专利名称：生理节律调控基因簇、dna芯片以及使用该dna芯片的方法
技术领域：
本发明涉及生理节律调控基因簇(circadian rhythm control gene cluster)、至少排列有该生理节律调控基因簇的DNA芯片、通过使用该DNA芯片预测生理节律调控基因簇的表达时机(expression timing)调节的方法、测定生理节律异常的方法、选择生理节律调节剂(circadian rhythm regulator)的方法以及筛选方法。
背景技术：
生理节律是具有大约24小时的循环周期的生物节律，是包括从单细胞生物到人类的许多生物中普遍观察到的体内现象。个体生物具有与生理节律的调控相关的基因(在下文中称为″生理节律调控基因″)，其用来调整生理节律。
对于哺乳动物，该生理节律调控基因的表达量在脑部下丘脑区的视交叉上核(nucleus suprachiasmatica)(SCN)高许多，其作为在个体水平调整生理节律的中心。另一方面，该生理节律调控基因在其他的体内组织(即生理节律外周组织)中表达，其中通过与生理节律中心类似的生理节律调控基因的方式在每个细胞和每种组织的水平调整生理节律。此外，已经公认存在一种机制，其中以生理节律中心为基础的个体水平生理节律整合(integrate)生理节律外周组织的生理节律。
对于哺乳动物的生理节律调控基因，已知的有Per基因(Per 1、Per 2、Per 3)、Clock基因、Bmal基因(Bmal 1、Bmal 2、Bmal 3)、Cry基因、Npas2基因、Dbp基因、Rev-erb基因(Rev-erbα、Rev-erbβ)等(在下文中一般表示为“生理节律调控基因簇”)。
在生理节律调控基因的编码区或者上游序列，存在该生理节律调控基因的转录调控区(即特定的碱基序列)。对于该转录调控区域，已经阐明RORE、DBP结合位点和E-BOX。该转录调控区域是转录因子结合区域，转录因子结合至转录调控区域并调控生理节律调节基因的转录和表达。
RORE存在于Bmal1的编码区域或其上游序列。众所周知作为转录因子的Ror转录因子家族(REV-ERB等)与RORE结合从而调节Bmal1基因表达。需要指出的是REV-ERB是该Rev-erb基因的转录产物(蛋白质)。
DBP结合区域存在于如Per1基因等的编码区域或者其上游序列。作为转录因子的DBP(即Dbp基因的转录产物)等与DBP结合位点结合从而促进Per1基因表达。
E-BOX存在于如Per1基因、Per2基因等的编码区域或者其上游序列中。作为转录因子的CLK-BMAL复合物(Clock基因转录产物和Bmal基因转录产物的复合物)与E-BOX结合以促进Per1基因和Per2基因表达。
如已在上文中陈述的，每个生理节律调控基因的表达是以生理节律调控基因的转录产物(蛋白质)为基础调整的。需要指出的是在Hitoshi Okamura和Yoshitaka Fukada所编写的和由Springer-Verlag Tokyo K.K.April 5，2004出版的″Molecular Biology of Clock Genes″中，记载了上述生理节律调控基因和转录调控区域(E-BOX、DBP结合位点、RORE)。
发明内容
通常认为细胞单位(cell unit)的生理节律形成是由生理节律调控基因簇的表达时机调控的。因此，阐明单个生理节律基因的表达时机·表达顺序是很重要的。更具体地，对生理节律调控基因表达时机和顺序的阐明辅助说明了生理节律控制机理。
更进一步地，当清楚在通常情况下生理节律调控基因簇的表达时机和顺序时，人们根据生理节律调控基因簇的表达时机和顺序的差异(deviation)能够容易地检测出生理节律异常。
此外，对在通常情况下生理节律调控基因簇的表达时机·表达顺序的阐明，使寻找能够使得生理节律调控基因簇的表达时机·表达顺序发生前后移动(shifting back and forth)的物质成为可能。
相应地，本发明的一个目的是提供生理节律调控基因簇在正常情况下的表达时机·表达顺序。
本发明的另一个目的是提供通过使用该表达时机·表达顺序测定生理节律异常的方法。
本发明更进一步的目的是提供一种使用该表达时机·表达顺序的筛选方法。
本发明者们首次发现，在基本上所有的生理节律外周组织中，下述生理节律调控基因簇(1)至(7)的表达时机显示生理节律的变化。还发现这些生理节律调控基因簇在正常情况下的表达顺序存在规律性。此外，首次发现与生理节律调控基因相关的转录控制区域(RORE、DBP结合位点和E-BOX)的存在位置和存在数量。
在本发明的实践中，当按照生理节律时间16点为基准时(例如，当光照条件启动时间为常规时间的8点时，常规时间的上午0点)，提供一种生理节律调控基因簇，其中下述基因(1)或/和(2)表达后，下述基因(3)到(7)开始按顺序表达，并且其含有全部基因(1)到(7)或选自基因(1)到(7)的多个基因(1)在编码区或其上游序列中含有RORE的Bmal1基因；(2)在编码区上游序列中含有RORE的Npas2基因；(3)在编码区或其上游序列中含有RORE、DBP结合位点和E-BOS的Rev-erbα基因；(4)在编码区或其上游序列中含有RORE和E-BOX的Dbp基因；(5)在编码区或其上游序列中含有DBP结合位点的Per3基因；(6)在编码区上游序列中含有DBP结合位点的Per1基因；和(7)在编码区上游序列中含有E-BOX的Per2基因。
如同本文陈述的，当按照生理节律时间16点为基准时，生理节律调控基因簇按下述顺序表达(a)在编码区或其上游序列中具有RORE的基因；(b)在编码区或其上游序列中具有DBP结合位点的基因；和(c)在编码区或其上游序列中具有E-BOX的基因。
更具体地，在三个转录控制区域(RORE，DBP结合位点和E-BOX)之中，首先仅具有RORE的Bmal1和Npas2表达，此后是除了具有RORE以外还具有DBP结合位点和E-BOX的Rev-erbα进行表达，随后是除了具有RORE以外还具有E-BOX的Dbp进行表达(a)。接下来，仅具有DBP结合位点的Per3表达，然后是具有除了DBP结合位点以外还具有E-BOX的Per1进行表达(b)。此后，仅具有E-BOX的Per2表达(c)。
应当注意基因(1)至(7)各基因的碱基序列在NCBI(美国National Centerfor Biotechnology Information)的公共数据库被公开。下面显示在该NCBI数据库中的各个基因的基因编号，其中每个括号中的数字表示在基因中的区域。
(1)Bmal1；人NT_009237(12054318至12069318)，小鼠NT_081129.1(107781至122781)，大鼠NW_047562.1(13774073至13789073)。(2)Npas2人hCG27614(95632226至65646226)，小鼠mCG8437(35980102至35994102)，大鼠rCT22431(39204499至39218499)。(3)Rev-erbα人hcg93862(34926094至34912094)，小鼠mCG15360(105438925至105424925)，大鼠rCG33292(82492796至82478796)。(4)Dbp人NT_011109.15(c21417778至21402778)，小鼠NT_078442.1(59711至74711)，大鼠NW_047558.1(5120734至5135734)。(5)Per3人NT_021937.16(1962822至1977822)，小鼠NT_039268.2(c4331528至4316528)，大鼠NW_047727.1(c801656至8001956)。(6)Per1人NT_010718.14(c6905708至6890708)，小鼠NT_039515.2(65661216至65676216)，大鼠rCG34390(52960430至52974430)。(7)Per2人NT_0051120.14(c5136562至5121562)，小鼠NT_039173.2(c5833757至5818757)，大鼠NW_047817.1(c6827703至6812703)。
生理节律调控基因的转录控制区域RORE、DBP结合位点和E-BOX的碱基序列显示于序列表中(序列号1至序列号3)，。
需要指出的是在正常情况下该生理节律调控基因簇(1)至(7)的表达峰分别是，基因(1)或/和(2)在生理节律时间20点到24点，基因(3)在生理节律时间4点到8点，基因(4)在生理节律时间6点到10点，基因(5)在生理节律时间8点到12点，基因(6)在生理节律时间10点到14点以及基因(7)在生理节律时间12点到16点。
接下来，根据本发明，提供至少其中排列有生理节律调控基因簇的DNA芯片。该DNA芯片能被用于，例如，(1)预测生理节律基因簇表达时机的异常的方法，(B)检测生理节律异常的方法，(C)选择生理节律调节剂的方法；(D)生理节律调节剂的筛选以及(E)对其副作用为生理节律异常的药物的筛选。
(A)预测生理节律调控基因簇在表达时机中的异常的方法如本文中所陈述的，本发明者们已经阐明该生理节律调控基因簇的表达时机和转录因子的结合位点(RORE、DBP结合位点、E-BOX)之间的相互关系。利用这种相互关系，可以预测生理节律调控基因簇的表达时机的调节。更具体地，当生理节律调控基因的表达时机中检测到异常时，具有该转录因子结合位点的其它生理节律调控基因的表达时机中的异常可以被检测出，其中所述生理节律调控基因在编码区域或者其上游序列中具有具体的转录因子结合位点。
例如，如果在编码区域或其上游序列中具有RORE的基因(例如，Bmal1)中的表达时机的异常被检测到，在编码区域或其上游序列中具有RORE的其它基因(Npas 2、Rev-erbα、Dbp)的表达时机的调节可以被预测。同样地，当编码区域或其上游序列中具有DBP结合位点的基因(例如Per3)的表达时机中的异常被检测到，在编码区域或其上游序列中具有DBP结合位点的其它基因(例如Per1、Rev-erbα等等)可以被预测。此外，当在编码区域或其上游序列中具有E-BOX的基因的表达时机中的异常被检测到，在编码区域或其上游序列中具有E-BOX的其它基因(例如Per1、Rev-erbα、Dbp)可以被预测。
(B)测定生理节律的调节的方法生理节律在以下情况下被调节当生理节律调控基因簇的表达时机(即表达峰的时间)被改变，例如，在样品细胞中没有观察到指定的生理节律调控基因的表达或者生理节律调控基因簇的表达序列与正常的不同。因此，当从每个时刻(clock-time interval)的样品细胞中提取出的DNA，例如，与DNA芯片上的DNA相互作用(例如通过杂交)时，生理节律的异常可以被轻易测定到。
需要注意的是对于与生理节律异常相关的疾病，包括，例如，睡眠障碍(sleep disorder)、唤醒疾病(awakening disorder)、时差综合征(jet syndrome)、失眠症(insomnia)、植物神经性共济失调(autonomic ataxia)、抑郁症(depression)、老年痴呆(senile dementia)、与夜晚工作、换班工作等由生活方式不规则导致的生理平衡的恶化(deterioration of physical balance throughirregularities of life style involved by night work，shift work or the like)，与自闭症等相关的生活方式不规则导致的疲劳等(fatigues through irregularities oflife style accompanied by autistic and the like)。对于这些由生理节律异常引发的疾病，需要一提的是，例如，由于夜晚工作引起的诸如护士的乳癌发生率的增加。
(C)选择生理节律调节剂的方法当生理节律异常时，通过本发明的DNA芯片，可以容易地检测出在生理节律调控基因簇中，生理节律异常是基于哪个基因的表达异常而发生的。因此，当未观察到Per3(序列中具有DBP结合位点)的表达或者测定到Per3的表达时机的变化时，选择作用于Dbp结合位点的生理节律调节剂可以改善生理节律异常。类似地，当未观察到Bmal1(启动子部位具有RORE)的表达或者当测定到Bmal1的表达时机的变化时，可以通过选择作用于RORE的生理节律调节剂改善生理节律的异常。对于其它类型的生理节律调控基因也是如此。
(D)生理节律调节剂的筛选采用本发明的DNA芯片，可以广泛搜索能够改变生理节律基因簇的表达时机的物质，即生理节律调节剂的候选物质。例如，当Per3基因的表达时机前移(即当表达时机提前)，该物质可能作为促进Per3基因表达的因子或直接或间接作用于DBP结合位点的物质，成为生理节律调节剂的有力候选。其它类型的生理节律调控基因也是如此。
(E)筛选伴随有生理节律异常的副作用的物质通过使用与本发明相关的DNA芯片对可用作药物的所有物质进行全面搜索，例如，由此可以检测伴随有生理节律异常的物质。
当检测到伴随有生理节律异常的物质时，可以确定该物质的给药时间。例如，当筛选的结果表明该物质是可以改变Per3基因的表达时机的物质时，可以通过找出不改变Per3基因表达时机的给药时间(timing)来避免该物质的副作用。这对于其它类型的生理节律调控基因的情况也是如此。
本文所应用的技术术语如下定义。
术语“生理节律调控基因簇”一般是指与体内生理节律的调节机制相关的基因的总称。术语“生理节律调控基因”是指与生理节律的调节机制相关的基因。
术语“生理时间(CT)”是指以光照条件启动时间作为0点钟(CT 0)的时间。相反的，术语“常规时间”是指从0a.m.开始12p.m.为止的一天中的时间。
术语“编码区域”是指编码碱基序列上的基因的区域，其为从转录起始位点至转录终止位点的序列。术语“上游序列”是在指编码区域的转录起始位点上游的序列。
术语“生理节律外周组织”是指除了生理节律中心(脑部下丘脑区的视交叉上核(SCN))的其它组织，包括，例如，心脏、肺、肝、胃、脾和肾。
术语“生理节律调节剂”所指的调节剂包括具有改善生理节律调节活性的药物、其它物质以及组合物。
按照本发明，可以测定生理节律调控基因簇的表达时机·表达顺序及其异常。
图1显示出实时RT-PCT的结果；图2是显示生理节律调控基因簇表达时机的示意图；图3显示出各生理节律调控基因中转录调控位点的位置示意图；以及图4是显示生理节律调控基因簇表达调节机制的示意图。
序列表200407061434313900_A163049049110112004199122AAA_0.app实施例本发明通过实施例更具体地描述。
实施例1在实施例1中，检测生理节律外周组织中的生理节律调控基因在每个时刻的表达峰。其方法如下所述。
首先，使得用于试验的小鼠的生理节律变为同步的。更具体地，在两个星期的时间内，以从8点到20点为光照时刻，从20点至第二天的8点为黑暗时刻，在室内饲养小鼠，使小鼠的生理节律是同步的。值得注意的是本实验中，使用从Nihon SLC kabushikikaisha购买的ICR小鼠(雄性，五星期大)。
接下来，在规定的时刻分别从小鼠的心脏、肺、肝、胃、脾和睾丸取样，作为生理节律外周组织并且迅速用液氮冷冻。值得注意的是各个内脏器官的取样时间被设定为从生理节律的同步化之后的8点开始，每四个小时(8点、12点、16点、20点、24点和第二天的4点)取样。
此后，对器官样品分别进行匀浆，而后用Promega Total SV RNA分离试剂盒(Promega公司生产)从各内脏中提取出总RNA。接下来，进行定量实时RT-PCR(定量实时反转录酶链反应)以测定生理节律调控基因的表达量。
如下所示，由此测得的生理节律调控基因为14种。Bal1、Npas2、Rev-erbα、Dbp、Rev-erbβ、Per3、Per1、Per2、Cry1、Cry2、Clock、Cklδ、，Cklε以及Tim。
定量实时RT-PCR采用ABI PRISSM 7000(Applied Biosystems，Ltd.制造)。对于PCR，采用SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司)50℃，2分钟/95℃，10分钟/(95℃，15秒/60℃，1分钟)，进行40个循环。采用下面所示的引物。
Bal1(有义引物序列号(sequence No.)4，反义引物序列号5)，Npas2(有义引物序列号6，反义引物序列号7)，Rev-erbα(有义引物序列号8，反义引物序列号9)，Dbp(有义引物序列号10，反义引物序列号11)，Rev-erbβ(有义引物序列号12，反义引物序列号13)，Per3(有义引物序列号14，反义引物序列号15)，Per1有义引物序列号16，反义引物序列号17)，Per2(有义引物序列号18，反义引物序列号19)，Cry1(有义引物序列号20，反义引物序列号21)，Cry2有义引物序列号22，反义引物序列号23)，Clock(有义引物序列号24，反义引物序列号25)，Cklδ(有义引物序列号26，反义引物序列号27)，Cklε(有义引物序列号28，反义引物序列号29)以及Tim(有义引物序列号30，反义引物序列号31)。
在上述实验中，各基因的表达水平是以看家(housekeeping)基因的表达量为基准计算的相对值。首先，从在反转录PCR的实验过程中提取的总RNA中选择β-肌动蛋白和G3PDH的转录产物进行同步扩增，而后合成β-肌动蛋白和G3PDH的cDNA。β-肌动蛋白和G3PDH都是看家基因，具有基本上恒定的表达水平。将各基因的表达水平与β-肌动蛋白和G3PDH的表达量相比，以计算出相应的表达水平。值得注意的是，对于表达水平的计算，使用两种类型的看家基因(β-肌动蛋白和G3PDH)以获得各基因的表达水平，通过校正和调整使用β-肌动蛋白的情况和使用G3PDH的情况中的误差，来提高各自基因的表达水平的准确度。
结果在图1中显示，其中显示了心脏、肺、肝、胃、脾和睾丸中各基因的表达水平。基因中的符号“m”(例如，在mBal1中开头出现的“m”)是指哺乳动物。在每个图中，横坐标显示的是生理时间(CT)，纵坐标显示的是相对表达水平(％)。按照生理时间(CT)，CT0至CT12是光照条件(称为白天)，CT12至CT24是在黑暗条件(称为夜晚)。
如图1所示，在所有14种基因中，可以观察到8种基因(Bmal1、Npas2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Dbp、Per3、Per1和Per2)在除睾丸以外的所有器官中出现生理节律调控基因表达的生理节律变化。
在图2中，按照图式显示了各个基因的表达峰。在图2的最上面部分中的空白部分表示光照条件(CT0至CT12)，而填实的部分表示黑暗条件(CT12至CT24)。横坐标表示生理时间(CT)。在横坐标上显示出，与用作转录因子结合区域的“DBPE”、“E-BOX”以及“RORE”相对的、转录因子的结合时机的预测时间(bind timing predicting time)。
如图2中所示，各自基因的表达峰为，对Bmal1和Npas2而言在CT20至CT0，对Rev-erbα而言在CT4至CT8，对Dbp而言在CT6至CT10，对Per3而言在CT8至CT12，对Per1而言在CT10至CT14，以及对Per2而言在CT12至CT16。在各个器官中各生理节律调控基因的表达峰基本在相同的时刻。
上述结果表明在生理节律调控基因中，调节生理节律外周组织的生理节律(分子生物钟)的基因主要为8种(Bmal1、Npas2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Dbp、Per3、Per1和Per2)。
进一步地，上述结果显示在各种生理节律外周组织中的生理节律调控基因的表达顺序具有规律性。更具体地，显示出在一天正常时间CT0至CT24的过程中，生理节律调控基因簇按照Rev-erbα、Dbp、Per3、Per1和Per2的时间顺序表达，而后Bmal1和Npas2在同一时间表达。
此外，上述结果显示整个生理节律外周组织具有按照类似机制重新设定生理节律的可能性。也就是说，对于整个生理节律外周组织，生理节律调控基因的表达峰基本上出现在同一时刻，这个事实表明各生理节律外周组织，具有按照类似机制以生理节律中心(SCN)的生理节律为基础重新设定生理节律的可能性。
此外，图1中显示的睾丸的结果表明了Per1可能具有除形成生理节律以外的功能。在本试验中，如图1所示，发现对于睾丸，观察到四个基因(Bmal1、Npas2、Rev-erbα、和Dbp)的微弱生理节律变化。另一方面，对于Per1基因，尽管没有观察到Per1基因表达的生理变化，但是表达量或者水平比其它生理节律调控基因的要高。因此，这一试验结果表明在睾丸中，Per1具有除形成生理节律以外的功能，例如，调节精子形成(spermatogenesis)的发生。
实施例2在实施例2中，使用NCBI数据库和Celera数据库系统，搜索到了八种生理节律时钟控制基因(Bmal1、Npas2、Rev-erbα、Rev-erbβ、Dbp、Per3、Per1和Per2)中的生理节律时钟控制基因转录调控区域(E-BOX，DBP结合区域和RORE)。
搜索的结果如下(参见图3)。
(1)RORE存在于Bmal1基因的启动子区域。
(2)RORE存在于Npas2基因的启动子区域。
(3)一个RORE、一个DBP结合位点和五个E-BOX存在于Rev-erbα基因中。
(4)两个RORE和两个E-BOX存在于Dbp基因中。
(5)DBP结合位点存在于Per3基因内含的启动子区域。
(6)五个E-BOX和DBP结合位点存在于Per1基因的启动子区域。
(7)E-BOX存在于Per2基因的启动子区域。Per2基因中的E-BOX(CACGTT)在序列上不同于通常的E-BOX(CACGTG)。
该结果表明存在下述生理节律控制机制。
(1)Bmal1基因的表达和(2)Npas2基因的表达通过结合于RORE的转录因子(Rev-erb等)调控。另一方面，Bmal1基因表达BMAL1(蛋白)。该表达的BMAL1(蛋白)与CLK(蛋白)结合形成CLK-BMAL1复合物。CLK-BMAL1复合物促进启动子区域中具有E-BOX的基因(Rev-erbα基因、Dbp基因、Per1基因和Per2基因)的表达。需要注意的是Npas2基因表达NPAS2(蛋白)。
(3)公知Rev-erbα基因的表达是由结合于RORE的转录因子(Rev-erb等)、结合于DBP结合位点的转录因子(DBP等)和结合于E-BOX的转录因子(CLK-BMAL1复合物)调控。更具体地，可知Rev-erbα基因的表达通过反馈系统在表达水平调控。另一方面，Rev-erbα基因表达Rev-erbα(蛋白)。REV-REBα(蛋白)作为转录因子，调控具有RORE的基因(Bmal1基因和Npas2基因)的表达。
(4)公知Dbp基因的表达是由结合于RORE的转录因子(Rev-erb等)和结合于E-BOX的转录因子(CLK-BMAL1复合物)调控。另一方面，Dbp基因表达DBP(蛋白)。DBP作为转录因子，与DBP结合位点结合，以促进具有DBP结合位点的基因(Rev-erbα基因、Per3基因和Per1基因)的表达。
(5)Per3基因的表达由结合于DBP结合位点的转录因子诸如DBP来促进。
(6)Per1基因的表达由结合于DBP结合位点的转录因子诸如DBP和结合于E-BOX的转录因子(CLK-BMAL1复合物)调控。
(7)Per2基因的表达由结合于E-BOX的转录因子(CLK-BMAL1复合物)调控。
总之，如图4所示，显示了生理节律时钟控制基因是按照Rev-erbα基因、Bmal1基因、Dbp基因和Per基因的顺序进行表达的可能。更具体地，还显示相应基因所表达的蛋白调控下游基因表达的可能。上述表达顺序与实施例1所示的生理节律表达时机基本一致(参见图2)。
需要注意的是在图4中，省略了显示自生理节律时钟调控基因表达的蛋白对Rev-erbα的作用的箭头。可知在实施例1(图2)中，Rev-erbα的表达时机存在于Bmal1/Npas2和Dbp之间的原因是由于Rev-erbα基因具有大量转录因子(一个RORE，一个DBP结合位点和五个E-BOX)，Rev-erbα基因的表达是由复杂的反馈机制调控的。在图2中，Rev-erbα基因在CT4到CT8表达的转录产物(REV-ERBα)具有调控Dbp基因在CT6到CT20表达的表达时机和Bmal1在随后CT20到CT24表达的表达时机的可能性。
此外，可知Per3基因、Per1基因和Per2基因在表达时机上的差异是由于转录因子结合位点的类型、数量和顺序的不同或存在复杂调控系统所导致的。
产业利用性本发明的生理节律调控基因簇不仅可以应用于DNA芯片，还可以应用于，例如，培养细胞，所述细胞具有至少生理节律调控基因簇。上述培养的细胞可以应用于副作用为生理节律异常的物质的筛选方法。根据前面所述，本发明的生理节律调控基因簇在工业上是有用的。
虽然本发明优选的实施方案已经用具体的术语进行了描述，该描述只是用作例证目的，不超出下述权利要求的精神和范围的修改和改变都是不言而喻理所当然的。
序列表<110>索尼株式会社(SONY Corp.)<120>生理节律调控基因簇、DNA芯片以及使用该DNA芯片的方法<130>04904491101<160>31<210>1<211>11<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>RORE<400>1wawntdggtc a 11<210>2<211>10<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>D B P E<400>2rtkaygtaay 10<210>3<211>6<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>E-BOX<400>3cacgtg 6<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Bal1的有义引物<400>4gcagtgccac tgactaccaa ga 22<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Bal1的反义引物<400>5tcctggacat tgcattgcat20<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Npas2的有义引物<400>6gtatgcacag agccaagtga tgtt 24<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Npas2的反义引物<400>7tgctcactgt gcagagatgt tg 22<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Rev-erbα的有义引物<400>8cgttcgcatc aatcgcaacc20<210>9
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Rev-erbα的反义引物<400>9gatgtggagt aggtgagg 18<210>10<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Dbp的有义引物<400>10aatgaccttt gaacctgatc ccgct 25<210>11<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Dbp的反义引物<400>11gctccagtac ttctcatcct tctgt 25<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Rev-erbβ的有义引物<400>12acggattccc aggaacatgg20<210>13<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Rev-erbβ的反义引物<400>13cctccagtgt tgcacaggta 20<210>14<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Per3的有义引物<400>14ctgctccaac tcagcttcct tt22<210>15<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Per3的反义引物<400>15ttagacagca aggctctggt tct 23<210>16<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Per1的有义引物<400>16caggctaacc aggaatatta ccagc 25<210>17<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Per1的反义引物<400>17cacagccaca gagaaggtgt cctgg 25<210>18
<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Per2的有义引物<400>18ggcttcacca tgcctgttgt 20<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Per2的反义引物<400>19ggagttattt cggaggcaag tgt 23<210>20<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cry1的有义引物<400>20cccaggcttt tcaaggaatg gaaca25<210>21<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cry1的反义引物<400>21tctcatcatg gtcatcagac agagg25<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cry2的有义引物<400>22gggactctgt ctattggcat ctg 23<210>23<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cry2的反义引物<400>23gtcactctag cccgcttggt 20<210>24<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Clock的有义引物<400>24cctatcctac cttggccacaca22<210>25<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Clock的反义引物<400>25tcccgtggag caacctagat 20<210>26<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cklδ的有义引物<400>26ccagcctgga agacctgttc 20<210>27
<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cklδ的反义引物<400>27tggccagccc aaagtcaa 18<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cklε的有义引物<400>28ggatgtgaag cccgacaact t 21<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Cklε的反义引物<400>29tctcgacggc tttgctcaat 20<210>30<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Tim的有义引物<400>30acatgtgggc aatggctt 18<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>Tim的反义引物<400>31ctgctccaca aagtgaaagg t 21以下显示了“w”，”n”，”d”，“r”，“k”，“y”的具体识别信息(identifying infbrmation)。
“w”是a或t；“n”是任意核苷酸，(a或t或g或c)“d”是a或g；“r”是g或a；“k”是g或t；“y”是t或c；序列1为“wawntdggtca”，含义是“[AT]A[AT]NT[AG]GGTCA”，序列2为“rtkaygtaay”，含义是”[GA]T[GT]A[TC]GTAA[TC]，([AT]含义是A或T).
权利要求
1.生理节律调控基因簇，其中下述基因(1)或/和(2)表达后，下述基因(3)到(7)按顺序表达，并且所述基因簇含有全部基因(1)到(7)或选自基因(1)到(7)的多个基因(1)在编码区或其上游序列中含有RORE的Bmall基因；(2)在编码区上游序列中含有RORE的Npas2基因；(3)在编码区或其上游序列中含有RORE、DBP结合位点和E-BOS的Rev-erbα基因；(4)在编码区或其上游序列中含有RORE和E-BOX的Dbp基因；(5)在编码区或其上游序列中含有DBP结合位点的Per3基因；(6)在编码区上游序列中含有DBP结合位点的Per1基因；和(7)在编码区上游序列中含有E-BOX的Per2基因。
2.权利要求1的生理节律调控基因簇，其中当以生理节律时间16点为基准时，生理节律调控基因簇按下述顺序表达(a)在编码区或其上游序列中具有RORE的基因；(b)在编码区或其上游序列中具有DBP结合位点的基因；和(c)在编码区或其上游序列中具有E-BOX的基因。
3.权利要求1的生理节律调控基因簇，其中所述表达显示于生理节律外周组织。
4.权利要求1的生理节律调控基因簇，其中在正常条件下生理节律调控基因簇(1)到(7)的表达峰分别为基因(1)或/和(2)在生理节律时间20点到24点，基因(3)在生理节律时间4点到8点，基因(4)在生理节律时间6点到10点，基因(5)在生理节律时间8点到12点，基因(6)在生理节律时间10点到14点，和基因(7)在生理节律时间12点到16点。
5.DNA芯片，其特征在于至少排列有权利要求1所述的生理节律调控基因簇。
6.一种利用权利要求5所述的DNA芯片来预测生理节律调控基因簇的表达时机调节的方法。
7.权利要求6的方法，其中通过测定在编码区或其上游序列中具有RORE的基因的表达时机调节，从而预测其它在编码区或其上游序列中具有RORE的基因的表达时机调节。
8.权利要求6的方法，其中通过测定在编码区或其上游序列中具有DBP结合位点的基因的表达时机调节，从而预测其它在编码区或其上游序列中具有DBP结合位点的基因的表达时机调节。
9.权利要求6的方法，其中通过测定在编码区或其上游序列中具有E-BOX的基因的表达时机调节，从而预测其它在编码区或其上游序列中具有E-BOX的基因的表达时机调节。
10.一种利用权利要求5所述的DNA芯片测定生理节律异常的方法。
11.权利要求10的方法，其中测定睡眠障碍。
12.权利要求10的方法，其中测定失眠症。
13.权利要求10的方法，其中测定时差综合征。
14.一种利用权利要求5所述的DNA芯片选择生理节律调节剂的方法。
15.一种利用权利要求5所述的DNA芯片筛选作用于任意或多个RORE、DBP结合位点和E-BOX的物质的方法。
16.权利要求15的方法，其中所述物质是生理节律调节剂。
17.权利要求15的方法，其中所述物质是伴随有生理节律异常的物质。
全文摘要
本发明提供在通常条件下具有给定表达时机和表达顺序的生理节律调控基因簇(Bmall基因、Npas2基因、Rev－erbα基因、Rev－erbβ基因、Dbp基因、Per3基因、Per2基因和Per1基因)，以及具有至少按顺序排列的生理节律调控基因群的DNA芯片。还提供预测生理节律调控基因簇表达时机调节的方法、测定生理节律调节的方法、选择生理节律调节剂的方法、筛选生理节律调节剂和筛选涉及生理节律异常的物质的方法，上述方法均利用DNA芯片。
文档编号C12N15/12GK1769445SQ20051010988
公开日2006年5月10日 申请日期2005年7月6日 优先权日2004年7月6日
发明者山本拓郎, 相马温彦, 真峰隆义, 内匠透, 中畑泰和 申请人:索尼株式会社