生物指示物的制作方法

专利名称：：生物指示物的制作方法专利说明生物指示物本发明涉及生物指示物，一般而言，其适于验证一种过程，包括基于热的失活过程和失活步骤，更具体地，其适于验证失活传染性海绵状脑病(transmissiblespongiformencephalopathy)(TSE)因子的步骤。克-雅综合征(Creutzfeldt-JakobDisease)(CJD)是一种相对罕见的人类神经变性疾病形式，以家族性、散发性或医源性疾病存在，发病率是每百万人群中大约1例。该疾病的一个新的变种形式(vCJD)的出现—其主要发生在年轻人群中并且可能是由于消费了受牛海绵状脑病(BSE)感染的肉类产品，增加了病例数大量增加的概率。这些因素具有重要的公共健康意义。在二十世纪八十年代晚期，高比例的英国人群曾经通过食物潜在地暴露于该疾病。尽管迄今为止的病例数相对低(至2004年2月是149例)，仍然存在着对来自通过其它传播途径，包括手术、移植、输血或污染的医疗用品的所有形式CJD的显著风险。这些途径中的许多涉及该疾病在临床情况中的医源性传播，其它途径在动物模型中得到确定。在人类中引起所有形式CJD的因子对应用标准方法的失活是高度抵抗的。迫切需要对外科器械除污染的有效方法。已经对多种处理，包括化学处理和利用湿热或干热的高温及高压的应用进行了测试，但是没有一种方法是满足要求的[Taylor，D.M.(1999)于Principlesandpracticeofdisinfection，preservationandsterilisation中.(Russell，A.D.，Hugo，W.B.andAyliffe，G.A.J.，Eds)pp222-236BlackwellScientificPublications，Oxford；Taylor，D.M..(2001)ContribMicrobiol.7，58-67；Taylor，D.M.，Fernie，K，Steele，P.J.，McConnell，I.andSomerville，R.A.(2002)JGenVirol.83，3199-3294]。焚烧是有效的，但是阻碍了对原材料和或器械的任何恢复或再利用。已经显示，高浓度氢氧化钠(高达2M)或高水平次氯酸钠(高达20000ppm)的应用明显降低TSE因子的水平，但是其对外科器械具有损害效应，并且对操作者有害。已经提议了多种其它方法作为失活外科器械上的TSE因子的方法，这些方法目前还在开发中。这些包括多种气态杀菌剂，包括蒸气态过氧化氢、臭氧和环氧乙烷。已经提议了其它方法作为常规灭菌之前特定的抗TSE预处理，这些方法包括在限定的pH条件和温度条件下，用热稳定蛋白酶处理外科器械。嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)芽孢的失活是常规用于验证高压灭菌之正确实施的方法。这种指示物可以给出细菌或病毒被该过程失活的相对指示，以该过程通常由于降低了感染因子水平106个数量级而得到验证。然而，TSE因子独特的稳定性质意味着需要强得多的指示物来提供对失活这种因子的过程的性能的相对指示。基于热稳定芽孢或酶制备物的其它生物指示物是熟悉本领域技术人员公知的。这些指示物都有缺点它们不能验证感染因子活性降低超过106的失活。TSE因子的失活也是处理受牛海绵状脑病(BSE)感染物质和制备动物来源的原材料中的重要问题。现在存在可靠的科学根据，认为BSE的发生和传播是通过炼油操作中的转变形成的，高度感染的神经组织被通过肉骨粉添加剂(meat-and-bone-mealsupplements)反过来喂给牲畜。也有可靠证据表明，BSE是vCJD的病因，几乎确定地是食用污染的牛肉产品的结果。由于这个原因，死于BSE的任何牲畜，以及所有牲畜的脊髓和脑组织，通常从食物链中被去除，并且经可选的途径被处理。其结果是，大量的动物废物目前被积累或经焚烧处理。用热稳定蛋白酶对这些物质进行处理是一个可能的解决方法。此外，存在着对确保任何感染物在适当的过程中被摧毁的验证方法的需求。本发明的一个目的是，提供可选的和/或改进的生物指示物以及它的应用。因此，在本发明的第一方面，提供了生物过程指示物(biologicalprocessindicator)，用于验证旨在降低样品中生物因子的含量或活性的处理过程，其包括激酶。在一个优选实施方案中，指示物还包括固体支持物，其中的激酶被固定化在所述固体支持物中或被固定化在所述固体支持物上。在一个特别优选的实施方案中，激酶是热稳定激酶。在本发明的应用中，生物指示物被包含在待接受处理的样品中，所述处理意图在于降低样品中的潜在污染物，特别是传染因子的含量。从以前的试验已知，处理所致指示物激酶活性的降低与污染物的量或活性的降低相关。为了确定污染物的量/活性是否被降低至可接受水平以下，在处理之前和之后，或在处理过程中测定指示物激酶的活性。当达到已知与污染物中的可接受降低相关的活性水平时，则认为该处理是有效的。如果污染物是感染因子，则认为样品是无菌的。在本发明的一个特殊应用中，热稳定激酶是指示一种因子(例如，感染因子)在清洁步骤或失活步骤之后可能存在的方法中的报告物。首先，含有热稳定的腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶的样品被暴露于清洁/失活程序(例如，选择的温度、pH值或蛋白酶浓度中的一种或多种)。随后的步骤是通过热处理去除任何污染的酶活性，例如，在60至80℃，至少10分钟(即，在不明显影响热稳定激酶的条件下)。随后使热稳定激酶在30℃至70℃与底物(例如ADP)反应，使得ATP产生。ATP的形成可以通过生物发光检测而测定，其中应用萤光素/萤光素酶和合适的发光计，在20-30℃测定10分钟至1小时。发光计的读数给出了残余激酶活性，即，暴露于清洁/失活处理后的激酶活性的读数。根据以前的单独试验得到的数据，该方法通过将残余激酶活性与被处理样品中的传染因子的可能性存在相关联而完成。在一种实施方案中，在指示物加入之前，样品中的污染性酶活性或ATP可以通过起始处理步骤(例如，选择的温度、pH值或蛋白酶浓度)被去除。已经发现激酶能够产生可以在极宽范围内检测的信号。一般而言，激酶是应用含有ADP的底物被检测的，ADP转变为ATP，ATP本身被用于产生光，例如，应用萤光素/萤光素酶，用发光计检测。宽范围使得指示物特别适于验证，原因是激酶甚至在量/活性降低许多个对数级时保持可检测。对于灭菌，大多数国家机构(nationalinstitutes)认为生物因子的量或活性降低6个对数级是验证灭菌状态所需的。本发明的激酶提供了验证因子的量或活性的降低程度充分超过6个对数级、至8个对数级和更多的潜能，因而增加了目前提供的监测范围。在本发明的优选实施方案中，激酶是热稳定的，因此适于在验证高温下进行的过程中应用。也发现热稳定激酶对其它极端环境具有抗性，并且例如，通常发现其对极端pH值具有抗性和对暴露于蛋白水解酶具有抗性。因此本发明的激酶可以被用来监测生物因子的处理，所述处理应用高pH值、高温和蛋白酶中的一种、其组合或全部。热稳定意味着，暴露于70℃30分钟后，保留至少95％的激酶活性。本发明的优选酶非常热稳定，并且在加热至80℃10分钟后将保留至少95％的活性。来自嗜温生物、甚至是多种嗜热生物如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的激酶(广泛用作生物指示物)不满足这些标准，但是适于用作在较低温度下进行处理的指示物。在本发明特定实施方案中应用的激酶是腺苷酸激酶、乙酸激酶和丙酮酸激酶，或它们的组合。进一步地，腺苷酸激酶、乙酸激酶或丙酮酸激酶可以从激烈热球菌(Pyrococcusfuriousus)、P.abyssi、P.horikoshii、沃氏热球菌(P.woesii)、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)、嗜酸热硫化叶菌(S.acidocaldarius)、芝田硫化叶菌(S.shibatae)、Rhodothermusmarinus、Thermococcuslitoralis、Thermatogamaritima、Thermatoganeapolitana和甲烷球菌各种(Methanococcusspp.)得到。腺苷酸激酶是特别优选的，用在下面详述的本发明实施例中。激酶催化ATP从含ADP的底物中形成，随后容易地用已知方法和试剂检测ATP。适用于本发明的具体激酶在SEQIDNO.s1-30中列出。ATP生物发光检测是测定激酶活性的优选方法。标准的萤光素-萤光素酶分析方法可以检测少至10-15摩尔的ATP。通过偶联酶扩增与生物发光检测方法，能够检测少至10-20摩尔的激酶。这种类型的形式从而提供了检测分子的显著灵敏性，其中应用与腺苷酸激酶(AK)连接的结合物质种类(bindingspecies)，如WO02/053723中所述。偶联于生物发光检测的激酶、例如AK的应用，具有许多其它的明显优势。本分析在比其它类似分析形式相比大得多的范围内，给出了酶活性和光产物之间的直接关联。因此，虽然应用传统报告酶如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的分析将在5-6个对数的稀释范围内得到成比例的反应，但AK-萤光素酶分析可以提供至少8个对数级的动态范围。作为直接指示物，这使得它们对于需要失活水平高于标准的6个对数级范围的过程特别有用，因为其可以使信号在整个分析范围内有意义，这在应用其它分析形式时有些不可能。这与在更坏的情况下，多如8个对数级的传染性存在于外科器械表面时的TSE失活特别相关，假定存在每mg高达108传染单位水平的1mg脑组织。在这些情况下，提供8个对数级的信号范围的本发明指示物是特别有价值的。假定过程类型需要TSE指示物，则优选高水平的热稳定性和物理稳定性。在下面的实施例中，比较了来自嗜热生物体的一系列AK酶的性质。甚至来自嗜热生物体如指示菌株嗜热脂肪芽孢杆菌的AKs在相对低的温度下丧失其大部分活性。对于欲包含在例如高压灭菌循环中的基于激酶的指示物，应用显著增强的热稳定性程度，如被来自硫化叶菌属(Sulfolobus)的种或激烈热球菌的酶所证明。对于增加酶、例如激酶对热失活的稳定性的许多添加剂和对制剂的改变，是本领域技术人员已知的。鉴于本发明实施方案中应用的热稳定激酶已经比这种过程类型中应用的其它酶明显更加稳定，它们将需要明显少的稳定作用。本文描述的AK酶，特别是来自嗜酸热硫化叶菌、硫磺矿硫化叶菌、芝田硫化叶菌、激烈热球菌、Rhodothermusmarinus和Thermococcuslitoralis的AK酶，在80℃和90℃时明显更加稳定，这是与甚至来自通常用作灭菌过程指示物的生物体如嗜热脂肪芽孢杆菌的酶相比而言的。在许多情况下，被固定在固体支持物上的这些AK酶不需要进一步稳定以提供欲在例如高压灭菌、巴氏灭菌或等价方法之后测定的所需活性范围。稳定剂，如高达4M浓度的山梨醇，或高达2M浓度的其它多元醇如乙二醇、甘油，或甘露醇的添加可以改进酶的热稳定性。其它添加剂如木聚糖、海藻糖、明胶也可以单独或联合提供附加的稳定效应。一定范围的二价金属离子，最主要是Ca2+、Mg2+或Mn2+的添加也可以改进酶稳定性。也可以用对酶的化学修饰改进它们的热稳定性。用乙醛酸对表面暴露的氨基进行还原性烷基化(例如，Melik-Nubarov(1987)BiotechIetts9725-730)、向蛋白质表面加入碳水化合物(例如，Klibanov(1979)Anal.Biochem.931-25)和酰胺化(例如，Klibanov(1983)Adv.Appl.Microbiol.291-28)，均可以增加酶的稳定性。用于酶固定的其它方法—包括应用化学交联剂和应用多种聚合物支持物—也是增加酶的热稳定性的相关方法(在Gupta(1991)Biotech.Appl.Biochem.141-11中综述)。相似的修饰也与指示物对其它灭菌过程如过氧化氢或臭氧的稳定相关。特别地，气态杀菌剂向酶接近受到限制的过程，将在需要时提供增加酶稳定性的有用方法，所述限制是例如，受到包封在合适聚合物中或与降低气体渗透的添加剂配制的限制。有效增强酶的热稳定性的许多处理也与对蛋白酶处理的稳定性相关，例如，用于开发通过蛋白酶处理有效失活TSE因子的指示物。一般而言，表现出高水平热稳定性的蛋白质对降解过程如变性或蛋白酶处理也可能表现出高度的稳定性(参见，例如，DanielRM，CowanDA，MorganHW，CurranMP，″Acorrelationbetweenproteinthermostabilityandresistancetoproteolysis″，BiochemJ.1982207641-4；ReesDC，RobertsonAD，″Somethermodynamicimplicationsforthethermostabilityofproteins″，ProteinSci.2001101187-94；BurdetteDS，TchernajenckoVV，ZeikusJG.′EffectofthermalandchemicaldenaturantsonThermoanaerobacterethanolicussecondary-alcoholdehydrogenasestabilityandactivity″，EnzymeMicrobTechnol.20002711-18；ScandurraR，ConsalviV，ChiaraluceR，PolitiL，EngelPC，″Proteinthermostabilityinextremophiles″，Biochimie.1998Nov；80(11)933-41；和LiaoHH.，″ThermostablemutantsofkanamycinnucleotidyltransferasearealsomorestabletoproteinaseK，urea，detergents，andwater-miscibleorganicsolvents″，EnzymeMicrobTechnol.1993Apr；15(4)286-92)。从而，与等价的嗜温性激酶相比，热稳定激酶通常表现出对设计用来失活TSE因子的蛋白酶处理行为的更高的稳定性。根据应用的过程的类型，也可以选择激酶，以便满足过程的其它特性。因此，对于碱性pH下的蛋白酶处理，方案趋向于应用来自中度嗜碱生物如激烈热球菌的热稳定激酶，而在酸性pH下的蛋白酶处理可能应用来自嗜酸性生物如嗜酸热硫化叶菌或硫磺矿硫化叶菌的激酶。如果需要改进激酶指示物对蛋白酶处理的稳定性，存在许多其它选择。这些选择中的许多与上述针对热处理稳定酶的方法相同。例如，含有山梨醇、甘露醇或其它复合聚合物的制剂降低指示物表面的酶的失活水平。此外，特异性降低蛋白酶底物降解速率的处理与此用途特别相关。例如，在含有充当可选的蛋白酶底物的、最高达约10mg/ml(超过优选的指示物浓度10倍)的合适的载体蛋白如酪蛋白或清蛋白的溶液中的激酶制剂，将特异地降低激酶指示物的消化速率。类似地，向制剂中加入游离氨基酸如甘氨酸、酪氨酸、色氨酸或二肽将提供在底物水平对酶抑制的方法并降低激酶指示物的局部失活。本发明还提供了通过在细菌中重组表达产生多种热稳定激酶的方法，所述激酶用作生物指示物。已经显示，酶的遗传修饰使热稳定性显著增加，通过类比，这样的突变也可能显著增强指示物酶在其它过程，如蛋白酶处理或气态“灭菌”中的稳定性。在图1中显示的、采用三聚体(古细菌)AKs的已经确定的3-D结构(Vonrheinetal(1998)J.MoI.Biol.282167-179andCriswelletal(2003)J.MoI.Biol.3301087-1099)，对激酶热稳定性进行比较，鉴定出影响酶稳定性的氨基酸。表现出改进热稳定性的激酶的遗传工程变体也在本发明中被提供和应用，并且可以通过许多方法产生。这些主要涉及认为形成三聚体分子的中央核心堆积区(centralcorepackingregion)的氨基酸的特定的位点定向诱变和随机“定向进化”方法，其中整个分子经历随后的诱变和对具有改进性质的分子进行选择/筛选的循环。本文中描述的修饰，例如，在实施例8-10中描述的修饰，是基于杂交方法，其中根据观察到的结构相关分子之间的差异，应用基于共有序列的方法，确定出可能影响酶的热稳定性的区域。随后通过将确定变化引入与最佳热稳定性相关的氨基酸，或者在确定为热稳定性所必须的位置处引入每一可能的氨基酸的随机替换。本发明的特定修饰酶是实施例8-10中列出的多种变体，将它们共同称作SEQIDNOs17-19(尽管几种变体被每一参考符号所包含)。生物指示物可以适当地用在处理样品的容器中。例如，指示物包括为基质的固体支持物，激酶分散在所述基质中。基质应当耐受处理条件，并且有助于为来自处理的激酶提供保护—因而对指示物提供一些稳定作用。激酶可以位于聚合物基质中。支持物可以被设计为，射入或加入到处理容器中，其可以是指示条(indicatorstrip)、蘸棒(dipstick)或珠子。本发明中包含多种支持物，其带有或不带有化学修饰并带有多种制剂中的一种或多种激酶指示物，这取决于，例如，待验证过程的需要。在一种形式中，支持物是作为固定装置的塑料、陶瓷、钢或其它金属或聚合物表面，激酶在其上被干燥。支持物可以是聚碳酸酯、聚苯乙烯或聚丙烯条或蘸棒，其可能具有平坦表面，激酶被施加在该表面上。带有用于连接激酶的多孔表面的其它类型的支持物作为气态过程的指示物也特别有用。包被了激酶的塑料、金属或陶瓷珠子也可以为指示物提供有价值的形式，这也具有监测气态过程的特定相关性。对于一些用途，这些支持物比固体支持物有优势，因为它们为连接指示物提供了明显增加的表面积。对于制备用于验证TSE失活过程的设备的特定实例，钢表面如棒(rod)、盘(disk)或切片(coupon)是外科器械除污染的有效指示物。例如，热稳定腺苷酸激酶的结合是疾病相关朊病毒异构体的聚集形式(PrPSc)的非常好的模式，如此提供了显著好的PrPSc与手术钢表面相互作用的指示物。激酶在指示物的支持物上结合或向指示物的支持物的结合可以通过用于将蛋白质连接到表面上的常规方法获得，例如，将蛋白质在0.1M碳酸氢钠缓冲液中，在约pH9.6，在室温下温育约1小时。可选地，用本领域技术人员已知的宽范围的偶联化学中的任意方法，将蛋白质与表面共价偶联。例如，与SPDP(Piercechemicals；采用制造商的指导说明)衍生化、用DTT还原，以提供游离巯基用于交联的腺苷酸激酶，被共价连接到带有马来酰亚胺表面的聚苯乙烯支持物。带有这样的巯基结合表面的塑料表面在文献中充分描述。这种偶联方法的另外的益处是，如果需要，可以将酶从支持物切割出来，例如，通过用DTT或MESNA还原，以使得单独对任何指示物支持物进行分析。本发明描述的腺苷酸激酶和其它指示物激酶具有如下性质它们在衍生化并与这些支持物交联后保持活性。可选地，应用聚苯乙烯或聚碳酸酯支持物上的胺活性表面，其中应用双功能交联剂如单体戊二醛，以通过蛋白质上的游离胺基为激酶提供直接的不可切割交联。也可以应用紫外线(UV)处理直接将指示物连接到合适的支持物。可以用与塑料表面相似的方法处理钢表面，用以介导指示物激酶的共价连接。宽范围的蛋白交联剂可以从各个公司得到，如Piercechemicalcompany(Perbio)。对巯基、氨基、羟基和羧基有活性的试剂被设计成偶联蛋白质，但是它们可以被相等地用于将蛋白质交联到天然有活性的或包被的固体支持物如塑料、其它聚合物、玻璃和金属。也可以利用将酶交联到糖的活性化学物。例如，可以用试剂BMPH((N-[β-马来酰亚胺基丙酸]酰肼·TFA)、KMUH((N-[k-马来酰亚胺基十一酸]酰肼)和MPBH(4-(4-N-马来酰亚胺基苯基)丁酸盐酸酰肼)(4-(4-N-Maleimidophenyl)butyricacidhydrazidehydrochloride)将含有游离巯基的激酶与糖交联，其中巯基的形式或是半胱氨酸残基或是还原产生巯基活性基团的化学衍生蛋白质。这对于固体支持物可能特别重要，所述支持物是复合糖(例如纸、基于纤维素的膜、凝胶或树脂)或者可以用糖溶液包被或处理，产生适当的活性表面。对于每种类型的支持物，激酶优选地在增强结合和/或稳定结合的蛋白质的溶液中配制。这样的制剂包括含有多达10％(w/v)蔗糖、山梨醇、甘露糖、纤维素或聚乙二醇(PEG)的溶液。此外，激酶可以被配制为施加在合适支持物的表面或腔内的凝胶的一部分。实例包括藻酸盐、琼脂或聚丙烯酰胺基质。指示物也可以包括稳定激酶的制剂，合适的稳定剂选自金属离子、糖、糖醇和凝胶形成剂。为了协助指示物的应用，还可以包括将指示物连接到表面的装置，如突出部分、凹入部分或孔，用于通过工具如螺钉、螺帽和螺栓或夹具将支持物连接到表面。在本发明的特定实施方案中，将纯化的激酶如腺苷酸激酶(AK)，配制成高达1mg/ml的浓度，并包被在固体支持物上。优选地，将1-2mg或0.5-1mg或0.1-0.5mg或0.1mg的激酶包被在固体支持物上。对于蛋白酶处理，可以使激酶干燥在类似于微量滴定板的聚丙烯、聚碳酸酯或聚苯乙烯表面上。对于121℃15-20分钟的标准高压灭菌或134℃18分钟的“朊病毒循环”高压灭菌，可以应用热稳定性支持物如不锈钢。对于气态失活步骤如过氧化氢或臭氧，可以应用聚碳酸酯固体支持物，其也可以被配制为多孔基质，以便在需要时，对失活剂提供更高程度的抗性。方便的固体支持物采用蘸棒形式，其从失活步骤直接被转移到含有全部所需分析成分的管中。这可以是与食品和制药工业市场上已有的众多“快速读出(rapidread-out)”卫生监测器中的其中一种监测器相连的管式发光计(tubeluminometer)。可选地，它可以采用为研究中的指示物设计的专用设备形式，特别着重于保持热稳定酶所需的最佳温度(参见实施例24)。本发明也提供了生物指示物，包括在生物因子经历不同水平失活作用后可以检测的多种酶。一种实施方案的生物指示物包括支持物、位于第一位置的第一酶和位于第二位置的第二酶，第二位置与第一位置分开。第一酶和第二酶都具有将产物转变为底物的活性，并且在生物指示物暴露于失活过程起始时间段之后，两种酶的活性均可以被检测。在生物指示物暴露于失活过程随后一段时间后，第一酶的活性不能被检测到，但是第二酶的活性可以被检测。在生物指示物暴露于失活过程又一随后时间段后，第二酶的活性不能被检测到。本实施方案的优势是，可以用指示物表示由过程得到的生物因子的大致失活水平，而无需采取精确的测定。因此，例如，当可以测定两种酶时，这可以表明，失活没有达到一定的阈值。当仅可以测定第二酶时，这表明，失活的第一阈值已经达到，但还没有达到第二阈值。最后，当两种酶均不再测得时，这表明，失活已经经过了第二阈值。如果第一酶在活性降低程度达到6个对数级时可以检测，第二酶在活性降低程度达到8个对数级时可以检测，则能够检测两种酶表明，失活没有达到6个对数级，仅能够检测第二酶表明，活性的降低程度已达到6个对数级和8个对数级之间，两种酶均检测不到表明，活性降低程度达到了至少8个对数级。第一酶适于在活性降低多达5和8个对数级之间时可检测，第二酶适于在活性降低6个对数级或更多时可检测。第一酶优选地在活性降低6和7个对数级之间时可检测，第二酶优选地在活性降低7和8个对数级之间时可检测。生物指示物还可以包括位于第三位置(与第一位置和第二位置分开)的第三酶，其中在生物指示物暴露于失活过程又一随后时间段之后，第三酶可以被检测，并且在生物指示物暴露于失活过程第三个随后时间段之后，第三酶不能被检测。第三酶适于在活性降低8个对数级或更多时可检测。应用具有在不同水平处理中(例如，不同的暴露时间)可检测的多种酶的这种类型的指示物，可以监测失活过程的进展，并且可以容易地预测失活的终点。多酶指示物的优选酶是激酶，更优选地是热稳定的酶，更优选地是如本文中公开和描述的与本发明其它实施方案相关的酶。在本发明的第二方面，提供了试剂盒(任选地是便携式试剂盒)，用于验证降低样品中生物因子的量或活性的处理过程，包括(i)根据本发明第一方面的生物过程指示物，和(ii)激酶的底物。为了对激酶量/活性进行测定，试剂盒可以包括检测ATP的工具，例如萤光素/萤光素酶和任选的发光计。底物优选地是ADP。从前面的对已知生物因子的试验中，可以得出将生物因子的量或活性的降低程度与激酶活性相关联的数据，试剂盒从而也可以包括将激酶活性与指定的一系列生物因子的量或活性的降低程度相关联的一个或多个查询表(look-uptables)。在优选的实施方案中，试剂盒用于监测TSE失活。在本发明的第三方面，提供了验证处理过程的方法，包括(i)获得样品，所述样品含有生物因子，或者怀疑其含有生物因子；(ii)在确定量的激酶存在的情况下，使样品接受处理，其中所述处理降低生物因子的量或活性；(iii)测定残余的激酶活性，可选地，计算激酶活性的降低程度；和(iv)将所述残余活性与预先确定的激酶活性相比较，或者将激酶活性的所述降低程度与预先确定的激酶活性降低程度相比，其中所述预先确定的激酶活性或预先确定的激酶活性降低程度相当于在相同处理条件下，该生物因子量或活性的确认的降低程度。在本文中，激酶可以是本说明书中描述的任一激酶，和/或具有本说明书描述激酶的任意性质。优选地，激酶被配制为根据本发明第一方面的指示物。样品通常在不存在任何激酶的情况下提供，因此方法可以包括，获得认为含有生物因子的样品和加入确定量的激酶。因子可以根本不存在(虽然优选地，已知样品含有生物因子)。验证的要点在于，在进行处理之后，确认曾经可能存在的任何因子已被去除/失活至可接受的程度。典型地，操作者在处理样品之前和处理样品之后测定激酶活性。也可能有污染的激酶，通常是嗜温性激酶，可以在激酶活性分析之前进入样品。因此，优选的是，加入到样品的激酶是热稳定的并且分析步骤包括使嗜温性激酶失活，如在测定残余激酶活性之前，在70℃处理样品至少30分钟，优选地在80℃处理样品至少10分钟。在优选的实施方案中，当在萤光素/萤光素酶存在的情况下用发光计检测时，激酶在处理之前的活性是每千克激酶至少10,000,000相对光单位(RelativeLihtUnit)(RLU)，或者每千克激酶至少8,000,000相对光单位，或者每千克激酶至少5,000,000相对光单位，或者每千克激酶至少3,000,000相对光单位，或者每千克激酶至少1,000,000相对光单位，或者每千克激酶至少500,000相对光单位。在本发明的优选实施方案中，预先确定的激酶活性是小于每千克激酶10,000相对光单位，或者小于每千克激酶1000相对光单位，或者小于每千克激酶500相对光单位，或者小于每千克激酶250相对光单位，或者小于每千克激酶100相对光单位，或者小于每千克激酶10相对光单位，或者小于每千克激酶1相对光单位，或者是每千克激酶0相对光单位。在本发明的优选实施方案中，预先确定的激酶活性降低程度等于或大于激酶活性1个对数级的降低(logreduction)，或者2个对数级的降低，或者3个对数的级降低，或者4个对数级的降低，或者5个对数级的降低，或者6个对数级的降低，或者7个对数级的降低，或者8个对数级的降低，或者9个对数级的降低。在其它实施方案中，预先确定的激酶活性降低程度相当于激酶的量或浓度至少6个对数级的降低，或者7个对数级的降低，或者8个对数级的降低，或者9个对数级的降低。在又一实施方案中，预先确定的激酶活性降低程度相当于RLU降低至少800,000，或至少900,000，或至少950,000，或至少990,000，或至少999,000，或至少999,900，或至少999,990，或至少999,999RLU。在本发明的优选实施方案中，样品中生物因子量或活性的确认降低程度是至少6个对数级，优选地至少7个对数级，更优选地至少8个对数级，最优选地至少9个对数级。在特别优选的实施方案中，持续处理直至残余的激酶活性或激酶活性降低程度相当于至少6个对数级、或至少7个对数级、或至少8个对数级、或至少9个对数级的生物因子量或活性的确认降低程度。在本发明的第四方面，提供了将样品中生物因子量或活性的降低程度与根据本发明第一方面的指示物的激酶活性相关联的方法，包括(i)制备含有确定量的生物因子的样品和含有限定量激酶的样品；(ii)使样品接受处理；(iii)测定残余的激酶活性，可选地计算激酶活性的降低程度；(iv)测定生物因子的残余量或残余活性，可选地计算生物因子的量或活性的降低程度；(v)重复步骤(i)至(v)，其中至少一个处理参数被变化。在一个实施方案中，生物因子和激酶可以在相同的样品中存在。在一个优选的实施方案中，处理参数包括时间、温度、pH值、压力、蛋白酶浓度、和杀菌剂或去污剂浓度中的一种或多种。在一个特别的实施方案中，处理包括在50-140℃，优选地在80-100℃，更优选在134-138℃加热样品；处理参数是时间；通过使样品接受所述处理1、5、10、20、40和60分钟时间，重复步骤(i)至(iv)。在又一实施方案中，处理包括将样品暴露于pH值9-14、优选地pH值12或更高、更优选地约pH12；处理参数是时间；通过使样品接受所述处理1、5、10、20、40和60分钟时间，重复步骤(i)至(iv)。在另一实施方案中，处理包括将样品暴露于浓度是0.5-2mg/ml、优选地是约1mg/ml、更优选地是约2mg/ml的蛋白酶；处理参数是时间；通过使样品接受所述处理1、5、10、20、40和60分钟时间，重复步骤(i)至(iv)。上述方法使得能够制备校准数据，用于进一步用指示物验证对含有或怀疑含有生物因子的样品的处理。许多处理过程的校准描述于在本发明的第五方面，提供了激酶作为指示物的应用，用于验证降低样品中生物因子的量或活性的处理过程。在该上下文中，激酶可以是本说明书中描述的激酶中的任一，和/或具有本说明书中描述的激酶的任意性质。优选地，激酶被配制为根据本发明第一方面的指示物。现在描述应用本发明指示物监测/验证多种过程。在一个实施方案中，应用指示物验证生物洗涤制备物在洗涤循环中的性能(参见实施例14)。虽然洗涤循环的验证将潜在地在家庭环境中应用，其最有优势的用途将是在卫生保健、药学或食品制备环境中，例如，用于验证与遭受或暴露于感染因子(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)或诺沃克病毒/诺沃克类病毒发作)的患者相关的床上用品、外衣或其它物品的除污染情况。在本文中，本发明的指示物的优势是，它与生物材料如血液或其它体液有关。为了验证洗涤循环，通过将合适的激酶交联在柔性棒(flexiblewand)、布条(stripofcloth)或适于包含在循环中的其它材料上，制备指示物。将指示物和其它加载物放入洗涤器。优选地，可以将指示物固定在洗涤器内部上合适的固定器中，以便协助其回收。随后进行洗涤循环，在对加载物进行任意的进一步操作或处理之前，去除指示物并评价指示物，其中应用“读数器(reader)”，读数器已被校准，以便提示指示物中残余激酶活性的可接受水平—可接受水平来自对过程中的合适洗涤性能的在前校准和评定。这种评定可能包括污染(soiling)的总水平和微生物的可存活数，如应用技术人员已知的合适的模式微生物所评定。根据校准的读数，加载物被批准进行进一步处理，或重复洗涤循环。在第二种实施方案中，应用指示物验证病毒失活过程(参见实施例15)。对环境中活病毒分离物的检测是困难的，特别是在与对速度和精确性要求严格的紧急情况相关时。本发明提供了开发出使能够基本上实时监测除污染步骤的指示系统的可能性。这对于在病毒因子爆发(例如，诺沃克类病毒)或蓄意释放(如天花)后卫生保健和相关设施的表面除污染是特别有价值的。验证病毒失活过程的指示物可以采取多种不同形式，例如，用于监测喷洒或浸入杀病毒剂的区域的棒或蘸棒，或者用于监测气态除污染过程的悬浮指示物。可选地，指示物激酶可以在除污染之前被喷洒在表面上，随后通过擦拭该表面评定残余激酶活性水平。在本发明的又一实施方案中，应用指示物验证细菌蛋白毒素，植物毒素如蓖麻毒蛋白和其它毒性蛋白质、肽或肽类似物的蛋白酶降解情况(参见实施例16)。蛋白酶表现出降解宽范围蛋白毒素的巨大潜能，所述蛋白毒素是潜在的生物战/生物恐怖袭击制剂，包括肉毒杆菌毒素、炭疽毒素和蓖麻毒蛋白。它们也具有失活宽范围的其它潜在具有毒性的或有害蛋白或肽制剂，从而使得能够对表面/设备除污染或对物质进行安全处理的潜能。在该上下文中，本发明的指示物与待除污染的表面/物质共同接受蛋白酶除污染步骤。在步骤的末期，移去指示物并根据本发明方法评定残余激酶活性水平。随后将残余激酶活性水平与特定蛋白毒素或毒素群的失活指数相关联。假定活性水平等于或低于限定的指数值，则物质可以被安全地处理或者表面/设备被重新使用。优选地，将合适的安全极限设置在失活指数的校准中，使得允许过程性能的任何变化。本发明的中应用的酶的附加稳定性使其比宽范围的其它酶指示物更确定地和更动态范围地进行，所述其它酶指示物包括那些来自“热稳定”生物如嗜热脂肪芽孢杆菌的指示物，如显示AKs形式嗜热生物的相对热稳定性的数据所示(图1，实施例2)。也可以用指示物验证洗净药物生产设备中的蛋白酶除污染步骤。宽范围的药物产品应用来自人或动物的材料，所述材料可能受到宽范围因子的污染，包括朊病毒(TSE)因子和病毒(例如，西尼罗病毒、肝炎病毒、HIV)。当材料来源是动物来源(例如胎牛血清、马免疫球蛋白)和中间处理期带有增加特定样品中未鉴定病原体浓度的风险时，风险可能被加重。在制造批次之间应用蛋白酶洗净制造设备和装置(例如，层析柱、容器、管)的可能性，具有降低或消除这种风险的潜能，甚至在污染物没有被正式鉴定时。这对朊病毒因子是特别可靠的，例如，具有将感染因子积累和携带进最终产物的显著风险的血液分离设备中的朊病毒因子。为了验证这种类型的步骤，本发明的指示物理想地被设计为欲浸入蛋白酶处理液的蘸棒，或者与待清洁设备排列连接的筒状物(cartridge)。通过在处理后评定指示部件中残余激酶的活性水平，并将其与可接受的清洁水平相关联，可以开发快速和性能可靠的监测器。在本发明的另一实施方案中，应用指示物验证生物因子如TSE的气态失活(参见实施例17)。许多出版物和文章提出了臭氧或其它气态杀菌剂使这种因子失活的潜能，但是，至今为止，没有方法明确表现出是有效的。为了支持此气态技术的开发和引入到卫生保健中，将需要验证该技术的性能的方法。由于因子如TSE已经表现出比传统的病毒或细菌因子对这种形式的失活作用更具抗性，目前可利用的验证气态失活的方法未必合适。本发明着眼于此问题。对于这种类型的失活，通过任何适当方法将指示物激酶连接在固体支持物上，例如，普通吸附和通过酰胺、肽、羰基或半胱氨酸键的化学交联。例如，对于臭氧灭菌，可以应用刚性的聚氯乙烯(PVC)、玻璃、钢、聚酰胺或聚丙烯支持物，激酶通过以前描述的任一化学方法偶联于支持物。随后将指示物包含在待灭菌的一批材料/器械中，暴露于臭氧，并针对设计用来评价待测因子相应失活的适当校准的失活指数进行评定。成功的失活使得能够继续加工或应用材料/器械。指示物可以可选地被连接于管或等价的内部空间的内表面，以至于气体渗透受到限制。这提供了适于评定气体渗透入带有腔的器械的等价空间、或渗透通过填塞的加载物质的监测器。可选地，可以将激酶连接于多孔材料如聚苯乙烯珠子，或者可以将其固定在凝胶或树脂中。在本发明的又一实施方案中，应用指示物验证液体化学灭菌系统(例如，Endoclens)，如用于内窥镜和相关器械的处理(参见实施例18)。宽范围的内窥镜常规用于医疗中，是医学诊断和治疗的重要部分。这些器械极度敏感并且为常规清洁和消毒提出了非常显著的问题。传统地，和在目前的实践中仍然存在的，在用低温方法除污染之前手工清洁内窥镜。已经开发出一些化学消毒剂和自动再处理装置着眼于对器械如内窥镜的敏感部件除污染的特殊问题，传统的高压灭菌对于所述敏感部件是不可能的。这些方法有助于降低难于清洁器械上的污染水平，该污染水平与宽范围的病毒和细菌病原体的医源性传播相关。目前验证这种过程的方法是，监测洗涤溶液的流速和温度。本发明的指示物提供了验证的进一步方法，所述方法提供了内窥镜腔内的实际清洁效率的读数。对于这种类型的验证，指示物被连接于设计为具有和内窥镜管相似的总内径的管的内表面。此指示装置被串联连接于自动再处理装置上的内窥镜。随后用通常的方式处理内窥镜。在处理末期，优选地在将内窥镜从装置中移去之前，分离指示物并评定残余的激酶活性水平。可以将活性水平与从前限定的该过程的可接受性能的阈值相关，根据该评定结果，可以将内窥镜转移用于另外的清洁或除污染或准备应用。如果性能水平不足，则可以用如前述连接的新的指示物再处理器械(用相同和更严格的条件)。指示装置也适于验证内窥镜和/或任何其它带有内腔的器械的手工清洁。在制备用于上述验证的指示物时，优选的是，根据酶的疏水性，使激酶通过非特异性蛋白吸附方法与其支持物粘合。图5说明了不同的重组激酶以此方式与聚苯乙烯粘合的能力。图5也说明了，一些激酶对于这种类型的用途具有更令人满意的性质，例如，与来自T.maritima和A.fulgidus的激酶相比，嗜酸热硫化叶菌激酶对这种类型的表面明显更加粘附。这对于其它类型的表面可以是不同的，特别是对表面的粘附可以通过带电氨基酸残基进行的表面。在此类指示物中，激酶从表面的直接去除是评价清洁性能的决定性特征，而不是对激酶的任何变化或修饰。如此，这类“吸附的”指示物在评定洗涤性能中有非常宽范围的应用。这对于验证从设备如内窥镜的内腔有效去除生物膜的过程的能力是特别重要的，因为认为它是影响性能的关键因素之一。如此，可以用合适的非感染生物膜作为激酶的基质，优选地应用血清、蔗糖溶液、含水凝胶或刺激生物膜的其它工具，以便确保该过程有效针对对此污染形式。适于验证这种过程的其它类型的指示物与以前描述的那些指示物相似，其中激酶被共价连接于支持物表面，产生化学连接如二硫键、酰胺键或羰基键。在这些情况下，洗涤和/或灭菌的效果通过修饰激酶被施加，以至于激酶不再有活性。这将与通过断裂肽键、交联蛋白质或破坏蛋白质结构的其它方法起作用的化学杀菌剂特别相关。在本发明的进一步实施方案中，应用指示物监测洗涤器-消毒器中的常规的清洁性能，如在医院中应用的那些洗涤器-消毒器(参见实施例19)。在本发明的另一实施方案中，应用指示物监测戊二醛或邻苯二醛(ortho-phthaldehyde)(OPA)处理。多年来，戊二醛和甲醛已经被广泛用作杀菌剂。化学消毒剂通过以非特异方式多重交联蛋白质，以破坏其功能而起作用。近来，出现邻苯二醛(OPA)作为此家族的新的消毒剂，由于它避免了与戊二醛有关的一些毒性问题而被广泛应用。本发明的指示物适于监测所有这种类型的化学消毒剂，原因是激酶对这种类型的非特异性交联敏感。在这种类型的指示物中，激酶被共价连接于合适的表面并与待灭菌的其它物品共同暴露于化学杀菌剂。过程的效率通过移去指示物并测定残余激酶活性来评定。将此活性与表明该过程正确性能的限定阈值相比较。不同类型激酶的应用可以为过程提供附加的敏感性或灵敏度，如不同用途中可能所需的。本申请中描述的热稳定腺苷酸激酶可以根据其分子结构被广义地归为两类。因此，来自硫化叶菌各种的酶是具有含中央疏水核心的三聚结构的酶的例子，所述中央疏水核心是在高温下维持其活性的主要决定因素。第二类酶是单体酶，由来自Thermotoga各种的腺苷酸激酶示例，但是具有略微更长的多肽链，所述多肽链带有影响活性部位的附加的“盖(lid)”结构域。这些不同类型的热稳定酶将对这类化学杀菌剂表现出不同的敏感性，这是由于在酶作用期间它们的肽链的可变的柔性。对于任何特定的杀菌剂和/或浓度，经验筛选将鉴定出具有适当灵敏度的酶，用于监测和验证这些类型的化学品。在本发明的进一步实施方案中，应用指示物作为环氧乙烷、过氧化氢或其它气态过程的超速读出监测器。目前，宽范围的气态杀菌剂被许多制造商用于细菌和病毒因子的常规消毒。本发明方法利用气体的氧化性质来破坏肽键。如此，本发明的激酶，以它们的坚韧的理化性质，对提供非常快速的失活读出是理想的。该实施例中的指示物与之前描述的那些指示物相似，例如，与因子如TSE的臭氧失活相关的指示物。杀菌和除污染过程中的特别有挑战性的问题是验证大量液体的杀菌情况的能力，这可能在制造许多药品或其它药物制品中是必需的。虽然目前的方法监测特定过程的温度、时间、和/或压力参数(根据其精确性质)，但验证大量液体中的实际杀菌情况的可利用方法极少，如果存在这种方法的话。这在甚至约1升体积内是困难的，而在更大体积下几乎是不可能的。本发明提供了许多解决此问题的可能方案(参见实施例20)。在最简单的形式中，可以将激酶加入待灭菌的液体中，激酶的浓度适于测定过程末期激酶失活的限定水平和使该水平等同于灭菌状态。虽然这在一些类型的过程中可能不是所希望的，激酶的惰性性质和等同酶活性在所有生物体中的普遍存在，使其可以接受。可接受性可以通过下列事实得到改进许多热稳定酶是被高度浓缩，因此在接种到动物中之后具有非常低的免疫源性。当这种直接添加不可接受时，可以将激酶这样加入大量液体中在透析袋、多孔容器中、或固定在合适的支持物上，以至于没有激酶部分被释放到大量液体中，但是灭菌条件以与对全部样品相同的方式在指示物上起作用。包含或固定蛋白质，以允许液体样品全面扩散但是限制指示物样品移动的宽范围的可能方法，将是本领域技术人员已知的。可能的示例包括但不限于透析膜、Visking管(Viskingtubing)、多孔膜、蛋白结合树脂、刚性凝胶或如对所论述的其它指示物所描述的固体支持物。可以用前述任一方法，将指示物连接于表面，或仅包封在合适的膜中而不连接，这样，可以在过程结束时将指示物简单地从大量液体中移出。定义部分术语“生物因子”(biologicalagent)包括感染因子和非感染因子。与本发明相关的生物因子的具体例子包含细菌、病毒、芽孢、蛋白质、肽和朊病毒(感染性PrPSc形式和非感染性PrPSc形式)，也包含实施例14-20中描述的特定因子。在本发明的优选实施方案中，生物因子是传染性海绵状脑病。术语“处理”(treatment)或“处理过程”(treatmentprocess)包括设计用来降低样品中生物因子量或活性的任何过程。合适的处理包括下列中的一种或多种选择的pH值、温度或压力，将样品暴露于蛋白酶或其它酶，将样品暴露于去污剂、化学杀菌剂或气态杀菌剂。在优选的实施方案中，将处理设计为，降低感染性生物因子如TSE的感染活性(也称为感染性)。在特别优选的实施方案中，处理包括将样品暴露于蛋白酶，温度是50-120℃之间、优选地是60℃或更高、更优选地是100℃或更高，和/或将样品暴露于至少9的pH值下、优选地pH值是至少12。术语“处理”也包括清洁和失活过程如利用湿蒸气或干蒸气的高温高压灭菌、臭氧灭菌、H2O2灭菌、熔解(rendering)或设计用于消除或失活生物因子的其它方法。术语“样品”(sample)包括任何物品、器械、表面、流体或材料。示例包括但不限于，外科器械和医疗器械、医院衣物、床上用品、大量液体、收集的动物材料、药品、工作台、墙壁和地板。术语“RLU”意味着相对光单位(RelativeLightUnit)。本领域技术人员将了解，相对光单位是相对的而不是绝对的测定值。说明书中给出的图涉及用带有进样系统的BertholdOrion96孔微孔板发光计，用“闪光型(flash)”光测定法取得的测定值，在加入萤光素/萤光素酶试剂后即刻2秒钟测得(光电倍增管的技术规范测定在波长300-650nm发出的光)。为了着眼于此问题，制造商生成了用于RLU“因数”的数据，这使得能够针对校准过的标准品对给定发光计产生的数据进行标准化。因此，可以在不同器械间进行比较。本说明书描述的试验中应用的BertholdOrion96孔微孔板发光计的RLU因数是1。因此，本说明书给出的RLU值可以被认为是标准化的/规格化的(standardized/normalised)RLU值。关于绝对值，RLU值可以与得到所述值所需的ATP浓度相关，其中应用方法(例如，实施例1的方法)中描述的试剂。作为近似的转变，给出RLU值和ATP浓度之间的线性关系，可以应用下列值现在用下列实施例中的具体实施方案并参考所附的附图详细描述本发明，其中图1示出了在70℃(A)、80℃(B)和90℃(C)处理后腺苷酸激酶(AK)的活性；图2示出了用不同浓度的碱性蛋白酶消化腺苷酸激酶(AK)后的残余酶活性；和图3示出了关联腺苷酸激酶(AK)的酶活性和残余浓度的标准曲线。图4示出了在大肠杆菌中重组表达的一系列AK酶的热稳定性。编码AK酶的基因如实施例4所述被克隆和表达。所有的基因都是从载体pET28a表达的，除了嗜酸热硫化叶菌克隆I是如前述从pET3a表达的。每一克隆的表达水平相似，但是一定比例的激烈热球菌(Pyrococcusfuriosus)(P.fu)酶在不可溶部分中，这可能降低了被分析的酶量。重组酶的热稳定性是在从1mg/ml细胞总蛋白起10倍连续稀释的粗提大肠杆菌裂解物(这样，柱12相当于1fg/ml总蛋白)中，80℃温育30分钟后测定的。来自Thermotogamaritima和Archaeoglobusfulgidus的酶表现出比检测的其它酶明显高的稳定性，尽管残余酶(Sulfolobussolfataricus(S.soP2)、Aeropyrumpernix和P.fu)表现出与用作前面分析的基础的嗜酸热硫化叶菌酶(数据表示为S.acI)相似的活性。图5示出了热稳定腺苷酸激酶(tAK)与固体支持物的差异性结合。为了评定纯化的重组热稳定腺苷酸激酶与固体支持物的相对结合，说明它们用于直接吸附型指示物的潜在应用，评价了酶与封闭平板的结合。标准聚苯乙烯微量滴定板的表面通过加入5％脱脂奶而被封闭。去除脱脂奶，将来自Archaeoglobusfulgidus(Afu)、Thermotogamaritima(Tma)和嗜酸热硫化叶菌(Sac)的tAKs的稀释物施加在平板上。洗涤之后，如标准分析方法所述(实施例1)测定结合的tAK的量。结果表明，与其它两个可选的tAKs中任意一个相比，SactAK对封闭平板表现出显著高的结合。虽然酶的具体活性不同，但Afu和TmatAKs都表现出比SactAK更高的活性，如此，结合的实际差异甚至比图中显示的更大。由于脱脂奶是普遍应用的用于降低蛋白质与平板结合的封闭试剂，这些结果表明，SactAK具有疏水性吸附于这些试验中应用的表面(聚苯乙烯)的极强倾向性。酶的这种性质—类似于对朊病毒分子与钢表面所观察到的—意味着，它是评定宽范围TSE失活和/或去除过程的极有效的指示物。图6示出了失活朊病毒的蛋白酶消化处理的校准曲线的绘制。图7示出了失活朊病毒的气态臭氧处理的校准曲线的绘制。图8示出了去除标准污染物的医院洗涤器-消毒器的校准曲线的绘制。图9示出了对手持式卫生监测器的修改，以便使得能够快速读出对tAK指示物的评价。SEQID1来自硫磺矿硫化叶菌的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID2来自嗜酸热硫化叶菌的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID3来自Sulfolobustokodaii的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID4来自激烈热球菌的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID5来自Pyrococcushorikoshii的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID6来自Pyrococcusabyssi的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID7来自Methanococcusthermolithotrophicus的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID8来自Methanococcusvoltae的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID9来自Methanococcusjannaschii的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID10来自Methanopyruskandleri的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID11来自Methanotorrisigneus的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID12来自Pyrobaculumaerophilum的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID13来自Thermotogamartima的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID14来自敏捷气热菌(Aeropyrumpernix)的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID15来自Archaeoglobusfulgidus的腺苷酸激酶的蛋白序列。SEQID16来自Pyrococcusabyssi的腺苷酸激酶(单体腺苷酸激酶(AdkE))的蛋白序列。SEQID17来自激烈热球菌的腺苷酸激酶的蛋白序列，所述激酶被遗传工程改造以提供改进的稳定性。SEQID18来自Pyrococcushorikoshii的腺苷酸激酶的蛋白序列，所述激酶被遗传工程改造以提供改进的稳定性。SEQID19来自嗜酸热硫化叶菌的腺苷酸激酶的蛋白序列，所述激酶被遗传工程改造以提供改进的稳定性。SEQID20来自Thermatogamantlma的乙酸激酶的蛋白序列。SEQID21来自Pyrococcushorikoshii的丙酮酸激酶的蛋白序列。SEQID22来自硫磺矿硫化叶菌的丙酮酸激酶的蛋白序列。SEQID23来自Thermotogamaritima的丙酮酸激酶的蛋白序列。SEQID24来自激烈热球菌的丙酮酸激酶的蛋白序列SEQID25来自Methanosarcinathermophila的乙酸激酶的蛋白序列。SEQID26编码来自嗜酸热硫化叶菌的腺苷酸激酶的DNA序列。SEQID27编码来自嗜酸热硫化叶菌的腺苷酸激酶的DNA序列，其中已经优化了密码子使用，用于在大肠杆菌(E-coli)中表达基因。SEQID28编码来自Thermotogamaritima的腺苷酸激酶的DNA序列。SEQID29编码来自Thermotogamaritima的腺苷酸激酶的DNA序列，其中已经优化了密码子使用，用于在大肠杆菌中表达基因。SEQID30编码来自Archaeoglobusfulgidus的腺苷酸激酶的DNA序列，其中已经优化了密码子使用，用于在大肠杆菌中表达基因。实施例1对嗜酸热硫化叶菌AK的分析方案指示物是合适固体支持物上的100微升的1mg/ml腺苷酸激酶制剂，并且按需要接受处理过程。热失活步骤是任选的。这包括将样品加热至指示物AK许可的温度，但在高于其中任何嗜温性AKs均被变性的温度。典型地，通过在80℃温育10分钟实现这一步骤。洗涤步骤是可选的，可以并入此步骤，以便在发现用于实施处理的任何痕量物质干扰分析时，去除该痕量物质。随后向含有ADP底物(例如，得自Celsis，Biothema，Promega的试剂)的管中加入指示物，浓度是13.5μM，在15mMMgAc、1mMEDTA缓冲液pH6.8中稀释，并在70℃温育20分钟。冷却样品至室温，加入萤光素/萤光素酶底物(ATP试剂，ThermoLifeScience)。温育分析物一段所需的时间，用发光计读取样品。实施例2天然腺苷酸激酶的纯化从24个不同嗜热和嗜高热微生物(表1)产生生物材料。表示出八种古细菌成员和十六种不同的好氧菌和厌氧菌。通过利用选择性吸附和解吸附的亲和层析—来自CibacronBlue3A(BlueSepharose)—纯化出来自这些生物体中每一种的AKs。经过凝胶过滤进一步表征和纯化(SuperdexG200)所有的酶。这使得能够鉴定主要的AK部分和估计分子量。实施例3分析天然腺苷酸激酶的热稳定性评价从来自嗜热性生物体的生物材料分离的天然腺苷酸激酶在70℃、80℃和90℃的热稳定性，结果表示在图1中。通过利用选择性吸附和解吸附的亲和层析—来自CibacronBlue3A(BlueSepharose)—从生物材料分离出腺苷酸激酶。将从柱子洗脱的样品稀释1∶10000倍，随后将每一样品10μl加入微量滴定孔。将2.5μl的腺苷三磷酸双磷酸酶加入到每孔，用以破坏洗脱缓冲液中存在的ATP，在37℃温育30分钟。于65℃热处理20分钟，使腺苷三磷酸双磷酸酶失活。加入ADP底物，在70℃(图A)、80℃(图B)或90℃(图C)温育30分钟并冷却至25℃，随后加入10μl的D-萤光素-萤光素酶试剂。产生的ATP测定为平板上发光计上的RLU。实施例4重组腺苷酸激酶的表达和纯化得到表达代表性热稳定AKs的克隆，产生来自嗜热嗜酸古细菌，嗜酸热硫化叶菌和嗜热性细菌，嗜热芽孢杆菌的重组热稳定AKs。将质粒转移到大肠杆菌中，细胞提取物在相应于期望的AKs分子量处显示出含有蛋白条带。在合适的温度下(对于嗜酸热硫化叶菌AK是80℃，对于嗜热芽孢杆菌AK是60℃)温育后，测定热稳定AK的活性。建立对两种热稳定AKs的纯化方法，其包括在80℃温育20分钟进行初步的热处理，以便失活和凝集来自大肠杆菌的蛋白质，随后进行亲和层析和凝胶过滤。亲和层析包括使酶吸附于BlueSepharose，随后用低浓度AK辅因子(AMP+ATP和镁离子)特异性地洗脱。洗脱缓冲液中的ATP和AMP(Sigma)通过与嗜温性腺苷三磷酸双磷酸酶温育而降解，嗜温性腺苷三磷酸双磷酸酶经随后的热处理容易地失活。凝胶过滤层析被提高至利用制备级Superdex柱，以使得能够制备大量的两种酶。设计引物，用于对来自筛选候选的天然酶期间鉴定出的嗜热性生物的AK基因进行PCR扩增。用分别确定的生长条件培养热稳定微生物，分离基因组DNA，将其用作PCR扩增每一生物体腺苷酸激酶基因的模板。将经PCR扩增的来自嗜热性生物Thermotogamaritima、Aeropyrumpernix、嗜酸热硫化叶菌和硫磺矿硫化叶菌的腺苷酸激酶基因亚克隆入载体pET28a，并转化入表达稀有tRNAs的密码子增强的大肠杆菌菌株(codonenhancedE.colistrain)(Zdanovskyetal，2000)。此大肠杆菌菌株适于增强富含AT的基因的表达水平。转化成功与否通过小量表达试验(mini-expressionstudy)评定，通过对与IPTG温育之前和之后的培养上清进行SDS-PAGE来分析结果。也在包含热处理步骤之后用SDS-PAGE分析上清液，热处理步骤由在SDS-PAGE凝胶上跑胶之前加热样品至80℃20分钟，以去除样品中存在的对热不稳定的蛋白质所构成。序列SeqIDs1-来自硫磺矿硫化叶菌的腺苷酸激酶MKIGIVTGIPGVGKTTVLSFADKILTEKGISHKIVNYGDYMLNTALKEGYVKSRDEIRKLQIEKQRELQALAARRIVEDLSLLGDEGIGLIDTHAVIRTPAGYLPGLPRHVIEVLSPKVIFLLEADPKIILERQKRDSSRARTDYSDTAVINEVIQFARYSAMASAVLVGASVKVVVNQEGDPSIAASEIINSLM2-来自嗜酸热硫化叶菌的腺苷酸激酶MKIGIVTGIPGVGKSTVLAKVKEILDNQGINNKIINYGDFMLATALKLGYAKDRDEMRKLSVEKQKKLQIDAAKGIAEEARAGGEGYLFIDTHAVIRTPSGYLPGLPSYVITEINPSVIFLLEADPKIILSRQKRDTTRNRNDYSDESVILETINFARYAATASAVLAGSTVKVIVNVEGDPSIAANEIIRSMK3-来自Sulfolobustokodaii的腺苷酸激酶MSKMKIGIVTGIPGVGKTTVLSKVKEILEEKKINNKIVNYGDYMLMTAMKLGYVNNRDEMRKLPVEKQKQLQIEAARGIANEAKEGGDGLLFIDTHAVIRTPSGYLPGLPKYVIEEINPRVIFLLEADPKVILDRQKRDTSRSRSDYSDERIISETINFARYAAMASAVLVGATVKIVINVEGDPAVAANEIINSML4-来自激烈热球菌的腺苷酸激酶MPFVVIITGIPGVGKSTITRLALQRTKAKFRLINFGDLMFEEAVKAGLVKHRDEMRKLPLKIQRELQMKAAKKITEMAKEHPILVDTHATIKTPHGYMLGLPYEVVKTLNPNFIVIIEATPSEILGRRLRDLKRDRDVETEEQIQRHQDLNRAAAIAYAMHSNALIKIIENHEDKGLEEAVNELVKILDLAVNEYA5-来自Pyrococcushorikoshii的腺苷酸激酶MPFVVIITGIPGVGKSTITKLALQRTRAKFKLINFGDLMFEEALKLKLVKHRDEMRKLPLEVQRELQMNAAKKIAEMAKNYPILLDTHATIKTPHGYLLGLPYEVIKILNPNFIVIIEATPSEILGRRLRDLKRDRDVETEEQIQRHQDLNRAAAITYAMHSNALIKIIENHEDKGLEEAVNELVKILDLAVKEYA6-来自Pyrococcusabyssi的腺苷酸激酶MSFVVIITGIPGVGKSTITRLALQRTKAKFKLINFGDLMFEEAVKAGLVNHRDEMRKLPLEIQRDLQMKVAKKISEMARQQPILLDTHATIKTPHGYLLGLPYEVIKTLNPNFIVIIEATPSEILGRRLRDLKRDRDVETEEQIQRHQDLNRAAAIAYAMHSNALIKIIENHEDKGLEEAVNELVEILDLAVKEYA7-来自Methanococcusthermolithotrophicus的腺苷酸激酶MKNKLVVVTGVPGVGGTTITQKAMEKLSEEGINYKMVNFGTVMFEVAQEENLVEDRDQMRKLDPDTQKRIQKLAGRKIAEMVKESPVVVDTHSTIKTPKGYLPGLPVWVLNELNPDIIIVVETSGDEILIRRLNDETRNRDLETTAGIEEHQIMNRAAAMTYGVLTGATVKIIQNKNNLLDYAVEELISVLR8-来自Methanococcusvoltae的腺苷酸激酶MKNKVVVVTGVPGVGSTTSSQLAMDNLRKEGVNYKMVSFGSVMFEVAKEENLVSDRDQMRKMDPETQKRIQKMAGRKIAEMAKESPVAVDTHSTVSTPKGYLPGLPSWVLNELNPDLIIVVETTGDEILMRRMSDETRVRDLDTASTIEQHQFMNRCAAMSYGVLTGATVKIVQNRNGLLDQAVEELTNVLR9-来自Methanococcusjannaschii的腺苷酸激酶MMMMKNKVVVIVGVPGVGSTTVTNKAIEELKKEGIEYKIVNFGTVMFEIAKEEGLVEHRDQLRKLPPEEQKRIQKLAGKKIAEMAKEFNIVVDTHSTIKTPKGYLPGLPAWVLEELNPDIIVLVEAENDEILMRRLKDETRQRDFESTEDIGEHIFMNRCAAMTYAVLTGATVKIIKNRDFLLDKAVQELIEVLK10-来自Methanopyruskandleri的腺苷酸激酶MGYVIVATGVPGVGATTVTTEAVKELEGYEHVNYGDVMLEIAKEEGLVEHRDEIRKLPAEKQREIQRLAARRIAKMAEEKEGIIVDTHCTIKTPAGYLPGLPIWVLEELQPDVIVLIEADPDEIMMRRVKDSEERQRDYDRAHEIEEHQKMNRMAAMAYAALTGATVKIIENHDDRLEEAVREFVETVRSL11-来自Methanotorrisigneus的腺苷酸激酶MKNKVVVVTGVPGVGGTTLTQKTIEKLKEEGIEYKMVNFGTVMFEVAKEEGLVEDRDQMRKLDPDTQKRIQKLAGRKIAEMAKESNVIVDTHSTVKTPKGYLAGLPIWVLEELNPDIIVIVETSSDEILMRRLGDATRNRDIELTSDIDEHQFMNRCAAMAYGVLTGATVKIIKNRDGLLDKAVEELISVLK12-来自Pyrobaculumaerophilum的腺苷酸激酶MKIVIVALPGSGKTTILNFVKQKLPDVKIVNYGDVMLEIAKKRFGIQHRDEMRKKIPVDEYRKVQEEAAEYIASLTGDVIIDTHASIKIGGGYYPGLPDRIISKLKPDVILLLEYDPKVILERRKKDPDRFRDLESEEEIEMHQQANRYYAFAAANAGESTVHVLNFRGKPESRPFEHAEVAAEYIVNLILRTRQKS13-来自Thermotogamaritima的腺苷酸激酶MMAYLVFLGPPGAGKGTYAKRIQEKTGIPHISTGDIFRDIVKKENDELGKKIKEIMEKGELVPDELVNEVVKRRLSEKDCEKGFILDGYPRTVAQAEFLDSFLESQNKQLTAAVLFDVPEDVVVQRLTSRRICPKCGRIYNMISLPPKEDELCDDCKVKLVQRDDDKEETVRHRYKVYLEKTQPVIDYYGKKGILKRVDGTIGIDNVVAEVLKIIGWSDK14-来自敏捷气热菌的腺苷酸激酶MKVRHPFKVVVVTGVPGVGKTTVIKELQGLAEKEGVKLHIVNFGSFMLDTAVKLGLVEDRDKIRTLPLRRQLELQREAAKRIVAEASKALGGDGVLIIDTHALVKTVAGYWPGLPKHVLDELKPDMIAVVEASPEEVAARQARDTTRYRVDIGGVEGVKRLMENARAASIASAIQYASTVAIVENREGEAAKAAEELLRLIKNL15-来自Archaeoglobusfulgidus的腺苷酸激酶MNLIFLGPPGAGKGTQAKRVSEKYGIPQISTGDMLREAVAKGTELGKKAKEYMDKGELVPDEVVIGIVKERLQQPDCEKGFILDGFPRTLAQAEALDEMLKELNKKIDAVINVVVPEEEVVKRITYRRTCRNCGAVYHLIYAPPKEDNKCDKCGGELYQRDDKEETVRERYRVYKQNTEPLIDYYRKKGILYDVDGTKDIEGVWKEIEAILEKIKS16-来自Pyrococcusabyssi的单体腺苷酸激酶(AdkE)MNILIFGPPGSGKSTQARRITERYGLTYIASGDIIRAEIKARTPLGIEMERYLSRGDLIPDTIVNTLIISKLRRVRENFIMDGYPRTPEQVITLENYLYDHGIKLDVAIDIYITKEESVRRISGRRICSKCGAVYHVEFNPPKVPGKCDICGGELIQRPDDRPEIVEKRYDIYSKNMEPIIKFYQKQGIYVRIDGHGSIDEVWERIRPLLDYIYNQENRR实施例5重组腺苷酸激酶的热稳定性分析评价粗提大肠杆菌细胞裂解物中的重组tAK酶的热稳定性。基本上如实施例4所述培养细胞，经超声波裂解细胞。在80℃热处理30分钟之前和之后，随后按10倍连续稀释，测定粗提物中的AK活性。结果(参见图4)表明，宽范围的重组酶适于应用在本发明方法中。特别优选的AKs是来自T.maritima、A.fulgidus和嗜酸热硫化叶菌的酶。这些酶在需要的情况下，可能为生物发光分析提供更大的动态范围，从而提供更进一步的灵敏度。实施例6特定热稳定腺苷酸激酶的性质表明了它们作为TSE失活指示物的价值朊病毒分子表现出明显高的粘附于钢表面的倾向。为了开发出验证朊病毒除污染程序的指示物，具有与朊病毒分子相似性质的激酶是有优势的。为了研究这一概念，评价了不同重组热稳定腺苷酸激酶与指定表面的结合情况(参见图5)。评价激酶与之前已被封闭的平板的结合情况。通过加入5％脱脂奶封闭标准聚苯乙烯微量滴定板的表面。去除脱脂奶并将来自Archaeoglobusfulgidus(Afu)、Thermotogamaritime(Tma)和嗜酸热硫化叶菌(Sac)的热稳定腺苷酸激酶的稀释物施加在平板上。洗涤之后，如上述标准分析方法(实施例1)测定结合的激酶的量。结果表明，与任一另外两种激酶相比，Sac激酶对封闭平板表现出显著高的结合。虽然酶的比活性不相同，但是Afu和Tma激酶均表现出比Sac激酶高的活性，从而结合的实际差异甚至比图中表现的更大。由于脱脂奶是用于降低蛋白质与平板结合的常用封闭剂，这些结果说明，Sac激酶具有与这些试验中应用的表面(聚苯乙烯)疏水吸附的极强倾向性。酶的性质—与对朊病毒与钢表面中观察到的相似—意味着，它是评价宽范围的TSE失活和/或去除过程的极有效的指示物。Sac激酶以非常相似的方式与不锈钢结合，并且表现出结合协同性(即，在低浓度时，结合活性和酶量之间存在对数关联(而不是线性关联)，这表明，它在此表面上有聚集性质，这与在朊病毒中所见相似)。酶的这种性质表明了其作为直接吸附型指示物的潜能，其中激酶被直接吸附在适当的支持物上，而不是共价连接在支持物上。在这种情况下，指示物通过评价一种过程从表面去除物质的能力而起作用，并被广泛应用以便监测洗涤和除污染过程。实施例7对腺苷酸激酶进行遗传修饰，以改进稳定性应用本领域技术人员已知的标准方法，在分别如实施例8-10和SEQIDs17-19所示的来自激烈热球菌、P.horikoshii和嗜酸热硫化叶菌的AK基因中构建位点定向突变。除了在每一基因中鉴定的特定变化之外，嗜酸热硫化叶菌序列中下划线的区域形成古细菌腺苷酸激酶三聚体结构的核心包装区(corepackingregion)。因此，干扰此区域包装的氨基酸替换可能在降低酶的热稳定性和物理稳定性中起主要作用。相反地，改进核心包装的氨基酸替换，特别是具有大的侧链的疏水残基，可以使酶对热或其它过程稳定。因此，除了已描述的特定突变，也应用许多“选择性”方法，其中利用这些区域中的相关基因序列的局部基因改组(基本上如Stemmer(1994)Nature370389-391和Cramerietal(1996)NatureBiotech.14315-319所述)和应用简并寡核苷酸或修饰核苷酸混合物进行基于PCR的随机诱变(例如，Vartanianetal(1996)NucleicAcidRes.242627-2633)。通过在大肠杆菌中重组表达和在高温下快速分析裂解细胞中的腺苷酸激酶活性时，这些修饰中的许多表现出改变的稳定性。实施例8来自激烈热球菌的腺苷酸激酶，被遗传工程改造以提供改进的稳定性(SEQIDNO.17)。MPFVVIITGIPGVGKSTITRLALQRTKAKFRLINFGDLMFEEAVKAGLVKHRDEMRKLPL(K变为E)IQRELQMKAAKKI(T变为A)EMAKEHPILVDTHATIKTPHGY(M变为L)LGLPYEVVKTLNPNFIVIIEATPSEILGRRLRDLKRDRDVETEEQIQRHQDLNRAAAIAYAMHSNALIKIIENHEDKGLEEAVNELVKILDLAVNEYA示出的在一个位点或多个位点或所有位点的突变改变酶的热稳定性。除了被强调的这三种限定变化之外，位点157处的丙氨酸变为另一小的疏水残基(如I、L)或较大的疏水残基(如F)增加重组蛋白的热稳定性。因此，在这些位点处的改变的组合可能产生35种变体。将氨基酸157改变为极性残基如T(如在P.horikoshii的AdkA中的等价位点所见)、S、Y、D、E、K、R，导致稳定性减少。实施例9来自Pyrococcushorikoshii的腺苷酸激酶，被遗传工程改造以提供改进的稳定性(SEQIDNO.18)。粗体或下划线所示残基中的任一或两者的改变增加酶的热稳定性(可能产生3种变体)。MPFVVIITGIPGVGKSTITKLALQRTRAKFKLINFGDLMFEEALKLGLVKHRDEMRKLPLEVQRELQMNAAKKIAEMAKNYPILLDTHATIKTPHGYLLGLPYEVIKILNPNFIVIIEATPSEILGRRLRDLKRDRDVETEEQIQRHQDLNRAAAIAYAMHSNALIKIIENHEDKGLEEAVNELVKILDLAVKEYA实施例10来自嗜酸热硫化叶菌的腺苷酸激酶，被遗传工程改造以提供改进的稳定性(SEQIDNO.19)。所示的下划线残基的改变可以增加酶的热稳定性。MKIGIVTGIPGVGKSTVLAKVKEILDNQGINNKIINYGDFMLATALKLGYAKDRDEMRKLSVEKQKKLQIDAAKGIAEEARAGGEGYLFIDTHAVIRTPSGY(A变为M)PGLPSYVITEINPSVIFLLEADPKIILSRQKRDTTRNRNDYSDESVILETINFARYAATASAVLAGSTVKVIVNVEGDPSIAANEIIRSMK实施例11用于验证TSE失活的腺苷酸激酶指示物开发在增加的温度和pH下与TSE材料的蛋白酶失活应用的基于AK的朊病毒指示物。指示物1用纯化的重组嗜酸热硫化叶菌AK制剂(如实施例4所述)包被聚碳酸酯支持物。在磷酸缓冲盐水pH7.4(PBS)中的5％(w/v)山梨醇、10mg/ml牛血清白蛋白(FractionV；Sigmachemicalcompany)存在的情况下，将酶配制为浓度1mg/ml。将100μl体积在支持物上干燥，22℃持续1小时。指示物2用100微升的制剂包被聚苯乙烯支持物，所述制剂含有Tris缓冲盐水(TBS)pH7.4中的1mg/ml嗜酸热硫化叶菌AK、1mM色氨酸、5％(w/v)山梨醇，4℃下干燥24小时。指示物3用基于二硫键形成的方法，将100微升来自硫磺矿硫化叶菌的热稳定腺苷酸激酶的1mg/ml制剂交联到柔性聚苯乙烯棒上，制备第三种指示物。将重组热稳定腺苷酸激酶用异双功能剂硫代琥珀酰亚胺基6-(3′-[2-吡啶基二硫]-丙酰胺基)己酸酯(SPDP；Piercechemicalcompany，UK)衍生化，SPDP蛋白质的比率是1至3之间。随后通过与还原剂二硫苏糖醇(DTT)反应还原衍生化的激酶，通过透析去除还原剂，使激酶与马来酰亚胺衍生的聚苯乙烯棒反应。蛋白酶处理设定器械洗浴(washbath)在60℃操作，加入碱性蛋白酶制剂，得到1.5至2mg/ml之间的、在pH12缓冲的酶(如在浴温度下测定)。适当的阴离子去污剂也可以在需要时包含在制剂中。在所述条件下温育指示物30分钟。随后去除指示物，用蒸馏水洗涤1次。随后如实施例1所述测定酶活性，用发光计测定发光情况。腺苷酸激酶的标准曲线AK酶的标准曲线制备如下制备纯化的嗜酸热硫化叶菌AK的连续稀释物—从10微克/ml至1fg/ml，在50mMTris、25mMMESNA，pH7.3中制备。向微量滴定板的每孔中加入100微升酶，并向每孔加入100微升135微摩尔ADP、15mMMgAc、1mMEDTA。对在30℃、50℃和70℃温育20分钟的分析平板，绘制三条单独的标准曲线。温育后加入30微升萤光素/萤光素酶试剂(Biothema)，在发光计(Orion，Berthold)中读取信号，结果显示于图3。TSE失活的验证针对激酶的标准曲线评价激酶活性水平。对于带有发光值大于1,000,000相对光单位(RLU)的100微克激酶的指示物而言，如标准曲线所评价，小于4000RLU的发光值相当于激酶浓度下降6个对数级，小于500RLU的发光值相当于激酶浓度下降8个对数级。在上述蛋白酶消化条件下，(2mg/ml指名为MC3的碱性蛋白酶，在pH12的缓冲制剂中，于60℃消化30分钟)，我们证明，在VM小鼠中生物分析的BSE-301V株的感染性水平降低约8个对数级。在相同条件下，如上制备的AK指示物的RLU从超过1,000,000(未处理)降低到低于500RLU。因此，激酶浓度降低8个对数级相当于BSE的感染性降低8个对数级。应用本事实，可能监测激酶浓度并将其与BSE感染性水平的降低程度关联起来。验证步骤的应用将用于不知道感染了任何形式CJD的患者的常规外科或常规神经外科中的一套外科器械在使用后送回医院的灭菌设备室中。在设定于60℃操作30分钟的洗涤器/消毒器中，用碱性蛋白酶MC3制剂常规清洁来准备器械。如上述的一种或多种AK指示物包含在处理浴中。处理后，以及在器械送至常规高压灭菌之前，移去指示物，进行快速分析以验证该过程是有效的。表现出6个对数级或8个对数级的活性丧失的分析结果，如过程的参数所限定，是任何器械可以被进一步处理前所必需的。成功处理之后，器械可以被准备，用于在需要时进行其它灭菌步骤如高压灭菌。实施例12乙酸激酶和丙酮酸激酶的表达根据实施例4的方法，我们表达乙酸激酶和丙酮酸激酶20-来自Thermatogamaritima的乙酸激酶MRVLVINSGSSSIKYQLIEMEGEKVLCKGIAERIGIEGSRLVHRVGDEKHVIERELPDHEEALKLILNTLVDEKLGVIKDLKEIDAVGHRVVHGGERFKESVLVDEEVLKAIEEVSPLAPLHNPANLMGIKAAMKLLPGVPNVAVFDTAFHQTIPQKAYLYAIPYEYYEKYKIRRYGFHGTSHRYVSKRAAEILGKKLEELKIITCHIGNGASVAAVKYGKCVDTSMGFTPLEGLVMGTRSGDLDPAIPFFIMEKEGISPQEMYDILNKKSGVYGLSKGFSSDMRDIEEAALKGDEWCKLVLEIYDYRIAKYIGAYAAAMNGVDAIVFTAGVGENSPITREDVCSYLEFLGVKLDKQKNEETIRGKEGIISTPDSRVKVLVVPTNEELMIARDTKEIVEKIGR21-来自Pyrococcushorikoshii的丙酮酸激酶MRRMKLPSHKTKIVATIGPATNSKKMIKKLIEAGMNVARINFSHGTFEEHAKIIEMVREQSQKLDRRVAILADLPGLKIRVGEIKGGYVELERGEKVTLTTKDIEGDETTIPVEYKDFPKLVSKGDVIYLSDGYIVLRVEDVKENEVEAVVISGGKLFSRKGINIPKAYLPVEAITPRDIEIMKFAIEHGVDAIGLSFVGNVYDVLKAKSFLERNGAGDTFVIAKIERPDAVRNFNEILNAADGIMIARGDLGVEMPIEQLPILQKRLIRKANMEGKPVITATQMLVSMTMEKVPTRAEVTDVANAILDGTDAVMLSEETAVGKFPIEAVEMMARIAKVTEEYRESFGITRMREFLEGTKRGTIKEAITRSIIDAICTIGIKFILTPTKTGRTARLISRFKPKQWILAFSTREKVCNNLMFSYGVYPFCMEEGFNENDIVRLIKGLGLVGSDDIVLMTEGKPIEKTVGTNSIKIFQIA22-来自硫磺矿硫化叶菌的丙酮酸激酶MRKTKIVATLGPSSEEKVKELAEYVDVFRINFAHGDETSHRKYFDLIRTYAPESSIIVDLPGPKLRLGELKEPIEVKKGDKIVFSQKDGIPVDDELFYSAVKENSDILIADGTIRVRVKSKAKDRVEGTVIEGGILLSRKGINIPNVNLKSGITDNDLKLLKRALDLGADYIGLSFVISENDVKKVKEFVGDEAWVIAKIEKSEALKNLTNIVNESDGIMVARGDLGVETGLENLPLIQRRIVRTSRVFGKPVILATQVLTSMINSPIPTRAEIIDISNSIMQGVDSIMLSDETAIGNYPVESVRTLHNIISNVEKSVKHRPIGPLNSESDAIALAAVNASKVSKADVIVVYSRSGNSILRVSRLRPERNIIGVSPDPRLAKKFKLCYGVIPISINKKMQSIDEIIDVSAKLMQEKIKDLKFKKIVIVGGDPKQEAGKTNFVIVKTLEQQKK23-来自Thermotogamaritima的丙酮酸激酶MRSTKIVCTVGPRTDSYEMIEKMIDLGVNVFRINTSHGDWNEQEQKILKIKDLREKKKKPVAILIDLAGPKIRTGYLEKEFVELKEGQIFTLTTKEILGNEHIVSVNLSSLPKDVKKGDTILLSDGEIVLEVIETTDTEVKTVVKVGGKITHRRGVNVPTADLSVESITDRDREFIKLGTLHDVEFFALSFVRKPEDVLKAKEEIRKHGKEIPVISKIETKKALERLEEIIKVSDGIMVARGDLGVEIPIEEVPIVQKEIIKLSKYYSKPVIVATQILESMIENPFPTRAEVTDIANAIFDGADALLLTAETAVGKHPLEAIKVLSKVAKEAEKKLEFFRTIEYDTSDISEAISHACWQLSESLNAKLIITPTISGSTAVRVSKYNVSQPIVALTPEEKTYYRLSLVRKVIPVLAEKCSQELEFIEKGLKKVEEMGLAEKGDLVVLTSGVPGKVGTTNTIRVLKVD24-来自激烈热球菌的丙酮酸激酶MRRVKLPSHKTKIVATIGPATNSRKMIKQLIKAGMNVARINFSHGSFEEHARVIEIIREEAQKLDRRVAILADLPGLKIRVGEIKGGYVELKRGEKVILTTKDVEGDETTIPVDYKGFPNLVSKGDIIYLNDGYIVLKVENVRENEVEAVVLSGGKLFSRKGVNIPKAYLPVEAITPKDFEIMKFAIEHGVDAIGLSFVGSVYDVLKAKSFLEKNNAEDVFVIAKIERPDAVRNFDEILNAADGIMIARGDLGVEMPIEQLPILQKKLIRKANMEGKPVITATQMLVSMTTEKVPTRAEVTDVANAILDGTDAVMLSEETAIGKFPIETVEMMGKIAKVTEEYRESFGLSRIREFMEIKKGTIKEAITRSIIDAICTIDIKFILTPTRTGRTARLISRFKPKQWILAFSTNERVCNNLMFSYGVYPFCLEEGFDENDIVRLIKGLGLVESDDMVLMTEGKPIEKTVGTNSIKIFQIA25-来自Methanosarcinathermophila的乙酸激酶MKVLVINAGSSSLKYQLIDMTNESALAVGLCERIGIDNSIITQKKFDGKKLEKLTDLPTHKDALEEVVKALTDDEFGVIKDMGEINAVGHRVVHGGEKFTTSALYDEGVEKAIKDCFELAPLHNPPNMMGISACAEIMPGTPMVIVFDTAFHQTMPPYAYMYALPYDLYEKHGVRKYGFHGTSHKYVAERAALMLGKPAEETKIITCHLGNGSSITAVEGGKSVETSMGFTPLEGLAMGTRCGSIDPAIVPFLMEKEGLTTREIDTLMNKKSGVLGVSGLSNDFRDLDEAASKGNRKAELALEIFAYKVKKFIGEYSAVLNGADAVVFTAGIGENSASIRKRILTGLDGIGIKIDDEKNKIRGQEIDISTPDAKVRVFVIPTNEELAIARETKEIVETEVKLRSSIPV实施例13热稳定腺苷酸激酶作为TSE因子蛋白水解失活的指示物用在缓冲的0.2MKCIpH12中的10μg/ml重组嗜酸热硫化叶菌AK溶液稀释20mg/ml碱性蛋白酶贮存液，产生从2mg/ml降至0.001μg/ml的一系列蛋白酶浓度。将100μl体积的材料加入聚苯乙烯热循环平板，60℃温育10分钟，使得AK被碱性蛋白酶消化。随后通过加入10μl的10×磷酸盐缓冲液pH7中和溶液。以100μl/孔，加入15mMMgAc、1mMEDTA缓冲液中的135μMADP。随后在热循环仪中70℃温育孔20分钟。加入30μl/孔的萤光素/萤光素酶(ATP)试剂(Biothema)，迅速在发光计上对孔读数。分析结果显示于图2。这些结果显示，在确定用于外科器械除污染的条件下，AK酶对碱性蛋白酶消化有显著的稳定性。为了将碱性蛋白酶消化后观察到的降低与处理后残余的活性水平相关联，应用如图3所示的标准曲线。进而，应用TSE滴定曲线，将其与感染性水平的降低程度相关联。对于作为指示物的应用，设计分析，以便酶活性标准曲线明确地标记有相当于该过程的可接受除污染水平的限值/阈值。实施例14验证应用生物去污剂的衣物洗涤循环的性能指示物1的制备应用基于二硫键形成的方法，将来自硫磺矿硫化叶菌的热稳定腺苷酸激酶交联在柔性聚苯乙烯棒上，制备第一指示物。在本方法中，将热稳定激酶用异双功能剂如硫代琥珀酰亚胺基6-(3′-[2-吡啶基二硫]-丙酰胺基)己酸酯(SPDP；Piercechemicalcompany，UK)衍生化，SPDP蛋白质的比率是1-3之间。随后通过与还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或2-巯基乙烷磺酸(MESNA)反应，还原衍生化的激酶，通过透析去除还原剂，使激酶与马来酰亚胺衍生的聚苯乙烯表面反应。典型地，指示物中存在0.1mg激酶。指示物2的制备将来自嗜酸热硫化叶菌的热稳定腺苷酸激酶非特异性粘合在高蛋白质结合聚苯乙烯条上，制备第二指示物。在碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)中制备浓度0.5-2mg/ml的激酶，缓冲液中任选地含有0.1至2％w/v之间的稳定剂山梨醇。随后使结合缓冲液中的激酶与高蛋白质结合聚苯乙烯条于22℃温育1-2小时(或4℃过夜)。通过在磷酸缓冲盐水中洗涤去除残余激酶。典型地，指示物中存在0.1mg激酶。洗涤循环的验证使洗涤器加载待洗涤物质，将指示物固定在洗涤器内适当的固定器中(以便协助其回收)。随后进行洗涤循环。在循环完成时，移去指示物，用基于实施例1所述分析方法的“读数器”评价激酶的残余活性。该读数器被校准，显示出指示物中残余激酶活性的可接受“阈值”水平。此“阈值”水平来自此前对该过程中适当性能的校准和评定。如果读数器显示，残余激酶活性与此阈值水平相等或低于该阈值水平，加载物已被清洗可用于进一步处理。实施例15用蛋白酶制剂验证硬表面上诺沃克类病毒(也称为诺罗病毒(Norovirus)、诺沃克病毒(Norwalkvirus)或冬季呕吐疾病(WinterVomitingDisease))的失活过程指示物的制备应用实施例14所述的二硫键介导的交联，将来自嗜酸热硫化叶菌的0.1mg热稳定腺苷酸激酶固定在细聚苯乙烯条上，制备指示物。验证将指示条放置在潜在污染的表面上。随后用在膏状物中配制的具有高活性的碱性蛋白酶—蛋白酶K包被表面和指示条。(将蛋白酶K配制在膏状物中改进了酶和表面/指示物之间的接触)，将膏状物留在表面/指示物上1-2小时。在处理末期，移去指示物，用实施例14所述“读数器”评价残余激酶活性水平。如果残余激酶活性与读数器的阈值水平相等或低于该阈值水平，则表面已被清洗可安全使用。实施例16验证蓖麻毒蛋白的蛋白酶降解指示物的制备应用文中和实施例14中所述的标准的巯基-马来酰亚胺基偶联方法，将来自Thermotogamaritima的0.1mg热稳定乙酸激酶固定在聚碳酸酯条上，制备指示物。验证将指示条和待除污染的物体浸没在蛋白酶溶液中，如实施例11所示，或者将指示物连接于待除污染的表面，如实施例15所示。随后用蛋白酶溶液处理物体/表面一段所需的时间。在处理末期，移去指示物，用如实施例14所述的“读数器”评价残余激酶活性水平。如果残余激酶活性与读数器的“阈值”水平相等或低于该“阈值”水平，则该物体/表面已被清洗可安全使用。实施例17验证TSE因子的气态臭氧失活指示物1的制备应用如实施例14所述的SPDP-马来酰亚胺方法，将来自嗜酸热硫化叶菌的0.1mg热稳定腺苷酸激酶交联在刚性聚氯乙烯(PVC)支持物上，制备第一指示物。指示物2的制备在胺活性PVC表面存在的情况下，使嗜酸热硫化叶菌腺苷酸激酶与二-[β-(4-叠氮水杨酰胺基)乙基]二硫化物(BASED；Piercechemicals)反应，制备第二指示物。这导致激酶与表面通过酰胺键快速共价连接。验证将指示物和受TSE污染的物品暴露于气态臭氧失活过程。在该过程末期，移去指示物，用如实施例14所述的“读数器”评价残余激酶活性水平。如果残余激酶活性与读数器的“阈值”水平相等或低于该阈值水平，则该物品已被清洗可安全使用。实施例18验证用于清洁内窥镜的液体化学灭菌系统(例如，Endoclens)指示物1的制备将来自A.fulgidus的0.1mg热稳定腺苷酸激酶化学交联(应用如实施例14所述的基于SPDP的方法)在与内窥镜管总内径相似的管的内表面，制备指示物。指示物2的制备第二指示物在腺苷酸激酶不衍生化的情况下制备。修饰来自激烈热球菌的腺苷酸激酶的基因序列，以至于重组蛋白质包括如SEQID4所示的序列氨基末端上的附加半胱氨酸。如前述表达和纯化重组蛋白质，并用DTT还原，以确保巯基可以利用。随后可以使其直接与马来酰亚胺活化塑料反应，产生所需的交联。约1-2mg/ml含半胱氨酸酶的制剂与如实施例14所述的衍生化方法所需的制剂相似。验证将指示物装置串连连接到自动再处理装置上的内窥镜，随后以正常方式处理内窥镜。在处理末期，分离指示物，用如实施例14所述的“读数器”评价残余激酶活性水平。如果残余激酶活性与读数器的“阈值”水平相等或低于该阈值水平，则内窥镜已被清洗可安全使用。实施例19验证医院洗涤器-消毒器中的外科器械的清洁情况指示物1的制备将来自嗜酸热硫化叶菌的0.1mg热稳定腺苷酸激酶非共价连接于不锈钢表面，制备指示物。在本实施例中，不将蛋白质共价连接在指示部件上，原因是指示物被设计为，测定过程对表面污染物的去除情况。将激酶配制为1-2mg/ml之间，优选地在约pH9.6的碳酸氢盐缓冲液中。通过在室温下温育1-2小时，将物质吸附在金属表面上。如果需要，可以修饰金属表面，使其更具疏水性(例如，对于高严谨性洗涤，需要额外的连接，以便确保指示物上保留足够的信号)。在不变换结合的指示物激酶明显比例的情况下，通过洗涤指示物去除任何未连接的激酶。指示物2的制备将来自嗜酸热硫化叶菌的0.1mg腺苷酸激酶粘结在(应用指示物1所述方法)不锈钢表面上，制备第二指示物，其作为含有目前用于验证此类型清洁过程的标准污染物的制剂的一部分。这使得指示技术与作为洗涤器-消毒器的常规验证和维护的一部分的调节部分能够接受的方法相关。验证指示物被包含在待处理的一批外科器械中，运行洗涤器-消毒器循环。在运行末期，移去指示物，用如实施例14所述的“读数器”评价残余激酶活性水平。如果残余激酶活性与读数器的“阈值”水平相等或低于该阈值水平，则器械已清洁可安全使用。实施例20验证对大量液体灭菌的过程指示物1的制备通过将来自硫磺矿硫化叶菌的0.1mg丙酮酸激酶共价连接于聚苯乙烯条，制备第一指示物。指示物2的制备将来自A.fulgidus的0.1mg热稳定激酶连接于半透膜如透析管的内表面，制备第二指示物。A.fulgidus激酶含有天然发生的活性半胱氨酸残基(即，在天然酶中不形成二硫键)，其可以与BMPH(Pierce)反应。这产生了能够与氧化的糖反应的基团，如，例如，通过用适当的氧化剂处理Visking管而产生。如实施例14所述配制酶，使其与氧化的膜表面反应，产生共价连接指示物。验证随后将指示物连接在大量液体中，进行灭菌过程(如高压灭菌，通过氧化气体或其它化学杀菌剂)。过程结束时，从大量液体中移去指示物，将残余的激酶活性与限定阈值相比，实施例14所述。实施例21蛋白酶消化后残余腺苷酸激酶活性的校准用于评价朊病毒因子的适当失活水平的校准曲线的说明在图6中示出。示出的例子对于外科器械的蛋白酶处理而言的，处理条件限定为pH12、30℃、30分钟。通过评价在所述条件下、在不同蛋白酶浓度下、朊病毒的失活水平，确定出蛋白酶的浓度(图A)。在该示例中，在限定条件下，1mg/ml浓度下，蛋白酶MC3能够提供相当于感染剂量降低6个对数级的失活水平。在相等的蛋白酶浓度下，在相同的条件下，基本上如实施例11所述制备的嗜酸热硫化叶菌指示物上残留的腺苷酸激酶的残余活性处于10RLU级别(图B)。因而需要低于10RLU的值，使得允许一批器械再使用。任选地，建立额外的安全极限，以至于需要低于1的RLU值，这将处理指示物后残余腺苷酸激酶活性水平与使朊病毒感染性降低7个对数级(比设定标准的失活多1个对数级)的蛋白酶浓度关联起来。实施例22臭氧处理后残余腺苷酸激酶活性的校准评价朊病毒因子经臭氧处理方法失活的适当水平的说明在图7中示出。示出的例子是对于臭氧处理而言的，所述处理在限定期间将固定比率的臭氧释放入灭菌室内。随后通过增加时间或减少时间，同时增加或减少臭氧浓度，计算臭氧水平。在图A中，示出了根据标准循环时间的分数或倍数的朊病毒失活水平。从而，2.5个标准循环表示朊病毒失活6个对数级。在相等倍数的臭氧循环，基本上如实施例17所述制备的指示物中残留的残余腺苷酸激酶水平是1000RLU级别。因而需要低于1000RLU的值，使得允许一批器械再使用。可选地，为指示物建立额外的安全极限，以至于需要低于100的RLU值，这将处理指示物后残余腺苷酸激酶活性水平与使朊病毒感染性降低7个对数级(比设定标准的失活多1个对数级)的臭氧浓度关联起来。实施例23对设计用来监测医院洗涤器-消毒器中的外科器械的常规清洁的指示物的校准图8示出了对校准曲线的说明，所述校准曲线用于评价应用基于生物学(含酶)或去污剂的制剂对外科器械的常规清洁。指示部件如实施例19所述制备。图A示出了标准污染物通过洗涤器消毒器从限定医疗器械去除的百分数，其中所述洗涤器消毒器用限定的洗涤器制剂运行。改变洗涤循环的次数，用以鉴定出适当的性能水平。图B示出了如实施例17所述制备并在与标准的污染器械相同的条件下洗涤的指示部件的残余嗜酸热硫化叶菌激酶活性。残余污染物水平被限定为本试验中起始物质的0.1％，这与25分钟的洗涤时间相关。洗涤25分钟的指示物的RLU值是约100RLU。从而，指示物可以在30分钟洗涤循环中应用，提供可接受“污染物”去除的提示，在0.1％水平处，RLU阈值是100，或者在0.05％水平处，RLU截点(cut-off)是约25。实施例24修改手持式卫生监测器，以便快速读出对激酶指示物的评价。许多分析方式可以潜在地用于评价与本发明指示物相关的激酶活性水平。这些包括管式发光计、微量滴定板发光计和多种其它方式。特别用于评价本发明指示物上的激酶活性的一种方式是手持式卫生监测器。目前的技术通过萤光素-萤光素酶系统检测ATP，或是在表面上直接检测，或是通过裂解从表面去除的细菌或其它细胞而检测。本领域技术人员将知道，此系统服从于适应检测指示部件上的激酶，因为该系统已经具有产生和测定相应于ATP存在的光的能力。通过改变试剂配方，加入激酶的ADP底物，能够快速测定指示物上酶的存在。事实上，指示物被加入一批材料并被处理。随后将指示物移去，插入试剂管中，使ATP产生。本试剂管的配制基本上如实施例1的方法所述，具有高纯度ADP试剂。将管温育一段限定的时间长度，如指示物和监测过程的类型所限定。在温育末期，含ATP—由于存在残余tAK而产生—的试剂样品被释放到含萤光素-萤光素酶的第二区室中，产生可测定的光。本设备不同于标准的卫生监测器，因为第一ATP-生成步骤不是测定ATP所需的。构建这样的部件的最简单方法是，具有带2个区室的管，所述区室通过可破隔膜分隔开，如图9所示。在第一位置插入管中(步骤1)的指示物使得ATP产生，在温育末期，指示物自动地或手动地被推动，到达步骤2所示的位置，在该处产生光。这种部件的宽范围的其它构造都是可能的。可选地，可以进行热变性步骤，用以去除内源性激酶活性和/或进行腺苷三磷酸双磷酸酶处理，用以去除内源性ATP。如果需要，ATP生成步骤可以在增高的温度下进行。表1被培养用以产生生物材料，用于分离热稳定AKs的嗜热性生物体列表。序列表<110>健康保护机构J·M·萨顿N·D·H·雷文<120>生物指示物<130>P26205WO-MRM<150>GB0406427.5<151>2004-03-22<160>30<170>PatentInversion3.1<210>1<211>195<212>PRT<213>硫磺矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus)<400>1MetLysIleGlyIleValThrGlyIleProGlyValGlyLysThrThr151015ValLeuSerPheAlaAspLysIleLeuThrGluLysGlyIleSerHis202530LysIleValAsnTyrGlyAspTyrMetLeuAsnThrAlaLeuLysGlu354045GlyTyrValLysSerArgAspGluIleArgLysLeuGlnIleGluLys505560GlnArgGluLeuGlnAlaLeuAlaAlaArgArgIleValGluAspLeu65707580SerLeuLeuGlyAspGluGlyIleGlyLeuIleAspThrHisAlaVal859095IleArgThrProAlaGlyTyrLeuProGlyLeuProArgHisValIle100105110GluValLeuSerProLysValIlePheLeuLeuGluAlaAspProLys115120125IleIleLeuGluArgGlnLysArgAspSerSerArgAlaArgThrAsp130135140TyrSerAspThrAlaValIleAsnGluValIleGlnPheAlaArgTyr145150155160SerAlaMetAlaSerAlaValLeuValGlyAlaSerValLysValVal165170175ValAsnGlnGluGlyAspProSerIleAlaAlaSerGluIleIleAsn180185190SerLeuMet195<210>2<211>194<212>PRT<213>嗜酸热硫化叶菌(sulfolobusacidocaldarius)<400>2MetLysIleGlyIleValThrGlyIleProGlyValGlyLysSerThr151015ValLeuAlaLysValLysGluIleLeuAspAsnGlnGlyIleAsnAsn202530LysIleIleAsnTyrGlyAspPheMetLeuAlaThrAlaLeuLysLeu354045GlyTyrAlaLysAspArgAspGluMetArgLysLeuSerValGluLys505560GlnLysLysLeuGlnIleAspAlaAlaLysGlyIleAlaGluGluAla65707580ArgAlaGlyGlyGluGlyTyrLeuPheIleAspThrHisAlaValIle859095ArgThrProSerGlyTyrLeuProGlyLeuProSerTyrValIleThr100105110GluIleAsnProSerValIlePheLeuLeuGluAlaAspProLysIle115120125IleLeuSerArgGlnLysArgAspThrThrArgAsnArgAsnAspTyr130135140SerAspGluSerValIleLeuGluThrIleAsnPheAlaArgTyrAla145150155160AlaThrAlaSerAlaValLeuAlaGlySerThrValLysValIleVal165170175AsnValGluGlyAspProSerIleAlaAlaAsnGluIleIleArgSer180185190MetLys<210>3<211>197<212>PRT<213>Sulfolobustokodaii<400>3MetSerLysMetLysIleGlyIleValThrGlyIleProGlyValGly151015LysThrThrValLeuSerLysValLysGluIleLeuGluGluLysLys202530IleAsnAsnLysIleValAsnTyrGlyAspTyrMetLeuMetThrAla354045MetLysLeuGlyTyrValAsnAsnArgAspGluMetArgLysLeuPro505560ValGluLysGlnLysGlnLeuGlnIleGluAlaAlaArgGlyIleAla65707580AsnGluAlaLysGluGlyGlyAspGlyLeuLeuPheIleAspThrHis859095AlaValIleArgThrProSerGlyTyrLeuProGlyLeuProLysTyr100105110ValIleGluGluIleAsnProArgValIlePheLeuLeuGluAlaAsp115120125ProLysValIleLeuAspArgGlnLysArgAspThrSerArgSerArg130135140SerAspTyrSerAspGluArgIleIleSerGluThrIleAsnPheAla145150155160ArgTyrAlaAlaMetAlaSerAlaValLeuValGlyAlaThrValLys165170175IleValIleAsnValGluGlyAspProAlaValAlaAlaAsnGluIle180185190IleAsnSerMetLeu195<210>4<211>196<212>PRT<213>激烈热球菌(pyrococcusfuriosus)<400>4MetProPheValValIleIleThrGlyIleProGlyValGlyLysSer151015ThrIleThrArgLeuAlaLeuGlnArgThrLysAlaLysPheArgLeu202530IleAsnPheGlyAspLeuMetPheGluGluAlaValLysAlaGlyLeu354045ValLysHisArgAspGluMetArgLysLeuProLeuLysIleGlnArg505560GluLeuGlnMetLysAlaAlaLysLysIleThrGluMetAlaLysGlu65707580HisProIleLeuValAspThrHisAlaThrIleLysThrProHisGly859095TyrMetLeuGlyLeuProTyrGluValValLysThrLeuAsnProAsn100105110PheIleValIleIleGluAlaThrProSerGluIleLeuGlyArgArg115120125LeuArgAspLeuLysArgAspArgAspValGluThrGluGluGlnIle130135140GlnArgHisGlnAspLeuAsnArgAlaAlaAlaIleAlaTyrAlaMet145150155160HisSerAsnAlaLeu1leLysIleIleGluAsnHisGluAspLysGly165170175LeuGluGluAlaValAsnGluLeuValLysIleLeuAspLeuAlaVal180185190AsnGluTyrAla195<210>5<211>196<212>PRT<213>Pyrococcushorikoshii<400>5MetProPheValValIleIleThrGlyIleProGlyValGlyLysSer151015ThrIleThrLysLeuAlaLeuGlnArgThrArgAlaLysPheLysLeu202530IleAsnPheGlyAspLeuMetPheGluGluAlaLeuLysLeuLysLeu354045ValLysHisArgAspGluMetArgLysLeuProLeuGluValGlnArg505560GluLeuGlnMetAsnAlaAlaLysLysIleAlaGluMetAlaLysAsn65707580TyrProIleLeuLeuAspThrHisAlaThrIleLysThrProHisGly859095TyrLeuLeuGlyLeuProTyrGluValIleLysIleLeuAsnProAsn100105110PheIleValIleIleGluAlaThrProSerGluIleLeuGlyArgArg115120125LeuArgAspLeuLysArgAspArgAspValGluThrGluGluGlnIle130135140GlnArgHisGlnAspLeuAsnArgAlaAlaAlaIleThrTyrAlaMet145150155160HisSerAsnAlaLeuIleLysIleIleGluAsnHisGluAspLysGly165170175LeuGluGluAlaValAsnGluLeuValLysIleLeuAspLeuAlaVal180185190LysGluTyrAla195<210>6<211>196<212>PRT<213>Pyrococcusabyssi<400>6MetSerPheValValIleIleThrGlyIleProGlyValGlyLysSer151015ThrIleThrArgLeuAlaLeuGlnArgThrLysAlaLysPheLysLeu202530IleAsnPheGlyAspLeuMetPheGluGluAlaValLysAlaGlyLeu354045ValAsnHisArgAspGluMetArgLysLeuProLeuGluIleGlnArg505560AspLeuGlnMetLysValAlaLysLysIleSerGluMetAlaArgGln65707580GlnProIleLeuLeuAspThrHisAlaThrIleLysThrProHisGly859095TyrLeuLeuGlyLeuProTyrGluValIleLysThrLeuAsnProAsn100105110PheIleValIleIleGluAlaThrProSerGluIleLeuGlyArgArg115120125LeuArgAspLeuLysArgAspArgAspValGluThrGluGluGlnIle130135140GlnArgHisGlnAspLeuAsnArgAlaAlaAlaIleAlaTyrAlaMet145150155160HisSerAsnAlaLeuIleLysIleIleGluAsnHisGluAspLysGly165170175LeuGluGluAlaValAsnGluLeuValGluIleLeuAspLeuAlaVal180185190LysGluTyrAla195<210>7<211>192<212>PRT<213>Methanococcusthermolithotrophicus<400>7MetLysAsnLysLeuValValValThrGlyValProGlyValGlyGly151015ThrThrIleThrGlnLysAlaMetGluLysLeuSerGluGluGlyIle202530AsnTyrLysMetValAsnPheGlyThrValMetPheGluValAlaGln354045GluGluAsnLeuValGluAspArgAspGlnMetArgLysLeuAspPro505560AspThrGlnLysArgIleGlnLysLeuAlaGlyArgLysIleAlaGlu65707580MetValLysGluSerProValValValAspThrHisSerThrIleLys859095ThrProLysGlyTyrLeuProGlyLeuProValTrpValLeuAsnGlu100105110LeuAsnProAspIleIleIleValValGluThrSerGlyAspGluIle115120125LeuIleArgArgLeuAsnAspGluThrArgAsnArgAspLeuGluThr130135140ThrAlaGlyIleGluGluHisGlnIleMetAsnArgAlaAlaAlaMet145150155160ThrTyrGlyValLeuThrGlyAlaThrValLysIleIleGlnAsnLys165170175AsnAsnLeuLeuAspTyrAlaValGluGluLeuIleSerValLeuArg180185190<210>8<211>192<212>PRT<213>Methanococcusvoltae<400>8MetLysAsnLysValValValValThrGlyValProGlyValGlySer151015ThrThrSerSerGlnLeuAlaMetAspAsnLeuArgLysGluGlyVal202530AsnTyrLysMetValSerPheGlySerValMetPheGluVa1AlaLys354045GluGluAsnLeuValSerAspArgAspGlnMetArgLysMetAspPro505560GluThrGlnLysArgIleGlnLysMetAlaGlyArgLysIleAlaGlu65707580MetAlaLysGluSerProValAlaValAspThrHisSerThrValSer859095ThrProLysGlyTyrLeuProGlyLeuProSerTrpValLeuAsnGlu100105110LeuAsnProAspLeuIleIleValValGluThrThrGlyAspGluIle115120125LeuMetArgArgMetSerAspGluThrArgValArgAspLeuAspThr130135140AlaSerThrIleGluGlnHisGlnPheMetAsnArgCysAlaAlaMet145150155160SerTyrGlyValLeuThrGlyAlaThrValLysIleValGlnAsnArg165170175AsnGlyLeuLeuAspGlnAlaValGluGluLeuThrAsnValLeuArg180185190<210>9<211>195<212>PRT<213>Methanococcusjannaschii<400>9MetMetMetMetLysAsnLysValValValIleValGlyValProGly151015ValGlySerThrThrValThrAsnLysAlaIleGluGluLeuLysLys202530GluGlyIleGluTyrLysIleValAsnPheGlyThrValMetPheGlu354045IleAlaLysGluGluGlyLeuValGluHisArgAspGlnLeuArgLys505560LeuProProGluGluGlnLysArgIleGlnLysLeuAlaGlyLysLys65707580IleAlaGluMetAlaLysGluPheAsnIleValValAspThrHisSer859095ThrIleLysThrProLysGlyTyrLeuProGlyLeuProAlaTrpVal100105110LeuGluGluLeuAsnProAspIleIleValLeuValGluAlaGluAsn115120125AspGluIleLeuMetArgArgLeuLysAspGluThrArgGlnArgAsp130135140PheGluSerThrGluAspIleGlyGluHisIlePheMetAsnArgCys145150155160AlaAlaMetThrTyrAlaValLeuThrGlyAlaThrValLysIleIle165170175LysAsnArgAspPheLeuLeuAspLysAlaValGlnGluLeuIleGlu180185190ValLeuLys195<210>10<211>91<212>PRT<213>Methanopyruskandleri<400>10MetGlyTyrValIleValAlaThrGlyValProGlyValGlyAlaThr151015ThrValThrThrGluAlaValLysGluLeuGluGlyTyrGluHisVal202530AsnTyrGlyAspValMetLeuGluIleAlaLysGluGluGlyLeuVal354045GluHisArgAspGluIleArgLysLeuProAlaGluLysGlnArgGlu505560IleGlnArgLeuAlaAlaArgArgIleAlaLysMetAlaGluGluLys65707580GluGlyIleIleValAspThrHisCysThrIleLysThrProAlaGly859095TyrLeuProGlyLeuProIleTrpValLeuGluGluLeuGlnProAsp100105110ValIleValLeuIleGluAlaAspProAspGluIleMetMetArgArg115120125ValLysAspSerGluGluArgGlnArgAspTyrAspArgAlaHisGlu130135140IleGluGluHisGlnLysMetAsnArgMetAlaAlaMetAlaTyrAla145150155160AlaLeuThrGlyAlaThrValLysIleIleGluAsnHisAspAspArg165170175LeuGluGluAlaValArgGluPheValGluThrValArgSerLeu180185190<210>11<211>192<212>PRT<213>Methanotorrisigneus<400>11MetLysAsnLysValValValValThrGlyValProGlyValGlyGly151015ThrThrLeuThrGlnLysThrIleGluLysLeuLysGluGluGlyIle202530GluTyrLysMetValAsnPheGlyThrValMetPheGluValAlaLys354045GluGluGlyLeuValGluAspArgAspGlnMetArgLysLeuAspPro505560AspThrGlnLysArgIleGlnLysLeuAlaGlyArgLysIleAlaGlu65707580MetAlaLysGluSerAsnValIleValAspThrHisSerThrValLys859095ThrProLysGlyTyrLeuAlaGlyLeuProIleTrpValLeuGluGlu100105110LeuAsnProAspIleIleValIleValGluThrSerSerAspGluIle115120125LeuMetArgArgLeuGlyAspAlaThrArgAsnArgAspIleGluLeu130135140ThrSerAspIleAspGluHisGlnPheMetAsnArgCysAlaAlaMet145150155160AlaTyrGlyValLeuThrGlyAlaThrValLysIleIleLysAsnArg165170175AspGlyLeuLeuAspLysAlaValGluGluLeuIleSerValLeuLys180185190<210>12<211>197<212>PRT<213>Pyrobaculumaerophilum<400>12MetLysIleValIleValAlaLeuProGlySerGlyLysThrThrIle151015LeuAsnPheValLysGlnLysLeuProAspValLysIleValAsnTyr202530GlyAspValMetLeuGluIleAlaLysLysArgPheGlyIleGlnHis354045ArgAspGluMetArgLysLysIleProValAspGluTyrArgLysVal505560GlnGluGluAlaAlaGluTyrIleAlaSerLeuThrGlyAspValIle65707580IleAspThrHisAlaSerIleLysIleGlyGlyGlyTyrTyrProGly859095LeuProAspArgIleIleSerLysLeuLysProAspValIleLeuLeu100105110LeuGluTyrAspProLysValIleLeuGluArgArgLysLysAspPro115120125AspArgPheArgAspLeuGluSerGluGluGluIleGluMetHisGln130135140GlnAlaAsnArgTyrTyrAlaPheAlaAlaAlaAsnAlaGlyGluSer145150155160ThrValHisValLeuAsnPheArgGlyLysProGluSerArgProPhe165170175GluHisAlaGluValAlaAlaGluTyrIleValAsnLeuIleLeuArg180185190ThrArgGlnLysSer195<210>13<211>220<212>PRT<213>Thermotogamaritima<400>13MetMetAlaTyrLeuValPheLeuGlyProProGlyAlaGlyLysGly151015ThrTyrAlaLysArgIleGlnGluLysThrGlyIleProHisIleSer202530ThrGlyAspIlePheArgAspIleValLysLysGluAsnAspGluLeu354045GlyLysLysIleLysGluIleMetGluLysGlyGluLeuValProAsp505560GluLeuValAsnGluValValLysArgArgLeuSerGluLysAspCys65707580GluLysGlyPheIleLeuAspGlyTyrProArgThrValAlaGlnAla859095GluPheLeuAspSerPheLeuGluSerGlnAsnLysGlnLeuThrAla100105110AlaValLeuPheAspValProGluAspValValValGlnArgLeuThr115120125SerArgArgIleCysProLysCysGlyArgIleTyrAsnMetIleSer130135140LeuProProLysGluAspGluLeuCysAspAspCysLysValLysLeu145150155160ValGlnArgAspAspAspLysGluGluThrValArgHisArgTyrLys165170175ValTyrLeuGluLysThrGlnProValIleAspTyrTyrGlyLysLys180185190GlyIleLeuLysArgValAspGlyThrIleGlyIleAspAsnValVal195200205AlaGluValLeuLysIleIleGlyTrpSerAspLys210215220<210>14<211>204<212>PRT<213>Aeropyrumpernix<400>14MetLysValArgHisProPheLysValValValValThrGlyValPro151015GlyValGlyLysThrThrValIleLysGluLeuGlnGlyLeuAlaGlu202530LysGluGlyValLysLeuHisIleValAsnPheGlySerPheMetLeu354045AspThrAlaValLysLeuGlyLeuValGluAspArgAspLysIleArg505560ThrLeuProLeuArgArgGlnLeuGluLeuGlnArgGluAlaAlaLys65707580ArgIleValAlaGluAlaSerLysAlaLeuGlyGlyAspGlyValLeu859095IleIleAspThrHisAlaLeuValLysThrValAlaGlyTyrTrpPro100105110GlyLeuProLysHisValLeuAspGluLeuLysProAspMetIleAla115120125ValValGluAlaSerProGluGluValAlaAlaArgGlnAlaArgAsp130135140ThrThrArgTyrArgValAspIleGlyGlyValGluGlyValLysArg145150155160LeuMetGluAsnAlaArgAlaAlaSerIleAlaSerAlaIleGlnTyr165170175AlaSerThrValAlaIleValGluAsnArgGluGlyGluAlaAlaLys180185190AlaAlaGluGluLeuLeuArgLeuIleLysAsnLeu195200<210>15<211>216<212>PRT<213>Archaeoglobusfulgidus<400>15MetAsnLeuIlePheLeuGlyProProGlyAlaGlyLysGlyThrGln151015AlaLysArgValSerGluLysTyrGlyIleProGlnIleSerThrGly202530AspMetLeuArgGluAlaValAlaLysGlyThrGluLeuGlyLysLys354045AlaLysGluTyrMetAspLysGlyGluLeuValProAspGluValVal505560IleGlyIleValLysGluArgLeuGlnGlnProAspCysGluLysGly65707580PheIleLeuAspGlyPheProArgThrLeuAlaGlnAlaGluAlaLeu859095AspGluMetLeuLysGluLeuAsnLysLysIleAspAlaValIleAsn100105110ValValValProGluGluGluValValLysArgIleThrTyrArgArg115120125ThrCysArgAsnCysGlyAlaValTyrHisLeuIleTyrAlaProPro130135140LysGluAspAsnLysCysAspLysCysGlyGlyGluLeuTyrGlnArg145150155160AspAspLysGluGluThrValArgGluArgTyrArgValTyrLysGln165170175AsnThrGluProLeuIleAspTyrTyrArgLysLysGlyIleLeuTyr180185190AspValAspGlyThrLysAspIleGluGlyValTrpLysGluIleGlu195200205AlaIleLeuGluLysIleLysSer210215<210>16<211>220<212>PRT<213>Pyrococcusabyssi<400>16MetAsnIleLeuIlePheGlyProProGlySerGlyLysSerThrGln151015AlaArgArgIleThrGluArgTyrGlyLeuThrTyrIleAlaSerGly202530AspIleIleArgAlaGluIleLysAlaArgThrProLeuGlyIleGlu354045MetGluArgTyrLeuSerArgG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IleIleGluMetValArgGluGlnSerGlnLysLeu505560AspArgArgValAlaIleLeuAlaAspLeuProGlyLeuLysIleArg65707580ValGlyGluIleLysGlyGlyTyrValGluLeuGluArgGlyGluLys859095ValThrLeuThrThrLysAspIleGluGlyAspGluThrThrIlePro100105110ValGluTyrLysAspPheProLysLeuValSerLysGlyAspValIle115120125TyrLeuSerAspGlyTyrIleValLeuArgValGluAspValLysGlu130135140AsnGluValGluAlaValValIleSerGlyGlyLysLeuPheSerArg145150155160LysGlyIleAsnIleProLysAlaTyrLeuProValGluAlaIleThr165170175ProArgAspIleGluIleMetLysPheAlaIleGluHisGlyValAsp180185190AlaIleGlyLeuSerPheValGlyAsnValTyrAspValLeuLysAla195200205LysSerPheLeuGluArgAsnGlyAlaGlyAspThrPheValIleAla210215220LysIleGluArgProAspAlaValArgAsnPheAsnGluIleLeuAsn225230235240AlaAlaAspGlyIleMetIleAlaArgGlyAspLeuGlyValGluMet245250255ProIleGluGlnLeuProIleLeuGlnLysArgLeuIleArgLysAla260265270AsnMetGluGlyLysProValIleThrAlaThrGlnMetLeuValSer275280285MetThrMetGluLysValProThrArgAlaGluValThrAspValAla290295300AsnAlaIleLeuAspGlyThrAspAlaValMetLeuSerGluGluThr305310315320AlaValGlyLysPheProIleGluAlaValGluMetMetAlaArgIle325330335AlaLysValThrGluGluTyrArgGluSerPheGlyIleThrArgMet340345350ArgGluPheLeuGluGlyThrLysArgGlyThrIleLysGluAlaIle355360365ThrArgSerIleIleAspAlaIleCysThrIleGlyIleLysPheIle370375380LeuThrProThrLysThrGlyArgThrAlaArgLeuIleSerArgPhe385390395400LysProLysGlnTrpIleLeuAlaPheSerThrArgGluLysValCys405410415AsnAsnLeuMetPheSerTyrGlyValTyrProPheCysMetGluGlu420425430GlyPheAsnGluAsnAspIleValArgLeuIleLysGlyLeuGlyLeu435440445ValGlySerAspAspIleValLeuMetThrGluGlyLysProIleGlu450455460LysThrValGlyThrAsnSerIleLysIlePheGlnIleAla465470475<210>22<211>452<212>PRT<213>硫磺矿硫化叶菌<400>22MetArgLysThrLysIleValAlaThrLeuGlyProSerSerGluGlu151015LysValLysGluLeuAlaGluTyrValAspValPheArgIleAsnPhe202530AlaHisGlyAspGluThrSerHisArgLysTyrPheAspLeuIleArg354045ThrTyrAlaProGluSerSerIleIleValAspLeuProGlyProLys505560LeuArgLeuGlyGluLeuLysGluProIleGluValLysLysGlyAsp65707580LysIleValPheSerGlnLysAspGlyIleProValAspAspGluLeu859095PheTyrSerAlaValLysGluAsnSerAspIleLeuIleAlaAspGly100105110ThrIleArgValArgValLysSerLysAlaLysAspArgValGluGly115120125ThrValIleGluGlyGlyIleLeuLeuSerArgLysGlyIleAsnIle130135140ProAsnValAsnLeuLysSerGlyIleThrAspAsnAspLeuLysLeu145150155160LeuLysArgAlaLeuAspLeuGlyAlaAspTyrIleGlyLeuSerPhe165170175ValIleSerGluAsnAspValLysLysValLysGluPheValGlyAsp180185190GluAlaTrpValIleAlaLysIleGluLysSerGluAlaLeuLysAsn195200205LeuThrAsnIleValAsnGluSerAspGlyIleMetValAlaArgGly210215220AspLeuGlyValGluThrGlyLeuGluAsnLeuProLeuIleGlnArg225230235240ArgIleValArgThrSerArgValPheGlyLysProValIleLeuAla245250255ThrGlnValLeuThrSerMetIleAsnSerProIleProThrArgAla260265270GluIleIleAspIleSerAsnSerIleMetGlnGlyValAspSerIle275280285MetLeuSerAspGluThrAlaIleGlyAsnTyrProValGluSerVal290295300ArgThrLeuHisAsnIleIleSerAsnValGluLysSerValLysHis305310315320ArgProIleGlyProLeuAsnSerGluSerAspAlaIleAlaLeuAla325330335AlaValAsnAlaSerLysValSerLysAlaAspValIleValValTyr340345350SerArgSerGlyAsnSerIleLeuArgValSerArgLeuArgProGlu355360365ArgAsnIleIleGlyValSerProAspProArgLeuAlaLysLysPhe370375380LysLeuCysTyrGlyValIleProIleSerIleAsnLysLysMetGln385390395400SerIleAspGluIleIleAspValSerAlaLysLeuMetGlnGluLys405410415IleLysAspLeuLysPheLysLysIleValIleValGlyGlyAspPro420425430LysGlnGluAlaGlyLysThrAsnPheValIleValLysThrLeuGlu435440445GlnGlnLysLys450<210>23<211>466<212>PRT<213>Thermotogamaritima<400>23MetArgSerThrLysIleValCysThrValGlyProArgThrAspSer151015TyrGluMetIleGluLysMetIleAspLeuGlyValAsnValPheArg202530IleAsnThrSerHisGlyAspTrpAsnGluGlnGluGlnLysIleLeu354045LysIleLysAspLeuArgGluLysLysLysLysProValAlaIleLeu505560IleAspLeuAlaGlyProLysIleArgThrGlyTyrLeuGluLysGlu65707580PheValGluLeuLysGluGlyGlnIlePheThrLeuThrThrLysGlu859095IleLeuGlyAsnGluHisIleValSerValAsnLeuSerSerLeuPro100105110LysAspValLysLysGlyAspThrIleLeuLeuSerAspGlyGluIle115120125ValLeuGluValIleGluThrThrAspThrGluValLysThrValVal130135140LysValGlyGlyLysIleThrHisArgArgGlyValAsnValProThr145150155160AlaAspLeuSerValGluSerIleThrAspArgAspArgGluPheIle165170175LysLeuGlyThrLeuHisAspValGluPhePheAlaLeuSerPheVal180185190ArgLysProGluAspValLeuLysAlaLysGluGluIleArgLysHis195200205GlyLysGluIleProValIleSerLysIleGluThrLysLysAlaLeu210215220GluArgLeuGluGluIleIleLysValSerAspGlyIleMetValAla225230235240ArgGlyAspLeuGlyValGluIleProIleGluGluValProIleVal245250255GlnLysGluIleIleLysLeuSerLysTyrTyrSerLysProValIle260265270ValAlaThrGlnIleLeuGluSerMetIleGluAsnProPheProThr275280285ArgAlaGluValThrAspIleAlaAsnAlaIlePheAspGlyAlaAsp290295300AlaLeuLeuLeuThrAlaGluThrAlaValGlyLysHisProLeuGlu305310315320AlaIleLysValLeuSerLysValAlaLysGluAlaGluLysLysLeu325330335GluPhePheArgThrIleGluTyrAspThrSerAspIleSerGluAla340345350IleSerHisAlaCysTrpGlnLeuSerGluSerLeuAsnAlaLysLeu355360365IleIleThrProThrIleSerGlySerThrAlaValArgValSerLys370375380TyrAsnValSerGlnProIleValAlaLeuThrProGluGluLysThr385390395400TyrTyrArgLeuSerLeuValArgLysValIleProValLeuAlaGlu405410415LysCysSerGlnGluLeuGluPheIleGluLysGlyLeuLysLysVal420425430GluGluMetGlyLeuAlaGluLysGlyAspLeuValValLeuThrSer435440445GlyValProGlyLysValGlyThrThrAsnThrIleArgValLeuLys450455460ValAsp465<210>24<211>477<212>PRT<213>激烈热球菌<400>24MetArgArgValLysLeuProSerHisLysThrLysIleValAlaThr151015IleGlyProAlaThrAsnSerArgLysMetIleLysGlnLeuIleLys202530AlaGlyMetAsnValAlaArgIleAsnPheSerHisGlySerPheGlu354045GluHisAlaArgValIleGluIleIleArgGluGluAlaGlnLysLeu505560AspArgArgValAlaIleLeuAlaAspLeuProGlyLeuLysIleArg65707580ValGlyGluIleLysGlyGlyTyrValGluLeuLysArgGlyGluLys859095ValIleLeuThrThrLysAspValGluGlyAspGluThrThrIlePro100105110ValAspTyrLysGlyPheProAsnLeuValSerLysGlyAspIleIle115120125TyrLeuAsnAspGlyTyrIleValLeuLysValGluAsnValArgGlu130135140AsnGluValGluAlaValValLeuSerGlyGlyLysLeuPheSerArg145150155160LysGlyValAsnIleProLysAlaTyrLeuProValGluAlaIleThr165170175ProLysAspPheGluIleMetLysPheAlaIleGluHisGlyValAsp180185190AlaIleGlyLeuSerPheValGlySerValTyrAspValLeuLysAla195200205LysSerPheLeuGluLysAsnAsnAlaGluAspValPheValIleAla210215220LysIleGluArgProAspAlaValArgAsnPheAspGluIleLeuAsn225230235240AlaAlaAspGlyIleMetIleAlaArgGlyAspLeuGlyValGluMet245250255ProIleGluGlnLeuProIleLeuGlnLysLysLeuIleArgLysAla260265270AsnMetGluGlyLysProValIleThrAlaThrGlnMetLeuValSer275280285MetThrThrGluLysValProThrArgAlaGluValThrAspValAla290295300AsnAlaIleLeuAspGlyThrAspAlaValMetLeuSerGluGluThr305310315320AlaIleGlyLysPheProIleGluThrValGluMetMetGlyLysIle325330335AlaLysValThrGluGluTyrArgGluSerPheGlyLeuSerArgIle340345350ArgGluPheMetGluIleLysLysGlyThrIleLysGluAlaIleThr355360365ArgSerIleIleAspAlaIleCysThrIleAspIleLysPheIleLeu370375380ThrProThrArgThrGlyArgThrAlaArgLeuIleSerArgPheLys385390395400ProLysGlnTrpIleLeuAlaPheSerThrAsnGluArgValCysAsn405410415AsnLeuMetPheSerTyrGlyValTyrProPheCysLeuGluGluGly420425430PheAspGluAsnAspIleValArgLeuIleLysGlyLeuGlyLeuVal435440445GluSerAspAspMetValLeuMetThrGluGlyLysProIleGluLys450455460ThrValGlyThrAsnSerIleLysIlePheGlnIleAla465470475<210>25<211>408<212>PRT<213>Methanosarcinathermophila<400>25MetLysValLeuValIleAsnAlaGlySerSerSerLeuLysTyrGln151015LeuIleAspMetThrAsnGluSerAlaLeuAlaValGlyLeuCysGlu202530ArgIleGlyIleAspAsnSerIleIleThrGlnLysLysPheAspGly354045LysLysLeuGluLysLeuThrAspLeuProThrHisLysAspAlaLeu505560GluGluValValLysAlaLeuThrAspAspGluPheGlyValIleLys65707580AspMetGlyGluIleAsnAlaValGlyHisArgValValHisGlyGly859095GluLysPheThrThrSerAlaLeuTyrAspGluGlyValGluLysAla100105110IleLysAspCysPheGluLeuAlaProLeuHisAsnProProAsnMet115120125MetGlyIleSerAlaCysAlaGluIleMetProGlyThrProMetVal130135140IleValPheAspThrAlaPheHisGlnThrMetProProTyrAlaTyr145150155160MetTyrAlaLeuProTyrAspLeuTyrGluLysHisGlyValArgLys165170175TyrGlyPheHisGlyThrSerHisLysTyrValAlaGluArgAlaAla180185190LeuMetLeuGlyLysProAlaGluGluThrLysIleIleThrCysHis195200205LeuGlyAsnGlySerSerIleThrAlaValGluGlyGlyLysSerVal210215220GluThrSerMetGlyPheThrProLeuGluGlyLeuAlaMetGlyThr225230235240ArgCysGlySerIleAspProAlaIleValProPheLeuMetGluLys245250255GluGlyLeuThrThrArgGluIleAspThrLeuMetAsnLysLysSer260265270GlyValLeuGlyValSerGlyLeuSerAsnAspPheArgAspLeuAsp275280285GluAlaAlaSerLysGlyAsnArgLysAlaGluLeuAlaLeuGluIle290295300PheAlaTyrLysValLysLysPheIleGlyGluTyrSerAlaValLeu305310315320AsnGlyAlaAspAlaValValPheThrAlaGlyIleGlyGluAsnSer325330335AlaSerIleArgLysArgIleLeuThrGlyLeuAspGlyIleGlyIle340345350LysIleAspAspGluLysAsnLysIleArgGlyGlnGluIleAspIle355360365SerThrProAspAlaLysValArgValPheValIleProThrAsnGlu370375380GluLeuAlaIleAlaArgGluThrLysGluIleValGluThrGluVal385390395400LysLeuArgSerSerIleProVal405<210>26<211>585<212>DNA<213>嗜酸热硫化叶菌<400>26atgaagattggtattgtaactggaattcctggtgtagggaaaagtactgtcttggctaaa60gttaaagagatattggataatcaaggtataaataacaagatcataaattatggagatttt120atgttagcaacagcattaaaattaggctatgctaaagatagagacgaaatgagaaaatta180tctgtagaaaagcagaagaaattgcagattgatgcggctaaaggtatagctgaagaggca240agagcaggtggagaaggatatctgttcatagatacgcatgctgtgatacgtacaccctct300ggatatttacctggtttaccgtcatatgtaattacagaaataaatccgtctgttatcttt360ttactggaagctgatcctaagataatattatcaaggcaaaagagagatacaacaaggaat420agaaatgattatagtgacgaatcagttatattagaaaccataaacttcgctagatatgca480gctactgcttctgcagtattagccggttctactgttaaggtaattgtaaacgtggaagga540gatcctagtatagcagctaatgagataataaggtctatgaagtaa585<210>27<21l>585<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>27atgaaaatcggtatcgttaccggtatcccgggtgttggtaaatctaccgttctggctaaa60gttaaagaaatcctggacaaccagggtatcaacaacaaaatcatcaactacggtgacttc120atgctggctaccgctctgaaactgggttacgctaaagaccgtgacgaaatgcgtaaactg180tctgttgaaaaacagaaaaaactgcagatcgacgctgctaaaggtatcgctgaagaagct240cgtgctggtggtgaaggttacctgttcatcgacacccacgctgttatccgtaccccgtct300ggttacctgccgggtctgccgtcttacgttatcaccgaaatcaacccgtctgttatcttc360ctgctggaagctgacccgaaaatcatcctgtctcgtcagaaacgtgacaccacccgtaac420cgtaacgactactctgacgaatctgttatcctggaaaccatcaacttcgctcgttacgct480gctaccgcttctgctgttctggctggttctaccgttaaagttatcgttaacgttgaaggt540gacccgtctatcgctgctaacgaaatcatccgttctatgaaatag585<210>28<211>663<212>DNA<213>Thermotogamaritima<400>28atgatggcgtaccttgtctttctaggacctccaggtgcaggaaaaggaacctacgcaaag60agattgcaggaaataacggggattcctcatatatccaccggtgacattttcagggacatt120gtaaaaaaagagaacgacgagcttgggaaaaagataaaagagatcatggaaaggggagaa180ctcgttccggacgaactcgtgaacgaggttgtgaaaagaagactctcagaaaaagattgt240gaaagaggattcatactggacggctatccaagaaccgttgctcaggcggaattcctcgac300ggctttttgaaaactcaaaacaaagagctcacggctgctgtactctttgaagttcctgag360gaagtggtcgttcagaggctcacggccagaaggatctgcccgaaatgtggaagaatttac420aatttgatttcgctccctccaaaagaagacgaactgtgcgatgattgtaaagtg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的方法，其中所述预先确定的激酶活性降低程度相当于激酶的量或浓度降低至少8个对数级。63.根据权利要求38-62的任一项的方法，其中所述预先确定的激酶活性降低程度相当于相对光单位降低至少900,000RLU。64.根据权利要求63的方法，其中所述预先确定的激酶活性降低程度相当于相对光单位降低至少990,000RLU。65.根据权利要求64的方法，其中所述预先确定的激酶活性降低程度相当于相对光单位降低至少999,000RLU。66.根据权利要求65的方法，其中所述预先确定的激酶活性降低程度相当于相对光单位降低至少999,900RLU。67.根据权利要求66的方法，其中所述预先确定的激酶活性降低程度相当于相对光单位降低至少999,990RLU。68.根据权利要求38-67的任一项的方法，其中所述生物因子的量或活性的确定降低程度是至少6个对数级的降低。69.根据权利要求68的方法，其中所述生物因子的量或活性的确定降低程度是至少7个对数级的降低。70.根据权利要求68的方法，其中所述生物因子的量或活性的确定降低程度是至少8个对数级的降低。71.根据权利要求38-70的任一项的方法，包括在处理所述样品之前和处理所述样品之后测定激酶活性。72.根据权利要求38-71的任一项的方法，包括在测定残余激酶活性之前，于80℃处理所述样品至少10分钟。73.根据权利要求38-72的任一项的方法，其中测定残余激酶活性包括向所述残余激酶中加入含ADP底物，和测定ATP的形成。74.根据权利要求38-73的任一项的方法，包括持续所述处理，直至所述残余激酶活性或所述激酶活性降低程度相当于所述生物因子的量或活性的确定降低程度是至少6个对数级。75.根据权利要求74的方法，包括持续所述处理，直至所述残余激酶活性或所述激酶活性降低程度相当于所述生物因子的量或活性的确定降低程度是至少7个对数级。76.根据权利要求75的方法，包括持续所述处理，直至所述残余激酶活性或所述激酶活性降低程度相当于所述生物因子的量或活性的确定降低程度是至少8个对数级。77.将样品中生物因子的量或活性的降低程度与根据权利要求18-30中任一项的指示物的激酶活性关联的方法，包括(i)制备含有确定量的所述生物因子的样品和含有确定量的所述激酶的样品；(ii)使所述样品接受处理；(vi)测定所述激酶的残余活性，任选地计算所述激酶活性的降低程度；(vii)测定所述生物因子的残余量或残余活性，并任选地计算所述生物因子量或活性的降低程度；(viii)重复步骤(i)至(v)，其中至少一个处理参数被改变。78.根据权利要求77的方法，其中所述生物因子是感染性生物因子，所述处理降低所述因子的感染活性。79.根据权利要求77或78的方法，其中所述生物因子是传染性海绵状脑病。80.根据权利要求77-79中任一项的方法，其中所述处理参数包括时间、温度、pH值、压力、蛋白酶浓度和杀菌剂或去污剂浓度中的一个或多个。81.根据权利要求77-80中任一项的方法，其中所述处理包括，在50-140℃之间的温度下，优选地在134-138℃下，加热所述样品；所述处理参数是时间；其中通过使所述样品接受所述处理1、5、10、20、40和60分钟，重复所述步骤(i)至(iv)。82.根据权利要求77-81中任一项的方法，其中所述处理包括，将所述样品暴露于9-14的pH下，优选地暴露于约pH12下；所述处理参数是时间；其中通过使所述样品接受所述处理1、5、10、20、40和60分钟，重复所述步骤(i)至(iv)。83.根据权利要求77-82中任一项的方法，其中所述处理包括，将所述样品暴露于浓度为0.5-2mg/ml，优选地为1mg/ml的蛋白酶；所述处理参数是时间；其中通过使所述样品接受所述处理1、5、10、20、40和60分钟，重复所述步骤(i)至(v)。全文摘要将激酶用在生物指示物中，用于验证设计用来降低样品中生物因子的量或活性的处理过程。可以将指示物用于验证灭菌处理。从包含ADP的底物形成ATP是通过发光计中的萤光素/萤光素酶系统得以测定。来自嗜酸热硫化叶菌的热稳定腺苷酸激酶特别适合用于验证失活传染性海绵状脑病(TSE)因子的步骤。文档编号C12Q1/48GK1946857SQ200580009130公开日2007年4月11日申请日期2005年3月22日优先权日2004年3月22日发明者J·M·萨顿,N·D·H·雷文申请人:健康保护机构