新的醇脱氢酶的制作方法

专利名称：新的醇脱氢酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有NAD-或NADP-依赖性醇脱氢酶的生物学活性的新多肽。本发明进一步涉及编码所述多肽的核酸，涉及非人宿主或者宿主细胞及涉及可用于制备所需产物的反应系统。本发明的多肽优选用于从醛或酮开始制备可作为药物中间体的伯醇和对映异构体纯的仲醇。或者，本发明的多肽也可用于逆反应中，即形成醛或酮的醇的氧化。
本说明书参考许多文献。这些文献以其全文在此并入参考。
对映异构体纯的醇是工业和精细化学最重要的手性构造单元(building block)。这些产物作为制备药物中的基本的关键中间体。长期以来，这些靶分子的工业途径优选通过纯化学方法进行，例如通过外消旋物的拆分进行。这包括从酮开始，首先制备其外消旋形式的醇，然后借助于至少化学计量的手性辅助物质在外消旋物的拆分中分离所需的对映异构体。这些方法的缺点包括不仅外消旋物的拆分只有50％的最大产量，而且还要使用许多有生态问题的起始化合物制备外消旋物。另外的缺点是再循环非所需对映异构体的额外步骤以及需要手性辅助试剂(而且是其化学计量的量)以拆分外消旋物。外消旋物拆分的概念在

图1中反应式(1a)中概括。获得更可持续的方法的首次实质上的进展是使用生物催化拆分外消旋物实现的，从而不需要应用化学计量的手性辅助试剂。然而，遗憾的是这种生物催化途径仍保留上述所有其它缺点。
避免外消旋物拆分及非对映异构选择性合成中上述缺点的一个可能途径是在一步中将酮直接转化为所需的光学活性醇。这种“直接不对称方法(direct asymmetrical process)”可以首先通过使用含有金属的化学催化剂进行，所述化学催化剂是包括一个手性配体的含有重金属的复合物。除了使用具有生态问题的重金属作为主要的催化剂成分之外，还需要昂贵的和部分非常敏感的配体，例如phosphane配体，这也是不利的。
另一种方法是使用适当的生物催化剂将前手性底物(prochiralsubstrates)定量转化为所需对映异构体纯的产物的直接不对称还原法。这种方法中也是将许多反应步骤缩减为在理论上可能的最少仅一个步骤，生物催化转化是在生态极佳的条件下进行(以水作为溶剂)，所述方法具有高原子经济性(high atom economy)。这种生物催化和可持续方法的概念在图1的反应式(1b)中表示。
然而，生物催化方法的一个缺点是缺少可工业规模可利用的醇脱氢酶作为适当的生物催化剂来进行靶反应及其表达。因此，本发明的一个目的是获得新的、有效的并可工业应用的醇脱氢酶。这个目的通过特征在于权利要求书所述的实施方案而实现。
因此，本发明涉及一种多肽，其具有NAD-或NADP-依赖性醇脱氢酶生物活性，并且其包含或具有如下序列之一SEQ ID NO1所示序列、SEQ ID NO2所示序列、SEQ ID NO3所示序列或者与SEQID NO3所示序列至少90％相同的序列。所述序列优选与SEQ IDNO3至少95％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO3至少98％或者99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO4所示序列。另外包含的是SEQ ID NO5所示序列或者与SEQ ID NO5所示序列至少90％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO5至少95％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO5至少98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO6所示序列或者与SEQ ID NO6所示序列至少90％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO6至少95％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO6至少98％或99％相同。另外所述序列包含SEQ ID NO7所示序列或者与SEQ ID NO7所示序列至少70％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO7至少75％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO7所示序列至少80％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO7所示序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO8所示序列或者与SEQ ID NO8所示序列至少70％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO8至少75％相同。更优选地，所述序列与SEQID NO8所示序列至少80％相同。更优选地，所述序列与SEQ IDNO8所示序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。
所述序列还包含SEQ ID NO9所示序列或者与SEQ ID NO9所示序列至少70％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO9至少75％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO9所示序列至少80％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO9所示序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO10所示序列或者与SEQ ID NO10所示序列至少70％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO10至少75％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO10所示序列至少80％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO10所示序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO11所示序列或者与SEQ ID NO11所示序列至少70％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO11所示序列至少75％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO11所示序列至少80％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO11所示序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO12所示序列或者与SEQ ID NO12所示序列至少60％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO12至少65％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO12所示序列至少70％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO12至少75％或者80％相同。特别优选地，所述序列与SEQ ID NO12所示序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。另外，所述序列还包含SEQ ID NO13所示序列或者与SEQ IDNO13所示序列至少60％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ IDNO13至少65％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO13所示序列至少70％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO13至少75％或者80％相同。特别优选地，所述序列与SEQ ID NO13所示序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO14所示序列或者与SEQ ID NO14所示序列至少75％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO14所示序列至少80％相同。更优选地，所述序列SEQ ID NO14所示序列与至少85％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO14所示序列至少90％、95％、98％或99％相同。另外，所述序列包含SEQ ID NO15所示序列或者与SEQ ID NO15所示序列至少95％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO15所示序列至少98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO16所示序列或者与SEQ ID NO16所示序列至少95％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO16所示序列至少98％或99％相同。另外所述序列包含SEQ ID NO17所示序列或者与SEQ ID NO17所示序列至少75％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO17所示序列至少80％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO17所示序列至少85％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO17所示序列至少90％、95％、98％或99％相同。另外所述序列包含SEQ ID NO18所示序列或者与SEQ ID NO18所示序列至少70％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO18至少75％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO18所示序列至少80％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO18所示序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO19所示序列或者与SEQ ID NO19所示序列至少70％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO19至少75％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO19所示序列至少80％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO19所示序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。另外所述序列还包含SEQ ID NO20所示序列或者与SEQ ID NO20所示序列至少60％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO20至少65％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO20至少70％相同。更优选地，所述序列与SEQ IDNO20至少75％或者80％相同。特别优选地，所述序列与SEQ IDNO20所示序列至少85％、90％、95％、98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO21所示序列或者与SEQ ID NO21所示序列至少90％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO21所示序列至少95％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO21所示序列至少98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO22所示序列或者与SEQID NO22所示序列至少70％相同的序列。优选地，所述序列与SEQID NO22至少75％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO22所示序列至少80％相同。特别优选所述序列与SEQ ID NO22所示序列至少85％，90％，95％，98％或99％相同。所述序列还包含SEQ IDNO23所示序列或者与SEQ ID NO23所示序列至少55％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO23至少60％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO23所示序列至少65％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO23至少70％或者75％相同。特别优选地，所述序列与SEQ ID NO23至少80％，85％，90％，95％，98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO24所示序列或者与SEQ ID NO24所示序列至少65％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO24至少70％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO24所示序列至少75％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO24至少80％或者85％相同。特别优选地，所述序列与SEQ ID NO24所示序列至少90％，95％，98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO25所示序列或者与SEQ ID NO25所示序列至少55％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO25至少60％相同。更优选地，所述序列与SEQ IDNO25所示序列至少65％相同。更优选地，所述序列与SEQ IDNO25至少70％或者75％相同。特别优选地，所述序列与SEQ IDNO25所示序列至少80％，85％，90％，95％，98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO26所示序列或者与SEQ ID NO26所示序列至少55％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO26至少60％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO26所示序列至少65％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO26至少70％或者75％相同。特别优选地，所述序列与SEQ ID NO26所示序列至少80％，85％，90％，95％，98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO27所示序列或者与SEQ ID NO27所示序列至少55％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO27至少60％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO27所示序列至少65％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO27至少70％或75％相同。特别优选地，所述序列与SEQID NO27所示序列至少80％，85％，90％，95％，98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO28所示序列或者与SEQ ID NO28所示序列至少75％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO28至少80％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO28所示序列至少85％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO28至少90％，95％，98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO29所示序列或者与SEQID NO29所示序列至少70％相同的序列。优选地，所述序列与SEQID NO29至少75％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO29所示序列至少80％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO29至少85％或90％相同。特别优选地，所述序列与SEQ ID NO29所示序列至少95％，98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO30所示序列或者与SEQ ID NO30所示序列至少60％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO30至少65％相同。更优选地，所述序列与SEQ IDNO30所示序列至少70％相同。更优选地，所述序列与SEQ IDNO30至少75％或80％相同。特别优选地，所述序列与SEQ IDNO30所示序列至少85％，90％，95％，98％或99％相同。另外所述序列还包含SEQ ID NO31所示序列或者与SEQ ID NO31所示序列至少55％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO31至少60％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO31所示序列至少65％或70％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO31至少75％或80％相同。特别优选地，所述序列与SEQ ID NO31所示序列至少85％，90％，95％，98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO32所示序列或者与SEQ ID NO32所示序列至少55％相同的序列。优选地，所述序列与SEQ ID NO32至少60％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO32所示序列至少65％或者70％相同。更优选地，所述序列与SEQ ID NO32至少75％或80％相同。特别优选地，所述序列与SEQ ID NO32所示序列至少85％，90％，95％，98％或99％相同。所述序列还包含SEQ ID NO33所示序列或者SEQ ID NO34所示序列。所论及的及以SEQ ID号代表的氨基酸序列优选由SEQ IDNO35-68所示DNA序列编码。优选所述多肽的全长相应于天然发生的酶。在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽另外包含至少一个异源氨基酸节段，其表现出所述多肽是融合蛋白的特征。本发明的融合蛋白的异源成分可能的例子是可用于纯化本发明的融合蛋白的标记(例如His标记或者Flag标记)。在其它实施方案中，所述异源成分可具有其自身的酶活性。在这种情况中，两种酶成分优选通过接头连接以确保所述成分的功能性，所述接头例如是长度为6-10个氨基酸的柔性甘氨酸或者甘氨酸-丝氨酸接头。本文所用术语“异源”是指首先融合蛋白的成分不是天然共价连接在一起的，其次所述成分源自不同的物种。融合蛋白通常使用重组DNA技术制备(见Sambrook et al.，如前述)。
根据本发明，术语“具有NAD-或NADP-依赖性醇脱氢酶的生物活性的多肽”是指一组酶，其催化醇转化为醛或者酮或者相应的逆反应，即醛转化为伯醇或者酮转化为仲醇。所述第一个反应是氧化过程，第二个反应是还原过程。醇脱氢酶(ADH)的EC编号是EC1.1.1.1。除了在本发明中分离的天然发生的酶之外，本发明的保护范围还包括与分离自天然来源的多肽相比在氨基酸水平具有前述相同性数值的并且也可能源自天然来源的那些多肽。另一方面，它们可以通过重组DNA技术修饰，由此保留或者基本保留所述酶活性，这为技术人员所已知(见例如Sambrook et al，″Molecular Cloning，ALaboratory Handbook″，2nd edition 1989，CSH Press，Cold SpringHarbor，Ausubel et al.″Current Protocols in Molecular Biology″，JohnWiley & Sons，NY 2001)。因此，不位于活性位点并且第一眼看起来用“相同种类”的氨基酸进行置换预期不会导致三维结构实质改变的氨基酸用“相同种类”的氨基酸置换是可能的。例如，期望具有非极性侧链的特定氨基酸(相同种类的氨基酸)能被取代，例如缬氨酸取代为丙氨酸，而(基本上)不影响本发明所述酶的生物学功能、酶的活性。基于这种专业知识，技术人员可以得出其它类型氨基酸取代的相应结论(例如碱性氨基酸用其它碱性氨基酸置换或者具有不带电极性侧链的氨基酸用这个组的其它氨基酸置换)。
分离自天然来源的多肽的氨基酸序列(在本文用SEQ ID编号描述)的相同性百分比可易于由技术人员使用本领域已知的方法确定。根据本发明可以使用的一个合适程序是BLASTP(Altschul et al..1997.Gapped BLAST and PSI-BLASTa new generation of proteindatabase search programs.Nucleic Acids Res.25(17)3389-3402.)。
本发明还涉及编码本发明多肽的核酸分子。
本发明的核酸分子可以是DNA分子或者RNA分子。优选所述核酸分子是cDNA分子或者mRNA分子。根据本发明，所述DNA分子还可以是基因组DNA分子。本发明还包括其中所述DNA分子是PNA分子或者DNA分子的其它衍生物的实施方案。根据本发明，优选包含SEQ ID NO35-68所示DNA序列的DNA序列。
为了实现本发明所基于的目的，进行如下方案。首先，基于广泛的所拥有的菌株集合，将优先考虑的菌株在平板上生长，在进行存活力和纯度控制之后，在液体培养基中培养。将这些生物体的基因组DNA从收获的细胞沉淀中分离。基于制备的基因组DNA，将选择的分离株利用本发明的引物通过PCR分型而遗传筛选醇脱氢酶基因。在这点上，即使由于与已知醇脱氢酶具有同源性导致氨基酸序列具有相似性，这也不会容易地衍生出可以用于成功扩增先前未鉴别的醇脱氢酶的寡核苷酸引物。最初这个方案基于在先前已知的醇脱氢酶基因中保守的特定序列基序也存在于所需的新醇脱氢酶基因中的假说。然而，在先前已知的醇脱氢酶基因中保守的序列基序不适于通过本领域技术人员已知的方法衍生简并引物(Kwok et al..1995.Design and use of mismatched and degenerate primers.InPCRPrimer，A laboratory Manual，Dieffenbach CW & Dveksler GS(Editors)，Cold Spring Habor Laboratory Press，pp143-155；ComptonT.1990.Degenerate Primers for DNA Amplification.InPCRProtocols，A Guide to Methods and Applications.Innis et al.(Editors)Academic Press，San Diego，pp39-34)。NAD-或者NADP-依赖性醇脱氢酶分为长链、中链和短链ADH。基于其金属依赖性和亚基的大小将其分成这三组。短链ADH不需要任何金属离子，其亚基由大约250个氨基酸组成。相反，中链和长链ADH依赖于金属离子。其亚基典型由大约350个氨基酸组成的中链ADH需要锌离子。其亚基由大约385个氨基酸组成的长链ADH需要铁离子(Hummel，W.1997.New alcohol dehydrogenases for the synthesis of chiral compounds.58145-84)。不仅在所有先前已知的NAD-或者NADP-依赖性ADH中，而且在上述三个ADH组中，序列不均匀性均非常高。因此，构建如下的引物不是那么容易，所述引物需能够被利用来首先特异扩增ADH序列，其次还能捕获新多种所需的ADH以实现这个目的。因此，尽管在使用的序列中有预期的序列同源性，但是在研究的细菌中无论如何也未分离到长链ADH。就此而论，需要首先使用已知其醇脱氢酶基因是已知的模型生物体的基因组DNA或者用由不同微生物的DNA组成的DNA库测试构建的引物的质量。这包括克隆、测序及随后分析PCR产物。在这个确定阶段之后，将选择的分离株基于制备的被筛选的微生物的基因组DNA进行PCR分型，如上述。综合实验结果(关于序列相同性和特异性活性)将其新的醇脱氢酶基因被分离的潜在Hit生物体区分优先次序。尽管在尝试分离推测编码长链ADH的核酸期间出现不希望的、令人失望和消极的结果，但是根据本发明分离了编码短链酶和中链酶链的许多核酸。一些这种酶和酶链于已知的这类酶具有令人惊奇的低序列相同性(＜50％)。
本发明进一步涉及与本发明的核酸分子互补的核酸分子。
根据本发明，术语“互补”是指与本发明核酸分子整个区域的没有缺口的互补性。换句话说，根据本发明，优选所述互补性延伸至100％的本发明序列的全部区域(即从5’末端至3’末端)。在另外优选的实施方案中，所述互补性延伸至至少19、优选至少21个连续核苷酸(其优选不编码酶活性的活性位点)的区域。
另外，本发明涉及包含本发明的核酸分子的载体。本发明的载体优选含有与一个表达控制序列可操纵地连接的本发明的核酸，由此所述核酸能在合适的宿主细胞中被转录及适当翻译。表达控制序列通常包含一个启动子，及适当地包含另外调节序列如操纵基因或者增强子。另外，也可以存在翻译起始序列。本领域技术人员已知对于原核或者真核宿主细胞合适的表达控制序列(见例如，Sambrooket al.，loc.cit.)。本发明的重组载体可另外还含有常规的元件，如复制起点和选择标记基因。合适的重组载体的例子是质粒、粘粒、噬菌体或者病毒(见例如，Sambrook et al.，supra)。制备本发明的重组载体的起始物质可商购获得(例如购自Stratagene、InVitroGen或者Promega)。
为此技术人员可利用的任何质粒和载体在原则上均适合。这些质粒和载体可以见于例如Studier及其同事所描述(Studier，W.F.；Rosenberg A.H.；Dunn J.J.；DubendroffJ.W.；(1990)，Use of the T7RNA polymerase to direct expression of cloned genes，Methods Enzymol.185，61-89)或者Novagen、Promega、New England Biolabs、Clontech或者Gibco BRL手册所述。进一步优选的质粒和载体可见于Glover，D.M.(1985)，DNA cloninga practical approach，Vol.I-III，IRL Press Ltd.，Oxford；Rodriguez，R.L.and Denhardt，D.T(eds)(1988)，Vectorsa survey of molecular cloning vectors and theiruses，179-204，Butterworth，Stoneham；Goeddel，D.V.(1990)，Systems for heterologous gene expression，Methods Enzymol.185，3-7；Sambrook，J.；Fritsch，E.F.and Maniatis，T.(1989)，Molecularcloninga laboratory manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York所描述。可用于将具有本发明的核酸的基因构建体以非常优选的方式克隆进宿主生物体中的质粒是如下质粒的衍生物pUC18和pUC19(Roche Biochemicals)、pKK-177-3H(RocheBiochemicals)、pBTac2(Roche Biochemicals)、pKK223-3(AmershamPharmacia Biotech)、pKK-233-3(Stratagene)或者pET(Novagen)。其它优选的质粒是pBR322(DSM3879)、pACYC184(DSM4439)和pSC101(DSM6202)，其可得自DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Brunswick，Germany)。优选启动子的例子是T7、lac、tac、trp、rha和ara。
本发明还涉及非人宿主，其包含本发明的多肽或者本发明的核酸分子或者本发明的载体。
所述非人宿主可以是细胞或者多细胞生物体。合适的多细胞生物体包括分子生物学熟知的模型系统，如黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)、斑马鱼(zebra fish)或者线虫(C.elegans)。在一个优选的实施方案中，所述宿主是细胞。
在这个优选的实施方案中，本发明的宿主是一种重组细胞，其已经用本发明的核酸或者本发明的载体转化或者转染(根据本发明，术语“转化”和“转染”同义应用)。转化或者转染可以通过已知方法进行，例如磷酸钙共沉淀、脂转染法、电穿孔、粒子轰击或者病毒感染。本发明的细胞可含有染色体外或者染色体整合形式的重组核酸。换句话说，所述转染/转化可以是稳定或者瞬时的。
所述重组细胞优选是原核细胞来源的。合适的宿主细胞包括单细胞微生物的细胞，如细菌细胞。特别合适的细菌宿主系统是大肠杆菌。大肠杆菌的细胞质含有本发明多肽的酶活性需要的辅因子。这些辅因子特别是NADH、NADPH、NAD+和NADP+。特别优选的是大肠杆菌XL1 Blue、W3110、DSM14459(PCT/US00/08159)、NM522、JM101、JM109、JM105、RR1、DH5、TOP 10-或者HB101。其也可以使用如下菌属/菌种的细菌表达本发明的核酸乳杆菌属(Lactobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、红球菌属(Rhodococus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、柄杆菌属(Caulobacter)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、奈瑟氏球菌属(Neisseria)、Ralstonia、假单胞菌属(Pseudomonas)和土壤杆菌属(Agrobacterium)。合适的菌株是现有技术可获得的并且至少部分可通过国际保藏机构如ATCC或者DMSZ获得。转染方案和转化方案为技术人员所已知(Chan andCohen.1979.High Frequency Transformation of Bacillus subtilisProtoplasts by Palsmid DNA.Mol Gen Genet.168(1)111-5；Kieser et al..2000.Practical Streptomyces Genetics.The John Innes FoundationNorwich.；Sambrook et al..1989.Molecular Cloning.A LaboratoryManual.Insecond ed..Cold Spring Harbor Laboratory Press.ColdSpring Harbor.NY.；Irani and Rowe.1997.Enhancement oftransformation in Pseudomonas aeruginosa PAOl by Mg2+and heat.Biotechniques 2254-56)。可以使用的宿主生物体的另外例子是酵母如多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)、毕赤氏酵母属(Pichiasp.)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。或者，所述细胞可以是真核细胞来源的。合适的真核细胞包括CHO细胞、HeLa细胞及其它细胞。许多这些细胞可通过保藏机构如ATCC或者DMSZ获得。
在另一个优选的实施方案中，所述宿主是一种转基因非人动物。
转基因非人动物可以通过本领域已知的方法产生。本发明的转基因非人动物可优选具有多种遗传结构。其可以(i)组成型或者诱导型过表达本发明核酸的基因，(ii)含有失活形式的本发明核酸的内源基因，(iii)含有完全或者部分用本发明核酸的突变基因置换的本发明核酸的内源基因，(iv)本发明核酸的基因被条件性及组织特异性过表达或者低表达或者(v)本发明核酸的基因被条件性及组织特异性敲除。优选地，所述转基因动物另外含有在允许过表达的启动子控制下的本发明核酸的内源基因。或者，本发明核酸的内源基因可以通过激活或/和置换内在启动子而过表达。优选地，本发明核酸的基因的内源启动子具有导致该基因表达增加的遗传修饰。内源启动子的所述遗传修饰包括各个碱基的突变也包括缺失和插入突变。
在本发明宿主的一个特别优选的实施方案中，所述宿主是转基因啮齿动物，优选转基因小鼠、转基因兔、转基因大鼠或者转基因绵羊、转基因牛、转基因山羊或者转基因猪。
小鼠具有优于其它动物的许多优势。它们易于饲养，并且其生理学被认为是人的模型系统。这种基因被操纵的动物的产生为本领域技术人员所熟知，可以使用常用的方法进行(见例如，Hogan，B.，Beddington，R.，Costantini，F.and Lacy，E.(1994)，Manipulatingthe Mouse-Embryo；A Laboratory Manual，2nd ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY；WO91/08216)。或者或另外，可以根据针对本发明的非人转基因动物的所述应用，应用细胞培养系统，特别是人细胞培养系统。如述，依赖于特定的醇脱氢酶所使用的醇脱氢酶的辅因子例子是NADH和NADPH及其氧化形式，分别是NAD+和NADP+。
所述辅因子原则上可以酶偶联的方式使用另一种酶例如甲酸脱氢酶或者葡萄糖脱氢酶而再生，或者以底物偶联的方式使用公认是所用的醇脱氢酶的底物的任何醇例如异丙醇(如果认为是底物)而再生。下图示出了使用甲酸脱氢酶经过醇脱氢酶催化的酮还原及酶偶联的辅因子再生。
醇脱氢酶用于例如从前手性酮中制备对映异构体富集的、优选对映异构体纯的仲醇。就此而论，已知(R)-和(S)-特异性醇脱氢酶分别都导致形成醇的特殊对映异构体(R)和(S)形式。
相应地，本发明优选具有另一个适于辅因子再生或者编码所述脱氢酶的核酸分子的脱氢酶的宿主。
就此而论，所述宿主可天然含有所述另一个脱氢酶或者已经用编码所述脱氢酶的重组核酸转染，这样在所述宿主中可以表达所述脱氢酶。这个实施方案还需要具有所述另一个脱氢酶发挥作用必需的辅因子的宿主或者所述辅因子以合适的方式输送至所述宿主。
为此特别优选的是其中适于辅因子再生的脱氢酶是甲酸脱氢酶或者葡萄糖脱氢酶的宿主。特别优选的是博伊丁氏假丝酵母(Candida boidinii)甲酸脱氢酶。也特别优选的辅因子再生脱氢酶是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)葡萄糖脱氢酶。根据本发明，还优选保留所述酶功能的所述辅因子再生脱氢酶的遗传修饰突变体。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种反应系统，其包含作为脱氢酶底物的一种有机化合物、还有本发明的多肽、本发明的载体或者本发明的宿主及如果适当的话本发明多肽的辅因子。(在所述系统中无辅因子存在的那些情况中需要加入辅因子，见下述)。在一个例子中，本发明的反应系统可以是细菌细胞，其相应于本发明的宿主并且在胞质中具有本发明的多肽以及必需的辅因子。在辅因子天然存在于所述系统/宿主中的情况中，所述辅因子不在需要单独给予。适当地，所述宿主是具有另一个适于辅因子再生的脱氢酶或者编码所述脱氢酶的核酸分子以及所需要的辅因子的宿主。如果将所需产物的底物应用于所述反应系统或者如果所述底物在反应系统中自身代谢，如果所述反应系统在合适的条件下保持，则所需产物可易于从反应系统中分离。合适的条件包括在10-80℃的温度、优选在20-60℃及非常优选在20-40℃进行反应。底物浓度优选为100-2000mM、优选200-800mM。在一个优选的形式中，进行所需反应以在＜20小时、特别是＜10小时及非常优选＜5小时的反应时间内达到＞80％、特别是＞90％的转化。在另一个实施方案中，所述反应系统可以是转化合适底物以获得所需产物的体外系统。例如，本发明的多肽可以在合适条件下与所述辅因子和底物接触，适当地(即如果需要)还可以与另一个适于辅因子再生的脱氢酶接触(适当地，所需辅因子特别是NADH和/或NADPH其氧化形式)，所述条件如上述，例如经过足够的时间以产生所需产物。在这种利用分离的酶(纯化形式或者粗提物)及加入辅因子的体外变体中，这些辅因子从经济角度应控制在＜0.01当量(基于应用的底物的量)、优选＜0.001当量及特别优选＜0.0005当量。
“反应系统”也可以是补料或给予了合适底物及适当时给予了辅因子和/或所述另一个脱氢酶的转基因非人动物，其能在合适的组织中转化所述底物。在另一个实施方案中，所述反应系统也可以是细胞膜系统，其中锚定了所述酶及适当地锚定所述辅因子。
本发明优选的是这样的一种反应系统，其中作为脱氢酶底物的有机化合物是羰基化合物。
特别优选的反应系统是其中所述羰基化合物是醛或者酮。
本发明的这个实施方案可以特别优选用于制备技术级别的醇，所述醇可用于例如作为制备药物中可使用的活性化合物的中间体。
本发明特别优选的是所述酮是不对称取代的酮。
本发明的这个实施方案是特别优选的，因为在相应还原反应中产生的产物具有一个手性中心，并且具有高度对映异构体选择性。通常，所需手性仲醇以对映异构体纯的形式获得，对映异构体＞99％。
在本发明的反应系统的另一个优选的实施方案中，作为脱氢酶的底物的有机化合物是醇。这个变体优选适于制备商业上重要的羰基化合物，例如在合成香料领域中相关的酮。另外，也可以利用氧化形成对映异构体纯的仲醇，从外消旋醇作为底物开始，通过对映异构体选择性氧化将非所需对映异构体转化为酮化合物。然后相应分离保留的所需对映异构体。
所述醇优选是伯醇或者手性仲醇。在第一种情况中，产生的产物是醛，而在第二种情况中，形成相应的酮。
本发明的反应系统中的辅因子优选是NADH、NADPH、NAD+或者NADP+。
本发明还涉及一种制备本发明的多肽或者本发明的核酸分子编码的多肽的方法，所述方法包括生长本发明的宿主并分离所述多肽。
所述多肽可以通过例如常规方法纯化，例如通过破坏合适的细胞(例如通过French press)、离子交换、大小选择或者亲和层析等方法进行(Coligan et al..Current Protocols in Protein Science，JohnWiley & Sons，Inc.)。或者，本发明的多肽当与前导肽连接时，可以从细胞中输出并且从培养上清中纯化。这个实施方案需要不天然含有前导肽的本发明多肽被遗传修饰。这个实施方案具有可以简便地从培养上清中纯化本发明多肽的优势。最佳的方法及合适的前导肽可易于由技术人员确定。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，所述多肽分离自非人转基因动物的体液或者组织样品。在这个实施方案中，本发明的多肽优选含有前导肽。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，如果所述非人转基因动物是哺乳动物，例如是牛、山羊或者绵羊，则所述体液是乳汁或者血清。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种制备作为脱氢酶产物的有机化合物的方法，所述方法包括将作为脱氢酶底物的有机化合物与本发明多肽、本发明的宿主或者利用本发明的反应系统反应。
本发明的方法中使用的不同实施方案的主要区别在于，如果多肽是在体外无细胞系统中使用，要在多肽中加入进一步的成分如辅因子等(如前)。当使用本发明的反应系统时，必需的成分除了底物之外也优选及有利地存在于该系统中，因此不需要单独加入。
本发明优选这样的一种方法，其进一步包括分离反应产物的步骤。合适的分离/纯化方法已如上述。
在本发明的方法的一个特别优选的实施方案中，进一步包括加工所述产物以获得药物。利用对映异构体纯的醇作为中间体制备药物活性化合物的许多描述在文献中提供。关于这方面的综述见A.Kleemann，J.Engels，B.Kutscher，D.Reichert，PharmaceuticalSubstancesSyntheses，Patents，Applications，4th edition，Thieme-Verlag，Stuttgart，2001。
在本发明方法的另一个特别优选的实施方案中，进一步包括加工所述产物获得二级产物的步骤。就此而论，可以通过修饰醇基团(例如通过酯化及随后的二级反应)或者通过修饰特殊的取代基进行衍生化。
本发明的方法特别优选进一步包括配制所述二级产物与药物可接受的载体或者赋形剂或者稀释剂以制备药物的步骤。
合适的药物可接受的载体和/或稀释剂为技术人员所已知，包括例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳浊液如油/水乳浊液，多种类型的增湿剂或者去污剂、无菌溶液等等。包含这种载体的药物可以通过已知的常规方法配制。所述药物可以合适剂量给予个体。所述给予可以是口服或者胃肠外给予，例如静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部、鼻内、支气管内、口服或者皮内给予，或者通过动脉内导管给予。胃肠外给予的制品包含适于注射的无菌水或者非水溶液、悬浮液和乳状液。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油及有机酯化合物如油酸乙酯。水载体包括水、基于醇/水的溶液、乳状液、悬浮液、盐溶液和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格葡萄糖(Ringer dextrose)、葡萄糖和氯化钠、林格乳酸盐和结合的油。静脉内载体的例子包括液体、营养素和电解质补充物(例如基于林格葡萄糖的那些物质)。所述药物另外可包含防腐剂及其它添加剂，如抗微生物化合物、抗氧化剂、络合剂和惰性气体。根据指定的特定用途，也可以包括其它活性化合物如白细胞介素、生长因子、分化因子、干扰素、趋化蛋白或者非特异性免疫调节剂。
剂量类型由主治医生根据临床因素确定。技术人员已知剂量类型依赖于多种因素，例如患者机体大小或体重、体表面积、年龄、性别或者一般健康状况，或者特别给予的制剂、给予时间和类型，及同时给予的其它药物。典型剂量可以是例如0.001-1000μg之间，特别是考虑上述因素时考虑使用的剂量可以低于或者高于这个示范剂量。如果本发明组合物是规律性给予，则每日单位剂量通常应在1μg-10mg范围内。这些制品中的活性化合物通常以大于10μg/ml生理缓冲液的浓度存在。然而，其也可以占总混合物重量的0.1-99.5％的浓度的固体形式存在。通常，每24小时给予活性化合物的总量为大约0.001-100mg/kg、优选总量大约0.01-10mg/kg体重是有利的，适当时持续灌注或者多次以单独剂量的形式给矛，以达到希望的结果。如果静脉内给予所述组合物，则每日每公斤体重的单位剂量在1μg-10mg范围内。所述药物可以局部、局部或者全身性给予。
最后，本发明特别优选其中所述产物是对映异构体纯的醇的方法。
本发明还涉及特异性结合本发明多肽的配体，该配体既不是所述多肽的底物，也不是其辅因子，也不是转化的产物。
术语“特异性结合”根据本发明是指配体与其它多肽包括具有相似的一级结构或者相似的三维结构的那些多肽不或者基本不交叉反应。交叉反应性可以通过本领域已知方法确定(参见Harlow andLane″Antibodies，A Laboratory Manual″，CSH Press，Cold SpringHarbor，1988)。为此，可以使用例如竞争性分析，例如浊度测试，其中将所述配体与标记的本发明多肽及与之竞争的多肽一起保温，后者可以不同浓度使用。
在一个优选的实施方案中，本发明的配体是抗体或其片段或衍生物、适体(aptamer)或者低分子量物质。
抗体片段包括Fv、Fab和F(ab′)2片段。衍生物包括scFv(Harlowand Lane，loc.cit.)。抗体可以是多克隆或者单克隆来源。在本发明受体的一个特别优选的术方案中，所述受体是单克隆抗体。
根据本发明，“低分子量物质”是天然发生的或者人工产生的分子，其分子量为大约250-1000Da、优选300-750Da、特别优选400-600Da，或者是衍生自天然物质的所述分子量的修饰分子。
本发明另外包含具有表1所示序列的引物。
另外，本发明涉及具有表1所示序列的引物对，所述引物对的第一个引物作为正向引物，所述引物对的第二个引物作为反向引物以扩增DNA序列。
本发明的引物(组合其它合适的引物，优选表1列出的另一个合适引物)及本发明的引物对可优选通过PCR或者LCR用于扩增本发明的序列。所述引物和引物对分别从大量具有潜在可能性的引物中仔细选择。除了扩增本发明的核酸序列之外，它们还可以扩增编码现有技术的酶的序列，并因此是多用途的。
本发明进一步涉及一种试剂盒，其包含本发明的多肽；本发明的核酸分子；本发明的载体；本发明的宿主；本发明的配体；本发明的反应系统；至少一个本发明的引物；和/或至少一个本发明的碱基对。
本发明的试剂盒的成分可以在合适的容器中单独包装或者部分包装在一起。所述成分可以例如以冻干形式或者例如与合适溶剂以溶液存在于本发明的试剂盒中，所述溶剂包括特定的水溶剂如缓冲溶液，例如磷酸盐缓冲溶液。
本发明的试剂盒可以不同方式应用。例如可优选使用本发明的引物鉴别其它的醇脱氢酶或者编码这些酶的核酸。在其它实施方案中，本发明的试剂盒可用于工业化生产本发明的酶或者所述酶转化的产物。在这些实施方案中，优选使用本发明的宿主或者本发明的反应系统。
附图简述图1示出通过外消旋物拆分的现有技术，至少4-4步骤。
图2示出簇2(＝引物组2)的总体情况，基于33个序列。
图3示出用引物组2使用多种库的PCR分型。
实施例例证了本发明。
实施例1ADH和引物设计的分簇(clustering)从广泛拥有的菌株集合获得菌株，在进行存活力和纯度检测后在液体培养基中生长。收获细胞沉淀作为起始物进行遗传筛选。构建用于遗传筛选醇脱氢酶基因的引物，然后基于制备的所选择的微生物分离株的基因组DNA借助于PCR进行测试。将NAD-或者NADP-依赖性醇脱氢酶分类为长链、中链和短链ADH。由于这些组中的序列异源性是显著的，因此将所述组基于序列分析而分簇。长链ADH分为3个簇，中链ADH分为4个簇，短链ADH分为3个簇。随后，每个簇构建4个简并引物组，所述引物组不同之处是特异性密码子的利用(密码子使用)不同，但是其针对所述簇的相同序列基序。
实施例2长链醇脱氢酶的遗传筛选基于序列分析将长链ADH分成3个簇，构建引物并用相似程序测试。然而，尽管与预期相反，但没有可归属于这一组的PCR标记被扩增。
实施例3中链醇脱氢酶的遗传筛选如下设计针对中链ADH的引物将中链的ADH基于序列分析分成4个簇。随后在每种情况中构建不同之处在于所选择的密码子使用不同的4个简并引物组。这在图2中基于确定引物组2的生物体组进行例证。所述引物组基于在33个不同的醇脱氢酶序列中的保守区域而选择。
这些引物组，例如引物组2，随后用于研究不同库(含有微生物的基因组DNA)。使用这个引物组，可以扩增、克隆并测序新的部分中链ADH序列。这个PCR分型的相应结果示于下图3。如图3中泳道1、2和10所表明，在每种情况中均发现显示出醇脱氢酶活性的基因序列，所述活性归因于相应于已知ADH酶的基因的基因序列。大体上鉴别了具有潜在醇脱氢酶活性的其它基因序列。发现序列标记与已知ADH的相同性为51-99％之间。
实施例4与红球菌属菌株的醇脱氢酶相似的中链醇脱氢酶的遗传筛选由于已知也属于中链醇脱氢酶的红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)(S)-醇脱氢酶(S-Re-ADH；这种酶特征在于将广谱酮和酮酯立体选择性转化为相应的羟基化合物)及也得自红球菌属菌株的其它醇脱氢酶的令人感兴趣的性质，借助于遗传筛选进行研究是否可以鉴别与这个序列具有相对高相似性的新的ADH序列。动力是假想其序列与S-Re-ADH序列具有共度相同性的新的ADH也具有令人感兴趣的性质。例如，这种新的ADH一方面可以具有S-Re-ADH的已证明的性质，但另一方面例如还可以具有修饰的底物谱或者增加的表达性能。为了回答上述问题，首先进行与这种S-Re-ADH的氨基酸序列的对比序列分析。这些分析表明S-Re-ADH是中链ADH第1簇的代表。另外，在这个簇中发现由5个蛋白质序列组成的一组，包括S-Re-ADH。从这5个序列开始，构建简并引物并考虑到密码子使用根据上述方法进行分析。
为了减少进行PCR的次数，建立由24个细菌分离株组成的库并分离DNA。这个DNA用作模板。扩增并测序许多序列标记。对翻译为氨基酸序列的序列标记进行分析揭示了与S-Re-ADH序列的相同性为大约。分离两个全长基因，其由一个序列标记代表并且在氨基酸序列水平与S-Re-ADH具有98％相同性。新的ADH衍生自生物体石蜡节杆菌(Arthrobacter paraffineus)ATCC21317。在DNA水平的同源性为94％。所述全长基因借助于序列同源性方法分离。
实施例5遗传筛选短链醇脱氢酶另外，针对这个组的3簇的短链ADH的12个引物组进行最后的分析。使用的模板是从5个分离株中分离的DNA，由于其ADH活性，在活性筛选中还原4-氯苯乙酮或者2-庚酮。氨基酸序列标记与已知短链ADH序列的相同性在之间，大多数这些序列与公布的序列出现小于的相同性。
表1用于筛选编码本发明ac的DNA序列的序列
序列表<110>德古萨股份公司<120>新的醇脱氢酶<130>S-IPM-PAT/Dr.Re-k？-K1419 EP<160>68<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>162<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0050197＝Pseudomonas oleovorans；ZF0050294＝Rhodococcus；ZF0050330＝Bacillus；ZF0051303＝Bacterium；ZF0051337＝Methylomonas；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillusbulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002852＝Rhodococcus；ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus；ZF0002862＝Streptomyces clavuligerus；ZF0050292＝Bacterium；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0002437＝Streptomyces；ZF0003712＝Micromonospora；ZF0003765＝Streptomyces；ZF0051305＝Bacterium；ZF0003513＝Actinomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0002332＝Streptomycesdiastatochromogenes；ZF0003768＝Actinomyces；ZF0002379＝Streptomyces coelescens；ZF0002351＝Nonomuraea roseoviolacea；ZF0003769＝Actinomyces；<400>1Gly Pro Trp Gly Cys Gly Asn Cys Trp His Cys Ser Gln Gly Leu Glu1 5 10 15Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Gln Glu Leu Gly Ile Asn Pro Pro Gly Leu20 25 30Gly Ala Pro Gly Ala Leu Ala Glu Phe Met Ile Val Asp Ser Pro Arg35 40 45His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp Pro Val Lys Thr Val Pro Leu50 55 60Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His Ala Ile Lys Arg Ser Leu Pro65 70 75 80Lys Leu Arg Gly Gly Ser Tyr Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu85 90 95Gly His Val Ala Ile Gln Leu Leu Arg His Leu Ser Ala Ser Thr Val100 105 110Ile Ala Leu Asp Val Ser Ala Asp Lys Leu Glu Leu Ala Thr Lys Val115 120 125Gly Ala His Glu Val Val Leu Ser Asp Lys Asp Ala Ala Glu Asn Val
130 135 140Arg Lys Ile Thr G1y Ser Gln Gly Ala Ala Leu Val LeuAsp Phe Val145 150 155160Gly Tyr<210>2<211>128<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0050197＝Pseudomonas oleovorans；ZF0050294＝Rhodococcus；ZF0050330＝Bacillus；ZF0051303＝Bacterium；ZF0051337＝Methylomonas；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillusbulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002852＝Rhodococcus；ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus；ZF0002862＝Streptomyces clavuligerus；ZF0050292＝Bacterium；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0002437＝Streptomyces；ZF0003712＝Micromonospora；ZF0003765＝Streptomyces；ZF0051305＝Bacterium；ZF0003513＝Actinomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0002332＝Streptomycesdiastatochromogenes；ZF0003768＝Actinomyces；ZF0002379＝Streptomyces coelescens；ZF0002351＝Nonomuraea roseoviolacea；ZF0003769＝Actinomyces；<400>2Gly Pro Trp Gly Cys Gly Asn Cys Trp His Cys Ser Gln Gly Leu Glu1 5 10 15Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Gln Glu Leu Gly Ile Asn Pro Pro Gly Leu20 25 30Gly Ala Pro Gly Ala Leu Ala Glu Phe Met Ile Val Asp Ser Pro Arg35 40 45His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp Pro Val Lys Thr Val Pro Leu50 55 60Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His Ala Ile Lys Arg Ser Leu Pro65 70 75 80Lys Leu Arg Gly Gly Ser Tyr Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu85 90 95Gly His Val Thr Ile Gln Leu Leu Arg His Leu Ser Ala Ala Thr Val100 105 110Ile Ala Leu Asp Val Ser Ala Asp Lys Leu Glu Leu Ala Thr Lys Val115 120 125<210>3<211>162
<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050286＝Corynebacterium hoagii<400>3Gly Pro Trp Gly Cys Gly Arg Cys Trp His Cys Ala Gln Gly Leu Glu1 5 10 15Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Arg Glu Leu Gly Ile Ala Pro Pro Gly Leu20 25 30Gly Ala Pro Gly Ala Ile Ala Glu Tyr Met Ile Val Asp Ser Pro Arg35 40 45His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp Pro Val Thr Thr Val Pro Leu50 55 60Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His Ala Ile Lys Arg Ser Leu Gly65 70 75 80Lys Leu Arg Ala Gly Ser Tyr Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu85 90 95Gly His Val Gly Ile Gln Leu Leu Arg His Leu Ser Pro Ala Arg Ile100 105 110Ile Ala Leu Asp Val Asn Asp Glu Lys Leu Ala Phe Ala Arg Glu Val115 120 125Gly Ala His Glu Thr Val Leu Ser Asn Ala Asp Ala Ala Ala Asn Val130 135 140Arg Lys Ile Thr Gly Ser Ala Gly Ala Ala Leu Val Leu Asp Phe Val145 150 155 160Gly Tyr<210>4<211>161<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>4Gly Pro Trp Gly Cys Gly Ser Cys Trp His Cys Ser Gln Gly Leu Glu1 5 10 15
Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Lys Glu Leu Gly Ile Asn Pro Pro Gly Leu20 25 30Gly Ala Pro Gly Ala Leu Ala Glu Phe Met Ile Val Asp Ser Pro Arg35 40 45His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp Pro Val Lys Thr Val Pro Leu50 55 60Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His Ala Ile Lys Arg Ser Leu Pro65 70 75 80Lys Leu Arg Gly Gly Ala Tyr Ala Val Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu85 90 95Gly His Val Ala Ile Gln Leu Leu Arg His Leu Ser Ala Ala Thr Val100 105 110Ile Ala Leu Asp Val Ser Ala Asp Lys Leu Val Leu Ala Thr Lys Val115 120 125Gly Ala His Glu Val Val Leu Ser Asp Lys Asp Ala Ala Glu Asn Val130 135 140Arg Arg Ile Thr Gly Ser Gln Gly Ala Ala Leu Val Leu Asp Phe Val145 150 155 160Gly<210>5<211>70<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0004210＝Actinomyces；ZF0004212＝Actinomyces；ZF0004211＝Actinomyces；ZF0003860＝Actinomyces；ZF0004218＝Actinomyces；ZF0003868＝Actinomadura；ZF0004213＝Actinomyces；ZF0003876＝Actinomyces；ZF0003866＝Actinomyces；ZF0003864＝Actinomyces；ZF0003862＝Actinomadura；ZF0003869＝Actinomyces；ZF0003867＝Actinomadura；ZF0004216＝Actinomyces；ZF0004235＝Actinomyces；ZF0004209＝Actinomadura；ZF0004214＝Actinomyces；ZF0003871＝Actinomyces；ZF0004063＝Actinomadura；ZF0004052＝Actinomadura；ZF0006405＝Streptomyces；ZF0003865＝Actinomadura；ZF0004047＝Actinomadura；ZF0004070＝Actinomyces；ZF0004085＝Actinomyces；ZF0004217＝Actinomyces；ZF0004089＝Actinomadura；ZF0004090＝Actinomadura；ZF0006138＝Streptomyces；ZF0004236＝Actinomadura；ZF0051203＝Bacterium；<400>5Gly Pro Trp Gly Cys Gly Thr Cys Val Lys Cys Ala Glu Gly Lys Glu1 5 10 15Asn Tyr Cys Leu Arg Ala Lys Glu Leu Gly Ile Ala Pro Pro Gly Leu20 25 30Gly Ser Pro Gly Ala Met Ala Glu Tyr Met Ile Val Asp Asp Pro Arg35 40 45
His Leu Val Pro Leu Gly Gly Leu Asp Pro Val Gln Ala Val Pro Leu50 55 60Thr Asp Ala Gly Leu Thr65 70<210>6<211>94<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillus bulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0003764＝Streptomyces；ZF0002331＝Actinoplanes philippinensis；ZF0002441＝Streptomyces；ZF0051307＝Bacterium；ZF0051301＝Bacterium；ZF0051240＝Bacterium；ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis；ZF0003713＝Micromonospora；ZF0004980＝Streptomyces；ZF0004821＝Actinomyces；ZF0002359＝Actinoplanes ianthinogenes；ZF0002396＝Actinoplanes；ZF0003781＝Actinomyces；ZF0003512＝Actinomyces；ZF0006093＝Streptomyces；ZF0006103＝Streptomyces；ZF0006087＝Streptomyces；ZF0050446＝Bacterium；ZF0050445＝Bacterium；ZF0006086＝Streptomyces；ZF0002322＝Rhodococcus；ZF0003538＝Actinomyces；ZF0003535＝Actinomyces；<400>6Cys His Thr Asp His His Ile Val Thr Gly Ala Thr Pro Met Pro Ser1 5 10 15Phe Pro Val Met Gly Gly His Glu Gly Ser Gly Val Ile Thr Lys Leu20 25 30Gly Pro Glu Val Lys Gly Leu Glu Val Gly Asp His Val Val Leu Ser35 40 45Phe Ile Pro Ala Cys Gly Thr Cys Pro Ala Cys Ser Ala Gly His Gln50 55 60Asn Leu Cys Asp Leu Gly Met Gly Leu Leu Ser Gly Gln Ala Ile Ser65 70 75 80Asp Gly Thr Tyr Arg Ile Gln Ala Arg Gly Glu Asn Val Ile85 90<210>7<211>92<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillus bulgaricus；
ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0003764＝Streptomyces；ZF0002331＝Actinoplanes philippinensis；ZF0002441＝Streptomyces；ZF0051307＝Bacterium；ZF0051301＝Bacterium；ZF0051240＝Bacterium；ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis；ZF0003713＝Micromonospora；ZF0004980＝Streptomyces；ZF0004821＝Actinomyces；ZF0002359＝Actinoplanes ianthinogenes；ZF0002396＝Actinoplanes；ZF0003781＝Actinomyces；ZF0003512＝Actinomyces；ZF0006093＝Streptomyces；ZF0006103＝Streptomyces；ZF0006087＝Streptomyces；ZF0050446＝Bacterium；ZF0050445＝Bacterium；ZF0006086＝Streptomyces；ZF0002322＝Rhodococcus；ZF0003538＝Actinomyces；ZF0003535＝Actinomyces；<400>7Cys His Thr Asp Asp His Ala Val Thr Gly Asp Leu Ala Val Pro Leu1 5 10 15Pro Val Ile Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Ile Val Glu Lys Val Gly20 25 30Pro Gly Val Arg Asp Val Glu Val Gly Asp His Val Val Leu Ser Phe35 40 45Ile Pro Ser Cys Gly Arg Cys Arg Trp Cys Ala Val Gly Gln Ser Asn50 55 60Leu Cys Asp Leu Gly Ala Ile Leu Met Ala Gly Ala Gln Val Asp Gly65 70 75 80Thr Tyr Arg Ala Thr Ala Arg Gly His Asp Val Gly85 90<210>8<211>92<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillus bulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0003764＝Streptomyces；ZF0002331＝Actinoplanes philippinensis；ZF0002441＝Streptomyces；ZF0051307＝Bacterium；ZF0051301＝Bacterium；ZF0051240＝Bacterium；ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis；ZF0003713＝Micromonospora；ZF0004980＝Streptomyces；ZF0004821＝Actinomyces；ZF0002359＝Actinoplanes ianthinogenes；ZF0002396＝Actinoplanes；ZF0003781＝Actinomyces；ZF0003512＝Actinomyces；ZF0006093＝Streptomyces；ZF0006103＝Streptomyces；ZF0006087＝Streptomyces；ZF0050446＝Bacterium；ZF0050445＝Bacterium；ZF0006086＝Streptomyces；ZF0002322＝Rhodococcus；ZF0003538＝Actinomyces；ZF0003535＝Actinomyces；<400>8Cys His Thr Asp Asp His Ala Val Thr Gly Asp Leu Ala Val Pro Leu1 5 10 15Pro Val Ile Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Ile Val Glu Lys Val Gly
20 25 30Pro Gly Val Arg Asp Val Glu Val Gly Asp His Val Val Leu Ser Phe35 40 45Ile Pro Ser Cys Gly Arg Cys Arg Trp Cys Ala Val Gly Gln Ser Asn50 55 60Leu Cys Asp Leu Gly Ala Ile Leu Met Ala Gly Ala Gln Val Asp Gly65 70 75 80Thr Tyr Arg Ala Thr Ala Arg Gly His Asp Val Gly85 90<210>9<211>92<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillus bulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0003764＝Streptomyces；ZF0002331＝Actinoplanes philippinensis；ZF0002441＝Streptomyces；ZF0051307＝Bacterium；ZF0051301＝Bacterium；ZF0051240＝Bacterium；ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis；ZF0003713＝Micromonospora；ZF0004980＝Streptomyces；ZF0004821＝Actinomyces；ZF0002359＝Actinoplanes ianthinogenes；ZF0002396＝Actinoplanes；ZF0003781＝Actinomyces；ZF0003512＝Actinomyces；ZF0006093＝Streptomyces；ZF0006103＝Streptomyces；ZF0006087＝Streptomyces；ZF0050446＝Bacterium；ZF0050445＝Bacterium；ZF0006086＝Streptomyces；ZF0002322＝Rhodococcus；ZF0003538＝Actinomyces；ZF0003535＝Actinomyces；<400>9Cys His Thr Asp Asp His Ala Val Thr Gly Asp Leu Ala Val Pro Leu1 5 10 15Pro Val Ile Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Ile Val Glu Lys Val Gly20 25 30Pro Gly Val Arg Asp Val Glu Val Gly Asp His Val Val Leu Ser Phe35 40 45Ile Pro Ser Cys Gly Arg Cys Arg Trp Cys Ala Val Gly Gln Ser Asn50 55 60Leu Cys Asp Leu Gly Ala Ile Leu Met Ala Gly Ala Gln Val Asp Gly65 70 75 80Thr Tyr Arg Ala Thr Ala Arg Gly His Asp Val Gly85 90<210>10<211>92
<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillus bulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0003764＝Streptomyces；ZF0002331＝Actinoplanes philippinensis；ZF0002441＝Streptomyces；ZF0051307＝Bacterium；ZF0051301＝Bacterium；ZF0051240＝Bacterium；ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis；ZF0003713＝Micromonospora；ZF0004980＝Streptomyces；ZF0004821＝Actinomyces；ZF0002359＝Actinoplanes ianthinogenes；ZF0002396＝Actinoplanes；ZF0003781＝Actinomyces；ZF0003512＝Actinomyces；ZF0006093＝Streptomyces；ZF0006103＝Streptomyces；ZF0006087＝Streptomyces；ZF0050446＝Bacterium；ZF0050445＝Bacterium；ZF0006086＝Streptomyces；ZF0002322＝Rhodococcus；ZF0003538＝Actinomyces；ZF0003535＝Actinomyces；<400>10Cys His Thr Asp Asp His Ala Val Thr Gly Asp Leu Ala Val Pro Leu1 5 10 15Pro Val Ile Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Ile Val Glu Lys Val Gly20 25 30Pro Gly Val Arg Asp Val Glu Val Gly Asp His Val Val Leu Ser Phe35 40 45Ile Pro Ser Cys Gly Arg Cys Arg Trp Cys Ala Val Gly Gln Ser Asn50 55 60Leu Cys Asp Leu Gly Ala Ile Leu Met Ala Gly Ala Arg Val Asp Gly65 70 75 80Thr Tyr Arg Ala Thr Ala Arg Gly His Asp Val Gly85 90<210>11<211>92<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillus bulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0003764＝Streptomyces；ZF0002331＝Actinoplanes philippinensis；ZF0002441＝Streptomyces；ZF0051307＝Bacterium；ZF0051301＝Bacterium；ZF0051240＝Bacterium；ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis；ZF0003713＝Micromonospora；ZF0004980＝Streptomyces；ZF0004821＝Actinomyces；ZF0002359＝Actinoplanes ianthinogenes；ZF0002396＝Actinoplanes；ZF0003781＝Actinomyces；ZF0003512＝Actinomyces；ZF0006093＝Streptomyces；ZF0006103＝Streptomyces；ZF0006087＝Streptomyces；ZF0050446＝Bacterium；ZF0050445＝Bacterium；
ZF0006086＝Streptomyces；ZF0002322＝Rhodococcus；ZF0003538＝Actinomyces；ZF0003535＝Actinomyces；<400>11Cys His Thr Asp Asp His Ala Val Thr Gly Asp Leu Ala Val Pro Leu1 5 10 15Pro Val Ile Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Ile Val Glu Lys Val Gly20 25 30Pro Gly Val Arg Asp Val Glu Val Gly Asp His Val Val Leu Ser Phe35 40 45Ile Pro Ser Cys Gly Arg Cys Arg Trp Cys Ala Val Gly Gln Ser Asn50 55 60Leu Cys Asp Leu Gly Ala Ile Leu Met Ala Gly Ala Gln Val Asp Gly65 70 75 80Thr Tyr Arg Ala Thr Ala Arg Gly His Asp Val Gly85 90<210>12<211>93<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>12Cys His Thr Asp Leu Phe Thr Lys Ser Val Leu Pro Glu Arg Leu Gly1 5 10 15Pro Cys Val phe Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Glu Ala Val Gly20 25 30Ser Ser Ile Asp Ser Ile Ala Pro Gly Asp His Val Leu Leu Ser Tyr35 40 45Arg Ser Cys Gly Val Cys Arg Gln Cys Leu Ser Gly His Arg Ala Tyr50 55 60Cys Glu Ser Ser His Gly Leu Asn Ser Ser Gly Ala Arg Thr Asp Gly65 70 75 80Ser Thr Pro Val Arg Arg Ser Gly Thr Pro Ile Arg Ser85 90<210>13<211>93<212>PRT<213>unknown
<220>
<221>source<223>ZF0002333＝Rhodoccocus erythropolis<400>13Cys His Thr Asp Leu Phe Thr Lys Thr Val Leu Pro Glu Lys Leu Gly1 5 10 15Pro Cys Val Phe Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Gln Ala Val Gly20 25 30Ser Ser Ile Asp Asn Ile Ala Ala Gly Asp His Val Leu Leu Ser Tyr35 40 45Arg Ser Cys Gly Val Cys Arg Gln Cys Leu Ser Asp His Arg Ala Tyr50 55 60Cys Glu Ser Ser His Gly Leu Asn Ser Ser Gly Ala Arg Thr Asp Gly65 70 75 80Ser Thr Pro Val Arg Arg Asn Gly Thr Pro Ile Arg Ser85 90<210>14<211>120<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0051303＝Bacterium；ZF0051337＝Methylomonas；ZF0002862＝Streptomyces clavuligerus；ZF0050292＝Bacterium；ZF0051305＝Bacterium；ZF0003513＝Actinomyces；ZF0002351＝Nonomuraearoseoviolacea；ZF0003769＝Actinomyces；ZF0002017＝Streptomyces；ZF0051306＝Bacterium；ZF0002016＝Streptomyces；ZF0003504＝Actinomyces；ZF0006073＝Streptomyces；ZF0003770＝Actinomyces；ZF0002352＝Actinoplanes italicus；ZF0002378＝Streptomycesaureomonopodiales；ZF0006089＝Streptomyces；ZF0006106＝Streptomyces；ZF0051325＝Bacterium；ZF0006108＝Streptomyces；ZF0002440＝Streptomyces；ZF0051302＝Bacterium；ZF0003532＝Actinomyces；ZF0003548＝Nocardiaform；<400>14Cys Gly Thr Asp Arg Glu Ile Ala Ser Gly Ile Tyr Gly Trp Ala Pro1 5 10 15Pro Gly Arg Glu His Leu Val Leu Gly His Glu Ser Leu Gly Arg Val20 25 30Arg Thr Ala Pro Asp Gly Ser Gly Phe Ala Ala Gly Asp Leu Val Val35 40 45Gly Ile Val Arg Arg Pro Asp Pro Val Pro Cys Gly Ala Cys Ala His50 55 60Gly Glu Phe Asp Met Cys Arg Asn Gly Glu Tyr Val Glu Arg Gly Ile65 70 75 80
Lys Gln Ile Asp Gly Tyr Gly Ser Thr Ser Trp Val Val Asp Ala Asp85 90 95Tyr Thr Val Lys Leu Asp Pro Ala Leu Thr Glu Val Gly Val Leu Met100 105 110Glu Pro Thr Thr Val Leu Gly Gln115 120<210>15<211>140<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0051303＝Bacterium；ZF0051337＝Methylomonas；ZF0002862＝Streptomyces clavuligerus；ZF0050292＝Bacterium；ZF0051305＝Bacterium；ZF0003513＝Actinomyces；ZF0002351＝Nonomuraearoseoviolacea；ZF0003769＝Actinomyces；ZF0002017＝Streptomyces；ZF0051306＝Bacterium；ZF0002016＝Streptomyces；ZF0003504＝Actinomyces；ZF0006073＝Streptomyces；ZF0003770＝Actinomyces；ZF0002352＝Actinoplanes italicus；ZF0002378＝Streptomycesaureomonopodiales；ZF0006089＝Streptomyces；ZF0006106＝Streptomyces；ZF0051325＝Bacterium；ZF0006108＝Streptomyces；ZF0002440＝Streptomyces；ZF0051302＝Bacterium；ZF0003532＝Actinomyces；ZF0003548＝Nocardiaform；<400>15Cys Gly Thr Asp Leu His Ile Arg Ser Trp Asp Gly Trp Ala Gln Lys1 5 10 15Thr Ile Ala Thr Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Phe Val Gly Glu Val20 25 30Val Glu Thr Gly Arg Asp Val Thr Asp Ile Gln Val Gly Asp Leu Val35 40 45Ser Gly Glu Gly His Leu Val Cys Gly Lys Cys Arg Asn Cys Leu Ala50 55 60Gly Arg Arg His Leu Cys Arg Ala Thr Val Gly Leu Gly Val Gly Arg65 70 75 80Asp Gly Ala Phe Ala Glu Tyr Val Val Leu Pro Ala Ser Asn Val Trp85 90 95Val His Arg Val Pro Val Asp Leu Asp Val Ala Ala Ile Phe Asp Pro100 105 110Phe Gly Asn Ala Val His Thr Ala Leu Ser Phe Pro Leu Val Gly Glu115 120 125Asp Val Leu Val Thr Gly Ala Gly Thr Ile Gly Ile130 135 140<210>16<211>138<212>PRT<213>unknown
<220>
<221>source<223>ZF0050197＝Pseudomonas oleovorans；ZF0050294＝Rhodococcus；ZF0050330＝Bacillus，ZF0002852＝Rhodococcus；ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus；ZF0002437＝Streptomyces；ZF0003712＝Micromonospora；ZF0003765＝Streptomyces；ZF0002332＝Streptomyces diatsatochromogenes；ZF0003768＝Actinomyces；ZF0002379＝Streptomyces coelescens；ZF0002443＝Streptomyces；ZF0002442＝Streptomyces；ZF0002436＝Streptomyces；ZF0050994＝Bacterium；ZF0050992＝Bacterium；ZF0050442＝Bacterium；ZF0002049＝Streptomyces；ZF0006069＝Streptomyces；ZF0006075＝Streptomyces；ZF0004724＝Nocardiaform；ZF0002392＝Actinoplanesnipponensis；ZF0002356＝Actinoplanes brasiliensis；ZF0003501＝Actinomyces；ZF0051322＝Bacterium；ZF0006078＝Streptomyces；ZF0006092＝Streptomyces；ZF0006090＝Streptomyces；ZF0006084＝Streptomyces；ZF0006068＝Streptomyces；ZF0050284＝Rhodococcus；ZF0050028＝Agrobacterium tumefaciens；ZF0003540＝Actinomyces；ZF0003528＝Actinomyces；ZF0003529＝Actinomyces；<400>16Gly Leu Thr Ile Gly His Glu Pro Val Gly Val Ile Glu Lys Leu Gly1 5 10 15Ser Ala Val Thr Gly Tyr Arg Glu Gly Gln Arg Val Ile Ala Gly Ala20 25 30Ile Cys Pro Asn Phe Asn Ser Tyr Ala Ala Gln Asp Gly Ala Pro Ser35 40 45Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Val Ala Ser Gly Ala Cys Gly Cys His Gly50 55 60Tyr Arg Ala Thr Ala Gly Trp Arg Phe Gly Asn Ile Ile Asp Gly Ala65 70 75 80Gln Ala Glu Tyr Leu Leu Val Pro Asp Ala Gln Gly Asn Leu Ala Pro85 90 95Val Pro Asp Asn Leu Ser Asp Glu Gln Val Leu Met Cys Pro Asp Ile100 105 110Met Ser Thr Gly Phe Lys Gly Ala Glu Asn Ala His Ile Arg Ile Gly115 120 125Asp Thr Val Ala Val Phe Ala Gln Gly Pro130 135<210>17<211>144<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050197＝Pseudomonas oleovorans；ZF0050294＝Rhodococcus；ZF0050330＝Bacillus，ZF0002852＝Rhodococcus；ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus；ZF0002437＝Streptomyces；ZF0003712＝Micromonospora；ZF0003765＝Streptomyces；ZF0002332＝Streptomyces diatsatochromogenes；ZF0003768＝Actinomyces；
ZF0002379＝Streptomyces coelescens；ZF0002443＝Streptomyces；ZF0002442＝Streptomyces；ZF0002436＝Streptomyces；ZF0050994＝Bacterium；ZF0050992＝Bacterium；ZF0050442＝Bacterium；ZF0002049＝Streptomyces；ZF0006069＝Streptomyces；ZF0006075＝Streptomyces ；ZF0004724＝Nocardiaform；ZF0002392＝Actinoplanesnipponensis；ZF0002356＝Actinoplanes brasiliensis；ZF0003501＝Actinomyces；ZF0051322＝Bacterium；ZF0006078＝Streptomyces；ZF0006092＝Streptomyces；ZF0006090＝Streptomyces；ZF0006084＝Streptomyces；ZF0006068＝Streptomyces；ZF0050284＝Rhodococcus；ZF0050028＝Agrobacterium tumefaciens；ZF0003540＝Actinomyces；ZF0003528＝Actinomyces；ZF0003529＝Actinomyces；<400>17Cys Gly Thr Asp Leu His Ile Leu Gly Gly Asp Val Pro Glu Val Thr1 5 10 15Asp Gly Arg Ile Leu Gly His Glu Ala Val Gly Thr Val Val Glu Val20 25 30Gly Asp Gly Val Gln Thr Leu Ala Pro Gly Asp Arg Val Leu Val Ser35 40 45Cys Val Thr Ala Cys Gly Thr Cys Arg Phe Cys Arg Glu Ser Arg Tyr50 55 60Gly Gln Cys Leu Gly Gly Gly Gly Trp Ile Leu Gly His Leu Ile Asp65 70 75 80Gly Thr Gln Ala Glu Leu Val Arg Val Pro Tyr Ala Asp Asn Ser Thr85 90 95His Arg Ile Pro Asp Gly Val Ser Asp Glu Gln Met Leu Met Leu Ala100 105 110Asp Ile Leu Pro Thr Ser Tyr Glu Val Gly Val Leu Asn Gly Cys Leu115 120 125Arg Pro Ala Asp Val Val Val Ile Ile Gly Ala Asp Asp Arg Pro Leu130 135 140<210>18<211>73<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>18Val Asp Val Val Val Asp Asn Ala Gly Phe Gly Thr His Gly Ala Phe1 5 10 15Val Asp Glu Asp His Glu Arg Val Thr Ser Glu Ile Gln Leu Asn Ile20 25 30Ala Thr Leu Val Glu Leu Thr His Thr Phe Pro Pro Asp Leu Leu Thr35 40 45
Gly Arg Gly Ala Leu Val Asn Ile Ala Ser Thr Ala Ser Phe Gln Pro50 55 60Thr Pro Gly Met Ala Val Tyr Cys Ala65 70<210>19<211>75<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>19Val Asp Val Val Val His Asn Ala Gly Phe Gly Thr His Gly Ala Phe1 5 10 15Val Asp Glu Asp Leu Glu Arg Val Thr Ser Glu Ile Gln Leu Asn Ile20 25 30Ala Thr Leu Val Glu Leu Thr His Thr Phe Leu Pro Asp Leu Leu Thr35 40 45Gly Arg Gly Ala Leu Val Asn Ile Ala Ser Thr Ala Ser Phe Gln Pro50 55 60Thr Pro Gly Met Ala Val Tyr Cys Ala Thr Lys65 70 75<210>20<211>79<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0003535＝Actinomyces<400>20Arg Val Asp Val Val Val His Asn Ala Ala Ile Thr Gln Lys Ala Thr1 5 10 15Phe Arg Asp Ile Thr Pro Ala Asp Phe Glu Arg Ile Leu Arg Val Asn20 25 30Leu Thr Gly Val Phe Asn Leu Ser Gln Ala Val Ile Pro Leu Met Ile35 40 45Gln Arg Gly Gly Gly Ser Ile Val Ser Ile Ser Ser Leu Ser Ala Gln50 55 60
Asn Gly Gly Gly Ile Phe Gly Gly Ala His Tyr Cys Ala Thr Lys65 70 75<210>21<211>76<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0003535＝Actinomyces<400>21Val Asp Val Val Val Asp Asn Ala Gly Leu Ala Leu Gly Thr Ala Pro1 5 10 15Ala Pro Gln Val Pro Leu Lys Asp Trp Gln Thr Met Val Asn Thr Asn20 25 30Ile Thr Gly Leu Leu Asn Ile Thr His His Leu Leu Pro Thr Leu Ile35 40 45Asp Arg Lys Gly Ile Val Val Asn Leu Ser Ser Val Ala Ala His Tyr50 55 60Pro Tyr Thr Gly Gly Asn Val Tyr Cys Ala Ser Lys65 70 75<210>22<211>72<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>22Gln Gly Ile Gly Tyr Ala Thr Ala Lys Arg Leu Ile Ser Leu Gly Ala1 5 10 15Thr Val Ala Ile Gly Asp Ile Asp Glu Ala Thr Leu Ala Arg Ala Ala20 25 30Lys Asp Leu Gly Ile Arg Thr Phe Gly Arg Leu Asp Val Thr Asp Pro35 40 45Ala Ser Phe Phe Asp Phe Leu Asp Thr Val Glu Gly Glu Leu Gly Pro50 55 60Ile Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala65 70
<210>23<211>75<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>23Gln Arg Ile Gly Leu Glu Ile Ala Arg Thr Phe Ile Lys Glu Gly Ala1 5 10 15Thr Val Val Leu Gly Asp Ile Asn Glu Thr Val Gly Thr Ala Ala Val20 25 30Ala Glu Leu Gly Gly Glu Ser Val Ala Arg Phe Ala Ser Cys Asp Val35 40 45Arg Asp Ser Gly Gln Val Glu Ala Met Leu Asp Leu Ala Glu Ser Ala50 55 60Phe Gly Pro Val Asp Val Met Met Asn Asn Ala65 70 75<210>24<211>72<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>24Gln Gly Ile Gly Tyr Gln Thr Ala Lys Glu Leu Ile Arg Arg Gly His1 5 10 15Arg Val Ala Ile Gly Asp Ile Asp Glu Ala Arg Ala Lys Glu Thr Ala20 25 30Ala Glu Leu Gly Val Lys Val Val Thr Arg Leu Asp Val Thr Asp Pro35 40 45Asp Ser Phe Lys Asp Phe Leu Asp Leu Val Glu Gly Asp Leu Gly Pro50 55 60Leu Asp Val Leu Ile Asn Asn Ala65 70<210>25<211>74<212>PRT
<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>25Gly Ile Gly Leu Glu Ile Ala Arg Thr Phe Ile Lys Glu Gly Ala Thr1 5 10 15Val Val Leu Gly Asp Ile Asn Glu Thr Val Gly Thr Ala Ala Val Ala20 25 30Glu Leu Gly Gly Glu Ser Val Ala Arg Phe Ala Ser Cys Asp Val Arg35 40 45Asp Ser Gly Gln Val Glu Ala Met Leu Asp Leu Ala Glu Ser Ala Phe50 55 60Gly Pro Val Asp Val Ile Val Asn Asn Ala65 70<210>26<211>74<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>26Ile Gly Leu Glu Ile Ala Arg Thr Phe Ile Lys Glu Gly Ala Thr Val1 5 10 15Val Leu Gly Asp Ile Asn Glu Thr Val Gly Thr Ala Ala Val Gly Glu20 25 30Leu Gly Gly Glu Ser Val Ala Arg Phe Ala Ser Cys Asp Val Arg Asp35 40 45Ser Gly Gln Val Glu Ala Met Leu Asp Leu Ala Glu Ser Ala Phe Gly50 55 60Pro Val Asp Val Met Val Asn Asn Ala Gly65 70<210>27<211>62<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis<400>27Val Pro Val Ala Val Val Asp Leu His Ile Glu Ser Ala Lys Glu Thr1 5 10 15Val Ala Leu Ile Glu Ser Gln Tyr Gly Thr Pro Ala Leu Ala Leu Glu20 25 30Ala Asp Val Arg Asp Arg Ala Ala Val Ser Ala Ala Phe Glu Ala Thr35 40 45Val Ala Glu Trp Gly Arg Phe Asp Tyr Leu Val Asn Asn Ala50 55 60<210>28<211>74<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis<400>28Leu Gly Arg Glu Ile Ala Leu Lys Leu Ala Ser Glu Gly Ala Ser Val1 5 10 15Val Val Asn Asp Leu Asp Pro Glu Pro Ala Ala Gln Thr Glu Arg Asp20 25 30Ile Lys Ala Thr Gly Gly Gln Ala Val Ser Cys Val Gly Ser Val Ala35 40 45Glu Asp Gly Phe Ala Glu Arg Phe Val Asn Thr Ala Val Glu Ser Phe50 55 60Gly Gly Leu Asp Val Met Val Asn Asn Ala65 70<210>29<211>76<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis<400>29Ala Gly Leu Gly Val Glu Phe Ala His Arg Phe Ala Ala Arg Gly Ala1 5 10 15
Asn Leu Val Leu Val Ala Arg Arg Ala Asp Arg Leu Glu Ala Leu Ala20 25 30Thr Glu Leu Arg Val Ala His Gly Ile Thr Val Thr Val Leu Pro Ala35 40 45Asp Leu Ala Ala Pro Gly Val Gly Ala Thr Leu His Gln Glu Leu Thr50 55 60Ser Arg Gly Ile Thr Val Thr Ser Leu Ile Asn Asn65 70 75<210>30<211>72<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0003535＝Actinomyces<400>30Pro Ala Asp Gly Tyr Gln Thr Ala Lys Glu Leu Ile Arg Arg Gly His1 5 10 15Arg Val Ala Ile Val Asp Ile Asp Glu Ala Arg Ala Lys Gly Ala Ala20 25 30Ala Glu Leu Gly Val Lys Val Val Thr Arg Leu Asp Val Thr Glu Pro35 40 45Asp Ser Phe Thr Thr Phe Leu Asp Leu Val Glu Arg Glu Leu Gly Pro50 55 60Leu Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala65 70<210>31<211>67<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>31Ala Thr Asp Gly Ala Arg Val Ala Val Val Asp Leu His Ile Glu Ser1 5 10 15Ala Glu Glu Thr Val Ala Leu Ile Glu Ser Gln Tyr Gly Thr Pro Ala20 25 30Leu Ala Leu Glu Ala Asp Val Arg Asp Arg Ala Ala Val Ser Ala Ala35 40 45
Phe Glu Ala Thr Val Ala Glu Trp Gly Arg Phe Asp Tyr Leu Val Asn50 55 60Asn Ala Gly65<210>32<211>67<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>32Ala Ala Asp Gly Ala Arg Val Ala Val Val Asp Leu His Ile Glu Ser1 5 10 15Ala Lys Glu Thr Val Ala Leu Ile Glu Ser Gln Tyr Gly Thr Pro Ala20 25 30Leu Ala Leu Glu Ala Asp Val Arg Asp Arg Ala Ala Val Ser Ala Ala35 40 45Phe Glu Ala Thr Val Ala Glu Trp Gly Arg Phe Asp Tyr Leu Val Asn50 55 60Asn Ala Gly65<210>33<211>348<212>PRT<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF00503 10＝Arthrobacter paraffineus<400>33Met Lys Ala Ile Gln Tyr Ala Arg Ile Gly Ala Glu Pro Glu Leu Thr1 5 10 15Glu Ile Pro Lys Pro Glu Pro Gly Pro Gly Glu Val Leu Leu Glu Val20 25 30Thr Ala Ala Gly Val Cys His Ser Asp Asp Phe Ile Met Ser Leu Pro35 40 45Glu Glu Gln Tyr Thr Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly50 55 60Ala Gly Arg Val Ala Ala Val Gly Glu Gly Val Glu Gly Leu Asp Ile65 70 75 80
Gly Thr Asn Val Val Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Ser Cys Trp85 90 95His Cys Ser Gln Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Lys Glu Leu100 105 110Gly Ile Asn Pro Pro Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ala Leu Ala Glu Phe115 120 125Met Ile Val Asp Ser Pro Arg His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp130 135 140Pro Val Lys Thr Val Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His145 150 155 160Ala Ile Lys Arg Ser Leu Pro Lys Leu Arg Gly Gly Ala Tyr Ala Val165 170 175Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu Gly His Val Ala Ile Gln Leu Leu Arg180 185 190His Leu Ser Ala Ala Thr Val Ile Ala Leu Asp Val Ser Ala Asp Lys195 200 205Leu Glu Leu Ala Thr Lys Val Gly Ala His Glu Val Val Leu Ser Asp210 215 220Lys Asp Ala Ala Glu Asn Val Arg Arg Ile Thr Gly Ser Gln Gly Ala225 230 235 240Ala Leu Val Leu Asp Phe Val Gly Tyr Gln Pro Thr Ile Asp Thr Ala245 250 255Met Ala Val Ala Gly Val Gly Ser Asp Val Thr Ile Val Gly Ile Gly260 265 270Asp Gly Gln Ala His Ala Lys Val Gly Phe Phe Gln Ser Pro Tyr Glu275 280 285Ala Ser Val Thr Val Pro Tyr Trp Gly Ala Arg Asn Glu Leu Ile Glu290 295 300Leu Ile Asp Leu Ala His Ala Gly Ile Phe Asp Ile Ala Val Glu Thr305 310 315 320Phe Ser Leu Asp Asn Gly Ala Glu Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Ala Gly325 330 335Thr Leu Ser Gly Arg Ala Val Val Val Pro Gly Leu340 345<210>34<211>348<212>PRT
<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>34Met Lys Ala Ile Gln Tyr Thr Arg Ile Gly Ala Glu Pro Glu Leu Thr1 5 10 15Glu Ile Pro Lys Pro Glu Pro Gly Pro Gly Glu Val Leu Leu Glu Val20 25 30Thr Ala Ala Gly Val Cys His Ser Asp Asp Phe Ile Met Ser Leu Pro35 40 45Glu Glu Gln Tyr Thr Tyr Gly Leu Pro Leu Thr Leu Gly His Glu Gly50 55 60Ala Gly Arg Val Ala Ala Val Gly Glu Gly Val Glu Gly Leu Asp Ile65 70 75 80Gly Thr Asn Val Val Val Tyr Gly Pro Trp Gly Cys Gly Ser Cys Trp85 90 95His Cys Ser Gln Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Ser Arg Ala Lys Glu Leu100 105 110Gly Ile Asn Pro Pro Gly Leu Gly Ala Pro Gly Ala Leu Ala Glu Phe115 120 125Met Ile Val Asp Ser Pro Arg His Leu Val Pro Ile Gly Asp Leu Asp130 135 140Pro Val Lys Thr Val Pro Leu Thr Asp Ala Gly Leu Thr Pro Tyr His145 150 155 160Ala Ile Lys Arg Ser Leu Pro Lys Leu Arg Gly Gly Ala Tyr Ala Val165 170 175Val Ile Gly Thr Gly Gly Leu Gly His Val Ala Ile Gln Leu Leu Arg180 185 190His Leu Ser Ala Ala Thr Val Ile Ala Leu Asp Val Ser Ala Asp Lys195 200 205Leu Glu Leu Ala Thr Lys Val Gly Ala His Glu Val Val Leu Ser Asp210 215 220Lys Asp Ala Ala Glu Asn Val Arg Arg Ile Thr Gly Ser Gln Gly Ala225 230 235 240Ala Leu Val Leu Asp Phe Val Gly Tyr Gln Pro Thr Ile Asp Thr Ala245 250 255Met Ala Val Ala Gly Val Gly Ser Asp Val Thr Ile Val Gly Ile Gly260 265 270
Asp Gly Gln Ala His Ala Lys Val Gly Phe Phe Gln Ser Pro Tyr Glu275 280 285Ala Ser Val Thr Val Pro Tyr Trp Gly Ala Arg Asn Glu Leu Ile Glu290 295 300Leu Ile Asp Leu Ala His Ala Gly Ile Phe Asp Ile Ala Val Glu Thr305 310 315 320Phe Ser Leu Asp Asn Gly Ala Glu Ala Tyr Arg Arg Leu Ala Ala Gly325 330 335Thr Leu Ser Gly Arg Ala Val Val Val Pro Gly Leu340 345<210>35<211>488<212>DNA<213>unknown<220>
<22l>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0050197＝Pseudomonas oleovorans；ZF0050294＝Rhodococcus；ZF0050330＝Bacillus；ZF0051303＝Bacterium；ZF0051337＝Methylomonas；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillusbulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002852＝Rhodococcus；ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus；ZF0002862＝Streptomyces clavuligerus；ZF0050292＝Bacterium；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0002437＝Streptomyces；ZF0003712＝Micromonospora；ZF0003765＝Streptomyces；ZF0051305＝Bacterium；ZF0003513＝Actinomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0002332＝Streptomycesdiastatochromogenes；ZF0003768＝Actinomyces；ZF0002379＝Streptomyces coelescens；ZF0002351＝Nonomuraea roseoviolacea；ZF0003769＝Actinomyces；<400>35gggccatggg gttgtggcaa ctgttggcac tgctcacaag gactcgagaa ctattgctct 60cgcgcccaag aactcggaat caatcctccc ggtctcggtg cacccggcgc gttggccgag120ttcatgatcg tcgattctcc tcgccacctt gtcccgatcg gtgacctcga cccggtcaag180acggtgccgc tgaccgacgc cggtctgacg ccgtatcacg cgatcaagcg ttctctgccg240aaacttcgcg gaggctcgta cgcggttgtc attggtaccg gcgggctcgg ccacgtcgcc300attcagctcc tccgtcacct ctcggcgtca acggtcatcg ctttggacgt gagcgcggac360aagctcgaac tggcaaccaa ggtaggcgct cacgaagtgg ttctgtccga caaggacgcg420gccgagaacg tccgcaagat cactggaagt caaggcgccg cactggttct cgacttcgtt480ggctacca 488<210>36<211>385<212>DNA<213>unknown
<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0050197＝Pseudomonas oleovorans；ZF0050294＝Rhodococcus；ZF0050330＝Bacillus；ZF0051303＝Bacterium；ZF0051337＝Methylomonas；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillusbulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002852＝Rhodococcus；ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus；ZF0002862＝Streptomyces clavuligerus；ZF0050292＝Bacterium；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0002437＝Streptomyces；ZF0003712＝Micromonospora；ZF0003765＝Streptomyces；ZF0051305＝Bacterium；ZF0003513＝Actinomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0002332＝Streptomycesdiastatochromogenes；ZF0003768＝Actinomyces；ZF0002379＝Streptomyces coelescens；ZF0002351＝Nonomuraea roseoviolacea；ZF0003769＝Actinomyces；<400>36gggccatggg gttgtggcaa ctgttggcac tgctcacaag gactcgagaa ctattgctct 60cgcgcccaag aactcggaat caatcctccc ggtctcggtg cacccggcgc gttggccgag120ttcatgatcg tcgattctcc tcgccacctt gtcccgatcg gtgacctcga cccggtcaag180acggtgccgc tgaccgacgc cggtctgacg ccgtatcacg cgatcaagcg ttctctgccg240aaacttcgcg gaggctcgta cgcggttgtc attggtaccg gcgggctcgg ccacgtcacc300attcagctcc tccgtcacct ctcggcggca acggtcatcg ctttggacgt gagcgcggac360aagctcgaac tggcaaccaa ggtag 385<210>37<211>486<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050286＝Corynebacterium hoagii<400>37ggcccttggg gttgcggacg ttgctggcac tgcgcgcagg ggctcgagaa ctactgctcc 60cgcgcaaggg aactcggcat cgccccaccc ggcttgggcg cgccgggcgc gatcgccgag120tacatgatcg tcgactcgcc gcgtcacctg gtcccgatcg gtgacctcga ccccgtcacg180acggtgccgc tgaccgacgc cgggctcacc ccgtaccacg cgatcaaacg gtcgctcggc240aagctccgcg ccggctcgta cgcagtcgtg atcggcaccg gaggcctcgg acacgtcggc300atccagctgc tccgccacct gtcccctgca cgcatcatcg ccctcgacgt caacgacgag360aagctcgcgt tcgcccgcga ggtcggcgcg cacgagaccg tgttgtcgaa cgccgacgcc420gccgcgaacg tccggaagat cacgggttcg gccggtgccg cgctggtcct agacttcgtc480ggctac 486<210>38<211>483<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>38ggcccatggg gctgtggcag ctgttggcac tgctcgcaag gactcgaaaa ctactgttct 60cgggcaaaag aactcggcat caatcctcct ggtctcggtg cacccggcgc gttggccgaa120ttcatgatcg tcgattcacc tcgccacctc gtcccgatcg gcgacctcga tccggtcaag180acggtgccac tgaccgacgc cggtctgact ccgtatcacg cgatcaagcg ttcactgccg240aaacttcgcg gtggcgcgta cgccgtcgtc atcggtaccg gcggtctcgg ccatgtcgcc300atccaactcc tccgccacct ctcggcagca accgtcatcg cactcgacgt gagcgcggac360aagctcgtac tggcaaccaa ggtaggcget cacgaagtgg tcctgtccga caaggacgcg420gccgagaacg tccgcaggat caccggaagt cagggcgccg cactggttct tgacttcgtt480ggc 483<210>39<211>210<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0004210＝Actinomyces；ZF0004212＝Actinomyces；ZF0004211＝Actinomyces；ZF0003860＝Actinomyces；ZF0004218＝Actinomyces；ZF0003868＝Actinomadura；ZF0004213＝Actinomyces；ZF0003876＝Actinomyces；ZF0003866＝Actinomyces；ZF0003864＝Actinomyces；ZF0003862＝Actinomadura；ZF0003869＝Actinomyces；ZF0003867＝Actinomadura；ZF0004216＝Actinomyces；ZF0004235＝Actinomyces；ZF0004209＝Actinomadura；ZF0004214＝Actinomyces；ZF0003871＝Actinomyces；ZF0004063＝Actinomadura；ZF0004052＝Actinomadura；ZF0006405＝Streptomyces；ZF0003865＝Actinomadura；ZF0004047＝Actinomadura；ZF0004070＝Actinomyces；ZF0004085＝Actinomyces；ZF0004217＝Actinomyces；ZF0004089＝Actinomadura；ZF0004090＝Actinomadura；ZF0006138＝Streptomyces；ZF0004236＝Actinomadura；ZF0051203＝Bacterium；<400>39ggaccgtggg gctgcggcac gtgcgtcaag tgcgccgagg gcaaggagaa ctactgcctg 60cgcgccaagg aactcggcat cgccccgccc ggactcggct cgcccggcgc catggccgag120tacatgatcg tcgacgaccc gcgccacctg gtgccgctcg gcggtctcga cccggtccag180gccgtgccgc tcactgacgc gggcctgaca 210<210>40<211>282<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillus bulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0003764＝Streptomyces；ZF0002331＝
Actinoplanes philippinensis；ZF0002441＝Streptomyces；ZF0051307＝Bacterium；ZF0051301＝Bacterium；ZF0051240＝Bacterium；ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis；ZF0003713＝Micromonospora；ZF0004980＝Streptomyces；ZF0004821＝Actinomyces；ZF0002359＝Actinoplanes ianthinogenes；ZF0002396＝Actinoplanes；ZF0003781＝Actinomyces；ZF0003512＝Actinomyces；ZF0006093＝Streptomyces；ZF0006103＝Streptomyces；ZF0006087＝Streptomyces；ZF0050446＝Bacterium；ZF0050445＝Bacterium；ZF0006086＝Streptomyces；ZF0002322＝Rhodococcus；ZF0003538＝Actinomyces；ZF0003535＝Actinomyces；<400>40tgtcacaccg atcaccacat cgtcaccggc gcgaccccga tgccgtcgtt cccggtcatg 60ggcgggcacg agggttcggg cgtcatcacc aagctcggcc ctgaggtcaa gggactggag120gtcggcgacc acgtcgttct gtccttcatt ccggcttgtg gaacctgtcc ggcgtgttcg180gccgggcatc agaatctttg tgacctcggg atgggcctcc tcagcggcca agccatcagc240gacggcacgt accggatcca ggctcgcggc gaaaacgtga tc 282<210>41<211>276<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillus bulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0003764＝Streptomyces；ZF0002331＝Actinoplanes philippinensis；ZF0002441＝Streptomyces；ZF0051307＝Bacterium；ZF0051301＝Bacterium；ZF0051240＝Bacterium；ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis；ZF0003713＝Micromonospora；ZF0004980＝Streptomyces；ZF0004821＝Actinomyces；ZF0002359＝Actinoplanes ianthinogenes；ZF0002396＝Actinoplanes；ZF0003781＝Actinomyces；ZF0003512＝Actinomyces；ZF0006093＝Streptomyces；ZF0006103＝Streptomyces；ZF0006087＝Streptomyces；ZF0050446＝Bacterium；ZF0050445＝Bacterium；ZF0006086＝Streptomyces；ZF0002322＝Rhodococcus；ZF0003538＝Actinomyces；ZF0003535＝Actinomyces；<400>41tgccataccg acgatcatgc tgtgaccggt gatctggcag tcccactccc cgtgatcggt 60ggccacgaag gcgcgggcat agtggagaaa gtcggccccg gcgtgcgaga cgtcgaggta120ggcgatcacg tcgtcctctc cttcattccc tcgtgtggac gctgccgttg gtgcgcagtc180ggacagagca acctctgcga cctcggcgcc attctgatgg ccggcgcaca ggtcgacggg240acgtaccgcg cgacagctcg cgggcacgac gtcgga 276<210>42<211>276<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillus bulgaricus；ZF0060544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝
Streptomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0003764＝Streptomyces；ZF0002331＝Actinoplanes philippinensis；ZF0002441＝Streptomyces；ZF0051307＝Bacterium；ZF0051301＝Bacterium；ZF0051240＝Bacterium；ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis；ZF0003713＝Micromonospora；ZF0004980＝Streptomyces；ZF0004821＝Actinomyces；ZF0002359＝Actinoplanes ianthinogenes；ZF0002396＝Actinoplanes；ZF0003781＝Actinomyces；ZF0003512＝Actinomyces；ZF0006093＝Streptomyces；ZF0006103＝Streptomyces；ZF0006087＝Streptomyces；ZF0050446＝Bacterium；ZF0050445＝Bacterium；ZF0006086＝Streptomyces；ZF0002322＝Rhodococcus；ZF0003538＝Actinomyces；ZF0003535＝Actinomyces；<400>42tgccatacag acgatcatgc tgtgaccggt gatctggcag tcccactccc cgtgatcggt 60ggccacgaag gcgcgggcat agtggagaaa gtcggccccg gcgtgcgaga cgtcgaggta120ggcgatcacg tcgtcctctc cttcattccc tcgtgtggac gctgccgttg gtgcgcagtc180ggacagagca acctctgcga cctcggcgcc attctgatgg ccggcgcaca ggtcgacggg240acgtaccgcg cgacagctcg cgggcacgac gtcgga 276<210>43<211>276<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillus bulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0003764＝Streptomyces；ZF0002331＝Actinoplanes philippinensis；ZF0002441＝Streptomyces；ZF0051307＝Bacterium；ZF0051301＝Bacterium；ZF0051240＝Bacterium；ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis；ZF0003713＝Micromonospora；ZF0004980＝Streptomyces；ZF0004821＝Actinomyces；ZF0002359＝Actinoplanes ianthinogenes；ZF0002396＝Actinoplanes；ZF0003781＝Actinomyces；ZF0003512＝Actinomyces；ZF0006093＝Streptomyces；ZF0006103＝Streptomyces；ZF0006087＝Streptomyces；ZF0050446＝Bacterium；ZF0050445＝Bacterium；ZF0006086＝Streptomyces；ZF0002322＝Rhodococcus；ZF0003538＝Actinomyces；ZF0003535＝Actinomyces；<400>43tgtcatactg acgatcatgc tgtgaccggt gatctggcag tcccactccc cgtgatcggt 60ggccacgaag gcgcgggcat agtggagaaa gtcggccccg gcgtgcgaga cgtcgaggta120ggcgatcacg tcgtcctctc cttcattccc tcgtgtggac gctgccgttg gtgcgcagtc180ggacagagca acctctgcga cctcggcgcc attctgatgg ccggcgcaca ggtcgacggg240acgtaccgcg cgacagctcg cgggcacgac gtcgga 276<210>44<211>276<212>DNA<213>unknown<220>
<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；
ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillus bulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0003764＝Streptomyces；ZF0002331＝Actinoplanes philippinensis；ZF0002441＝Streptomyces；ZF0051307＝Bacterium；ZF0051301＝Bacterium；ZF0051240＝Bacterium；ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis；ZF0003713＝Micromonospora；ZF0004980＝Streptomyces；ZF0004821＝Actinomyces；ZF0002359＝Actinop1anes ianthinogenes；ZF0002396＝Actinoplanes；ZF0003781＝Actinomyces；ZF0003512＝Actinomyces；ZF0006093＝Streptomyces；ZF0006103＝Streptomyces；ZF0006087＝Streptomyces；ZF0050446＝Bacterium；ZF0050445＝Bacterium；ZF0006086＝Streptomyces；ZF0002322＝Rhodococcus；ZF0003538＝Actinomyces；ZF0003535＝Actinomyces；<400>44tgtcacaccg acgatcatgc tgtgaccggt gatctggcag tcccactccc cgtgatcggt 60ggccacgaag gcgcgggcat agtggagaaa gtcggccccg gcgtgcgaga cgtcgaggta120ggcgatcacg tcgtcctctc cttcattccc tcgtgtggac gctgccgttg gtgcgcagtc180ggacagagca acctctgcga cctcggcgcc attctgatgg ccggcgcacg ggtcgacggg240acgtaccgcg cgacagctcg cgggcacgac gtcgga 276<210>45<211>276<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002326＝Actinoplanes missouriensis；ZF0003505＝Streptomyces；ZF0051321＝Bacterium；ZF0050782＝Lactobacillus bulgaricus；ZF0050544＝Phyllobacterium rubiacearum；ZF0002031＝Streptomyces；ZF0002349＝Streptomyces spectabilis；ZF0002434＝Streptomyces；ZF0050993＝Kocuria；ZF0002018＝Streptomyces；ZF0003767＝Actinomyces；ZF0003764＝Streptomyces；ZF0002331＝Actinoplanes philippinensis；ZF0002441＝Streptomyces；ZF0051307＝Bacterium；ZF0051301＝Bacterium；ZF0051240＝Bacterium；ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis；ZF0003713＝Micromonospora；ZF0004980＝Streptomyces；ZF0004821＝Actinomyces；ZF0002359＝Actinoplanes ianthinogenes；ZF0002396＝Actinoplanes；ZF0003781＝Actinomyces；ZF0003512＝Actinomyces；ZF0006093＝Streptomyces；ZF0006103＝Streptomyces；ZF0006087＝Streptomyces；ZF0050446＝Bacterium；ZF0050445＝Bacterium；ZF0006086＝Streptomyces；ZF0002322＝Rhodococcus；ZF0003538＝Actinomyces；ZF0003535＝Actinomyces；<400>45tgtcacactg acgatcatgc tgtgaccggt gatctggcag tcccactccc cgtgatcggt 60ggccacgaag gcgcgggcat agtggagaaa gtcggccccg gcgtgcgaga cgtcgaggta120ggcgatcacg tcgtcctctc cttcattccc tcgtgtggac gctgccgttg gtgcgcagtc180ggacagagca acctctgcga cctcggcgcc attctgatgg ccggcgcaca ggtcgacggg240acgtaccgcg cgacagctcg cgggcacgac gtcgga 276<210>46<211>279<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>46tgccacacag atctgttcac gaagtcggtg ctaccggaaa ggctcggccc ctgcgtgttc 60gggcacgaag gagcgggggt ggtcgaggcc gtcggctcgt cgatcgacag cattgcgccc120ggtgatcacg tgttgctgag ctaccgcagt tgcggtgtgt gcaggcagtg cctcagcggt180catcgggcgt actgcgaaag ctcacacggg ctcaacagct ctggcgcacg caccgacggc240tcgacgccgg tccggcgaag cggaactccg atacggtcc 279<210>47<211>279<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis<400>47tgtcatactg atctgttcac gaagacggtg ctaccggaaa agctcgggcc ctgcgtgttc 60ggacacgaag gcgccggcgt cgtgcaagcc gttggctcgt cgatcgacaa catcgcggct120ggtgatcacg tattgctgag ctaccgcagt tgcggtgtat gcaggcaatg tctcagcgac180catcgggcgt actgcgaaag ctcacacggg ctcaacagct ctggcgcacg caccgacggc240tcgacgccgg tccggcgaaa cggaactccg atacggtcc 279<210>48<211>360<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0051303＝Bacterium；ZF0051337＝Methylomonas；ZF0002862＝Streptomyces clavuligerus；ZF0050292＝Bacterium；ZF0051305＝Bacterium；ZF0003513＝Actinomyces；ZF0002351＝Nonomuraearoseoviolacea；ZF0003769＝Actinomyces；ZF0002017＝Streptomyces；ZF0051306＝Bacterium；ZF0002016＝Streptomyces；ZF0003504＝Actinomyces；ZF0006073＝Streptomyces；ZF0003770＝Actinomyces；ZF0002352＝Actinoplanes italicus；ZF0002378＝Streptomycesaureomonopodiales；ZF0006089＝Streptomyces；ZF0006106＝Streptomyces；ZF0051325＝Bacterium；ZF0006108＝Streptomyces；ZF0002440＝Streptomyces；ZF0051302＝Bacterium；ZF0003532＝Actinomyces；ZF0003548＝Nocardiaform；<400>48tgcgggacgg accgcgagat cgcctcgggc atctacgggt gggcgccgcc gggacgcgaa 60cacctcgtcc tcgggcacga atcgctgggc cgagtacgca ccgcgcccga cggcagcggt120ttcgccgccg gtgatctcgt cgtcgggatc gtgcgcaggc ccgatccggt gccgtgcggg180gcgtgtgcgc acggtgagtt cgacatgtgc cgcaacggtg agtacgtcga gcgcgggatc240aagcagatcg acgggtacgg gtcgacgtcg tgggtggtgg acgccgacta cacggtcaag300ctggacccgg cgctcaccga ggtgggtgtg ctgatggaac cgacgacggt gcttggccaa360
<210>49<211>421<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0051303＝Bacterium；ZF0051337＝Methylomonas；ZF0002862＝Streptomyces clavuligerus；ZF0050292＝Bacterium；ZF0051305＝Bacterium；ZF0003513＝Actinomyces；ZF0002351＝Nonomuraearoseoviolacea；ZF0003769＝Actinomyces；ZF0002017＝Streptomyces；ZF0051306＝Bacterium；ZF0002016＝Streptomyces；ZF0003504＝Actinomyces；ZF0006073＝Streptomyces；ZF0003770＝Actinomyces；ZF0002352＝Actinoplanes italicus；ZF0002378＝Streptomycesaureomonopodiales；ZF0006089＝Streptomyces；ZF0006106＝Streptomyces；ZF0051325＝Bacterium；ZF0006108＝Streptomyces；ZF0002440＝Streptomyces；ZF0051302＝Bacterium；ZF0003532＝Actinomyces；ZF0003548＝Nocardiaform；<400>49tgtggtaccg acctgcacat ccggtcctgg gacggatggg cgcagaagac catcgccacc 60ccgctcacgc tcggccacga gttcgtcggc gaggtcgtcg agaccggccg cgacgtgacc120gacatccagg tcggcgacct ggtcagcggc gagggccacc tggtctgcgg caagtgccgc180aactgcctgg ccggccgccg tcacctgtgc cgcgcgaccg tcggcctcgg tgtcggccgt240gacggcgcct tcgccgagta cgtggtgctg cccgcctcca acgtgtgggt gcaccgggtg300ccggtcgacc tcgacgtcgc cgcgatcttc gacccgttcg gcaacgcggt gcacaccgcg360ctctccttcc cgctcgtcgg cgaggacgtg ctggtcaccg gtgccggtac catcggcatc420t421<210>50<211>414<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050197＝Pseudomonas oleovorans；ZF0050294＝Rhodococcus；ZF0050330＝Bacillus，ZF0002852＝Rhodococcus；ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus；ZF0002437＝Streptomyces；ZF0003712＝Micromonospora；ZF0003765＝Streptomyces；ZF0002332＝Streptomyces diatsatochromogenes；ZF0003768＝Actinomyces；ZF0002379＝Streptomyces coelescens；ZF0002443＝Streptomyces；ZF0002442＝Streptomyces；ZF0002436＝Streptomyces；ZF0050994＝Bacterium；ZF0050992＝Bacterium；ZF0050442＝Bacterium；ZF0002049＝Streptomyces；ZF0006069＝Streptomyces；ZF0006075＝Streptomyces；ZF0004724＝Nocardiaform；ZF0002392＝Actinoplanesnipponensis；ZF0002356＝Actinoplanes brasiliensis；ZF0003501＝Actinomyces；ZF0051322＝Bacterium；ZF0006078＝Streptomyces；ZF0006092＝Streptomyces；ZF0006090＝Streptomyces；ZF0006084＝Streptomyces；ZF0006068＝Streptomyces；ZF0050284＝Rhodococcus；ZF0050028＝Agrobacterium tumefaciens；ZF0003540＝Actinomyces；ZF0003528＝Actinomyces；ZF0003529＝Actinomyces；<400>50ggcctgacga tcggccatga accggtgggc gtcatcgaaa agctgggcag cgccgtgacg 60ggttaccgcg agggccaacg cgtgatcgcc ggcgcgatct gccccaactt caattcgtat120gccgcgcagg atggcgcgcc gtcgcaggat ggcagctacc tggtggccag cggcgcatgc180
ggctgccatg gataccgggc cacggccggc tggcgctttg gcaacatcat cgatggcgcc240caggccgaat acctgctggt tcccgatgcg cagggcaatc tggcgccggt tccggacaac300ctgagcgatg aacaggtgct gatgtgcccg gacatcatgt ccaccggctt caaaggcgca360gagaacgcac acatccgcat cggcgacacg gtggcggtat ttgcgcaggg acca 414<210>51<211>432<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050197＝Pseudomonas oleovorans；ZF0050294＝Rhodococcus；ZF0050330＝Bacillus，ZF0002852＝Rhodococcus；ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus；ZF0002437＝Streptomyces；ZF0003712＝Micromonospora；ZF0003765＝Streptomyces；ZF0002332＝Streptomyces diatsatochromogenes；ZF0003768＝Actinomyces；ZF0002379＝Streptomyces coelescens；ZF0002443＝Streptomyces；ZF0002442＝Streptomyces；ZF0002436＝Streptomyces；ZF0050994＝Bacterium；ZF0050992＝Bacterium；ZF0050442＝Bacterium；ZF0002049＝Streptomyces；ZF0006069＝Streptomyces；ZF0006075＝Streptomyces；ZF0004724＝Nocardiaform；ZF0002392＝Actinoplanesnipponensis；ZF0002356＝Actinoplanes brasiliensis；ZF0003501＝Actinomyces；ZF0051322＝Bacterium；ZF0006078＝Streptomyces；ZF0006092＝Streptomyces；ZF0006090＝Streptomyces；ZF0006084＝Streptomyces；ZF0006068＝Streptomyces；ZF0050284＝Rhodococcus；ZF0050028＝Agrobacterium tumefaciens；ZF0003540＝Actinomyces；ZF0003528＝Actinomyces；ZF0003529＝Actinomyces；<400>51tgcgggacgg acctgcacat cctcggaggt gacgtccccg aggtgaccga cgggcgaatc 60ctgggccacg aggccgtcgg gaccgtggtc gaggtgggcg acggcgtaca gacactcgcg120ccgggcgatc gcgtgctcgt ctcgtgtgtc accgcatgcg gtacgtgccg gttctgccgc180gagagccgct acgggcaatg cctcggaggc ggcggctgga tcctcggaca cctgatcgac240ggcacccagg ccgaactcgt ccgagttccg tacgccgaca attcgaccca ccgcatcccc300gacggtgtga gcgacgagca gatgctcatg ctcgccgaca tcctgcccac ctcctacgag360gtcggtgttc tcaacggctg tctccggccg gcggacgtcg tcgtcatcat cggggccgac420gatcggcctc tt432<210>52<211>220<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>52cgtcgacgtc gtcgtcgaca acgcgggatt cggaacacac ggggcattcg tggacgaaga 60tcacgagcgc gtcacgtccg agattcagct caacatcgcc acgctggtcg agctgacaca120cacattcccg cccgaccttc tcaccggccg cggagcactg gtcaacatcg ccagcacagc180gtcgttccag ccgacaccgg gcatggccgt ctactgcgct 220
<210>53<211>226<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>53cgtcgacgtc gtcgtccaca acgccggatt cggaacacac ggggcattcg tggacgaaga 60tctcgagcgc gtcacgtccg agattcagct caacatcgcc acgctggtcg agctgacaca120cacattcctg cccgaccttc tcaccggccg cggagcactg gtcaacatcg ccagcacagc180gtcgttccag ccgacaccgg gcatggccgt ctactgcgcc accaag 226<210>54<211>237<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0003535＝Actinomyces<400>54cgtgtcgacg tcgtggtgca caatgctgcg atcactcaaa aggccacttt tcgcgacatt 60acccccgccg attttgagcg catcctgcgg gtgaacctga ccggcgtctt caacctgagc120caagccgtca ttcccttgat gattcagcgc ggcggaggaa gcatcgtctc gatttcctcg180ctgtcggcgc agaacggcgg ggggatcttc ggcggcgccc actattgcgc aaccaag 237<210>55<211>229<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0003535＝Actinomyces<400>55cgtcgacgtc gtcgtcgaca acgccggtct ggcactgggc acggcccccg cgccgcaggt 60gccgctaaag gactggcaga ccatggtgaa caccaacatc accggtctac tgaacatcac120ccaccatctc ctgccgacac tgatcgaccg taaaggtatc gtcgtcaacc tttcgtctgt180tgccgcgcac tatccctata cgggcggcaa tgtatactgc gcctccaag229<210>56<211>216<212>DNA
<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>56caggggatcg gatacgccac cgcgaagcgg ctgatcagcc tgggtgcgac ggtcgcgatc60ggcgacatcg acgaagccac tctcgcgcga gcagccaagg atttgggcat ccgcacgttc120gggcgcctcg acgtcaccga ccccgcctcg ttcttcgact tcctcgacac cgtcgaaggt180gaactcggcc cgatcgacgt gctgatcaac aacgcg 216<210>57<211>225<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0080310＝Arthrobacter paraffineus<400>57cagcggatcg ggctcgaaat tgcgcgcacc ttcatcaagg aaggcgcgac cgtcgttctc 60ggcgacatca acgaaaccgt gggaacggct gcggtcgccg aactcggtgg agagtcggtc120gcccgtttcg cttcctgcga cgtgcgtgac tccggacagg tcgaggccat gctcgatctg180gccgaaagcg ctttcggtcc agtcgatgtc atgatgaaca acgcg225<210>58<211>216<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0080310＝Arthrobacter paraffineus<400>58caggggatcg gctaccagac cgcgaaggag ctgatccgac gaggtcaccg cgtggccatc 60ggcgacatcg acgaggcacg tgctaaggag accgccgccg aactgggggt taaggttgtc120acccgcctcg atgtcaccga ccctgactcg ttcaaagact ttctcgacct agtcgaggga180gacctcggcc ccctcgacgt gctgatcaac aacgcg 216<210>59<211>222<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0080310＝Arthrobacter paraffineus
<400>59gggatcgggc tcgaaattgc gcgcaccttc atcaaggaag gcgcgaccgt cgttctcggc 60gacatcaacg aaaccgtggg aacggctgcg gtcgccgaac tcggtggaga gtcggtcgcc120cgtttcgctt cctgcgacgt gcgtgactcc ggacaggtcg aggccatgct cgatctggcc180gaaagcgctt tcggtccagt cgatgtcatc gtgaacaacg cg 222<210>60<211>222<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0080310＝Arthrobacter paraffineus<400>60atcgggctcg aaattgcgcg caccttcatc aaggaaggcg cgaccgtcgt tctcggcgac 60atcaacgaaa ccgtgggaac ggctgcggtc ggcgaactcg gtggagagtc ggtcgcccgt120ttcgcttcct gcgacgtgcg tgactccgga caggtcgagg ccatgctcga tctggccgaa180agcgctttcg gtccagtcga tgtcatggtc aacaacgccg gc 222<210>61<211>186<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis<400>61gtgccggtcg cggtcgtgga ccttcacatc gaaagtgcaa aggagaccgt cgcacttatc 60gaatcgcagt acggcacacc cgcgctcgcc cttgaggccg atgtgcgcga ccgcgccgcc120gtgagcgccg ctttcgaagc caccgtcgcc gaatggggac gcttcgacta cctcgtcaac180aacgcc 186<210>62<211>222<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis<400>62ctcggccgtg aaatcgctct caagctcgct tccgaaggcg cctcggtagt ggtcaacgac 60ctcgatcccg aacctgccgc tcagaccgag cgcgatatca aagccacagg tggacaggct120gtctcgtgcg tcggctccgt tgccgaggac gggttcgccg aacgcttcgt gaacactgcc180gtcgaatcat tcggcggact cgacgtcatg gtgaacaacg cg 222
<210>63<211>231<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0002333＝Rhodococcus erythropolis<400>63gcggggctcg gagtggaatt cgctcaccgc ttcgccgctc gcggtgcaaa tctggttctc 60gtcgccaggc gggcagatcg cctcgaagcc ctcgctaccg aactccgcgt cgcccacggc120atcacagtca cagttctgcc tgccgacctg gcggcgcccg gcgtcggcgc aacactgcac180caggagctga caagccgtgg catcaccgtc acctcgctga tcaacaacgc c 231<210>64<211>216<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0003535＝Actinomyces<400>64ccagcggacg gctatcagac agcgaaggag ttgattcgac gaggccaccg ggtcgccatc 60gtcgacatcg acgaggcacg tgcgaagggg gccgccgccg aactcggggt gaaggtcgtc120acccgactcg acgtcaccga acctgactcg ttcacaacgt ttctggacct ggtcgaacgt180gaactcggac ccctcgacat cctggtcaac aacgcg 216<210>65<211>201<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>65gccacggacg gtgcccgcgt cgcggtcgtg gaccttcaca tcgaaagtgc agaggagacc 60gtcgcactta tcgaatcgca gtacggcaca cccgcgctcg cccttgaggc cgatgtgcgc120gaccgcgccg ccgtgagcgc cgctttcgaa gccaccgtcg ccgaatgggg acgcttcgac180tacctcgtca acaacgccgg c 201<210>66<211>201<212>DNA<213>unknown
<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>66gccgcggacg gtgcccgcgt cgcggtcgtg gaccttcaca tcgaaagtgc aaaggagacc 60gtcgcactta tcgaatcgca gtacggcaca cccgcgctcg cccttgaggc cgatgtgcgc120gaccgcgccg ccgtgagcgc cgctttcgaa gccaccgtcg ccgaatgggg acgcttcgac180tacctcgtca acaacgccgg c 201<210>67<211>1047<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>67atgaaggcaa tccagtacgc gagaatcggc gcagaacccg aactcacgga gattcccaaa 60cccgagcccg gtccaggtga agtgctcctg gaagtcaccg ctgccggcgt ctgccactcg120gacgacttca tcatgagcct gcccgaagag cagtacacct acggccttcc tctcacgctc180ggccacgaag gcgccggccg ggtcgccgcc gtcggcgagg gcgtcgaagg actcgacatc240ggaaccaatg tcgtcgtcta cggaccctgg ggctgtggca gctgttggca ctgctcgcaa300ggactcgaaa actactgttc tcgggcaaaa gaactcggca tcaatcctcc tggtctcggt360gcacccggcg cgttggccga attcatgatc gtcgattcac ctcgccacct cgtcccgatc420ggcgacctcg atccggtcaa gacggtgcca ctgaccgacg ccggtctgac tccgtatcac480gcgatcaagc gttcactgcc gaaacttcgc ggtggcgcgt acgccgtcgt catcggtacc540ggcggtctcg gccatgtcgc catccaactc ctccgccacc tctcggcagc aaccgtcatc600gcactcgacg tgagcgcgga caagctcgaa ctggcaacca aggtaggcgc tcacgaagtg660gtcctgtccg acaaggacgc ggccgagaac gtccgcagga tcaccggaag tcagggcgcc720gcactggttc tcgacttcgt cggctatcag cccaccatcg acaccgcgat ggctgtcgcc780ggcgtcggat cggacgtcac gatcgtcggg atcggcgacg ggcaggccca tgccaaagtc840gggttcttcc aaagtcctta cgaggcttct gtgacagttc cgtactgggg tgcccgcaac900gagctgatcg aattgatcga cctggcgcac gccggcatct tcgacatcgc ggtggagacc960ttcagtctcg acaacggcgc cgaagcgtat cgacgactgg ccgccggaac gctcagcggc 1020cgcgcggttg tggtccctgg tctgtag 1047<210>68<211>1047<212>DNA<213>unknown<220>
<221>source
<223>ZF0050310＝Arthrobacter paraffineus<400>68atgaaggcaa tccagtacac gagaatcggc gcagaacccg aactcacgga gattcccaaa 60cccgagcccg gtccaggtga agtgctcctg gaagtcaccg ctgccggcgt ctgccactcg120gacgacttca tcatgagcct gcccgaagag cagtacacct acggccttcc tctcacgctc180ggccacgaag gcgccggccg ggtcgccgcc gtcggcgagg gcgtcgaagg actcgacatc240ggaaccaatg tcgtcgtcta cggaccctgg ggctgtggca gctgttggca ctgctcgcaa300ggactcgaaa actactgttc tcgggcaaaa gaactcggca tcaatcctcc tggtctcggt360gcacccggcg cgttggccga attcatgatc gtcgattcac ctcgccacct cgtcccgatc420ggcgacctcg atccggtcaa gacggtgcca ctgaccgacg ccggtctgac tccgtatcac480gcgatcaagc gttcactgcc gaaacttcgc ggtggcgcgt acgccgtcgt catcggtacc540ggcggtctcg gccatgtcgc catccaactc ctccgccacc tctcggcagc aaccgtcatc600gcactcgacg tgagcgcgga caagctcgaa ctggcaacca aggtaggcgc tcacgaagtg660gtcctgtccg acaaggacgc ggccgagaac gtccgcagga tcaccggaag tcagggcgcc720gcactggttc tcgacttcgt cggctatcag cccaccatcg acaccgcgat ggctgtcgcc780ggcgtcggat cggacgtcac gatcgtcggg atcggcgacg ggcaggccca tgccaaagtc840gggttcttcc aaagtcctta cgaggcttct gtgacagttc cgtactgggg tgcccgcaac900gagctgatcg aattgatcga cctggcgcac gccggcatct tcgacatcgc ggtggagacc960ttcagtctcg acaacggcgc cgaagcgtat cgacgactgg ccgccggaac gctcagcggc 1020cgcgcggttg tggtccctgg tctgtag
权利要求
1.A pe which has the biological activity of an dependentac and which comprises or has one of the followingaacid csthe sce ofthesce ofthe sce ofr a sce which isat leastcal to the sce of，the sce ofthe sce of r asce which is at leastcal to the sce of，the sce ofasce which is at leastidentical to the sce of，the sceof a sequence which is at least cal to the sce of，thesce ofa sce which is at least cal to the sce of，thesce of a sce which is at least cal to the sce of，thesce of a sce which is at leastcal to the sce of S，thesce ofr a sce which is at least cal to the sce of，the sce of a sce which is at least cal to the sce ofS，the sce ofa sce which is at least cal to the sce of，the sce ofa sce which is at leastcal to the sce of，the sce ofa sce which is at leastcal to the sce of，the sce ofa sce which is at least cal to the sce of，the sce of a sce which is at leastcal to the sce of，the sce ofa sce which is at leastcal to the sce of，the sce ofa sce which is at leastcal to the sce of，the sce of a sequence which is at least cal to the sceof，the sce ofa sce which is at least cal to the sceof，the sce ofa sce which is at least cal to the sceofthe sce of a sce which is at leastcal to the sceofthe sce ofa sce which is at leastcal to the sce of，the sce ofa sce which is at least cal to the sequenceof the sce ofa sce which is at least cal to the sceofthe sce ofa sce which is at leastcal to the sce of，the sce ofa sce which is at least cal to the sce ofthe sce of a sce which is at least 70cal to the sceofthe sce ofr a sce which is at leastcal to the sceof，the sce of a sce which is at least cal to the sceofthe sce of r a sce which is at lesst cal to the sceofthe sce ofthe sce of
2.一种核酸分子，其编码权利要求1的多肽。
3.一种核酸分子，其与权利要求2的核酸分子互补。
4.一种载体，其包含权利要求2或3的核酸分子。
5.一种非人宿主，其包含权利要求1的多肽或者权利要求2或3的核酸分子或者权利要求4的载体。
6.权利要求5的宿主，其是一种细胞。
7.权利要求5的宿主，其是一种转基因非人动物。
8.权利要求5-7任一项的宿主，其具有适于辅因子再生的另一个脱氢酶或者编码所述脱氢酶的核酸分子。
9.权利要求8的宿主，其中适于辅因子再生的脱氢酶是甲酸脱氢酶或者葡萄糖脱氢酶。
10.一种反应系统，其包含作为脱氢酶底物的有机化合物、权利要求1的多肽、权利要求4的载体或者权利要求5-9任一项的宿主，及适当地，包含权利要求1的多肽的辅因子。
11.权利要求10的反应系统，其中是脱氢酶底物的所述有机化合物是羰基化合物。
12.权利要求11的反应系统，其中所述羰基化合物是醛或者酮。
13.权利要求12的反应系统，其中所述酮是不对称取代的酮。
14.权利要求10的反应系统，其中是脱氢酶底物的有机化合物是醇。
15.权利要求14的反应系统，其中所述醇是伯醇或者手性仲醇。
16.权利要求10-15任一项的反应系统，其中所述辅因子是NADH、NADPH、NAD+或者NADP+。
17.一种制备权利要求1的多肽或者由权利要求2的核酸分子编码的多肽的方法，该方法包括生长权利要求5-9任一项的宿主及分离所述多肽。
18.一种制备权利要求1的多肽或者由权利要求2的核酸分子编码的多肽的方法，该方法包括从权利要求7-9任一项的宿主的体液或者组织样品中分离所述多肽。
19.一种制备作为脱氢酶产物的有机化合物的方法，所述方法包括将作为脱氢酶底物的有机化合物与权利要求1的多肽、权利要求5一9任一项的宿主反应或者利用权利要求10-16任一项的反应系统进行反应。
20.权利要求19的方法，其进一步包括分离反应产物的步骤。
21.权利要求20的方法，其进一步包括加工所述产物以制备药物。
22.权利要求20的方法，进一步包括加工所述产物以提供二级产物的步骤。
23.权利要求22的方法，进一步包括配制二级产物的步骤以制备药物。
24.权利要求19-23任一项的方法，其中所述产物是对映异构体纯的醇。
25.一种配体，其特异性结合权利要求1的多肽，该配体既不是所述多肽的底物或辅因子，也不是自其产生的产物。
26.权利要求25的配体，其是抗体或其片段或衍生物、适体或者低分子量物质。
27.一种引物，其具有表1所示序列。
28.一个引物对，其具有表1所示的序列，所述引物对的第一个引物作为正向引物，所述引物对的第二个引物作为反向引物以扩增DNA序列。
29.一种试剂盒，其包含；(a)权利要求1的多肽；(b)权利要求2或3的核酸分子；(c)权利要求4的载体；(d)权利要求6-9任一项的宿主；(e)权利要求10-16任一项的反应系统；(f)权利要求25或26的配体；(g)权利要求27中的至少一个引物；和/或(h)权利要求28中的至少一个引物对。
全文摘要
本发明涉及具有NAD－或者NADP－依赖性醇脱氢酶生物活性的新多肽。本发明还涉及编码所述多肽的核酸、非人宿主或者宿主细胞及可用于制备所需产物的反应系统。本发明的多肽优选用于从醛或者酮开始制备伯醇和对映异构体纯的仲醇，所述醇可作为药物的中间体。或者，本发明的多肽也可用于逆反应中，即用于醇的氧化反应形成醛或者酮。
文档编号C12N15/31GK1934250SQ200580009090
公开日2007年3月21日 申请日期2005年3月10日 优先权日2004年3月22日
发明者雷娜特·舒尔策, 帕特里克·洛伦茨, 于尔根·埃克, 奥利弗·迈, 哈拉尔德·格勒格尔, 哈拉尔德·特劳特韦因 申请人:德古萨股份公司