一种检测猪产仔数性状的方法

专利名称：一种检测猪产仔数性状的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测猪产仔数性状的方法。
背景技术：
寻找产仔数候选基因，将该基因作为高产仔遗传标记应用于猪品质的遗传改良，是目前和今后应用分子生物学技术对猪进行品种改良的研究热点。候选基因可根据生物及生理学的知识来选择，也可根据在人类和小鼠基因组分析研究中所揭示出的基因与性状的关系来选择，选取那些在家畜生长发育过程中对目标性状有影响的基因，再分析这些基因在目标性状表型差异较大的品种或个体间的变异，最后在分子生物学水平上验证这些基因的变异对目标性状表型变异的决定作用，并在候选基因中寻找与性状表型变异相关的DNA信息作为标记。对于动物繁殖性状的改良，候选基因法具有明显的优势。
TGF-β1是一种对胚胎早期死亡有重要影响的细胞因子。Ruegsegger等和Mau等分别在人、猪卵泡液中检测到TGF-β1，认为在卵泡发生过程中，TGF-β1及其受体和Smads信号蛋白在卵巢的表达显示该因子在卵巢功能中可能的重要作用(Ruegsegger VC，Assoian RK.Identification of transforming growth factor-βin human ovarian follicular fluid.Endocrinology，1988，1221227.)。FriedG等证实在人类体外受精情况下，在卵泡液中TGFβ1的含量与妊娠成功率呈正相关(Fried G，Wramsby H.Increase in transforming growth factor beta 1 in ovarianfollicular fluid following ovarian stimulation and in-vitro fertilizationcorrelates to pregnancy.Hum Reprod 1998，13656-659.)。
TGF-β1在妊娠早期即在子宫内膜上皮细胞表达的作用主要是增强胚泡与子宫内膜的黏附性。TGF-β1能促进细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的重要组成成分母胎界面癌胚纤维粘连蛋白(oncofetal fibronectin，onfFN)、胶原蛋白(collagen)的表达，还能够促进纤溶酶原激活物抑制因子和基质金属蛋白酶组织抑制因子的表达(Guller S，LaCroix NC，Kirkun G et al.Steroid regulation ofoncofetal fibronectin expression in human cytotrophoblasts.J Steroid BiochemMol Biol，1993，46(1)1-10)。抑制ECM的降解，可提高细胞外基质胶原的含量，促进滋养层细胞与细胞间质粘连，从而增强胚胎滋养层与子宫内膜的黏附程度，有利于胚胎附植。TGF-β1还可调控细胞表面分子整合素(integrin)的合成，可通过调控整合素而参与胚泡滋养层与子宫内膜的黏附(Milner R and Campbell I.L.TheExtracellular Matrix and Cytokines Regulate Microglial Integrin Expressionand Activation.J.Immunol.，2003，170(7)3850-3858.)。Integrin是FN等黏附蛋白的受体，可介导细胞之间、细胞与基质之间的相互识别和相互粘附。
在胚泡的发育、植入过程中，还伴随着胎盘的发育。胎盘中有大量的毛细血管网络，使得营养物质得以在胎儿和母体之间交换，为胎儿生长发育所必需。关于TGF-β1对血管形成的作用，Dickson等在小鼠TGF-β1无效突变模型中证实，TGF-β1通过阻断内皮细胞的分化而导致胎盘毛细血管网络形成发生障碍，胎儿在妊娠10.5天时死亡(Dickson MC，Martin JS，Cousins FM，et al.Defective haematopoiesisand vasculogenesis in transforming growth factor-beta 1 knock out mice.Development，1995，1211845-1854.)。Chung等的研究表明人妊娠早期胚胎滋养层细胞系产生的血管内皮生长因子受TGF-β1的正向调节，由此促进胎盘形成中血管的发育，调控胎盘血管通透性，在胚胎着床和胎盘形成中起到重要作用(Chung IB，Yelian FD，Zaher FM，et al.Expression and regulation of vascular endothelialgrowth factor in a first trimester trophoblast cell line.Placenta，2000，21(4)320-324.)。
Medawar于1956年提出胎儿可看作母体半异己的异体移植物的概念，认为妊娠是一种半同种异体移植过程。由于胚胎抗原特性的存在，母体免疫系统尤其是子宫局部的免疫细胞就可能识别胚胎抗原，并产生免疫应答，引起母体对胎儿的排斥，对妊娠的建立与维持产生不良影响。近年来生殖免疫学方面的研究表明，正常妊娠是一种特殊类型的外周免疫耐受，这种免疫耐受的形成与母-胎交界面的蜕膜细胞分泌的细胞因子网络平衡直接相关。
蜕膜分泌的细胞因子依照其免疫学作用可分为Th1和Th2两类。Th1型细胞因子有IL-2、IFN-γ、TNF-α、GM-CSF、TNF-β、淋巴毒素等，参与细胞介导的免疫应答，从而抑制胚胎着床、滋养细胞生长、胎盘发育及功能、胚胎发育和胎儿存活，导致流产的发生；Th2型细胞因子有IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、CM-CSF等，Th2型细胞因子可抑制Th1型细胞因子介导的免疫应答，防止对滋养细胞和胎儿的继发损伤。
正常妊娠的维持既需要Th1型细胞因子，也需要Th2型细胞因子，Th1和Th2型细胞因子保持动态平衡，使子宫局部形成特殊的免疫微环境，既可保证胎儿正常发育，又避免其被母体免疫排斥。妊娠早期Th1/Th2型细胞因子动态平衡的调节机制目前还不清楚，但母-胎界面存在着大量的TGF-β1，在免疫耐受的形成中发挥着重要作用。TGF-β1具有强大的免疫抑制作用，可抑制细胞毒性T淋巴细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤样T细胞的产生及T细胞增殖。还可下调粘附分子及抑制白细胞粘附到内皮细胞上，在其它抑制分子的共同作用下，使一些免疫豁免部位和重要器官维持在免疫耐受状态。
研究证实，TGF-β1可起着转换的作用，对抗和改变其它细胞因子的活动(Lois AS，Evdokia D，Robb M，et al.Cytokines in Implantation.J Semin Reprod Med，2000，18(3)299.)。由此推断蜕膜组织中产生的TGF-β1有助于诱导和维持有益于胎盘功能和胎儿生长的母体免疫反应(Wendy V I，Sarah A R.Defining the actionsof transforming growth factor beta in reproduction.BioEssays，2002，24904-914)。
尽管TGF-β1与Th1/Th2平衡转换的关系还有待于进一步研究，但在动物模型的免疫治疗中已取得较好的疗效(邱丽华.原因不明复发性流产与TH1/TH2型细胞因子.国外医学计划生育分册，2000，1920-23.)。
赵爱民等发现小鼠蜕膜转化生长因子TGF-β1mRNA表达与胚胎丢失率具有高度的相关性(赵爱民，林其德，于甬中.蜕膜转化生长因子-βmRNA表达与自然流产的相关性研究.现代妇产科进展，2002，11(2)113-115.)。在妊娠12-15天时，自然流产模型组胚胎丢失率为30.00％，显著高于正常妊娠模型组的4.54％(p＜0.05)，自然流产模型组蜕膜中TGF-β1mRNA表达的扫描灰度为44.52±9.28，明显低于正常妊娠模型组的117.97±3.11(p＜0.001)。提示蜕膜局部TGF-β1的减少除了可严重影响子宫内相关细胞的生长分化外，还可能由于它的缺失，削弱了妊娠期蜕膜局部应有的免疫抑制状态，相对增强了母体对胚胎抗原的免疫应答，产生异常的免疫排斥反应，导致流产的发生。
Moussad等对母猪妊娠早期母—胎界面TGF-β1的表达情况进行了研究，结果显示，妊娠第10天，腔上皮细胞和腺上皮细胞中可检测到TGF-β1mRNA和蛋白质，延伸卵球呈现TGF-β1强阳性，TGF-β1出现在胚外滋养层、内胚层和内细胞团。妊娠第12天，在与胚胎外膜联系不紧密的区域，腔上皮细胞、腺上皮细胞、间质细胞和内膜细胞中显示出大量的TGF-β1，但靠近胚外膜或与胚外膜直接融合的部位，腔上皮细胞中的TGF-β1显著下调。TGF-β1表达下降的区域集中在细胞外基质显著重建和下层间质胶原质降解部位，由此导致大量皮下毛细血管网的发育。同时延伸胚泡的滋养层细胞也显示出TGF-β1mRNA表达下调，检测不到TGF-β1蛋白。妊娠第14天和第17天，腔上皮细胞中又有TGF-β1的表达，这时子宫和胚外膜间的紧密融合已经建立。第17天，腔上皮细胞中TGF-β1很低甚至检测不到，但上皮下的间质和内膜细胞中却有中等偏上的表达。胚外膜中对这两种分子的染色呈部分或全部阳性到第21天，随着母体紧密融合的建立，相关的间质重组和血管形成已大致完成，这时，上皮细胞产生的TGF-β1较高，达到定植前的表达量。研究发现TGF-β1也可由血管皮下间质和胎盘膜细胞产生，胎盘膜细胞产生的mRNA浓度超过在腔上皮细胞中的表达。TGF-β1的这种变化与猪所具有的疏散型上皮绒毛膜胎盘特点相适应(Moussad EE-DA，Rageh M A，Wilson A K，et al.Temporal and spatial expression of connectivetissue growth factor(CCN2；CTGF)and transforming growth factor beta type1(TGF-beta1)at the utero-placental interface during early pregnancy in thepig.Mol Pathol，2002，55(3)186-192.)。该报道肯定了TGF-β1在猪妊娠早期子宫母胎界面的存在和变化，可惜没有对其功能即TGF-β1对胚胎存活率或产仔数的影响作出研究。
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换(transition)或颠换(transversion)所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。但通常所说的SNP并不包括后两种情况。这种变异可能是转换(C→T，在其互补链上则为G→A)，也可能是颠换(C→A，G→T，C→G，A→T)。转换的发生率总是明显高于其它几种变异，具有转换型变异的SNP约占2/3，其它几种变异的发生几率相似。
SNP检测方法常采用一些已有的成熟技术，如DNA测序、单链构象多态性(SSCP)、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交(ASO)等，也采用根据DNA列阵的微测序法、动态等位基因特异的杂交、寡聚核苷酸特异的连接、DNA芯片以及TaqMan系统等。但不管哪一种方法，首先必须进行靶序列的扩增，然后才能进行其它检测。
研究表明TGF-β1对胚胎的早期死亡有重要影响，但对猪TGF-β1基因的研究，目前只是将该基因定位于6q11-q21，并克隆得到猪TGF-β1的cDNA和第四、六内含子序列，猪TGF-β1的前体基因由7个外显子和6个内含子组成(Kondaiah P，Obberghen-Schilling E Van，Ludwig RL，et al.CDNA cloning of porcinetransforming growth factor-beta 1 mRNAs.Evidence for alternate splicing andpolyadenylation.J.Biol.Chem.，1988，26318313-18317.)。迄今为止，国内外关于猪TGF-β1基因多态性的报道还不多见，只有2002年Wimmers等以杜洛克猪、皮特兰猪、德国长白猪和柏林小型猪(Berlin-Miniature Pig)为研究材料，通过PCR-SSCP检测到皮特兰猪、柏林小型猪的TGF-β1基因的第5外显子自5’端第798位碱基(AccNumberAF461808)存在到一个单核苷酸多态(SNP)，但未和功能联系起来(Wimmers K，Chomdej S，Ponsuksili S，et al.Polymorphism in the porcinetransforming growth factor-β1 gene.Anim Genet，2002 33224-248.)。

发明内容
本发明的目的是提供一种利用猪转化生长因子β1(TGF-β1)基因的单核苷酸多态性检测猪产仔数性状的方法。
本发明所提供的检测猪产仔数性状的方法，是用下述至少一种方法对待测猪的转化生长因子β1基因进行单核苷酸多态性检测1)PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因第四内含子的核苷酸序列，确定自5’端第33位碱基为C还是T；2)PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因第六内含子的核苷酸序列，确定自5’端第179位碱基为G还是A；3)PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因的3’端非翻译区，确定自5’端第414位和第418位碱基，即待测猪的转化生长因子β1基因的cDNA序列自5’端第2490位和第2494位碱基同为A还是同为G。
PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因第四内含子的核苷酸序列所用的引物对可为序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2；PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因第六内含子的核苷酸序列所用的引物对可为序列表中的SEQ ID NO3和SEQ ID NO4；PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因的3’端非翻译区所用的引物对可为序列表中的SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
检测方法1)中，如果待测猪的转化生长因子β1基因第四内含子的核苷酸序列中自5’端第33位碱基为C时，其纯合体的基因型为AA；如果待测猪的转化生长因子β1基因第四内含子的核苷酸序列中自5’端第33位碱基为T时，其纯合体的基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB。
检测方法2)中，如果待测猪的转化生长因子β1基因第六内含子的核苷酸序列中自5’端第179位碱基为G时，其纯合体的基因型为AA；如果待测猪的转化生长因子β1基因第四内含子的核苷酸序列中自5’端第179位碱基为A时，其纯合体的基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB。
检测方法3)中，如果待测猪的转化生长因子β1基因的3’端非翻译区自5’端第414位和第418位碱基，即待测猪的转化生长因子β1基因的cDNA序列中自5’端第2490位和第2494位碱基同为A时，其纯合体的基因型为AA；如果待测猪的转化生长因子β1基因的3’端非翻译区自5’端第414位和第418位碱基，即自待测猪的转化生长因子β1基因的cDNA序列中自5’端第2490位和第2494位碱基同为G时，其纯合体的基因型为BB；它们的杂合体基因型为AB。
为提高检测结果的准确性，可用上述三种方法共同进行检测，如果待测猪的转化生长因子β1基因第四内含子的核苷酸序列中自5’端第33位碱基为C，第六内含子的核苷酸序列中自5’端第179位碱基为G，3’端非翻译区自5’端第414位和第418位碱基，即待测猪的转化生长因子β1基因的cDNA序列中自5’端第2490位和第2494位碱基同为A时，构成的基因型为CC；如果待测猪的转化生长因子β1基因第四内含子的核苷酸序列中自5’端第33位碱基为T，第六内含子的核苷酸序列中自5’端第179位碱基为A，3’端非翻译区自5’端第414位和第418位碱基，即待测猪的转化生长因子β1基因的cDNA序列中自5’端第2490位和第2494位碱基同为G时，构成的基因型为KK；它们的杂合体基因型为CK。
上述基因型中，BB基因型个体的产仔数高于AB基因型和AA基因型，BB基因型个体的产仔数显著高于AB基因型；KK基因型个体的产仔数高于CK基因型和CC基因型，KK基因型个体的产仔数显著地高于CK基因型的个体。
所述检测方法中的PCR反应体系可为10×PCR扩增缓冲液1.5μL，4×dNTP混合物(4×2.5mmol/L)1.2μL，上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，猪基因组DNA(100ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(3u/μL)0.3μL，ddH2O 10.5μL。PCR反应条件可为先95℃5min；再94℃1min，55-70℃ 15-20sec，72℃20sec，共进行39个循环；最后72℃7min。
本发明提供了一种利用猪转化生长因子β1(TGF-β1)基因的单核苷酸多态性检测猪产仔数性状的方法，实验证明TGF-β1基因对产仔数有一定影响，可以作为产仔数后选基因或产仔数遗传标记，对于全面揭示高产仔数机理，提高选择准确性具有重要的理论意义和学术价值，所发现的TGF-β1基因的三个多态性位点(含4个SNP)为猪的不同基因型的分型、筛选及辅助育种提供了有用的分子标记，其选择、改变对于提高母猪产仔数具有重要意义。本发明将在猪的育种中发挥巨大作用。


图1为利用TGF-β1基因第四内含子C33的多态性位点对猪产仔数性状进行检测的结果图2为利用TGF-β1基因第六内含子G179的多态性位点对猪产仔数性状进行检测的结果图3为利用TGF-β1基因cDNA的3’端非翻译区的G2490和G2494多态性位点对猪产仔数性状进行检测的结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、TGF-β1基因多态性位点的获得依据已报道的猪TGF-β1基因的第四内含子序列(GenBank号AF461809)、第六内含子序列(GenBank号AJ621785)和cDNA序列(GenBank号M23703；全长3206bp)中自5’端第2301-第2705位的3’端非翻译区序列设计三对引物，引物序列如下TGF-β1Intron4F(上游引物)5’-CTCAGTGCCCACTGTTCCTGTGA-3’(序列表中的SEQ ID NO1)TGF-β1Intron4R(下游引物)5’-GGATAGGGTTGGGGGAGACATACA-3’(序列表中的SEQ ID NO2)；TGF-β1Intron6F(上游引物)5’-CAGTACAGCAAGGTGCGTCTGG-3’(序列表中的SEQ ID NO3)TGF-β1Intron6R(下游引物)5’-GCTATGCCACCAGGGAACTCTC-3’(序列表中的SEQ ID NO4)；TGF-β1UTR3F(上游引物)5’-AAAGGGACTCTGATAACACC-3’(序列表中的SEQ IDNO5)TGF-β1UTR3R(下游引物)5’-GCACCTGAGACATATGGAAG-3’(序列表中的SEQ IDNO6)。
选择大白猪、长白猪、皮特兰猪和圣特西猪四种引入猪种和中国地方良种二花脸猪的耳组织样，按照常规方法提取基因组DNA，并以此为模板，分别在上述三对引物的引导下，进行PCR扩增，15μL PCR反应体系为10×PCR扩增缓冲液1.5μL，4×dNTP混合物(4×2.5mmol/L)1.2μL，上、下游引物(20pmol/μL)各0.25μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(3u/μL)0.3μL，ddH2O 10.5μL。PCR反应条件为先95℃5min；再94℃1min，55-70℃ 15-20sec，72℃20sec，共进行39个循环；最后72℃7min。反应结束后，用V-gene凝胶纯化试剂盒(购自V-gene Biotechonology Limited)回收三种PCR扩增产物，用将其分别克隆入载体pMD18-T(购自TaKaRa宝生物工程有限公司)中，使用ABI PRISM377 DNA测序仪进行测序，测序结果表明三种PCR产物中各含有一个多态性位点，获得的多态性位点分布如表1所示，C33表示位于TGF-β1基因第四内含子序列的自5’端第33位碱基为突变位点，存在C/T两种等位基因，参考序列AF461809中该位点的等位基因为C；G179表示位于TGF-β1基因第六内含子序列的自5’端第179位碱基为突变位点，存在G/A两种等位基因，参考序列AJ621785中该位点的等位基因为G；G2494和G2494表示位于TGF-β1基因cDNA的3’端非翻译区中自5’端第2490位和第2494位为连锁突变位点，存在GG/AA两种等位基因，参考序列M23703中两个位点的等位基因为AA。
表1 TGF-β1基因的多态性位点核苷酸多态性位点GenBank序列号内含子4 C33 AF461809内含子6 G179 AJ6217853’端非翻译区 A2490，A2494 M23703实施例2、利用TGF-β1基因第四内含子C33的多态性位点对猪产仔数性状进行检测以大白猪、长白猪、皮特兰猪和圣特西猪四种引入猪种和中国地方良种二花脸猪的基因组DNA为模板，在引物TGF-β1Intron4F和引物TGF-β1Intron4R的引导下，进行PCR扩增，15μL PCR反应体系为10×PCR扩增缓冲液1.5μL，4×dNTP混合物(4×2.5mmol/L)1.2μL，引物TGF-β1Intron4F和TGF-β1Intron4R(20pmol/μL)各0.25μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(3u/μL)0.3μL，ddH2O 10.5μL。PCR反应条件为先95℃5min；再94℃1min，63℃20sec，72℃20sec，共进行39个循环；最后72℃7min。反应结束后，取2μL PCR产物置于PCR管中，加8μL变性缓冲液(按10mL体积配比98％去离子甲酰胺9.8mL、2％0.5MEDTA(pH8.0)0.2mL、0.025％溴酚兰、0.025％二甲苯青)，98℃变性10min后，迅速冰浴10min，然后对经变性的PCR扩增产物进行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压100V，电泳时间18-20h)，银染显色，结果如图1所示，存在三种基因型，分别为AA、BB和AB，其中AA基因型的TGF-β1基因第四内含子序列自5’端第33位碱基为C，BB基因型的TGF-β1基因第四内含子序列自5’端第33位碱基为T。上述不同猪种TGF-β1内含子4中多态性位点C33的基因型频率和等位基因频率如表2所示表2 不同猪种TGF-β1 C33的基因型和等位基因频率检测个体 基因型频率等位基因频率品种数AA AB BBA B
大白猪 567 0.4750.4260.099 0.6910.309长白猪 174 0.9660.0340 0.9830.017皮特兰猪390.9490.0510 0.9740.026圣特西猪560.5890.3570.054 0.7680.232二花脸猪340.1760.3240.50 0.3380.662表2数据显示长白猪、皮特兰猪未出现BB基因型，而AA基因型的频率分别达到0.966和0.949。在长白猪、大白猪、皮特兰猪和圣特西四种引入猪种中，以等位基因A为主，而在中国地方猪种二花脸中则以等位基因B为主，二花脸猪是以高产仔闻名于国内外的猪种，长白猪、大白猪、皮特兰猪和圣特西猪的产仔数不及二花脸多，表明可利用猪转化生长因子β1基因第四内含子序列自5’端第33位碱基为C还是T对猪的产仔数性状进行检测。
实施例3、利用TGF-β1基因第六内含子G179的多态性位点对猪产仔数性状进行检测以大白猪、长白猪、皮特兰猪和圣特西猪四种引入猪种和中国地方良种二花脸猪的基因组DNA为模板，在引物TGF-β1Intron6F和引物TGF-β1Intron6R的引导下，进行PCR扩增，15μL PCR反应体系为10×PCR扩增缓冲液1.5μL，4×dNTP混合物(4×2.5mmol/L)1.2μL，引物TGF-β1Intron6F和TGF-β1Intron6R(20pmol/μL)各0.25μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(3u/μL)0.3μL，ddH2O 10.5μL。PCR反应条件为先95℃5min；再94℃1min，66℃15sec，72℃20sec，共进行39个循环；最后72℃7min。反应结束后，取2μL PCR产物置于PCR管中，加8μL变性缓冲液(按10mL体积配比98％去离子甲酰胺9.8mL、2％0.5MEDTA(pH8.0)0.2mL、0.025％溴酚兰、0.025％二甲苯青)，98℃变性10min后，迅速冰浴10min，然后对经变性的PCR扩增产物进行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压100V，电泳时间12-14h)，银染显色，结果如图2所示，存在三种基因型，分别为AA、BB和AB，其中AA基因型的TGF-β1基因第六内含子序列自5’端第179位碱基为G，BB基因型的TGF-β1基因第六内含子序列自5’端第179位碱基为A。上述不同猪种TGF-β1内含子6中多态性位点G179的基因型频率和等位基因频率如表3所示表3 不同猪种TGF-β1 G179的基因型和等位基因频率基因型频率 等位基因频率品种检测头数AAAB BB AB
大白猪 567 0.4770.4280.0950.6910.309长白猪 174 0.9710.02900.9860.014皮特兰猪390.9230.07700.9620.038圣特西猪560.5890.3570.0540.7680.232二花脸猪340.1760.3240.50 0 3380.662表3数据显示长白猪、皮特兰猪未出现BB基因型，而AA基因型的频率分别达到0.971和0.923。在长白猪、大白猪、皮特兰猪和圣特西四种引入猪种中，以等位基因A为主，而在中国地方猪种二花脸中则以等位基因B为主，二花脸猪是以高产仔闻名于国内外的猪种，长白猪、大白猪、皮特兰猪和圣特西猪的产仔数不及二花脸多，表明可利用猪转化生长因子β1基因第六内含子序列自5’端第179位碱基为G还是A对猪的产仔数性状进行检测。
实施例4、利用TGF-β1基因cDNA的3’端非翻译区的A2490和A2494多态性位点对猪产仔数性状进行检测以大白猪、长白猪、皮特兰猪和圣特西猪四种引入猪种和中国地方良种二花脸猪的基因组DNA为模板，在引物TGF-β1UTR3F和引物TGF-β1UTR3R的引导下，进行PCR扩增，15μL PCR反应体系为10×PCR扩增缓冲液1.5μL，4×dNTP混合物(4×2.5mmol/L)1.2μL，引物TGF-β1UTR3F和TGF-β1UTR3R(20pmol/μL)各0.25μL，模板DNA(100ng/μL)1μL，Taq DNA聚合酶(3u/μL)0.3μL，ddH2O10.5μL。PCR反应条件为先95℃5min；再94℃1min，61.8℃20sec，72℃20sec，共进行39个循环；最后72℃7min。反应结束后，取2μL PCR产物置于PCR管中，加8μL变性缓冲液(按10mL体积配比98％去离子甲酰胺9.8mL、2％0.5M EDTA(pH8.0)0.2mL、0.025％溴酚兰、0.025％二甲苯青)，98℃变性10min后，迅速冰浴10min，然后对经变性的PCR扩增产物进行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(电压100V，电泳时间20-22h)，银染显色，结果如图3所示，存在三种基因型，分别为AA、BB和AB，其中AA基因型的TGF-β1基因cDNA的3’端非翻译区自5’端第2490位和第2494位碱基同为A，BB基因型的TGF-β1基因cDNA的3’端非翻译区自5’端第2490位和第2494位碱基同为G。由于该扩增片段的SSCP带型呈现出的是典型的两个等位基因位点所具有的三种基因型条带，没有出现其它带型，说明这两个SNP位点是连锁的，因此可以把它们看作一个多态性位点，记为A2490+A2494。上述不同猪种TGF-β13’端非翻译区多态性位点的基因型频率和等位基因频率如表4所示表4 不同猪种中TGF-β1 A2490+A2494的基因型和等位基因频率基因型频率等位基因频率品种检测头数AA AB BB A B大白猪5670.4820.4240.0940.695 0.305长白猪1740.9790.02100.990 0.010皮特兰猪 39 0.9490.05100.974 0.026圣特西猪 56 0.6070.3210.0710.768 0.232二花脸猪 34 0.1760.3240.50 0.338 0.662表4数据显示长白猪、皮特兰猪未出现BB基因型，而AA基因型的频率分别达到0.979和0.949。在长白猪、大白猪、皮特兰猪和圣特西四种引入猪种中，以等位基因A为主，而在中国地方猪种二花脸中则以等位基因B为主，二花脸猪是以高产仔闻名于国内外的猪种，长白猪、大白猪、皮特兰猪和圣特西猪的产仔数不及二花脸多，表明可利用猪转化生长因子β1基因cDNA的3’端非翻译区自5’端第2490位和第2494位为G还是A对猪的产仔数性状进行检测。
实施例5、TGF-β1基因3个多态性位点的单倍型分析根据Tianhua Niu等提出的单倍型分型方法(Tianhua Niu，Zhaohui S.Qin，Xiping Xu，et al.Bayesian Haplotype Inference for Multiple LinkedSingle-Nucleotide Polymorphisms.Am.J.Hum.Genet.2002，70157-169.)，对实施例1获得的3个多态性位点进行分析，发现所检测的群体(由大白猪、长白猪、皮特兰猪和圣特西猪四种引入猪种和中国地方良种二花脸猪构成)中存在有8种单倍型，结果如表5所示表5 单倍型单倍型标 单倍型单倍型标识单倍型说明识C CGAA H TGGG 单倍型从左到右依次表D CGGG I TAAA 示为内含子4的一个E CAAA K TAGG SNP、内含子6的一个F CAGG SNP、3’端非翻译区的两G TGAA 个SNPs各种单倍型在受检群体中的分布频率如表6所示表6 不同猪种中单倍型的分布频率品种 头数 单倍型频率(％)
C D E F G H I K大白猪567 68.95 0.53 - - 0.27 - - 30.25长白猪174 97.99 - 0.29 - 0.29 - 0.29 1.15皮特兰猪 39 96.05 - 1.32 - - - - 2.63圣特西猪 56 75.25 - - 0.89 - 0.89 0.89 22.08二花脸猪 34 33.82 - - - - - - 66.18表6数据显示群体中主要以单倍型C和单倍型K的形式存在，其它形式的单倍型出现频率都较低，将频率小于5％的单倍型不预考虑，各品种以单倍型C和单倍型K构成的单倍型构成(HC，haplotype combination)频率如表7所示表7 不同猪种中单倍型构成频率CC CK KK品种 总头数 检出数 频率检出数 频率 检出频率(％)(％) 数 (％)大白猪 55326446.56 236 41.6253 9.35长白猪 17016795.98 3 1.72 0 0皮特兰猪 38 36 92.31 2 5.26 0 0圣特西猪 49 31 55.36 16 28.572 3.57二花脸猪 34 6 17.65 11 32.3517 50综上所述，群体中主要存在两种单倍型C和K，它们组合形成三种单倍型构成，即CC、CK和KK，联系单倍型与性状的关系，将这三种单倍型构成看作一个由二等位基因构成的三种基因型。
实施例6、猪TGF-β1基因单倍型构成与产仔数性状关系分析建立线性模型(Linear model)分析猪TGF-β1基因的单倍型构成(CC、CK和KK)与产仔数性状的关系，建立的模型如下所示Y＝u+场年季效应+TGF-β1基因单倍型构成效应+残差因大白猪群体数量可以满足模型分析，故以大白猪为分析群体，估计各单倍型构成的产仔数最小二乘均数。由于所选大白猪分别来自三个饲养场，因此将场和种群设为一个影响产仔数性状关系活仔数以及二胎总产仔数和产活仔数的最小二乘均数见表8。
表8 大白猪TGF-β1基因单倍型构成的总产仔数和产活仔数最小二乘均数单倍型构成头胎 二胎数量 总产仔数 产活仔数 数量 总产仔数 产活仔数CC 252 11.13AB10.18 23111.3310.49CK 218 10.60B9.88 21111.1810.53KK 50 11.62A10.55 46 11.5110.70注P＜0.05表8数据表明，在大白猪群体中，以KK型的产仔数为高。对以上产仔数的最小二乘均值进行比较，比较结果显示，对于头胎总产仔数而言，KK型比CK型平均多产1.02头/胎，两者之间差异显著(0.01＜P＜0.05)；KK型比CC型多产0.49头/胎，但二者之间的差异不显著(P＞0.1)；CC型比CK型多产0.53头/胎，二者之间差异也不显著(0.05＜P＜0.1)。
对头胎产活仔数的影响，KK型比CK型多0.67头/胎，比CC型多0.37头/胎，但差异不显著(P＞0.1)。三种基因型的二胎产仔数(包括总产和产活仔数)间差异不显著(P＞0.1)。
综上所述，猪TGF-β1基因的单倍型K是产仔数优势等位基因，单倍型构成KK是产仔数优势基因型，CK型产仔数低于KK和AA型，表明猪TGF-β1基因对产仔数有一定影响，可以作为产仔数候选基因或产仔数遗传标记，对猪的产仔数性状进行检测。
实施例7、利用猪TGF-β1基因的三种单倍型构成对猪的产仔数性状进行检测以大白猪、长白猪、皮特兰猪和圣特西猪四种引入猪种和中国地方良种二花脸猪的基因组DNA为模板，分别用实施例2、3、4中的三对引物及相应的反应体系、反应条件进行PCR扩增。反应结束后，分别取三种PCR产物各2μL置于PCR管中，再各加8μL变性缓冲液(按10mL体积配比98％去离子甲酰胺9.8mL、2％0.5M EDTA(pH8.0)0.2mL、0.025％溴酚兰、0.025％二甲苯青)，98℃变性10min后，迅速冰浴10min，然后对经变性的PCR扩增产物进行12％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色。根据检测结果统计上述不同猪种中TGF-β1基因的三种单倍型构成频率(基因型频率)和单倍型频率(等位基因频率)，统计结果如表9所示表9 不同猪种TGF-β1基因多态性位点单倍型化后的基因型频率和等位基因频率检测个体 基因型频率 等位基因频率品种数 CC CK KKC K
大白猪 553 0.4660.4160.0940.6910.309长白猪 170 0.9600.17200.9910.009皮特兰猪 380.9230.52600.9740.026圣特西猪 490.5540.2860.0360.7960.204二花脸猪 340.1770.3240.5000.3380.662表9数据显示长白猪、皮特兰猪未出现KK基因型，而CC基因型的频率分别达到0.960和0.923。在长白猪、大白猪、皮特兰猪和圣特西四种引入猪种中，以等位基因C为主，而在中国地方猪种二花脸中则以等位基因K为主，二花脸猪是以高产仔闻名于国内外的猪种，长白猪、大白猪、皮特兰猪和圣特西猪的产仔数不及二花脸多，表明可利用猪转化生长因子β1基因的两种单倍型是C(CGAA)还是K(TAGG)对猪的产仔数性状进行检测。
序列表<160>6<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1ctcagtgccc actgttcctg tga 23<210>2<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2ggatagggtt gggggagaca taca 24<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3cagtacagca aggtgcgtct gg 22<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4gctatgccac cagggaactc tc 22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5aaagggactc tgataacacc 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6gcacctgaga catatggaag 20
权利要求
1.一种检测猪产仔数性状的方法，是用下述至少一种方法对待测猪的转化生长因子β1基因进行单核苷酸多态性检测1)PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因第四内含子的核苷酸序列，确定自5’端第33位碱基为C还是T；2)PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因第六内含子的核苷酸序列，确定自5’端第179位碱基为G还是A；3)PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因的3’端非翻译区，确定自5’端第414位和第418位碱基同为A还是同为G。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因第四内含子的核苷酸序列所用的引物对为序列表中的SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因第六内含子的核苷酸序列所用的引物对为序列表中的SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因的3’端非翻译区所用的引物对为序列表中的SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于所述PCR反应体系为10×PCR扩增缓冲液1.5μL，4×dNTP混合物1.2μL，上、下游引物各0.25μL，猪基因组DNA 1μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，ddH2O 10.5μL；PCR反应条件为先95℃ 5min；再94℃ 1min，55-70℃ 15-20sec，72℃ 20sec，共进行39个循环；最后72℃ 7min。
全文摘要
本发明公开了一种检测猪产仔数性状的方法。该方法是用下述至少一种方法对待测猪的转化生长因子β1基因进行单核苷酸多态性检测1)PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因第四内含子的核苷酸序列，确定自5’端第33位碱基为C还是T；2)PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因第六内含子的核苷酸序列，确定自5’端第179位碱基为G还是A；3)PCR扩增待测猪的转化生长因子β1基因的3’端非翻译区，确定自5’端第414位和第418位碱基同为A还是同为G。本发明将在猪的育种中发挥巨大作用。
文档编号C12Q1/68GK1733938SQ200510093919
公开日2006年2月15日 申请日期2005年8月31日 优先权日2005年8月31日
发明者王爱国, 武艳萍, 李宁, 傅金恋 申请人:中国农业大学