使用全细胞催化剂制备光学活性氨基酸的方法

专利名称：使用全细胞催化剂制备光学活性氨基酸的方法
技术领域：
本发明描述了一种制备光学活性L-α-氨基酸的方法。本发明特别描述了一种制备通式(I)的化合物或者衍生于其的盐的方法， 其中R是烷基和取代的烷基或衍生于其的盐，所述烷基特别是展现一个叔C原子并且具有5-10个C原子空间充满支链烷基基团(space-filling branched alkyl group)，例如叔丁基。
光学活性L-α-氨基酸用于制备许多有价值的化合物。例如，这些化合物可作为生产药物的中间体。在许多药物活性化合物中作为结构元件并因此作为合成相应的药物活性化合物所需的中间体的L-叔-亮氨酸是这类产物中一种特别有价值的代表。A.S.Bommarius等(J.Mol.Cat.BEnzymatic 1998，5，1-11)提供了使用L-叔-亮氨酸作为药物活性化合物的构造单元(building block)的实例。
使用来自博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)的亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶酶促还原2-酮羧酸同时原位再生辅因子构成了已建立的制备光学活性L-α-氨基酸的工业化方法。特别地，这个途径适于制备非蛋白质氨基酸L-叔-亮氨酸，其是使用这种生物催化方法以成吨的规模生产的。这一方法在如下文献中详细描述(EP0692538；U.Kragl，D.Vasic-Racki，C.Wandrey，Bioprocess Engineering 1996，14，291-297；A.S.Bommarius，M.Schwarm，K.Drauz，J.Mol.Cat.BEnzymatic 1998，5，1-11；G.Krix，A.S.Bommarius，K.Kottenhahn，M.Schwarm，M.-R.Kula，J.Biotechnol.1997，53，29-39，A.Liese，C.Wandrey，A.Liese，K.Seelbach，C.Wandrey，Industrial Biotransformations，Wiley-VCH，Weinheim，2000，p.125f.和A.S.Bommarius，K.Drauz，W.Hummel，M.-R.Kula，C.Wandrey，Biocatalysis 1994，10，37-47。另外，A.S.Bommarius提供了一般综述Enzyme Catalysis in OrganicSynthesis(Eds.K.Drauz and H.Waldmann)，Volume 2，2nd edition，Wiley-VCH，Weinheim，2003，chapter 15.3，p.1047f.)。
图解1使用分离的酶及加入的辅因子(以NAD+-依赖性氨基酸脱氢酶和用于再生辅因子的甲酸脱氢酶为例)制备L-叔-亮氨酸使用的以及需要加入的NAD+辅因子的典型量在例如EP0692538中描述，范围是0.0008当量至0.02当量。另外，G.Krix等(J.Biotechnol.1997，53，29-39)描述了使用0.003当量的NAD+辅因子以工业批次规模制备(S)-新戊基甘氨酸的方法。EP0692538中典型的底物浓度为100-250mM。A.Liese等(Industrial Biotransformations，Wiley-VCH，Weinheim，2000，p.125f.)描述了使用0.5M浓度的底物制备L-叔-亮氨酸，产量为74％。G.Krix等(J.Biotechnol.1997，53，29-39)还描述了使用分离的亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶在0.5-1M底物浓度还原性胺化的性能。
＞99％ee及因此有助于符合药物中间体的严格质量要求的高转换率(turnover)和显著的对映异构体选择性是这种方法的优势。其也可以在高底物浓度下运转，从工业化观点来看这是一个重要方面。
然而，前述方法的缺点是首先需要分离的酶。这些分离的酶特别是以纯化的形式使用，这样由于生物催化剂的原因而伴随成本增加。由于较高的酶成本，必需将所述酶多次再循环以获得满意的经济效益，特别是降低酶的成本。除了这些连续进行的再循环步骤的长运转时间之外，由于这个缺点导致每批次的相对小的反应体积是不利的。
另一个缺点是需要在反应中加入辅因子。虽然这些辅因子是以大约0.001当量的级别催化性加入，然而由于高价格而甚至在催化数量下其也是相当可观的成本因素。
因此需要一种不需要使用分离的酶及加入辅因子、或者加入最少的辅因子、然而合成具有高转换率、高对映异构体选择性和高容量生产性的方法。以这种方式，可以大大降低酶的成本并且节约辅因子成本，因此增加经济效益。
Soda等描述了使用包含亮氨酸脱氢酶和细菌甲酸脱氢酶的全细胞催化剂(whole-cell catalyst)还原性胺化支链α-酮羧酸如L-叔-亮氨酸(Appl.Environm.Microbiology 1997，63，4651-4656)。这个出版物明确指出在还原性胺化中需要的酶可以全细胞催化剂的形式应用，特别是以包含这些酶的大肠杆菌(E.coli)、作为活的或者静止细胞的形式使用。然而，如果优选利用大肠杆菌中的NAD+胞内库以避免加入NAD+，则产物的终浓度限于大约0.3M。这不足以进行工业化应用。
因此本发明的目的是提供制备L-α-氨基酸的另一种方法，其是酶促运行的并且可以有利地以工业规模进行。所述方法特别在上述方面应优于现有技术，并且应该可以从经济效益方面(特别是时空产量)来看有利地生产所需的产物。
本发明的这些目的以及未详细描述但在本领域可以显而易见方式获得的其它目的是通过权利要求1的方法实现的。权利要求2-9涉及本发明方法的优选实施方案。
所述目的以非常优良及令人惊讶但有利的方式通过一种方法实现，所述方法是通过将相应的2-酮羧酸与铵离子供体在存在全细胞催化剂的条件下反应、计量每反应体积的底物总输入量≥500mM、加入底物使得2-酮羧酸的稳定浓度(stationary concentration)小于500mM、基于底物的总输入量外部加入辅因子相当于＜0.0001当量而制备对映异构体富集的L-α-氨基酸或其盐，所述全细胞催化剂包含编码辅因子依赖性氨基酸脱氢酶的克隆的基因和编码再生辅因子的酶的克隆的基因。
令人惊奇地，例如可以通过使用全细胞催化剂同时在底物中计量以省却加入昂贵的辅因子或者通过使得外部加入量最小(＜0.0001当量)以将其浓度保持在低范围，这样有助于节约输入成本。相反，不用这种计量技术，当最初导入的每反应体积底物数量＞500mM时，使用全细胞催化剂的还原性胺化只有在加入相对大量的NAD+辅因子时才取得成功。在不存在后者的情况中，所述浓度不能令人满意(见对比例“合成实施例1”，每反应体积初始底物数量为900mM-最终转换率为25％)。因此，只有通过使用本发明的方法(见合成实施例2-5)才能几乎完全省却外部加入辅因子，即使当使用相对高的每反应体积总转换数进行合成时，因此在这种情况下具有经济学意义。
因此，在一个优选的实施方案中，昂贵的辅因子仅以这样的数量加入，所述数量基于底物其浓度保持在优选＜0.00005当量，非常优选＜0.00001当量。特别优选的是在反应混合物中不用外部加入辅因子。因此在这种情况中，根本不需要加入辅因子(例如NAD(H))，这在现有技术中是不能显而易见推知的。
在所述反应中，本领域技术人员可随意选择编码辅因子依赖性氨基酸脱氢酶和再生辅因子的酶的基因，所述基因能由作为宿主生物体的全细胞催化剂表达。技术人员从现有技术可以获知所述酶。
关于氨基酸脱氢酶，合适的酶是选自亮氨酸脱氢酶(如US5854035所述)和苯丙氨酸脱氢酶(如US5416019所述)的酶。经证实是合适的氨基酸脱氢酶(例如A.Bommarius inEnzyme Catalysis in OrganicSynthesis(Eds.K.Drauz and H.Waldmann)，Volume III，Wiley-VCH，Weinheim，2002，chapter 15.3所述)特别是亮氨酸脱氢酶，来自芽孢杆菌菌株的亮氨酸脱氢酶，在这种情况中特别是球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)(Seq.ID No.5)和嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的亮氨酸脱氢酶是特别适合的。可以考虑的辅因子再生酶选自甲酸脱氢酶(如EP1295937所述)、苹果酸脱氢酶(如PCT/EP/03/08631所述)、乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶(后者例如A.Bommarius inEnzyme Catalysis in Organic Synthesis(eds.K.Drauz and H.Waldmann)，Volume III，Wiley-VCH，Weinheim，2002，p.1473，993，994，1037，1038，1054，1126；Glucose dehydrogenasefrom Bacillus subtilis expressed in Escherichia coli.IPurification，characterization and comparison with glucose dehydrogenase fromBacillus megaterium，Hilt W；Pfleiderer G；Fortnagel P Biochimica andbiophysica acta(1991 Jan 29)，1076(2)，298-304所述)。使用来自博伊丁氏假丝酵母的甲酸脱氢酶或者由其获得的突变体(如EP1295937所述；Seq.ID No.7)同时应用含有甲酸盐的成分作为底物经证实是特别优选的。
就此，包含亮氨酸脱氢酶和来自博伊丁氏假丝酵母的甲酸脱氢酶或者衍生于其的突变体的全细胞催化剂是特别适合的。
通过全细胞催化剂转化的底物谱(substrate spectrum)根据应用的氨基酸脱氢酶而有所不同。亮氨酸脱氢酶更适合线性和分支的脂肪族取代的2-酮羧酸，苯丙氨酸脱氢酶优选用于芳香族取代的底物。关于亮氨酸脱氢酶在全细胞催化剂中的应用，优选可以应用并转化具有脂肪族基团R的通式(II)所示底物。
具有大的脂族基团R的底物是特别合适的。这些R基团主要选自1-金刚烷基(1-adamantyl)、新戊基和叔丁基。为此，优选使用2-酮羧酸或者其盐，产生通式(I)所示氨基酸， 其中R是烷基和取代的烷基，特别是展现一个叔C原子并具有5-10个C原子的空间充满支链烷基基团，例如叔丁基。
原则上，本领域技术人员可以随意选择进行本发明方法的方式。就此而论，技术人员可以学习现有技术中已知的方法。这些方法可以是连续或者不连续的。有利的是根据补料分批方法计量加入的底物(见例如合成实施例2和4)或者通过连续方式加入(分别见例如合成实施例3和5)。在这两种改变方法中，加入底物由此底物的稳定浓度小于500mM。
在反应期间，2-酮羧酸作为底物在小于450mM、特别优选小于400mM的最大稳定浓度应用是有利的。
在补料分批方法中，所述底物在一定时间单位之后部分加入，优选以底物溶液加入。加入的底物部分的次数优选在3-15之间，特别优选5和9之间。加入的底物溶液的浓度应优选足够高以达到尽可能高的每反应体积总底物输入量。合成实施例2和4提供了这种补料分批方法的实例。在持续的改变方法中，底物在一定时间内持续加入，优选以恒定计量速度、优选底物以底物溶液的形式加入。合成实施例3提供了这种持续的改变方法的实例。
所有已知细胞均适合用作包含氨基酸脱氢酶和能再生辅因子的酶的全细胞催化剂。在这个方面可以提及的微生物是生物体，如酵母，例如多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、毕赤氏酵母(Pichiasp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，原核生物如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，或者真核生物如哺乳动物细胞、昆虫细胞或者植物细胞。克隆方法为技术人员所熟知(Sambrook，J.；Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)，Molecular cloninga laboratorymanual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)。为此优选使用大肠杆菌菌株。特别优选的是大肠杆菌XL1 Blue、NM 522、JM101、JM109、JM105、RR1、DH5α、TOP 10-、HB101、BL21 codonplus、BL21(DE3)codon plus、BL21、BL21(DE3)、MM294。优选用于将含有本发明核酸的基因构建体克隆进宿主生物体中的质粒同样为技术人员所已知(也见PCT/EP03/07148所述；如下述)。
合适的质粒或者载体原则上是技术人员为此可利用的所有形式。这些质粒和载体可见于例如Studier及其同事所述(Studier，W.F.；Rosenberg A.H.；Dunn J.J.；Dubendroff J.W.；(1990)，Use of the T7 RNApolymerase to direct expression of cloned genes，Methods Enzymol.185，61-89)或者由公司Novagen、Promega、New England Biolabs、Clontech或Gibco BRL提供。其它优选的质粒和载体可见于Glover，D.M.(1985)，DNA cloninga practical approach，Vol.I-III，IRL Press Ltd.，Oxford；Rodriguez，R.L.and Denhardt，D.T.(eds)(1988)，Vectorsasurvey of molecular cloning vectors and their uses，179-204，Butterworth，Stoneham；Goeddel，D.V.(1990)，Systems for heterologous geneexpression，Methods Enzymol.185，3-7；Sambrook，J.；Fritsch，E.F.andManiatis，T.(1989)，Molecular cloninga laboratory manual，2nd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York所述。特别优选用于将含有所述核酸序列的基因构建体克隆进宿主生物体的质粒是或者基于pUC18/19(Roche Biochemicals)、pKK-177-3H(Roche Biochemicals)、pBTac2(Roche Biochemicals)、pKK223-3(Amersham PharmaciaBiotech)、pKK-233-3(Stratagene)或pET(Novagen)。
在本发明的另一个实施方案中，在其应用之前，优选将全细胞催化剂进行预处理，由此细胞膜对于底物和产物的通透性与未经处理的系统相比而增加。就此而论，特别优选的方法是其中全细胞催化剂例如通过冷冻和/或通过用甲苯处理。本发明方法的基本特征示于图解2。
当使用本发明的方法时，底物可以非常高的浓度应用，因为当使用各个酶时现有技术已经加以描述。在本发明中，有利地应用高于500mM浓度的2-酮羧酸。也优选将底物以高于800mM、优选高于900mM及非常优选高于1000mM浓度导入反应中。然而，在这个实施方案中，重要是在反应混合物中加入辅因子以获得相应的转换率。
然而，尽管需要高空间-时间产量，但如果希望使用全细胞催化剂，则不需要外部加入昂贵的辅因子，或者仅需要外部加入小于0.0001当量的极小量辅因子，技术人员可惊奇地发现通过本发明的计量底物方法而达到这目的。
在本发明反应中，优选程序是首先将全细胞催化剂和铵离子供体导入水中。技术人员认为对此适合的任何化合物均可用作铵离子供体。特别地，这些铵离子供体是选自典型铵盐的化合物。当选择甲酸脱氢酶作为辅因子再生系统时，特别优选的是使用甲酸铵或者各个酮酸的铵盐。所述反应通过如下图解2非常清楚地描述。
图解2本发明的全细胞催化剂方法中所述反应的原理(以NAD+-依赖性氨基酸脱氢酶和甲酸脱氢酶再生辅因子为例)。
在另一个优选的实施方案中，将包含葡萄糖脱氢酶和氨基酸脱氢酶的全细胞催化剂与水和葡萄糖混合，向其中加入相应酮酸的铵盐。反应示于随后的图解3中。
图解3本发明全细胞催化剂的反应，例如通过NAD+-依赖性氨基酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶再生辅因子。
如果使用其它脱氢酶而不是亮氨酸脱氢酶，所述酶可以发挥最佳功能的条件可见于本领域。读者可参考US5416019和Galkin等(Appl.Environ.Microbiol.1997，63，4651)关于使用苯丙氨酸脱氢酶的描述。
关于辅因子再生酶和待确立的条件可参见EP1295937(甲酸脱氢酶)、PCT/EP/03/08631(苹果酸脱氢酶)和Enzyme Catalysis in OrganicSynthesis(Eds.K.Drauz and H.Waldmann)，Volume III，Wiley-VCH，Weinheim，2002，S.1473，993，994，1037，1038，1054或者1126。优选来自在大肠杆菌中表达的枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶(IPurification，characterization and comparison with glucose dehydrogenase fromBacillus megaterium，Hilt W；Pfleiderer G；Fortnagel P，Biochimica etbiophysica acta(1991 Jan 29)，1076(2)，298-304)和本文所引文献。
使用技术人员已知的方法纯化所述反应混合物。在分批方法中，所述生物量可以通过过滤或者离心而容易地从产物中分离。然后将获得的氨基酸可以使用常规方法分离(离子交换层析、结晶)。
然而，本发明的方法也可以持续进行。为此，可以在所谓酶-膜反应器中进行反应，所述反应器中高分子量物质，即生物量保留在超滤膜后，已经产生的低分子量的物质如氨基酸能通过该膜。这种方法在现有技术中已经多次描述(Wandrey et al.in year-book 1998，Verfahrenstechnik und Chemieingenieurwesen[Process technology andchemical engineering]，VDI，p.151ff；Kragl et al.，Angew.Chem.1996，6，684)。
本发明的制备氨基酸(特别是大体积的氨基酸)的方法由于其优势而非常易于以商业规模建立。令人惊奇的事实是在所述反应中必需的加入辅因子在本发明的方法中可以省却，并且全细胞催化剂易于处理，这又是本发明的方法相对于现有技术方法的非显而易见的优越性。
另外，令人惊奇的是当使用全细胞催化剂时，非所需的代谢/生理功能的影响是不重要的。这两方面均以非常全面的方式降低了制备L-α-氨基酸所需的成本。
再令人惊奇的是尽管存在细胞壁的通透化和与之相关的存在于细胞中的辅因子渗漏(escaping)的可能性，但是未观察到预期对反应的不利损害，例如转换率降低所致的结果。
在本发明中，光学富集的(对映异构体富集的、对映异构体纯的)化合物是指当与其它化合物混合时存在＞50mol％的一种旋光对映体。
全细胞催化剂是指一种微生物，其包含编码至少能催化在有机化合物转化中两个连续步骤的酶的克隆基因。在这方面及一般制备方法方面(在转换率方面符合酶表达)，参见EP1216304所述。
根据本发明，烷基是指(C1-C18)-烷基基团。这涵盖了线性和任意分支的这种性质的基团。其特别包括甲基、乙基、1-丙基、2-丙基、1-正丁基、2-正丁基、1-或2-异丁基，1-或2-仲丁基、叔丁基等等。所述基团可以被(C1-C8)-杂烷基基团或者如OH、SH、Hal和NH2基团取代一或多次。杂烷基基团特别是指上述在其链中具有1-8个碳原子并且含有杂原子如O、S或者N的烷基基团或者通过这些杂原子与研究中的分子结合的烷基基团。
外部加入辅因子是指辅因子的数量是人工加入反应混合物中的。这个数量可以看作是除了已经通过全细胞催化剂固有地导入反应混合物中的辅因子数量之外的数量。
毋庸置疑，反应中使用的2-酮羧酸以解离的形式存在于反应混合物中。这种形式可以通过使用酮羧酸并相应调节pH或者通过加入酮羧酸的盐而获得。本发明包括这两种形式。
术语总底物浓度是指每反应体积的底物总输入量。
附图简述

图1-pAM3.25(Seq.ID No.9)构建pJOE4580.2质粒pJOE4580.2是从公布的质粒pJOE3075(T.Stumpp，B.Wilmsand J.Altenbuchner(2000)Biospektrum 1/200033-36)通过用限制性核酸内切酶NdeI/HindIII切割而除去malE基因并将其用两个寡核苷酸置换而形成的，所述寡核苷酸再次互补NdeI和HindIII切割位点，并且携带一个NheI、AatII和PstI切割位点。将携带大肠杆菌lacZalpha基因的、质粒pJOE773(J.Altenbuchner，P.Viell，I.Pelletier(1992)Positiveselection vectors based on palindromic DNA sequences.MethodsEnzymol 216457-466)的SmaI片段用Klenow聚合酶和dNTP填充后插入NheI切割位点。当携带这种质粒时，大肠杆菌JM109在含有X-Gal和IPTG的LB平板上展现蓝色菌落。这个质粒称作pJOE4580.2。将FDH序列(Seq.ID No.7)克隆入这个质粒。所得质粒称作pAM3.25。
图2-pAM5.22构建pJOE4580.2质粒pJOE4580.2是从公布的质粒pJOE3075(T.Stumpp，B.Wilmsand J.Altenbuchner(2000)Biospektrum 1/200033-36)通过用限制性核酸内切酶NdeI/HindIII切割而除去malE基因并将其用两个寡核苷酸置换而形成的，所述寡核苷酸再次互补NdeI和HindIII切割位点，并且携带一个NheI、AatII和PstI切割位点。将携带大肠杆菌lacZalpha基因的、质粒pJOE773(J.Altenbuchner，P.Viell，I.Pelletier(1992)Positiveselection vectors based on palindromic DNA sequences.MethodsEnzymol 216457-466)的SmaI片段用Klenow聚合酶和dNTP填充后插入NheI切割位点。当携带这种质粒时，大肠杆菌JM109在含有X-Gal和IPTG的LB平板上展现蓝色菌落。这个质粒称作pJOE4580.2。将LeuDH序列(Seq.ID No.5)插入这个质粒中。新的质粒称作pAM5.22。
图3-pAM8.21构建pHWG640.12(Seq.ID No.11)质粒pHWG640.12先前未公布，因此如下描述其构建。这个质粒pHWG640.12源自公布的质粒pAW229，通过容易再现的方式构建。质粒pAW229是pACYC184衍生物，其含有一个鼠李糖启动子。从pAW229(B.Wilms，A.Wiese，C.Syldatk，R.Mattes，J.Altenbuchner(2001)J.Biotechnol 8619-30)中，用NdeI/HindIII切除hyuC基因并用经相同限制酶切割的、含有大肠杆菌K12sfcA(苹果酸酶)基因的PCR片段置换。所得质粒称作pHWG640.12。将LeuDH序列插入这个质粒中。新的质粒称作pAM8.21。
图4-pAM10.1(Seq.ID No.10)scfA基因(Seq.ID No.11)从质粒pAM8.21中缺失。新的质粒称作pAM10.1。
图5生物催化剂的亮氨酸脱氢酶(LeuDH)和甲酸脱氢酶(FDH)的比活性和光密度与诱导时间的关系描述；关于发酵条件的详细描述见实验部分。
实施例制备全细胞催化剂基因扩增与克隆为了克隆甲酸脱氢酶(FDH，来自博伊丁氏假丝酵母的fdh3，对氧化具有较低敏感性的突变体)和亮氨酸脱氢酶(蜡样芽孢杆菌LeuDH)以将三甲基丙酮酸经全细胞催化转化为叔-亮氨酸及再生辅因子，将这两种酶的基因首先通过PCR从得自上述菌株的染色体DNA中扩增。应用的寡核苷酸列于表1，PCR混合物的成分示于表2，PCR程序示于表3。
表1扩增FDH和LeuDH基因的寡核苷酸
寡核苷酸用于为基因附加限制性核酸内切酶的切割位点。在s3713情况中为BfrI，在s3714情况中为PstI，在s3723情况中为NdeI及在s3716情况中为AatII(见下划线处)。
表2得自Biomaster公司的PCR混合物、聚合酶、缓冲液和MgCl2；质粒DNA起始浓度为50μg/ml
表3PCR程序步骤2-4重复30次
在基因扩增后，将PCR片段使用GFX公司的“DNA PCR and gelband purification kit”纯化并使用下述限制性核酸内切酶分别连接进L-鼠李糖诱导型载体pJOE4580.2(pBR322衍生物；图1)和pHWG640.12(pACYC184衍生物；图3；Seq.ID No.11)中。
通常，限制混合物使用大约50μg的DNA/ml于10μl标准混合物中制备。加入1μl第一种酶和1μl的10×浓缩酶缓冲液。使用去离子H2O将混合物调节为终体积。待插入的DNA与从质粒DNA分离的限制酶保温。在用第一种酶限制后，进行沉淀步骤，其中用异丙醇沉淀DNA并用乙醇洗涤，然后干燥，溶解于8μl的TE 10.01中。在每种情况中，向这些混合物中加入1μl第二种酶和1μl第二种10×酶缓冲液，再次在37℃保温1.5小时。载体pAM10.1从pAM8.21制备，随后用Klenow聚合酶处理。然后使用1％琼脂糖凝胶(含有0.4μg溴化乙锭/ml的Seakem琼脂糖)分离DNA，用手术刀切下正确的条带以进一步使用。使用Biozym公司的EASY PURE凝胶纯化试剂盒根据说明书从小的凝胶块中洗脱DNA并溶解于15μl的TE 10.01中。
为了连接载体和插入体，选择混合物以使得插入DNA以大约两倍靶载体的浓度存在。在这种情况中，DNA浓度为大约50μg/ml。连接混合物的终体积为10μl，该混合物除了载体/插入体混合物之外还含有1μl连接酶和1μl的10×浓缩连接酶缓冲液(均得自ROCHE)。在4℃保温过夜。将该连接混合物转化进大肠杆菌K12JM109中，然后将该细菌在含有抗生素(100μg氨苄青霉素/ml(pAM3.25[Seq.ID No.9]，pAM5.22)或者25μg氯霉素/ml(pAM8.21，pAM10.1[Seq.ID No.10])的LB琼脂上选择，在分离质粒后检测克隆的所需质粒。
由于LeuDH(Seq.ID No.6)最初与苹果酸酶(Seq.ID No.12)偶联，因此首先将LeuDH基因插入已经含有苹果酸酶基因(sfcA)的pJOE4625.1中(图2)。然后将LeuDH基因插入pHGW640.12(图3)中，其是也含有鼠李糖启动子和sfcA基因的pACYC184衍生物，sfcA基因然后缺失。将来自质粒pAM5.22(图2)的LeuDH基因亚克隆进靶质粒pAM10.1(图4)中是构建一个双质粒系统必需的，该系统需要两个抗性标记用于选择。
表4克隆结果
发酵全细胞催化剂在HPLC分析示出FDH/LeuDH组合(大肠杆菌JM109/pAM3.25/pAM10.1)与对比模型系统(苹果酸酶/LeuDH，在pAM5.22上)相比，在缩小比例(1ml)的实验中在保温摇床中更好地将三甲基丙酮酸转化为叔-亮氨酸后，将质粒pAM3.25和pAM10.1转化进大肠杆菌BW3110中，因为这个菌株更适合发酵。本发明使用高细胞密度发酵制备足够大量的生物量以供随后使用模型系统进行研究。进行不加任何抗生素的发酵，预培养物(preliminary culture)在存在抗生素的条件下在30℃于30L发酵罐中生长，终体积为8L。为此，首先将细胞作为分批培养物在30℃生长直至OD600＝50及直至葡萄糖完全消耗(大约22小时)。然后通过加入已经过滤灭菌的终浓度为0.2％的鼠李糖诱导基因表达，补料分批培养通过自动加入营养溶液和矿物质(补料I和补料II)而起始。从诱导开始每2小时取样品，测定样品的OD和酶活性(酶活性使用各自的活性试验测定)。将直至发酵终止的OD和活性与时间的关系绘图表示，见图5。
在鼠李糖诱导后22小时终止发酵，因为尽管增加细胞密度，但是FDH的活性已经停滞，导致FDH活性停滞的原因大概是质粒丧失或者反应介质酸性太强。后者在全细胞反应中变得明显，其中当加入潮湿的生物量时与pH预先调节的溶液相比pH显著降低(ΔpHmax＝0.8)。两种酶的活性在LeuDH的情况中达到0.565U/mg总蛋白质，在FDH情况中达到0.123U/mg总蛋白质。基于发酵培养基，体积活性为32.77U/ml(LeuDH)和7.14U/ml(FDH)。在分离器中除去培养基之后，细胞产量为1.4kg潮湿的生物量。将细胞暂时贮存在-20℃直至用作全细胞催化剂。
发酵培养基预培养物 2×200ml预培养基cNa2SO4×10H2O＝2g/lc(NH4)2SO4＝2.675g/lcNH4Cl＝0.5g/lcK2HPO4＝14.625g/lcNaH2PO4×2H2O＝3.6g/l在90％体积H2O中高压灭菌c葡萄糖＝10g/l，终浓度(于H2O中的原液)单独高压灭菌1M MgSO4溶液，2ml/lTES，3ml/l硫胺素原液(10g/l于H2O中)，1ml/l分批培养将于接种瓶中含有葡萄糖、MgSO4、TES和硫胺素的接种物(380ml，其中Cx＝12g/l)加入高压灭菌的分批培养基中。
分批培养基(8L)Na2SO4×10H2O16g(NH4)2SO421.4gNH4Cl 4gK2HPO4117gNaH2PO4×2H2O28.8g(NH4)2H-柠檬酸 8g溶解于7.5L的H2O中，在30L发酵罐中灭菌一水葡萄糖 220g溶解于500ml的H2O中，高压灭菌(25g/l)1M MgSO4溶液 16mlTES 24ml硫胺素溶液(10g/l) 8ml(通过过滤将硫胺素灭菌，对剩余物高压灭菌)pH 7.2，使用H3PO4和NH3补料分批补料I.一水葡萄糖2750g于3.5L H2O中，高压灭菌，MgSO4×7H2O 98.5g于0.15L H2O中，高压灭菌TES溶液 0.5L，高压灭菌，
硫胺素 2.5g于0.5L H2O中，过滤灭菌然后在补料瓶中组合。
II(NH4)2HPO4396g于1L H2O中，pH 7，高压灭菌。
补料I和II使用两个单独的泵加入。
pH7.2(用H3PO4和NH3滴定)pO2大约50kPa(通过搅拌器的转速调节)微量元素溶液(TES)CaCl2×2H2O 0.5gZnSO4×7H2O 0.18gMnSO4×H2O 0.1gDi-Na-EDTA 20.1gFeCl3×6H2O 16.7gCuSO4×5H2O 0.16gCoCl2×6H2O 0.18gH2O至11使用900mM全细胞催化剂不用计量制备L-叔-亮氨酸(对比例＝合成使用大约0.9M的全细胞催化剂及应用补料分批计量方法制备L-叔-亮氨酸(合成实施例2)
首先将23.84g甲酸铵(基于所用底物总数量相应于2.8当量)和17.55g生物催化剂(大肠杆菌JM105(pAM 3.25_10.1)生物量)称重加入250ml三颈烧瓶中，之后加入28.50ml去离子水和150μl的1M氯化镁溶液(基于总体积相应1mM浓度)。当达到30℃反应温度时，通过加入7.50ml的1.8M三甲基丙酮酸溶液(pH7.0，用32％氨水调节)开始反应。然后通过加入32％氨水将pH调节为7.0。之后，在每种情况中，首先计量加入两次7.50ml的1.8M三甲基丙酮酸溶液(pH7.0，用32％氨水调节)，之后计量加入5次不同体积的0.9M三甲基丙酮酸溶液(pH7.0，用32％氨水调节)，所有加入均在指定时间间隔进行。在每种计量情况中的时间间隔和数量在如下计量表中示出。终体积为150ml，加入的底物总浓度为0.86M，相应于112.5g/l的三甲基丙酮酸的体积数量。在24小时的反应时间后观察到完全转化(根据HPLC测定＞98％)。
使用1M全细胞催化剂及应用持续计量方法制备L-叔-亮氨酸(合成实施例3)首先将26.48g甲酸铵(基于所用底物的总量相应于2.8当量)、150μl的1M氯化镁溶液(基于终体积相应于1mM浓度)和19.49g的生物催化剂(大肠杆菌JM105(pAM3.25_10.1)生物量)称重加入250ml三颈烧瓶中，之后加入30ml去离子水。然后通过加入32％氨水将pH调节为7.0。在达到30℃的反应温度之后，在10小时期间持续加入共120ml的1.25M三甲基丙酮酸溶液(pH7.0，用32％氨水调节)，流速为0.2ml/分钟。终体积为150ml，所用底物总浓度为1.0M，相应于130.1g/l三甲基丙酮酸的体积数量。在27小时反应时间后观察到96％的转化率(根据HPLC)。
使用700mM全细胞催化剂及应用补料分批计量方法制备L-叔-亮氨酸(合成实施例4)首先将2.55g甲酸钠(基于终体积相应于2.5mol/l)加入100ml锥形反应瓶STAT Titrino 718中，之后加入15μl的1M MgCl2溶液(相应于终浓度1mM)和4.5ml的1M TMP溶液(pH7，用25％氨水调节)和1.5％体积的甲苯(基于终体积)。用去离子水将体积补足为15ml。反应温度保持稳定在30℃，通过闭环水循环控制。将1g生物催化剂潮湿的生物量重悬于底物混合物中，用25％氨水将pH调节为6.9-7。
在达到pH 7.5之后，重复加入4.5ml的1M TMP溶液(pH7)。由此，pH下降大约ΔpH＝0.3。只要达到pH7.5，就再一次加入4.5ml的1M TMP溶液。重复10次加入所述体积的TMP，直至当加入TMP时pH不再下降。另外，在第八次加入TMP时同时加入4ml的4M甲酸钠溶液(不考虑任何反应，相当于在培养基中973mM浓度)。终体积为64ml，三甲基丙酮酸的体积终浓度(不考虑反应)为774mM(100.6g/l)。甲酸钠在溶液中终浓度为836mM。HPLC示出仅在6小时后92％的三甲基丙酮酸就已经转化。
在不同加入时间点的两种底物的浓度示于下表5。
制备包含蜡样芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶和枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶的全细胞催化剂菌株制备将化学感受态大肠杆菌DSM14459(在专利WO03/042412中描述)细胞用质粒pAM10.1(图4，Seq.ID No.10)转化(Sambrook et al.1989，Molecular cloningA Laboratory Manual，2nd Edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press)。这一质粒携带氯霉素抗性(cat)并且编码蜡样芽孢杆菌亮氨酸脱氢酶(ldh)(Stoyan，Tanja；Recktenwald，Achim；Kula，Maria-Regina.Cloning，sequencing and overexpression of the leucineedehydrogenase gene from Bacillus cereus.Journal of Biotechnology(1997)，54(1)，77-80)。然后使得pAM10.1转化的细胞呈化学感受态(Sambrook et al.，1989，Molecular cloningA Laboratory Manual，2ndEdition，Cold Spring Harbor Laboratory Press)并用质粒pNO4(图6，Seq.ID No.13)转化。pNO4携带氨苄青霉素抗性(bla)并且编码枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶(BS-葡萄糖脱氢酶)(Glucose dehydrogenase fromBacillus subtilis expressed in Escherichia coli.IPurification，characterization and comparison with glucose dehydrogenase fromBacillus megaterium.Hilt W；Pfleiderer G；Fortnagel P，Biochimica andbiophysica acta(1991 Jan 29)，1076(2)，298-304)。编码亮氨酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的基因在鼠李糖启动子(rhaP)的控制下(Stumpp，Tina；Wilms，Burkhard；Altenbuchner，Josef.，A new L-rhamnose-inducibleexpression system for Escherichia coli.BIOspektrum(2000)，6(1)，33-36)。
制备活性细胞将单菌落大肠杆菌DSM14459(pAM10.1，pNO4)在加入抗生素(50μg氨苄青霉素/1和20μg氯霉素/ml)的2ml的LB培养基(10g酵母提取物/1、5g胰胨/1、10g NaCl/1)中于37℃振荡(250rpm)保温18小时。将这一培养物在含有鼠李糖(2g/l)作为诱导物的新鲜LB培养基中1∶100稀释，加入抗生素(50μg氨苄青霉素/1和20μg氯霉素/ml)和1mMZnCl2，在30℃振荡(250rpm)保温18小时。将细胞离心(10,000g，10分钟，4℃)，之后弃去上清，将细胞沉淀直接或者在-20℃贮存后用于生物转化实验中。
使用1M全细胞催化剂及应用持续计量方法制备L-叔-亮氨酸(合成实施例5)首先将9.98g生物催化剂(大肠杆菌DSM 14459(pAM 10.1，pNO4)生物量)置于250L三颈烧瓶中的30ml水中，然后加入32.70g的D葡萄糖。通过加入氢氧化钠溶液(25％浓度)将pH调节为7.0，在反应期间保持恒定在这个值(总消耗量13.11ml)。在达到30℃的反应温度之后，在10小时期间持续加入共120ml的1.25M三甲基丙酮酸(pH7.0，用32％氨水调节)，流速为0.2ml/分钟。终体积为大约165ml，应用的底物总浓度为大约0.9M，相当于大约118g/l的三甲基丙酮酸的体积量。在24小时反应时间后观察到转化率＞97％(根据HPLC)，且形成的产物的对映异构体选择性＞99％ee。
序列表<110>德古萨股份公司<120>使用全细胞催化剂制备光学活性氨基酸的方法<130>040055 AM<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>47<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer<400>1aaaaaactta agaaggagat atacatatga cattagaaat cttcgaa 47<210>2<211>32<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer<400>2aaaaaactgc agttagcgac ggctaataat at 32<210>3<211>30<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer<400>3aaaaaacata tgaagattgt cttagttctt30<210>4<211>32<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Primer<400>4aaaaaagacg tcttatttct tatcgtgttt ac 32<210>5<211>1120<212>DNA<213>Bacillus cereus<220>
<221>CDS<222>(20)..(1120)<223>
<400>5ttaagaagga gatatacat atg aca tta gaa atc ttc gaa tac tta gaa aaa52Met Thr Leu Glu Ile Phe Glu Tyr Leu Glu Lys1 5 10tat gat tat gag caa gta gta ttt tgt caa gat aaa gaa tct ggt tta100
Tyr Asp Tyr Glu Gln Val Val Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu15 20 25aaa gca att att gca att cat gat aca aca ctt gga ccg gct ctt ggt148Lys Ala Ile Ile Ala Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly30 35 40gga aca aga atg tgg aca tat gat tct gaa gaa gcg gcg att gaa gat196Gly Thr Arg Met Trp Thr Tyr Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp45 50 55gca ttg cgt ctt gca aaa ggg atg aca tac aaa aac gca gca gct ggt244Ala Leu Arg Leu Ala Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly60 65 70 75tta aac tta ggt ggt gcg aaa aca gta att atc ggt gat cct cgt aaa292Leu Asn Leu Gly Gly Ala Lys Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys80 85 90gat aag agc gaa gca atg ttc cgt gca cta gga cgt tat atc caa gga340Asp Lys Ser Glu Ala Met Phe Arg Ala Leu Gly Arg Tyr Ile Gln Gly95 100 105cta aac gga cgt tac att aca gct gaa gat gtt ggt aca aca gta gat388Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Asp110 115 120gat atg gat att atc cat gaa gaa act gac ttt gta aca ggt atc tca436Asp Met Asp Ile Ile His Glu Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser125 130 135cca tca ttc ggt tct tct ggt aac cca tct ccg gta act gca tac ggt484Pro Ser Phe Gly Ser Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly140 145 150 155gtt tac cgt ggt atg aaa gca gct gca aaa gaa gct ttc ggt act gac532Val Tyr Arg Gly Met Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp160 165 170aat tta gaa gga aaa gta att gct gtt caa ggc gtt ggt aac gta gca580Asn Leu Glu Gly Lys Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala175 180 185tat cac cta tgc aaa cat tta cac gct gaa gga gca aaa tta att gtt628Tyr His Leu Cys Lys His Leu His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val190 195 200aca gat att aat aaa gaa gct gta caa cgt gct gta gaa gaa ttc ggt676Thr Asp Ile Asn Lys Glu Ala Val Gln Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly205 210 215gca tca gca gtt gaa cca aat gaa att tac ggt gtt gaa tgc gat att724Ala Ser Ala Val Glu Pro Asn Glu Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile220 225 230 235tac gca cca tgt gca cta ggc gca aca gtt aat gat gaa act att cca772Tyr Ala Pro Cys Ala Leu Gly Ala Thr Val Asn Asp Glu Thr Ile Pro240 245 250caa ctt aaa gca aaa gta atc gca ggt tct gcg aat aac caa tta aaa820Gln Leu Lys Ala Lys Val Ile Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Lys255 260 265gaa gat cgt cat ggt gac atc att cat gaa atg ggt att gta tac gca868Glu Asp Arg His Gly Asp Ile Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala270 275 280cca gat tat gta att aat gca ggt ggc gta att aac gta gca gac gaa916Pro Asp Tyr Val Ile Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu285 290 295tta tat gga tac aat aga gaa cgt gca cta aaa cgt gtt gag tct att964Leu Tyr Gly Tyr Asn Arg Glu Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Ser Ile300 305 310 315tat gac acg att gca aaa gta atc gaa att tca aaa cgc gat ggc ata 1012
Tyr Asp Thr Ile Ala Lys Val Ile Glu Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile320 325 330gca act tat gta gcg gca gat cgt cta gct gaa gag cgc att gca agc1060Ala Thr Tyr Val Ala Ala Asp Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ser335 340 345ttg aag aat tct cgt agc act tac tta cgc aac ggt cac gat att att1108Leu Lys Asn Ser Arg Ser Thr Tyr Leu Arg Asn Gly His Asp Ile Ile350 355 360agc cgt cgc taa1120Ser Arg Arg365<210>6<211>366<212>PRT<213>Bacillus cereus<400>6Met Thr Leu Glu Ile Phe Glu Tyr Leu Glu Lys Tyr Asp Tyr Glu Gln1 5 10 15Val Val Phe Cys Gln Asp Lys Glu Ser Gly Leu Lys Ala Ile Ile Ala20 25 30Ile His Asp Thr Thr Leu Gly Pro Ala Leu Gly Gly Thr Arg Met Trp35 40 45Thr Tyr Asp Ser Glu Glu Ala Ala Ile Glu Asp Ala Leu Arg Leu Ala50 55 60Lys Gly Met Thr Tyr Lys Asn Ala Ala Ala Gly Leu Asn Leu Gly Gly65 70 75 80Ala Lys Thr Val Ile Ile Gly Asp Pro Arg Lys Asp Lys Ser Glu Ala85 90 95Met Phe Arg Ala Leu Gly Arg Tyr Ile Gln Gly Leu Asn Gly Arg Tyr100 105 110Ile Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Val Asp Asp Met Asp Ile Ile115 120 125His Glu Glu Thr Asp Phe Val Thr Gly Ile Ser Pro Ser Phe Gly Ser130 135 140Ser Gly Asn Pro Ser Pro Val Thr Ala Tyr Gly Val Tyr Arg Gly Met145 150 155 160Lys Ala Ala Ala Lys Glu Ala Phe Gly Thr Asp Asn Leu Glu Gly Lys165 170 175Val Ile Ala Val Gln Gly Val Gly Asn Val Ala Tyr His Leu Cys Lys180 185 190His Leu His Ala Glu Gly Ala Lys Leu Ile Val Thr Asp Ile Asn Lys195 200 205Glu Ala Val Gln Arg Ala Val Glu Glu Phe Gly Ala Ser Ala Val Glu
210 215 220Pro Asn Glu Ile Tyr Gly Val Glu Cys Asp Ile Tyr Ala Pro Cys Ala225 230 235 240Leu Gly Ala Thr Val Asn Asp Glu Thr Ile Pro Gln Leu Lys Ala Lys245 250 255Val Ile Ala Gly Ser Ala Asn Asn Gln Leu Lys Glu Asp Arg His Gly260 265 270Asp Ile Ile His Glu Met Gly Ile Val Tyr Ala Pro Asp Tyr Val Ile275 280 285Asn Ala Gly Gly Val Ile Asn Val Ala Asp Glu Leu Tyr Gly Tyr Asn290 295 300Arg Glu Arg Ala Leu Lys Arg Val Glu Ser Ile Tyr Asp Thr Ile Ala305 310 315 320Lys Val Ile Glu Ile Ser Lys Arg Asp Gly Ile Ala Thr Tyr Val Ala325 330 335Ala Asp Arg Leu Ala Glu Glu Arg Ile Ala Ser Leu Lys Asn Ser Arg340 345 350Ser Thr Tyr Leu Arg Asn Gly His Asp Ile Ile Ser Arg Arg355 360 365<210>7<211>1095<212>DNA<213>Candida boidinii<220>
<221>CDS<222>(1)..(1095)<223>
<400>7atg aag att gtc tta gtt ctt tat gat gct ggt aag cac gct gct gat 48Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp1 5 10 15gaa gaa aaa tta tat ggt tct act gaa aat aaa tta ggt att gct aat 96Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Ser Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn20 25 30tgg tta aaa gat caa ggt cat gaa cta att act act tct gat aaa gaa144Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu35 40 45ggt gaa aca agt gaa ttg gat aaa cat atc cca gat gct gat att atc192Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile50 55 60atc acc act cct ttc cat cct gct tat atc act aag gaa aga ctt gac240Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp65 70 75 80aag gct aag aac tta aaa tta gtc gtt gtc gct ggt gtt ggt tct gat288Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp85 90 95cac att gat tta gat tat att aat caa aca ggt aag aaa atc tca gtc336His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val
100 105 110ctg gaa gtt aca ggt tct aat gtt gtc tct gtt gct gaa cac gtt gtc384Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val115 120 125atg acc atg ctt gtc ttg gtt aga aat ttc gtt cca gca cat gaa caa432Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln130 135 140att att aac cac gat tgg gag gtt gct gct atc gct aag gat gct tac480Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr145 150 155 160gat atc gaa ggt aaa act atc gct acc att ggt gct ggt aga att ggt528Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly165 170 175tac aga gtc ttg gaa aga tta ctc cca ttt aat cca aaa gaa tta tta576Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu180 185 190tac tac gat tat caa gct tta cca aaa gaa gct gaa gaa aaa gtt ggt624Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly195 200 205gct aga aga gtt gaa aat att gaa gaa tta gtt gct caa gct gat atc672Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile210 215 220gtt aca gtt aat gct cca tta cac gca ggt aca aaa ggt tta att aat720Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn225 230 235 240aag gaa tta tta tct aaa ttt aaa aaa ggt gct tgg tta gtc aat acc768Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr245 250 255gca aga ggt gct att gct gtt gct gaa gat gtt gca gca gct tta gaa816Ala Arg Gly Ala Ile Ala Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu260 265 270tct ggt caa tta aga ggt tac ggt ggt gat gtt tgg ttc cca caa cca864Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro275 280 285gct cca aag gat cac cca tgg aga gat atg aga aat aaa tat ggt gct912Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala290 295 300ggt aat gcc atg act cct cac tac tct ggt act act tta gac gct caa960Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln305 310 315 320aca aga tac gct gaa ggt act aaa aat att ttg gaa tca ttc ttt acc 1008Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr325 330 335ggt aaa ttt gat tac aga cca caa gat att atc tta tta aat ggt gaa 1056Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu340 345 350tac gtt act aaa gct tac ggt aaa cac gat aag aaa taa 1095Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys355 360<210>8<211>364<212>PRT<213>Candida boidinii<400>8Met Lys Ile Val Leu Val Leu Tyr Asp Ala Gly Lys His Ala Ala Asp1 5 10 15
Glu Glu Lys Leu Tyr Gly Ser Thr Glu Asn Lys Leu Gly Ile Ala Asn20 25 30Trp Leu Lys Asp Gln Gly His Glu Leu Ile Thr Thr Ser Asp Lys Glu35 40 45Gly Glu Thr Ser Glu Leu Asp Lys His Ile Pro Asp Ala Asp Ile Ile50 55 60Ile Thr Thr Pro Phe His Pro Ala Tyr Ile Thr Lys Glu Arg Leu Asp65 70 75 80Lys Ala Lys Asn Leu Lys Leu Val Val Val Ala Gly Val Gly Ser Asp85 90 95His Ile Asp Leu Asp Tyr Ile Asn Gln Thr Gly Lys Lys Ile Ser Val100 105 110Leu Glu Val Thr Gly Ser Asn Val Val Ser Val Ala Glu His Val Val115 120 125Met Thr Met Leu Val Leu Val Arg Asn Phe Val Pro Ala His Glu Gln130 135 140Ile Ile Asn His Asp Trp Glu Val Ala Ala Ile Ala Lys Asp Ala Tyr145 150 155 160Asp Ile Glu Gly Lys Thr Ile Ala Thr Ile Gly Ala Gly Arg Ile Gly165 170 175Tyr Arg Val Leu Glu Arg Leu Leu Pro Phe Asn Pro Lys Glu Leu Leu180 185 190Tyr Tyr Asp Tyr Gln Ala Leu Pro Lys Glu Ala Glu Glu Lys Val Gly195 200 205Ala Arg Arg Val Glu Asn Ile Glu Glu Leu Val Ala Gln Ala Asp Ile210 215 220Val Thr Val Asn Ala Pro Leu His Ala Gly Thr Lys Gly Leu Ile Asn225 230 235 240Lys Glu Leu Leu Ser Lys Phe Lys Lys Gly Ala Trp Leu Val Asn Thr245 250 255Ala Arg Gly Ala Ile Ala Val Ala Glu Asp Val Ala Ala Ala Leu Glu260 265 270Ser Gly Gln Leu Arg Gly Tyr Gly Gly Asp Val Trp Phe Pro Gln Pro275 280 285Ala Pro Lys Asp His Pro Trp Arg Asp Met Arg Asn Lys Tyr Gly Ala290 295 300Gly Asn Ala Met Thr Pro His Tyr Ser Gly Thr Thr Leu Asp Ala Gln305 310 315 320
Thr Arg Tyr Ala Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Glu Ser Phe Phe Thr325 330 335Gly Lys Phe Asp Tyr Arg Pro Gln Asp Ile Ile Leu Leu Asn Gly Glu340 345 350Tyr Val Thr Lys Ala Tyr Gly Lys His Asp Lys Lys355 360<210>9<211>5686<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Plasmid pAM3.25<400>9tatgaagatt gtcttagttc tttatgatgc tggtaagcac gctgctgatg aagaaaaatt 60atatggttct actgaaaata aattaggtat tgctaattgg ttaaaagatc aaggtcatga120actaattact acttctgata aagaaggtga aacaagtgaa ttggataaac atatcccaga180tgctgatatt atcatcacca ctcctttcca tcctgcttat atcactaagg aaagacttga240caaggctaag aacttaaaat tagtcgttgt cgctggtgtt ggttctgatc acattgattt300agattatatt aatcaaacag gtaagaaaat ctcagtcctg gaagttacag gttctaatgt360tgtctctgtt gctgaacacg ttgtcatgac catgcttgtc ttggttagaa atttcgttcc420agcacatgaa caaattatta accacgattg ggaggttgct gctatcgcta aggatgctta480cgatatcgaa ggtaaaacta tcgctaccat tggtgctggt agaattggtt acagagtctt540ggaaagatta ctcccattta atccaaaaga attattatac tacgattatc aagctttacc600aaaagaagct gaagaaaaag ttggtgctag aagagttgaa aatattgaag aattagttgc660tcaagctgat atcgttacag ttaatgctcc attacacgca ggtacaaaag gtttaattaa720taaggaatta ttatctaaat ttaaaaaagg tgcttggtta gtcaataccg caagaggtgc780tattgctgtt gctgaagatg ttgcagcagc tttagaatct ggtcaattaa gaggttacgg840tggtgatgtt tggttcccac aaccagctcc aaaggatcac ccatggagag atatgagaaa900taaatatggt gctggtaatg ccatgactcc tcactactct ggtactactt tagacgctca960aacaagatac gctgaaggta ctaaaaatat tttggaatca ttctttaccg gtaaatttga 1020ttacagacca caagatatta tcttattaaa tggtgaatac gttactaaag cttacggtaa 1080acacgataag aaataagacg tcaagcttgg ctgttttggc ggatgagaga agattttcag 1140cctgatacag attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg 1200cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc 1260cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac 1320gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc 1380tcctgagtag gacaaatccg ccgggagcgg atttgaacgt tgcgaagcaa cggcccggag 1440ggtggcgggc aggacgcccg ccataaactg ccaggcatca aattaagcag aaggccatcc 1500tgacggatgg cctttttgcg tttctacaaa ctcttttgtt tatttttcta aatacattca 1560aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 1620
aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc1680cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg1740ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt1800cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta1860ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat1920gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga1980gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca2040acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact2100cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc2160acgatgcctg tagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact2220ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt2280ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt2340gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt2400atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata2460ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag2520attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat2580ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa2640aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca2700aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt2760ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg2820tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc2880ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga2940cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc3000agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc3060gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca3120ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg3180tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta3240tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct3300cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag3360tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa3420gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc3480atatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac3540tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga3600cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc3660cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg3720gtaaagctca tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc3780cagctcgttg agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt3840aagggcggtt ttttcctgtt tggtcacttg atgcctccgt gtaaggggga atttctgttc3900
atgggggtaa tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat3960gaacatgccc ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg4020gaccagagaa aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt4080ccacagggta gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct4140gacttccgcg tttccagact ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct4200caggtcgcag acgttttgca gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca4260ttctgctaac cagtaaggca accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg4320atcatgcgca cccgtggcca ggacccaacg ctgcccgaga tgcgccgcgt gcggctgctg4380gagatggcgg acgcgatgga tatgttctgc caagggttgg tttgcgcatt cacagttctc4440cgcaagaatt gattggctcc aattcttgga gtggtgaatc cgttagcgag gtgccgccgg4500cttccattca ggtcgaggtg gcccggctcc atgcaccgcg acgcaacgcg gggaggcaga4560caaggtatag ggcggcgcct acaatccatg ccaacccgtt ccatgtgctc gccgaggcgg4620cataaatcgc cgtgacgatc agcggtccag tgatcgaagt taggctggta agagccgcga4680gcgatccttg aagctgtccc tgatggtcgt catctacctg cctggacagc atggcctgca4740acgcgggcat cccgatgccg ccggaagcga gaagaatcat aatggggaag gccatccagc4800ctcgcgtcgc gaacgccagc aagacgtagc ccagcgcgtc ggccgccatg ccggcgataa4860tggcctgctt ctcgccgaaa cgtttggtgg cgggaccagt gacgaaggct tgagcgaggg4920cgtgcaagat tccgaatacc gcaagcgaca ggccgatcat cgtcgcgctc cagcgaaagc4980ggtcctcgcc gaaaatgacc cagagcgctg ccggcacctg tcctacgagt tgcatgataa5040agaagacagt cataagtgcg gcgacgatag tcatgccccg cgcccaccgg aaggagctga5100ctgggttgaa ggctctcaag ggcatcggtc gacgctctcc cttatgcgac tcctgcatta5160ggaagcagcc cagtagtagg ttgaggccgt tgagcaccgc cgccgcaagg aatggtgcat5220gctcgatggc tacgagggca gacagtaagt ggatttacca taatccctta attgtacgca5280ccgctaaaac gcgttcagcg cgatcacggc agcagacagg taaaaatggc aacaaaccac5340cctaaaaact gcgcgatcgc gcctgataaa ttttaaccgt atgaatacct atgcaaccag5400agggtacagg ccacattacc cccacttaat ccactgaagc tgccattttt catggtttca5460ccatcccagc gaagggccat gcatgcatcg aaattaatac gacgaaatta atacgactca5520ctatagggca attgcgatca ccacaattca gcaaattgtg aacatcatca cgttcatctt5580tccctggttg ccaatggccc attttcctgt cagtaacgag aaggtcgcga attcaggcgc5640tttttagact ggtcgtaatg aacaattctt aagaaggaga tataca 5686<210>10<211>5106<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Plasmid pAM10.1<400>10gaaggagata tacatatgac attagaaatc ttcgaatact tagaaaaata tgattatgag 60caagtagtat tttgtcaaga taaagaatct ggtttaaaag caattattgc aattcatgat 120acaacacttg gaccggctct tggtggaaca agaatgtgga catatgattc tgaagaagcg 180
gcgattgaag atgcattgcg tcttgcaaaa gggatgacat acaaaaacgc agcagctggt240ttaaacttag gtggtgcgaa aacagtaatt atcggtgatc ctcgtaaaga taagagcgaa300gcaatgttcc gtgcactagg acgttatatc caaggactaa acggacgtta cattacagct360gaagatgttg gtacaacagt agatgatatg gatattatcc atgaagaaac tgactttgta420acaggtatct caccatcatt cggttcttct ggtaacccat ctccggtaac tgcatacggt480gtttaccgtg gtatgaaagc agctgcaaaa gaagctttcg gtactgacaa tttagaagga540aaagtaattg ctgttcaagg cgttggtaac gtagcatatc acctatgcaa acatttacac600gctgaaggag caaaattaat tgttacagat attaataaag aagctgtaca acgtgctgta660gaagaattcg gtgcatcagc agttgaacca aatgaaattt acggtgttga atgcgatatt720tacgcaccat gtgcactagg cgcaacagtt aatgatgaaa ctattccaca acttaaagca780aaagtaatcg caggttctgc gaataaccaa ttaaaagaag atcgtcatgg tgacatcatt840catgaaatgg gtattgtata cgcaccagat tatgtaatta atgcaggtgg cgtaattaac900gtagcagacg aattatatgg atacaataga gaacgtgcac taaaacgtgt tgagtctatt960tatgacacga ttgcaaaagt aatcgaaatt tcaaaacgcg atggcatagc aacttatgta 1020gcggcagatc gtctagctga agagcgcatt gcaagcttga agaattctcg tagcacttac 1080ttacgcaacg gtcacgatat tattagccgt cgctaacgcg tttgcggttg gcaaaatggc 1140gcagcagcaa ggcgtggcgg tgaaaacctc tgccgaagcc ctgcaacagg ccattgacga 1200taatttctgg caagccgaat accgcgacta ccgccgtacc tccatctaaa agcttatcga 1260tgataagctg tcaaacatga gaattacaac ttatatcgta tggggctgac ttcaggtgct 1320acatttgaag agataaattg cactgaaatc tagaaatatt ttatctgatt aataagatga 1380tcttcttgag atcgttttgg tctgcgcgta atctcttgct ctgaaaacga aaaaaccgcc 1440ttgcagggcg gtttttcgaa ggttctctga gctaccaact ctttgaaccg aggtaactgg 1500cttggaggag cgcagtcacc aaaacttgtc ctttcagttt agccttaacc ggcgcatgac 1560ttcaagacta actcctctaa atcaattacc agtggctgct gccagtggtg cttttgcatg 1620tctttccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cggactgaac 1680ggggggttcg tgcatacagt ccagcttgga gcgaactgcc tacccggaac tgagtgtcag 1740gcgtggaatg agacaaacgc ggccataaca gcggaatgac accggtaaac cgaaaggcag 1800gaacaggaga gcgcacgagg gagccgccag gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt 1860cgggtttcgc caccactgat ttgagcgtca gatttcgtga tgcttgtcag gggggcggag 1920cctatggaaa aacggctttg ccgcggccct ctcacttccc tgttaagtat cttcctggca 1980tcttccagga aatctccgcc ccgttcgtaa gccatttccg ctcgccgcag tcgaacgacc 2040gagcgtagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaatatatcc tgtatcacat attctgctga 2100cgcaccggtg cagccttttt tctcctgcca catgaagcac ttcactgaca ccctcatcag 2160tgccaacata gtaagccagt atacactccg ctagcgctga tgtccggcgg tgcttttgcc 2220gttacgcacc accccgtcag tagctgaaca ggagggacag ctgatagaaa cagaagccac 2280tggagcacct caaaaacacc atcatacact aaatcagtaa gttggcagca tcacccgacg 2340cactttgcgc cgaataaata cctgtgacgg aagatcactt cgcagaataa ataaatcctg 2400gtgtccctgt tgataccggg aagccctggg ccaacttttg gcgaaaatga gacgttgatc 2460
ggcacgtaag aggttccaac tttcaccata atgaaataag atcactaccg ggcgtatttt2520ttgagttatc gagattttca ggagctaagg aagctaaaat ggagaaaaaa atcactggat2580ataccaccgt tgatatatcc caatggcatc gtaaagaaca ttttgaggca tttcagtcag2640ttgctcaatg tacctataac cagaccgttc agctggatat tacggccttt ttaaagaccg2700taaagaaaaa taagcacaag ttttatccgg cctttattca cattcttgcc cgcctgatga2760atgctcatcc ggaattccgt atggcaatga aagacggtga gctggtgata tgggatagtg2820ttcacccttg ttacaccgtt ttccatgagc aaactgaaac gttttcatcg ctctggagtg2880aataccacga cgatttccgg cagtttctac acatatattc gcaagatgtg gcgtgttacg2940gtgaaaacct ggcctatttc cctaaagggt ttattgagaa tatgtttttc gtctcagcca3000atccctgggt gagtttcacc agttttgatt taaacgtggc caatatggac aacttcttcg3060cccccgtttt caccatgggc aaatattata cgcaaggcga caaggtgctg atgccgctgg3120cgattcaggt tcatcatgcc gtctgtgatg gcttccatgt cggcagaatg cttaatgaat3180tacaacagta ctgcgatgag tggcagggcg gggcgtaatt tttttaaggc agttattggt3240gcccttaaac gcctggtgct acgcctgaat aagtgataat aagcggatga atggcagaaa3300ttcgaaagca aattcgaccc ggtcgtcggt tcagggcagg gtcgttaaat agccgcttat3360gtctattgct ggtttaccgg tttattgact accggaagca gtgtgaccgt gtgcttctca3420aatgcctgag gccagtttgc tcaggctctc cccgtggagg taataattga cgatatgatc3480atttattctg cctcccagag cctgataaaa acggttagcg cttcgttaat acagatgtag3540gtgttccaca gggtagccag cagcatcctg cgatgcagat ccggaacata atggtgcagg3600gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgctg3660ccggcacctg tcctacgagt tgcatgataa agaagacagt cataagtgcg gcgacgatag3720tcatgccccg cgcccaccgg aaggagctac cggacagcgg tgcggactgt tgtaactcag3780aataagaaat gaggccgctc atggcgttga ctctcagtca tagtatcgtg gtatcaccgg3840ttggttccac tctctgttgc gggcaacttc agcagcacgt aggggacttc cgcgtttcca3900gactttacga aacacggaaa ccgaagacca ttcatgttgt tgctcaggtc gcagacgttt3960tgcagcagca gtcgcttcac gttcgctcgc gtatcggtga ttcattctgc taaccagtaa4020ggcaaccccg ccagcctagc cgggtcctca acgacaggag cacgatcatg cgcacccgtg4080gccaggaccc aacgctgccc gagatgcgcc gcgtgcggct gctggagatg gcggacgcga4140tggatatgtt ctgccaaggg ttggtttgcg cattcacagt tctccgcaag aattgattgg4200ctccaattct tggagtggtg aatccgttag cgaggtgccg ccggcttcca ttcaggtcga4260ggtggcccgg ctccatgcac cgcgacgcaa cgcggggagg cagacaaggt atagggcggc4320gcctacaatc catgccaacc cgttccatgt gctcgccgag gcggcataaa tcgccgtgac4380gatcagcggt ccagtgatcg aagttaggct ggtaagagcc gcgagcgatc cttgaagctg4440tccctgatgg tcgtcatcta cctgcctgga cagcatggcc tgcaacgcgg gcatcccgat4500gccgccggaa gcgagaagaa tcataatggg gaaggccatc cagcctcgcg tcgcgaacgc4560cagcaagacg tagcccagcg cgtcggccgc catgccggcg ataatggcct gcttctcgcc4620gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa ggcttgagcg agggcgtgca agattccgaa4680taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc gctccagcga aagcggtcct cgccgaaaat4740
gacccagagc gctgccggca cctgtcctac gagttgcatg ataaagaaga cagtcataag 4800tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag ctgactgggt tgaaggctct 4860caagggcatc ggtcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc agcccagtag 4920taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcatcg atcaccacaa 4980ttcagcaaat tgtgaacatc atcacgttca tctttccctg gttgccaatg gcccattttc 5040ctgtcagtaa cgagaaggtc gcgaattcag gcgcttttta gactggtcgt aatgaacaat 5100tcttaa 5106<210>11<211>5597<212>DNA<213>Unknown<220>
<223>Plasmid<220>
<221>CDS<222>(25)..(1749)<223>scfA-malic enzyme gene<400>11aattcttaag aaggagatat acat atg gat att caa aaa aga gtg agt gac51Met Asp Ile Gln Lys Arg Val Ser Asp1 5atg gaa cca aaa aca aaa aaa cag cgt tcg ctt tat atc cct tac gct 99Met Glu Pro Lys Thr Lys Lys Gln Arg Ser Leu Tyr Ile Pro Tyr Ala10 15 20 25ggc cct gta ctg ctg gaa ttt ccg ttg ttg aat aaa ggc agt gcc ttc 147Gly Pro Val Leu Leu Glu Phe Pro Leu Leu Asn Lys Gly Ser Ala Phe30 35 40agc atg gaa gaa cgc cgt aac ttc aac ctg ctg ggg tta ctg ccg gaa 195Ser Met Glu Glu Arg Arg Asn Phe Asn Leu Leu Gly Leu Leu Pro Glu45 50 55gtg gtc gaa acc atc gaa gaa caa gcg gaa cga gca tgg atc cag tat 243Val Val Glu Thr Ile Glu Glu Gln Ala Glu Arg Ala Trp Ile Gln Tyr60 65 70cag gga ttc aaa acc gaa atc gac aaa cac atc tac ctg cgt aac atc 291Gln Gly Phe Lys Thr Glu Ile Asp Lys His Ile Tyr Leu Arg Asn Ile75 80 85cag gac act aac gaa acc ctc ttc tac cgt ctg gta aac aat cat ctt 339Gln Asp Thr Asn Glu Thr Leu Phe Tyr Arg Leu Val Asn Asn His Leu90 95 100 105gat gag atg atg cct gtt att tat acc cca acc gtc ggc gca gcc tgt 387Asp Glu Met Met Pro Val Ile Tyr Thr Pro Thr Val Gly Ala Ala Cys110 115 120gag cgt ttt tct gag atc tac cgc cgt tca cgc ggc gtg ttt atc tct 435Glu Arg Phe Ser Glu Ile Tyr Arg Arg Ser Arg Gly Val Phe Ile Ser125 130 135tac cag aac cgg cac aat atg gac gat att ctg caa aac gtg ccg aac 483Tyr Gln Asn Arg His Asn Met Asp Asp Ile Leu Gln Asn Val Pro Asn140 145 150cat aat att aaa gtg att gtg gtg act gac ggt gaa cgc att ctg ggg 531His Asn Ile Lys Val Ile Val Val Thr Asp Gly Glu Arg Ile Leu Gly155 160 165ctt ggt gac cag ggc atc ggc ggg atg ggc att ccg atc ggt aaa ctg 579
Leu Gly Asp Gln Gly Ile Gly Gly Met Gly Ile Pro Ile Gly Lys Leu170 175 180 185tcg ctc tat acc gcc tgt ggc ggc atc agc ccg gcg tat acc ctt ccg627Ser Leu Tyr Thr Ala Cys Gly Gly Ile Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Pro190 195 200gtg gtg ctg gat gtc gga acg aac aac caa cag ctg ctt aac gat ccg675Val Val Leu Asp Val Gly Thr Asn Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Pro205 210 215ctg tat atg ggc tgg cgt aat ccg cgt atc act gac gac gaa tac tat723Leu Tyr Met Gly Trp Arg Asn Pro Arg Ile Thr Asp Asp Glu Tyr Tyr220 225 230gaa ttc gtt gat gaa ttt atc cag gct gtg aaa caa cgc tgg cca gac771Glu Phe Val Asp Glu Phe Ile Gln Ala Val Lys Gln Arg Trp Pro Asp235 240 245gtg ctg ttg cag ttt gaa gac ttt gct caa aaa aat gcg atg ccg tta819Val Leu Leu Gln Phe Glu Asp Phe Ala Gln Lys Asn Ala Met Pro Leu250 255 260 265ctt aac cgc tat cgc aat gaa att tgt tct ttt aac gat gac att cag867Leu Asn Arg Tyr Arg Asn Glu Ile Cys Ser Phe Asn Asp Asp Ile Gln270 275 280ggc act gcg gcg gta aca gtc ggc aca ctg atc gca gca agc cgc gcg915Gly Thr Ala Ala Val Thr Val Gly Thr Leu Ile Ala Ala Ser Arg Ala285 290 295gca ggt ggt cag tta agc gag aaa aaa atc gtc ttc ctt ggc gca ggt963Ala Gly Gly Gln Leu Ser Glu Lys Lys Ile Val Phe Leu Gly Ala Gly300 305 310tca gcg gga tgc ggc att gcc gaa atg atc atc tcc cag acc cag cgc 1011Ser Ala Gly Cys Gly Ile Ala Glu Met Ile Ile Ser Gln Thr Gln Arg315 320 325gaa gga tta agc gag gaa gcg gcg cgg cag aaa gtc ttt atg gtc gat 1059Glu Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Arg Gln Lys Val Phe Met Val Asp330 335 340 345cgc ttt ggc ttg ctg act gac aag atg ccg aac ctg ctg cct ttc cag 1107Arg Phe Gly Leu Leu Thr Asp Lys Met Pro Asn Leu Leu Pro Phe Gln350 355 360acc aaa ctg gtg cag aag cgc gaa aac ctc agt gac tgg gat acc gac 1155Thr Lys Leu Val Gln Lys Arg Glu Asn Leu Ser Asp Trp Asp Thr Asp365 370 375agc gat gtg ctg tca ctg ctg gat gtg gtg cgc aat gta aaa cca gat 1203Ser Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Val Val Arg Asn Val Lys Pro Asp380 385 390att ctg att ggc gtc tca gga cag acc ggg ctg ttt acg gaa gag atc 1251Ile Leu Ile Gly Val Ser Gly Gln Thr Gly Leu Phe Thr Glu Glu Ile395 400 405atc cgt gag atg cat aaa cac tgt ccg cgt ccg atc gtg atg ccg ctg 1299Ile Arg Glu Met His Lys His Cys Pro Arg Pro Ile Val Met Pro Leu410 415 420 425tct aac ccg acg tca cgc gtg gaa gcc aca ccg cag gac att atc gcc 1347Ser Asn Pro Thr Ser Arg Val Glu Ala Thr Pro Gln Asp Ile Ile Ala430 435 440tgg acc gaa ggt aac gcg ctg gtc gcc acg ggc agc ccg ttt aat cca 1395Trp Thr Glu Gly Asn Ala Leu Val Ala Thr Gly Ser Pro Phe Asn Pro445 450 455gtg gta tgg aaa gat aaa atc tac cct atc gcc cag tgt aac aac gcc 1443Val Val Trp Lys Asp Lys Ile Tyr Pro Ile Ala Gln Cys Asn Asn Ala460 465 470ttt att ttc ccg ggc atc ggc ctg ggt gtt att gct tcc ggc gcg tca 1491
Phe Ile Phe Pro Gly Ile Gly Leu Gly Val Ile Ala Ser Gly Ala Ser475 480 485cgt atc acc gat gag atg ctg atg tcg gca agt gaa acg ctg gcg cag 1539Arg Ile Thr Asp Glu Met Leu Met Ser Ala Ser Glu Thr Leu Ala Gln490 495 500 505tat tca cca ttg gtg ctg aac ggc gaa ggt atg gta ctg ccg gaa ctg 1587Tyr Ser Pro Leu Val Leu Asn Gly Glu Gly Met Val Leu Pro Glu Leu510 515 520aaa gat att cag aaa gtc tcc cgc gca att gcg ttt gcg gtt ggc aaa 1635Lys Asp Ile Gln Lys Val Ser Arg Ala Ile Ala Phe Ala Val Gly Lys525 530 535atg gcg cag cag caa ggc gtg gcg gtg aaa acc tct gcc gaa gcc ctg 1683Met Ala Gln Gln Gln Gly Val Ala Val Lys Thr Ser Ala Glu Ala Leu540 545 550caa cag gcc att gac gat aat ttc tgg caa gcc gaa tac cgc gac tac 1731Gln Gln Ala Ile Asp Asp Asn Phe Trp Gln Ala Glu Tyr Arg Asp Tyr555 560 565cgc cgt acc tcc atc taa aagcttatcg atgataagct gtcaaacatg 1779Arg Arg Thr Ser Ile570agaattacaa cttatatcgt atggggctga cttcaggtgc tacatttgaa gagataaatt1839gcactgaaat ctagaaatat tttatctgat taataagatg atcttcttga gatcgttttg1899gtctgcgcgt aatctcttgc tctgaaaacg aaaaaaccgc cttgcagggc ggtttttcga1959aggttctctg agctaccaac tctttgaacc gaggtaactg gcttggagga gcgcagtcac2019caaaacttgt cctttcagtt tagccttaac cggcgcatga cttcaagact aactcctcta2079aatcaattac cagtggctgc tgccagtggt gcttttgcat gtctttccgg gttggactca2139agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcggactgaa cggggggttc gtgcatacag2199tccagcttgg agcgaactgc ctacccggaa ctgagtgtca ggcgtggaat gagacaaacg2259cggccataac agcggaatga caccggtaaa ccgaaaggca ggaacaggag agcgcacgag2319ggagccgcca ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccaccactga2379tttgagcgtc agatttcgtg atgcttgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacggcttt2439gccgcggccc tctcacttcc ctgttaagta tcttcctggc atcttccagg aaatctccgc2499cccgttcgta agccatttcc gctcgccgca gtcgaacgac cgagcgtagc gagtcagtga2559gcgaggaagc ggaatatatc ctgtatcaca tattctgctg acgcaccggt gcagcctttt2619ttctcctgcc acatgaagca cttcactgac accctcatca gtgccaacat agtaagccag2679tatacactcc gctagcgctg atgtccggcg gtgcttttgc cgttacgcac caccccgtca2739gtagctgaac aggagggaca gctgatagaa acagaagcca ctggagcacc tcaaaaacac2799catcatacac taaatcagta agttggcagc atcacccgac gcactttgcg ccgaataaat2859acctgtgacg gaagatcact tcgcagaata aataaatcct ggtgtccctg ttgataccgg2919gaagccctgg gccaactttt ggcgaaaatg agacgttgat cggcacgtaa gaggttccaa2979ctttcaccat aatgaaataa gatcactacc gggcgtattt tttgagttat cgagattttc3039aggagctaag gaagctaaaa tggagaaaaa aatcactgga tataccaccg ttgatatatc3099ccaatggcat cgtaaagaac attttgaggc atttcagtca gttgctcaat gtacctataa3159ccagaccgtt cagctggata ttacggcctt tttaaagacc gtaaagaaaa ataagcacaa3219gttttatccg gcctttattc acattcttgc ccgcctgatg aatgctcatc cggaattccg3279
tatggcaatg aaagacggtg agctggtgat atgggatagt gttcaccctt gttacaccgt3339tttccatgag caaactgaaa cgttttcatc gctctggagt gaataccacg acgatttccg3399gcagtttcta cacatatatt cgcaagatgt ggcgtgttac ggtgaaaacc tggcctattt3459ccctaaaggg tttattgaga atatgttttt cgtctcagcc aatccctggg tgagtttcac3519cagttttgat ttaaacgtgg ccaatatgga caacttcttc gcccccgttt tcaccatggg3579caaatattat acgcaaggcg acaaggtgct gatgccgctg gcgattcagg ttcatcatgc3639cgtctgtgat ggcttccatg tcggcagaat gcttaatgaa ttacaacagt actgcgatga3699gtggcagggc ggggcgtaat ttttttaagg cagttattgg tgcccttaaa cgcctggtgc3759tacgcctgaa taagtgataa taagcggatg aatggcagaa attcgaaagc aaattcgacc3819cggtcgtcgg ttcagggcag ggtcgttaaa tagccgctta tgtctattgc tggtttaccg3879gtttattgac taccggaagc agtgtgaccg tgtgcttctc aaatgcctga ggccagtttg3939ctcaggctct ccccgtggag gtaataattg acgatatgat catttattct gcctcccaga3999gcctgataaa aacggttagc gcttcgttaa tacagatgta ggtgttccac agggtagcca4059gcagcatcct gcgatgcaga tccggaacat aatggtgcag ggcgcttgtt tcggcgtggg4119tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgct gccggcacct gtcctacgag4179ttgcatgata aagaagacag tcataagtgc ggcgacgata gtcatgcccc gcgcccaccg4239gaaggagcta ccggacagcg gtgcggactg ttgtaactca gaataagaaa tgaggccgct4299catggcgttg actctcagtc atagtatcgt ggtatcaccg gttggttcca ctctctgttg4359cgggcaactt cagcagcacg taggggactt ccgcgtttcc agactttacg aaacacggaa4419accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt cgcagacgtt ttgcagcagc agtcgcttca4479cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg ctaaccagta aggcaacccc gccagcctag4539ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat gcgcacccgt ggccaggacc caacgctgcc4599cgagatgcgc cgcgtgcggc tgctggagat ggcggacgcg atggatatgt tctgccaagg4659gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa gaattgattg gctccaattc ttggagtggt4719gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc attcaggtcg aggtggcccg gctccatgca4779ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg tatagggcgg cgcctacaat ccatgccaac4839ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa atcgccgtga cgatcagcgg tccagtgatc4899gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat ccttgaagct gtccctgatg gtcgtcatct4959acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga tgccgccgga agcgagaaga5019atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcgcgaacg ccagcaagac gtagcccagc5079gcgtcggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc cgaaacgttt ggtggcggga5139ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga ataccgcaag cgacaggccg5199atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa tgacccagag cgctgccggc5259acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa gtgcggcgac gatagtcatg5319ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat cggtcgacgc5379tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta gtaggttgag gccgttgagc5439accgccgccg caaggaatgg tgcatgcatc gatcaccaca attcagcaaa ttgtgaacat5499catcacgttc atctttccct ggttgccaat ggcccatttt cctgtcagta acgagaaggt5559
cgcgaattca ggcgcttttt agactggtcg taatgaac 5597<210>12<211>574<212>PRT<213>Unknown<220>
<223>Plasmid<400>12Met Asp Ile Gln Lys Arg Val Ser Asp Met Glu Pro Lys Thr Lys Lys1 5 10 15Gln Arg Ser Leu Tyr Ile Pro Tyr Ala Gly Pro Val Leu Leu Glu Phe20 25 30Pro Leu Leu Asn Lys Gly Ser Ala Phe Ser Met Glu Glu Arg Arg Asn35 40 45Phe Asn Leu Leu Gly Leu Leu Pro Glu Val Val Glu Thr Ile Glu Glu50 55 60Gln Ala Glu Arg Ala Trp Ile Gln Tyr Gln Gly Phe Lys Thr Glu Ile65 70 75 80Asp Lys His Ile Tyr Leu Arg Asn Ile Gln Asp Thr Asn Glu Thr Leu85 90 95Phe Tyr Arg Leu Val Asn Asn His Leu Asp Glu Met Met Pro Val Ile100 105 110Tyr Thr Pro Thr Val Gly Ala Ala Cys Glu Arg Phe Ser Glu Ile Tyr115 120 125Arg Arg Ser Arg Gly Val Phe Ile Ser Tyr Gln Asn Arg His Asn Met130 135 140Asp Asp Ile Leu Gln Asn Val Pro Asn His Asn Ile Lys Val Ile Val145 150 155 160Val Thr Asp Gly Glu Arg Ile Leu Gly Leu Gly Asp Gln Gly Ile Gly165 170 175Gly Met Gly Ile Pro Ile Gly Lys Leu Ser Leu Tyr Thr Ala Cys Gly180 185 190Gly Ile Ser Pro Ala Tyr Thr Leu Pro Val Val Leu Asp Val Gly Thr195 200 205Asn Asn Gln Gln Leu Leu Asn Asp Pro Leu Tyr Met Gly Trp Arg Asn210 215 220Pro Arg Ile Thr Asp Asp Glu Tyr Tyr Glu Phe Val Asp Glu Phe Ile225 230 235 240Gln Ala Val Lys Gln Arg Trp Pro Asp Val Leu Leu Gln Phe Glu Asp245 250 255
Phe Ala Gln Lys Asn Ala Met Pro Leu Leu Asn Arg Tyr Arg Asn Glu260 265 270Ile Cys Ser Phe Asn Asp Asp Ile Gln Gly Thr Ala Ala Val Thr Val275 280 285Gly Thr Leu Ile Ala Ala Ser Arg Ala Ala Gly Gly Gln Leu Ser Glu290 295 300Lys Lys Ile Val Phe Leu Gly Ala Gly Ser Ala Gly Cys Gly Ile Ala305 310 315 320Glu Met Ile Ile Ser Gln Thr Gln Arg Glu Gly Leu Ser Glu Glu Ala325 330 335Ala Arg Gln Lys Val Phe Met Val Asp Arg Phe Gly Leu Leu Thr Asp340 345 350Lys Met Pro Asn Leu Leu Pro Phe Gln Thr Lys Leu Val Gln Lys Arg355 360 365Glu Asn Leu Ser Asp Trp Asp Thr Asp Ser Asp Val Leu Ser Leu Leu370 375 380Asp Val Val Arg Asn Val Lys Pro Asp Ile Leu Ile Gly Val Ser Gly385 390 395 400Gln Thr Gly Leu Phe Thr Glu Glu Ile Ile Arg Glu Met His Lys His405 410 415Cys Pro Arg Pro Ile Val Met Pro Leu Ser Asn Pro Thr Ser Arg Val420 425 430Glu Ala Thr Pro Gln Asp Ile Ile Ala Trp Thr Glu Gly Asn Ala Leu435 440 445Val Ala Thr Gly Ser Pro Phe Asn Pro Val Val Trp Lys Asp Lys Ile450 455 460Tyr Pro Ile Ala Gln Cys Asn Asn Ala Phe Ile Phe Pro Gly Ile Gly465 470 475 480Leu Gly Val Ile Ala Ser Gly Ala Ser Arg Ile Thr Asp Glu Met Leu485 490 495Met Ser Ala Ser Glu Thr Leu Ala Gln Tyr Ser Pro Leu Val Leu Asn500 505 510Gly Glu Gly Met Val Leu Pro Glu Leu Lys Asp Ile Gln Lys Val Ser515 520 525Arg Ala Ile Ala Phe Ala Val Gly Lys Met Ala Gln Gln Gln Gly Val530 535 540Ala Val Lys Thr Ser Ala Glu Ala Leu Gln Gln Ala Ile Asp Asp Asn545 550 555 560
Phe Trp Gln Ala Glu Tyr Arg Asp Tyr Arg Arg Thr Ser Ile565 570<210>13<211>5068<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Plasmid<400>13tatgtatccg gatttaaaag gaaaagtcgt cgctattaca ggagctgctt cagggctcgg 60aaaggcgatg gccattcgct tcggcaagga gcaggcaaaa gtggttatca actattatag120taataaacaa gatccgaacg aggtaaaaga agaggtcatc aaggcgggcg gtgaagctgt180tgtcgtccaa ggagatgtca cgaaagagga agatgtaaaa aatatcgtgc aaacggcaat240taaggagttc ggcacactcg atattatgat taataatgcc ggtcttgaaa atcctgtgcc300atctcacgaa atgccgctca aggattggga taaagtcatc ggcacgaact taacgggtgc360ctttttagga agccgtgaag cgattaaata tttcgtagaa aacgatatca agggaaatgt420cattaacatg tccagtgtgc acgaagtgat tccttggccg ttatttgtcc actatgcggc480aagtaaaggc gggataaagc tgatgacaga aacattagcg ttggaatacg cgccgaaggg540cattcgcgtc aataatattg ggccaggtgc gatcaacacg ccaatcaatg ctgaaaaatt600cgctgaccct aaacagaaag ctgatgtaga aagcatgatt ccaatgggat atatcggcga660accggaggag atcgccgcag tagcagcctg gcttgcttcg aaggaagcca gctacgtcac720aggcatcacg ttattcgcgg acggcggtat gacacaatat ccttcattcc aggcaggccg780cggttaatag tagaagcttc tgttttggcg gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga840ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg900tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg960tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag 1020tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg 1080acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca 1140ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa attaagcaga aggccatcct gacggatggc 1200ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc 1260gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag 1320tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt 1380tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt 1440gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga 1500acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt 1560tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga 1620gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag 1680tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg 1740accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg 1800ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt 1860
agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg1920gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc1980ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg2040tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac2100ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact2160gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa2220acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa2280aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg2340atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc2400gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac2460tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca2520ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt2580ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc2640ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg2700aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc2760cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac2820gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct2880ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc2940cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt3000tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac3060cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg3120cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca tatatggtgc3180actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc3240tacgtgactg ggtcatggct gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac3300gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca3360tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag gcagctgcgg taaagctcat3420cagcgtggtc gtgaagcgat tcacagatgt ctgcctgttc atccgcgtcc agctcgttga3480gtttctccag aagcgttaat gtctggcttc tgataaagcg ggccatgtta agggcggttt3540tttcctgttt ggtcacttga tgcctccgtg taagggggaa tttctgttca tgggggtaat3600gataccgatg aaacgagaga ggatgctcac gatacgggtt actgatgatg aacatgcccg3660gttactggaa cgttgtgagg gtaaacaact ggcggtatgg atgcggcggg accagagaaa3720aatcactcag ggtcaatgcc agcgcttcgt taatacagat gtaggtgttc cacagggtag3780ccagcagcat cctgcgatgc agatccggaa cataatggtg cagggcgctg acttccgcgt3840ttccagactt tacgaaacac ggaaaccgaa gaccattcat gttgttgctc aggtcgcaga3900cgttttgcag cagcagtcgc ttcacgttcg ctcgcgtatc ggtgattcat tctgctaacc3960agtaaggcaa ccccgccagc ctagccgggt cctcaacgac aggagcacga tcatgcgcac4020ccgtggccag gacccaacgc tgcccgagat gcgccgcgtg cggctgctgg agatggcgga4080cgcgatggat atgttctgcc aagggttggt ttgcgcattc acagttctcc gcaagaattg4140
attggctcca attcttggag tggtgaatcc gttagcgagg tgccgccggc ttccattcag4200gtcgaggtgg cccggctcca tgcaccgcga cgcaacgcgg ggaggcagac aaggtatagg4260gcggcggcgc ctacaatcca tgccaacccg ttccatgtgc tcgccgaggc ggcataaatc4320gccgtgacga tcagcggtcc agtgatcgaa gttaggctgg taagagccgc gagcgatcct4380tgaagctgtc cctgatggtc gtcatctacc tgcctggaca gcatggcctg caacgcgggc4440atcccgatgc cgccggaagc gagaagaatc ataatgggga aggccatcca gcctcgcgtc4500gcgaacgcca gcaagacgta gcccagcgcg tcggccgcca tgccggcgat aatggcctgc4560ttctcgccga aacgtttggt ggcgggacca gtgacgaagg cttgagcgag ggcgtgcaag4620attccgaata ccgcaagcga caggccgatc atcgtcgcgc tccagcgaaa gcggtcctcg4680ccgaaaatga cccagagcgc tgccggcacc tgtcctacga gttgcatgat aaagaagaca4740gtcataagtg cggcgacgat agtcatgccc cgcgcccacc ggaaggagct gactgggttg4800aaggctctca agggcatcgg tcgacgctct cccttatgcg actcctgcat taggaagcag4860cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc gccgccgcaa ggaatggtgc atgcatcgat4920caccacaatt cagcaaattg tgaacatcat cacgttcatc tttccctggt tgccaatggc4980ccattttcct gtcagtaacg agaaggtcgc gaattcaggc gctttttaga ctggtcgtaa5040tgaacaattc ttaagaagga gatataca 5068
权利要求
1.一种制备对映异构体富集的L-α-氨基酸或者其盐的方法，其通过将相应的2-酮羧酸与铵离子供体在存在全细胞催化剂的条件下反应，每反应体积的底物的总输入量≥500mM，底物的加入是计量的，由此2-酮羧酸的稳定浓度小于500mM，而外部加入的辅因子基于底物的总输入量相当于＜0.0001当量，所述全细胞催化剂包含编码辅因子依赖性氨基酸脱氢酶的克隆基因和编码再生所述辅因子的酶的克隆基因。
2.权利要求1的方法，其特征在于不向反应混合物中加入辅因子。
3.权利要求1和/或2的方法，其特征在于使用产生通式(I)的氨基酸的2-酮羧酸， 其中R是烷基和取代的烷基，所述烷基特别是展现一个叔碳原子并具有5-10个C原子的空间充满支链烷基，例如叔丁基。
4.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述底物是根据补料分批方法计量的。
5.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述2-酮羧酸保持在小于450mM的最大稳定浓度，优选保持在小于400mM的最大稳定浓度。
6.前述权利要求任一项的方法，其特征在于所述全细胞催化剂在使用之前被预处理，以使得细胞膜对底物和产物的通透性与未处理系统相比是增加的。
全文摘要
本发明涉及一种制备特别是对映异构体富集的L－α－氨基酸、特别是具有通式(I)的那些氨基酸的方法。由此，本发明的方法使用包含氨基酸脱氢酶和辅因子再生酶的全细胞催化剂将2－酮羧酸转化为希望的产物。
文档编号C12P13/00GK1934264SQ200580009116
公开日2007年3月21日 申请日期2005年3月18日 优先权日2004年3月22日
发明者哈拉尔德·格勒格尔, 黑尔格·维尔纳, 约瑟夫·阿尔滕布赫纳, 安妮·门策尔, 维尔纳·胡梅尔 申请人:德古萨股份公司