌水重悬，然后12000rpm离心30sec，收集菌体；往装有菌体离心管中加入200μl破菌缓冲液重悬细胞，同时加入200μl体积玻璃珠和200μl PH＞7的苯酚或氯仿，振荡4min；加200μlTE缓冲液振荡，12000rpm离心5min，室温下将水相转移到一个干净的离心管中，加1ml无水乙醇，颠倒混匀；室温下12000rpm离心3min，弃掉上清液，沉淀用0.4mlTE缓冲液重悬；加3μl的1mg/mlRNA分解酶，混和均匀，37℃条件下温育5min；加10μl 3mol/L乙酸铵、1ml无水乙醇，颠倒混匀，室温下高速离心3min，弃上清液，干燥沉淀，用100μl TE缓冲液重悬，得到酵母染色体；扩增FPS1-ORF基因步骤同实施例1；PUC18和FPS1-ORF基因的消化将扩增的FPS1-ORF产物4μl和载体PUC18(图2)(北京天为时代科技有限公司)4-μl分别用EcoR I和HindIII各为0.25，10×酶缓冲液2μl；用无菌水加到总体积为20μl，在37℃条件下消化2小时；试剂盒(北京天为时代科技有限公司)纯化回收DNA片段将扩增的FPS1-ORF和载体PUC18的双酶切产物分别从琼脂糖凝胶上切下，加5倍体积溶胶液，50℃水浴放置5min，300rpm振荡，使琼脂糖凝胶完全溶解，加到一个吸附柱CB中，13000rpm离心5min，倒掉收集管中的废液；加入700μl漂洗液PW中，13000rpm离心5min后弃废液，然后重复一次；取出吸附柱，放到离心管中，加入洗脱缓冲液22μl，室温放置1min，13000rpm离心3min；PUC18片段和FPS1-ORF基因片段的连接在20μl连接体系中，加入2μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl T4连接酶，FPS1-ORF基因片段和载体PUC18(图2)片段的加入量分别为7μl和8μl，加水至20μl体系，在16℃条件下连接2h，最后通过酶切验证得到PUC18-FPS1-ORF质粒；(3)PUC18-FUF质粒的构建步骤同实施例1；(4)KAM-21菌株的构建对PUC18-FUF质粒进行双酶消化步骤同实施例1；1.93kb DNA片段转化到酵母细胞内与转化子的筛选将待转化的URA3缺陷型酵母菌株KAM-20转接到装有5ml YPD培养液的试管中，30℃200rpm 10小时培养，13000rpm30s离心收集菌体，用1ml无菌水清洗细胞；将一管SS-担体DNA(Sigma-Aldrich公司)沸水煮沸7min，放到冰上保持3min；往离心管中加入转化混合物，所述转化混合物为重量体积百分比为50％的3500PEG 240μl；1.0M醋酸锂36μl；浓度为2mg/ml的SS-担体DNA50μl；1.93kb DNA片段34μl；振荡混匀，置于预热的42℃水浴中30min；13000rpm离心30s收集菌体；用100μl无菌水重悬菌体，涂布于省却特定氨基酸成分的CM*平板上，32℃培养，将3天后培养基上长出的菌落进行染色体提取通过PCR的方法进行验证，电泳后片段大小为1.93kb的转化子为正确的，即得到了一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株-KAM-21。
实施例3(1)酿酒酵母单倍体的获得及URA3基因的缺失酿酒酵母子囊孢子的形成取适量新活化的双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞均匀地涂在醋酸钾产子囊孢子培养基上，30℃条件下培养2天，在所述培养基酵母涂层上刮取适量的酵母细胞，溶解到装有50μl无菌水的1.5ml离心管中，加浓度为20mg/ml的蜗牛酶(zymolyase)3μl 37℃消化子囊壁30min，形成酿酒酵母子囊孢子溶液；酿酒酵母子囊孢子的拆分步骤同实施例2；KAM-19菌株URA3基因的缺失步骤同实施例1；(2)PUC18-FPS1-ORF质粒的构建酵母染色体的制备步骤同实施例2；扩增FPS1-ORF基因步骤同实施例1；PUC18和FPS1-ORF基因的消化步骤同实施例2；试剂盒(北京天为时代科技有限公司)纯化回收DNA片段将扩增的FPS1-ORF和载体PUC18的双酶切产物分别从琼脂糖凝胶上切下，加2倍体积溶胶液，46℃水浴放置15min，300rpm振荡，使琼脂糖凝胶完全溶解，加到一个吸附柱CB中，13000rpm离心5min，倒掉收集管中的废液；加入700μl漂洗液PW中，13000rpm离心5min后弃废液，然后重复一次；取出吸附柱，放到离心管中，加入洗脱缓冲液22μl，室温放置1min，13000rpm离心3min；PUC18片段和FPS1-ORF基因片段的连接步骤同实施例2；(3)PUC18-FUF质粒的构建步骤同实施例1(4)KAM-21菌株的构建对PUC18-FUF质粒进行双酶消化步骤同实施例1；1.93kb DNA片段转化到酵母细胞内与转化子的筛选步骤同实施例2。
实施例4本发明的一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株KAM-21的发酵使用前将酵母菌株KAM-21划到YPD平板上2-3次进行活化处理。接种量为15-20％，可发酵性糖浓度为20-26％，发酵温度为30-35℃，进行厌氧发酵，pH为4.5-5.0，对发酵糖的最大耐受浓度为26％-28％；和目前工业酿酒酵母一样在淀粉质原料发酵液中补加一定量的营养盐，发酵38-42小时，每两个小时跟踪测定生物质生成量，每四个小时取样一次，离心后-20℃保存。
利用高效液相色谱-HPLC对葡萄糖消耗量、甘油生成量及乙醇产量进行测定。最后和野生型进行比较筛选出甘油生成量低、乙醇产量高的酿酒酵母菌株。
通过对KAM-21进行发酵实验，KAM-21的甘油生成量比野生型KAM-2降低了46％(图9)(表1)，乙醇产量提高了22.11％(图10)(表1)；同时降低乙醇精馏时的分离成本；另外可以减少乙醇生产厂家对环境的污染。降低乙醇生产成本，这对我国减少石油的进口、推动燃料汽油醇代替汽油项目在全国的普及、减少汽车对环境的污染有着重要的战略意义和环保意义。
表一甘油和乙醇的含量(g/100ml)
46.50％ 22.11％表一甘油和乙醇的含量表备注大肠杆菌E.coli Top 10(DH5a)北京天为时代科技有限公司1酿酒酵母工业用酿酒酵母2质粒PJJ242北京天为时代科技有限公司
3质粒PUC18北京天为时代科技有限公司4Yeplac195北京天为时代科技有限公司5引物上海博亚生物技术有限公司6DNA回收纯化试剂盒北京天为时代科技有限公司7担体DNA(Single-stranded DNA)Sigma-Aldrich公司8PEG400050％PEG 80％(v/v)10×TE(PH7.5)10％10×乙酸锂贮液10％9LB液体培养基(g/L)胰化蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，PH7.510LB固体培养基在LB液体培养基中加入1.5％(w/v)琼脂粉11YPD液体培养基(g/L)酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20，PH自然12YPD固体培养基在YPD液体培养基中加入1.5％(w/v)琼脂粉13醋酸钾产子囊孢子培养基(w/v)KAc 1％，酵母提取物0.1％，葡萄糖0.05％，1.5％(w/v)琼脂粉。
权利要求
1.一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征包括如下步骤(1)酿酒酵母单倍体的获得及URA3基因的缺失酿酒酵母子囊孢子的形成取适量新活化的双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞均匀地涂在醋酸钾产子囊孢子培养基上，26℃～30℃培养2～3天，在所述培养基酵母涂层上刮取适量的酵母细胞，溶解到装有50μl无菌水的1.5ml离心管中，加入浓度为10～20mg/ml的蜗牛酶3～10μl，37℃消化子囊壁10～30min；酿酒酵母子囊孢子的拆分向上述离心管中缓缓加入1ml无菌水，倒置1～4min，取30～50μl液体，滴到YPD平板边缘上，倾斜平板使细胞液在平板边缘形成条形状，干燥后在显微操作仪上进行子囊孢子拆分，直接将玻璃针尖上的子囊孢子摆放到YPD培养平板上，30℃的条件下培养2～3天，将单个子囊孢子长出的菌落转接到YPD液体试管中培养，培养7-8小时，收集菌体进行染色体提取、电泳进行单倍体验证，电泳图上仅出现一条544bp或404bp电泳带，证明是单倍体，再经过发酵挑选优良的出发酵母菌株KAM-19；KAM-19菌株URA3基因的缺失对质粒PJJ242中编码URA3基因的DNA片段用Nco I单酶消化，用Klenow大片段补平，再用T4连接酶进行平末端连接，得到含有失活URA3片段的PJJ242质粒；用HindIII限制性内切酶把所述失活的URA3基因切下，采用醋酸锂方法将所述失活的URA3基因转化到酵母细胞KAM-19中进行基因重组，使KAM-19染色体上的URA3基因由质粒PJJ242上失活的URA3基因取代，将转化的酵母细胞涂在5-氟乳清酸平板上，凡是在该平板上生长出的酵母菌株为URA3缺陷型菌株-KAM-20；(2)PUC18-FPS1-ORF质粒的构建酵母染色体的制备将双倍体酿酒酵母(S.cerevisiae)菌接种到含有5mlYPD培养液的试管中，30℃条件下振荡培养8-10小时，然后将培养液倒入1.5ml离心管中，12000rpm离心30sec后，弃掉上清液，沉淀用0.5ml无菌水重悬，然后12000rpm离心30sec，收集菌体；往装有菌体离心管中加入200μl破菌缓冲液重悬细胞，同时加入200μl体积玻璃珠和200μl PH＞7的苯酚或氯仿，振荡3～4min；加200μlTE缓冲液振荡，12000rpm离心5min，室温下将水相转移到一个干净的离心管中，加1ml无水乙醇，颠倒混匀；室温下12000rpm离心3min，弃掉上清液，沉淀用0.4mlTE缓冲液重悬；加3μl的1mg/mlRNA分解酶，混和均匀，37℃条件下温育5min；加10μl 3mol/L乙酸铵、1ml无水乙醇，颠倒混匀，室温下高速离心3min，弃上清液，干燥沉淀，用100μlTE缓冲液重悬，得到酵母染色体；扩增FPS1-ORF基因根据酿酒酵母染色体上FPS1基因序列设计引物，FPS1-上引为5’-CCCGGGGAATTCTAGTAGGAGAGCAGAGTGTC-3’，FPS1-下引为5’-TATAGTAGGTGACCAGGCTG-3’；PCR反应体系为上、下引物均为1μl；200μM的dNTP4μl；缓冲液5μl；所述酵母染色体为模板0.5μl；双蒸水38.25μl；聚合酶0.25μl，PCR反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30sec；58℃退火30sec；72℃延伸1min；得到PCR扩增产物FPS1-ORF基因；PUC18和FPS1-ORF基因的消化将扩增的FPS1-ORF产物4μl和载体PUC18 4-μl分别用EcoR I和HindIII各为0.25～0.5μl，10×酶缓冲液2μl；用无菌水将总体积补加到20μl，在37℃条件下消化1～2小时；试剂盒纯化回收DNA片段将扩增的FPS1-ORF和载体PUC18的双酶切产物分别从琼脂糖凝胶上切下，加2-5倍体积溶胶液，46～50℃水浴放置5～15min，300rpm振荡，使琼脂糖凝胶完全溶解，加到一个吸附柱中，13000rpm离心5min，倒掉收集管中的废液；加入700μl漂洗液中，13000rpm离心5min后弃废液，然后重复一次；取出吸附柱，放到离心管中，加入洗脱缓冲液22μl，室温放置1min，13000rpm离心3min；PUC18片段和FPS1-ORF基因片段的连接在20μl连接体系中，加入2μl 10×T4连接酶缓冲液，1μl T4连接酶，FPS1-ORF基因片段和载体PUC18片段的加入量分别为5-7μl和6-8μl，加水至20μl体系，在16℃条件下连接2～3h，通过酶切验证得到PUC18-FPS1-ORF质粒；(3)PUC18-FUF质粒的构建通过引物对PUC18-FPS1-ORF质粒进行PCR扩增，引物PUC18-F-上引为5’-ATTTTTCTGCAGTGAGAAAACAGACAAGAAAAAGA-3’；引物PUC18-F-下引为5’-AGGCTGTCAAGATGCATTAGAATGTACCCTCG-3’，以质粒PUC18-FPS1 ORF为模板进行PCR扩增，得到的PCR产物为PUC18-FF，其两端各带有FPS1的450bp和120bp碱基，以YEPLac195质粒上的URA3基因为模板，引物URA3-上引为5’-GTC GAC TCT AGA GTA GTC TAG TAC CTCCTG TG-3’；引物URA3-下引为5’-GTC GAC CTG CAG GAA AAG TGC CAC CTG ACG TC-3’，引物进行PCR扩增，得到的PCR产物为URA3-ORF，两套引物上都分别含有PST I和BamHI酶切位点；所述两套PCR产物分别用PST I和Xba I双酶消化，T4连接酶连接，然后转化到提前制备成感受态的大肠杆菌Top10中，提质粒进行酶切电泳验证，得到PUC18-FUF质粒；(4)KAM-21菌株的构建对PUC18-FUF质粒进行双酶消化将PUC18-FUF质粒用ECoR I和HindIII进行双酶消化得到两端分别带有FPS1同源片段和URA3标记基因，总长度为1.93kb DNA片段；1.93kb DNA片段转化到酵母细胞内与转化子的筛选将待转化的URA3缺陷型酵母菌株KAM-20转接到装有5ml YPD培养液的试管中，30℃200rpm 8-10小时培养，13000rpm30s离心收集菌体，用1ml无菌水清洗细胞；将一管SS-担体DNA沸水煮沸3-7min，放到冰上保持1-3min；往离心管中加入转化混合物，所述转化混合物为重量体积百分比为50％的3500PEG 240μl；1.0M醋酸锂36μl；浓度为2mg/ml的SS-担体DNA50μl；1.93kb DNA片段34μl；振荡混匀，置于预热的42℃水浴中30min；13000rpm离心30s收集菌体；用100μl无菌水重悬菌体，涂布于省却特定氨基酸成分的CM平板上，26-32℃培养，将2～3天后培养基上长出的菌落进行染色体提取通过PCR的方法进行验证，电泳后片段大小为1.93kb的转化子为正确的，即得到了一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株-KAM-21。
2.一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株，其特征是按权利要求1的方法构建的。
全文摘要
本发明公开了一种甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株及构建方法，构建方法包括如下步骤(1)酿酒酵母单倍体的获得及URA3基因的缺失；(2)PUC18－FPS1－ORF质粒的构建；(3)PUC18－FUF质粒的构建；(4)KAM－21菌株的构建，本发明采用基因工程技术缺失编码镶嵌在细胞膜上的甘油通道蛋白FPS1基因，丧失FPS1基因的表达，由于细胞膜上没有甘油通道蛋白Fpslp，细胞内产生的甘油无法分泌到细胞外而在细胞内积累，甘油合成途径受到细胞内积累的甘油反馈抑制，甘油代谢向乙醇代谢转换，增加了乙醇产量，解决了乙醇生产成本高、发酵周期长、对环境污染严重等系列问题。
文档编号C12R1/865GK1763175SQ20051001472
公开日2006年4月26日 申请日期2005年8月8日 优先权日2005年8月8日
发明者马平生, 张爱利, 孔庆学, 赵学明 申请人:天津大学