纤维素类生物质的降解中的全细胞生物催化剂的制作方法

纤维素类生物质的降解中的全细胞生物催化剂的制作方法
【专利摘要】本发明涉及纤维素类生物质的降解中的全细胞生物催化剂。本发明涉及在其表面展示纤维素酶的微生物。借助于相应的质粒制备了相应的微生物，所述质粒编码包括信号肽、异源纤维素酶、任选的蛋白酶识别位点、跨膜接头和自转运体的转运结构域或其变体的部分。此类微生物有利地用于将纤维素转化为纤维二糖和/或葡萄糖。从简单的底物转化后的反应混合物中回收该微生物也是可能的。并且，各种微生物的组合被用于从纤维素或木材产生葡萄糖，所述微生物被外切纤维素酶、内切纤维素酶和β-葡糖苷酶定殖。
【专利说明】纤维素类生物质的降解中的全细胞生物催化剂
[0001] 本发明涉及核酸分子，包含以下组分：（1)编码信号肽的部分，（2)编码异源纤维 素酶的部分，（3)编码蛋白酶识别位点的任选部分，（4)编码跨膜接头的部分，以及（5)编码 自转运体（autotransporter)的转运结构域或其变体的部分。
[0002] 本发明另外的方面涉及由如上文描述的核酸分子编码的多肽、展示相应多肽在其 表面的微生物、以及从此类微生物可获得的膜级分（membrane fraction)。本发明还涉及用 于使用微生物或膜级分制备反应产物、尤其是纤维素反应产物的方法，以及还涉及微生物 和/或膜制品用于从由纤维素酶所催化的反应制备产物的用途。
[0003] 纤维素酶是可降解纤维素为它的基本单元β -葡萄糖的酶。纤维素酶仅由降解植 物的生物体诸如例如专门的细菌和鞭毛类的一小部分，以及由降解木材的微生物诸如真菌 所形成。借助于这些酶，相应微生物能够分解并代谢循环纤维素为降解产物并最终降解为 葡萄糖，所述纤维素通常也由3000至15, 000个葡萄糖分子组成。纤维素酶包括特别地三 种酶类型，其联合作用使纤维素分子能够合理消化：
[0004] 1.内切纤维素酶(酶类EC3. 2. 1. 4):这些酶分解纤维素为较大部分并且，不像其他 纤维素酶，还可在纤维素链内工作。尤其，内切纤维素酶在"无定形区"内可变得活跃，其中 所述纤维素分子相对于彼此是无序的。作为该事件的结果，所述酶产生较大量的链末端。
[0005] 2.外切纤维素酶（EC3. 2. 1. 91):这些酶仅将纤维素从其末端分解下来，而不断缩 短纤维素链。外切纤维素酶的反应通常导致纤维二糖单元(二糖)，而且还导致葡萄糖、纤维 三糖或纤维四糖从纤维素链分解下来。
[0006] 3.纤维二糖酶或β -葡糖苷酶（EC3. 2. 1. 21):这组酶分解纤维二糖的两个葡萄糖 分子之间的β -糖苷键，并且从而使葡萄糖可用于进一步的代谢过程。
[0007] 提及的三种酶类型，各自都能够独立攻击纤维素类生物质。然而，假定当所述酶类 型攻击纤维素类生物质的不同天然结构单元时，它们的组合表现高度协同。尤其，当纤维二 糖酶被使用时，可预期降解由内切纤维素酶和外切纤维素酶所提供的纤维二糖、纤维三糖 和其他更高的纤维寡糖为葡萄糖，导致酶促催化反应的平衡的位移，并且因此促使更有效 的转化。
[0008] 纤维素和半纤维素是木材和许多植物的主要成分，并因此代表完全可用的原料 (freely-available raw material)。然而，材料的转化的一个问题在于分解其为例如葡 萄糖的难度，所述问题对材料广泛用于获得生物乙醇造成障碍。在本领域的现有技术中，目 前存在用于分解纤维素为葡萄糖的一些纯化的酶，其通常不得不从真菌培养物诸如里氏木 霉（Trichoderma reesei)或丙酮丁醇梭菌（C. acetobulyticum)中被分离（参见 Shah 等 人，App.Biochem. Biotech. (1991)，第18/29卷，99 - 106)。在用于纤维素类生物质的分 解之前，各个酶的纯化和有效的酶混合物（cocktail)的混合代表在本领域的当今技术中 的重要的成本因素。在本领域的现有技术中从获得的产物中回收相应游离的酶也是不可能 的。因此，对现成（ready-made)形式的纤维素酶存在需求，其首先使简化的制造和混合方 法成为可能，并且其次允许酶在其被使用之后以简单的方式被回收。
[0009] 因此，本发明的一个问题在于提供具有纤维素酶活性的剂，其中该剂不仅对于底 物分子是容易可及的，而且也可以以简单的方式被扩增、回收和再生。这将使数个催化步骤 成为可能，而无需重复制造新剂。本发明的另外的问题在于提供在其遗传学、热稳定性、可 储存性和稳定性方面呈现有利的特性的剂。
[0010] 本发明的发明人惊人地发现，通过使用自转运体系统，纤维素酶可在微生物表面 表达，并且对于用于分解纤维素和随后分离获得的产物的反应条件是足够稳定的。还惊人 地发现，在其表面携带相应纤维素酶的微生物可在不同条件下的各种溶液和缓冲液中长期 被培养并保持稳定。
[0011]自展示代表用于在细菌表面展示重组蛋白质的精妙的工具。此表达系统基于属于 V型分泌系统的自转运体的蛋白家族的分泌机制。
[0012] 在革兰阴性细菌中，形成自转运体通路既用于转运蛋白至细胞表面以及又用于在 细胞外空间分泌蛋白（Jose和Meyer，2007)。自转运体蛋白被合成为前体蛋白，其满足用于 转运至细胞表面的全部结构需求（Jose，2006)。它们被合成具有N-末端信号肽，其通常用 于使能够跨越内膜的Sec-通路。一旦在周质中分解该信号肽后，该前体的C-末端部分将 自身折叠进入外膜作为孔-样结构，称为β-桶。附着载客结构域（passenger domain)的 N-末端通过此孔易位至表面（Jose等人，2002)。在表面，其可被自我蛋白水解分解或通过 其他蛋白酶被分解-或经由转运结构域保持锚定至细胞被膜。
[0013] 通过重组蛋白取代天然载客导致其表面易位。为了这样做，基因工程方法必须被 用于构建人工前体，所述人工前体由信号肽、重组载客、β-桶和两者之间（in between) 的接头区组成，接头区对于无限制的接近表面是必要的。AIDA-I自转运体早已以这种方 式成功地用于各种载客结构域的有效表面展示（Henderson等人，2004)。在自展示系统 中，已观察到活性酶例如二聚酶中的山梨醇脱氢酶上的亚基的自缔合（self-association) (Jose, 2002 ;Jose 和 von Schwichow，2004)。
[0014] 特别地，自展示技术是用于特定蛋白在大肠杆菌（E.coli)和其他革兰阴性细 菌的外膜的表面的表达方法，具有该自展示系统是基于自转运体蛋白的天然分泌机制 (A.Banerjee等人（2002))。在这种情况下，重组载客蛋白的转运可简单地通过使用普通的 基因工程技术将其编码序列插入阅读框而发生，其中其编码序列在自展示载体的信号肽与 易位结构域之间。该信号肽可获自霍乱毒素的亚基，并且其可与人工启动子联合。因此，预 期用于跨越外膜易位的载客蛋白作为与称为自转运体（AIDA-I)的另一个蛋白的重组融合 蛋白在大肠杆菌的外膜表达（Jose, 2006)。自转运体蛋白的C-末端部分在大肠杆菌膜的外 膜内形成孔-样结构（β-桶）（Jose, 1995、2006、2007)。
[0015] 首先由Jose等人（1995)所描述的自展示系统的概念被知晓已超过15年。在此 期间，已显示其可被用于产生呈现期望的活性的细胞：具有固定的腈水解酶在其上的细胞 (参见W02011/057820)和具有氧化还原酶的细胞，所述氧化还原酶转而再生氧化还原因子 尤其是NAD/NADH和NADP/NADPH(参见W02012/025628)。尽管如此，转移该自展示系统至新 的酶类仍对本领域技术人员造成巨大挑战，特别由于在有时是必要的伴侣蛋白不存在时， 不能保证蛋白的正确折叠。迄今为止，本领域的现有技术既没有教导也没有提示使用关于 纤维素酶的固定的自转运体系统。
[0016] 本发明的问题通过独立权利要求的主题被解决。优选的实施方案可来自从属权利 要求。
[0017] 本发明的问题根据第一个方面通过核酸分子被解决，所述核酸分子包含
[0018] (1)编码信号肽的部分，
[0019] (2)编码异源纤维素酶或其变体的部分，
[0020] (3)编码蛋白酶识别位点的任选部分，
[0021] (4)编码跨膜接头的部分，以及
[0022] (5)编码自转运体的转运结构域或其变体的部分。
[0023] 本发明另外的方面涉及由相应核酸分子的转录可获得的蛋白和多肽，以及含有相 应蛋白的微生物及由此类微生物可获得的膜制品。本发明另外的方面涉及用于使用至少一 种纤维素酶制备反应产物的方法，所述方法包含如下步骤：
[0024] (i)展示纤维素酶在其表面的至少一种微生物和/或此微生物的膜制品的制备， 以及
[0025] (ii)在与纤维素酶活性兼容的条件下，引入至少一种微生物和/或膜制品与一种 或多种纤维素酶底物接触。
[0026] 最后，本发明还涉及使用所描述的微生物或膜制品以制造可由纤维素酶催化产生 的反应产物，并且还涉及用于制备相应微生物和膜制品的方法。
[0027] 在本发明一个优选的实施方案中，核酸分子与用于表达调节的序列功能性连接。 在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语"用于表达调节的序列"是指可调节核酸分 子，优选在用于表达调节的序列下游的核酸分子的表达水平的核酸序列。用于表达调节的 序列可以是例如启动子。本领域技术人员熟悉适于表达调节的序列和用于功能性连接这些 序列与核酸分子的方法。关于本发明，表达调节序列是特别优选的，其编码可由诱导物异丙 基硫代半乳糖苷（IPTG)或阿拉伯糖、尤其是L-阿拉伯糖的辅助所活化的表达调节物。
[0028] 在本发明的一个优选的实施方案中，核酸分子为重组质粒的部分。
[0029] 在本发明的一个优选的实施方案中，如本文所用的术语"异源的"是指用遗传工程 方法，例如通过剪接用于表达调节的序列以及待被表达的通常没有在该序列的表达调节的 控制下的序列，或通过使用具有来自原始序列的点突变的序列已被构建的核酸分子。所以， 即使只有构建体的一个部分被描述为异源的，那么这因此暗示整个构建体都是异源的。本 领域技术人员熟悉基因工程方法。在另外优选的实施方案中，如本文所用的术语"异源的" 是指编码多肽的核酸分子，其被剪接至用于表达调节的序列，和/或指融合的序列，其与用 于表达调节的序列来自不同的生物体并且待被表达。在另外优选的实施方案中，如本文所 用的关于纤维素酶多肽的术语"异源的"指核酸分子的部分，所述核酸分子编码与至少一个 另外的部分诸如转运结构域或用于表达调节或跨膜接头的序列获自或取自不同的生物体 的纤维素酶。例如，如果纤维素酶获自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)而所有其他序 列获自大肠杆菌，那么该纤维素酶则是异源的。在另外优选的实施方案中，如本文所用的术 语"异源的"指描述为异源的、源自不同于用于表达或扩增此核酸序列的宿主或预期宿主的 生物体的核酸序列。
[0030] 在一个特别优选的实施方案中，核酸分子包含SEQ ID N0:1、SEQ IDN0:3或SEQ ID NO:5的序列或其变体。
[0031] 在本发明一个优选的实施方案中，如本文所用的术语"信号肽"是指氨基酸序列、 优选在多肽的N-末端的氨基酸序列，当所述多肽在宿主细胞的胞质溶胶中表达时，具有下 述效果：所述多肽被易位至细胞的特定隔室，优选与胞质溶胶不同的隔室。在一个特别优选 的实施方案中，宿主细胞为革兰阴性细菌细胞，并且该信号肽引起新生的或完整的多肽被 易位至革兰阴性细菌细胞的周质或外膜中。
[0032] 在本发明另外优选的实施方案中，如本文所用的术语"蛋白酶-识别位点"指多肽 中特定氨基酸序列模式，其中该序列模式被所述蛋白酶特异性识别，以致所述蛋白酶结合 至多肽并裂解该多肽。
[0033] 在本发明的范围内，如果如本文所用的术语"跨膜接头"指柔性多肽部分，其被用 于连接自转运体结构域与再生氧化还原因子的多肽，而其具有足够柔性以使得再生氧化还 原因子的多肽能够独立折叠和/或转运，那么这也是优选的。
[0034] 在本发明一个优选的实施方案中，术语"自转运体的转运结构域"指可被用于获得 核酸分子的表达产物的结构域，如果其在细胞内部、优选在细菌的细胞质中被核糖体合成， 并且被易位至该细胞的外膜、优选至暴露于细胞外环境的外膜侧。在特别优选的实施方案 中，所述转运结构域具有所述表达产物位于外膜的外表面的效果。在本发明优选的实施方 案中，自转运体的转运结构域是位于细胞的外膜的蛋白，并且编码纤维素酶的部分为结构 域、环或转运结构域的一些其他部分的部分或被融合至其，以便纤维素酶被展示在该细胞 的表面。在本发明另外优选的实施方案中，自转运体的转运结构域为可被用于在细胞表面 展示多肽的系统的蛋白。
[0035] 在优选的实施方案中，氨基酸或核酸序列的变体是明确指在本申请中例如通过名 称或保藏号或甚至通过术语"…的变体"描述的，或隐含指例如通过它们在本发明的背景下 的功能的描述。在优选的实施方案中，如本文所用的术语"变体"包含以下氨基酸或核酸序 列：与用作参考的氨基酸 60%、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 相 同并在可比的条件下，呈现相似的纤维素酶活性。在一个优选的实施方案中，关于氨基酸序 列的术语"变体"包含相对于参考序列具有一个或多个保守氨基酸置换的那些氨基酸序列。 在一个优选的实施方案中，氨基酸序列或核酸序列的术语"变体"包含该氨基酸序列或核酸 序列的活性部分和/或片段。在一个优选的实施方案中，如本文所用的术语"活性部分"指 比全长的氨基酸或核酸序列短但仍保持至少一些其必需的生物活性，如作为纤维素酶的氨 基酸序列或核酸序列。在一个优选的实施方案中，核酸的术语"变体"包含互补链的核酸， 其-优选在严格条件下-与参考核酸杂交。杂交反应的严格性可由本领域技术人员很容易 确定，并且通常是经验计算，作为探针长度、洗涤温度和盐浓度的函数。一般而言，较长的探 针要求较高的温度用于完全退火，而较短的探针则要求较低的温度。当互补链处于具有低 于链的解链点的温度的环境时，杂交通常取决于变性的DNA的复性的能力。探针与杂交序 列之间期望的同源性的程度越高，可被应用的相对温度越高。因此，遵循较高的相对温度趋 向使反应条件更严格，而较低的温度降低这种严格性。杂交反应的严格性的另外的详细内 容和解释可见于Ausubel等人（1995)。在另一个优选的实施方案中，核酸或氨基酸的术语 "变体"是指具有至少达到与参考核酸或氨基酸某个程度相同的生物活性和/或功能的核酸 或氨基酸。在一个优选的实施方案中，如本文所用的核酸序列的术语"变体"指另一个核酸 序列，其编码与参考氨基酸序列相似的氨基酸序列。
[0036] 在一个优选的实施方案中，术语"纤维素酶"是指来自类EC3. 2. 1.4、EC3. 2. 1.91 或EC3. 2. 1. 21的酶。在另外优选的实施方案中，纤维素酶是来自枯草芽孢杆菌或热纤梭 菌（Clostridium thermocellum)的酶。纤维素酶可以为内切纤维素酶、外切纤维素酶或 β_葡糖苷酶。在本发明的范围内，然而，如果其是来自枯草芽孢杆菌的内切纤维素酶、来自 热纤梭菌的外切纤维素酶或来自热纤梭菌的β_葡糖苷酶，那么这是优选的。如果其是具 有根据SEQIDN0 :2、SEQIDN0:4或SEQIDN0:6的序列或其变体的酶，那么这是特别优选 的。
[0037] 优选地，纤维素酶与自转运体的转运结构域融合。
[0038] 根据本发明的自转运体的转运结构域可以为自转运体的任何转运结构域，并且 优选能够形成β-桶结构。β-桶结构的广泛描述和β-桶自转运体的优选实施例公 开于W097/35022,且通过引用形成本说明书的部分。Henderson等人（2004)描述了具 有合适的自转运体结构域的自转运体蛋白（概述可见于Henderson等人，2004中的表 1)。Henderson等人（2004)的公开内容通过引用形成本说明书的部分。例如，自转运体 的转运结构域可选自：Ssp(P09489,粘质沙雷氏菌（S.marcescens))、Ssp_hl(BAA33455， 粘质沙雷氏菌）、Ssp-h2 (BAA11383,粘质沙雷氏菌）、PspA (BAA36466,荧光假单胞杆 菌（P. f luorescens))、PspB (BAA36467，突光假单胞杆菌）、Ssal (AAA80490，溶血性 巴氏杆菌（P.haemolytica))、SphBl(CAC44081,百日咳杆菌（B. pertussis))、AspA/ NalP(AAN71715,脑膜炎奈瑟氏菌（N. meningitides))、VacA(Q48247,幽门螺旋杆菌 (Η· pylori) )、AIDA-I (Q03155,大肠杆菌）、IcsA (AAA26547,福氏志贺氏菌（S. flexneri))、 MisL (AAD16954,肠道沙门氏菌（S. enterica))、TibA (AAD41751，大肠杆菌）、Ag43 (P39180， 大肠杆菌）、ShdA(AAD25110,肠道寒沙门氏菌）、AutA(CAB89117,脑膜炎奈瑟氏菌）、 Tsh(I54632,大肠杆菌）、S印A(CAC05786,福氏志贺氏菌）、EspC(AAC44731，大肠杆菌）、 EspP (CAA66144,大肠杆菌）、Pet (AAC26634,大肠杆菌）、Pic (AAD23953,大肠杆菌）、 SigA(AAF67320,福氏志贺氏菌）、Sat (AAG30168,大肠杆菌）、Vat (AA021903,大肠杆 菌）、EpeA(AAL18821，大肠杆菌）、EatA(AA017297,大肠杆菌）、Espl(CAC39286,大肠杆 菌）、EaaA(AAF63237,大肠杆菌）、EaaC(AAF63038,大肠杆菌）、Pertactin(P14283,百日 咳杆菌）、BrkA(AAA51646,百日咳杆菌）、Tef (AAQ82668,百日咳杆菌）、Vag8(AAC31247， 百日咳杆菌）、PmpD (084818,沙眼衣原体（C. trachomatis) )、Pmp20 (Q9Z812,肺炎衣 原体（C. pneumonia))、Pmp21 (Q9Z6U5,肺炎衣原体）、IgAl 蛋白酶（NP_283693,脑膜 炎奈瑟氏菌）、App (CAC14670,脑膜炎奈瑟氏菌）、IgAl蛋白酶（P45386,流感嗜血 杆菌（H. influenza))、Hap (P45387，流感嗜血杆菌）、r0mpA(P15921，立氏立克次氏 体（R. rickettsii))、r0mpB(Q53047,立氏立克次氏体）、ApeE(AAC38796,肠道沙门 氏菌）、EstA(AAB61674，绿脓杆菌（P. aeruginosa))、Lip-1 (P40601，发光致病杆菌 (X. luminescens))、McaP(AAP97134,卡他莫拉氏菌（M. catarrhalis))、BabA(AAC38081，幽 门螺杆菌）、SabA (AAD06240，幽门螺杆菌）、AlpA (CAB05386，幽门螺杆菌）、Aae (AAP21063， 伴放线放线杆菌（A.actinomycetem-comitans))、NanB(AAG35309,溶血性巴氏杆菌）以 及这些自转运体的变体。对于自转运体蛋白的每一个实例，自转运体可获自其的适合的 GenBank登录号和物种的实例，在括号中给出。在本发明的范围内，自转运体的转运结构域 优选选自包含以下的组：Ssp、Ssp-hl、Ssp_h2、PspA、PspB、Ssal、SphBl、AspA/NalP、VacA、 AIDA-I、IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA、AutA、Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、 Pmp20、Pmp21、AgAl 蛋白酶、App、Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE、EstA、Lip-1、McaP、BabA、SabA、 AlpA、Aae、NanB以及其变体。在一个特别优选的实施方案中，转运结构域为自展示系统，还 称为革兰阴性细菌细胞、尤其是大肠杆菌的AIDA-I类型或其变体的自转运体通路的转运 结构域，例如，由Niewert等人（2001)所描述的那些。
[0039] 以上提及的自转运体序列的变体可通过例如改变在不属于跨膜部分的β -桶的 环结构中的氨基酸序列获得。任选地，编码表面环的核酸可被完全缺失。此外，保守氨基酸 置换可在两亲性的β_折叠片层结构内进行，即将一个亲水性氨基酸置换为另一个亲水性 氨基酸和/或将一个疏水性氨基酸置换为另一个疏水性氨基酸。优选地，变体在氨基酸水 平上与自转运体结构域、特别是在β-折叠片层结构区内的相应的天然存在的序列具有至 少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%的序列同一性。
[0040] 如上所述，本发明的问题在一个方面，通过如上所述的在其表面表达多肽、或使用 如上所述的核酸分子转化的微生物被解决。
[0041] 在一个优选的实施方案中，如本文所用的与术语"宿主细胞"互换使用的术语"微 生物"指能够表达多肽的微生物。这样的微生物也可被称为"全细胞催化剂"或"全细胞生 物催化剂"。在另一个优选的实施方案中，细胞或宿主细胞是原核细胞，优选地革兰阴性细 菌细胞，相当特别优选地大肠杆菌细胞。在另一个优选的实施方案中，细胞是真核细胞。在 另一个优选的实施方案中，细胞或宿主细胞是原核生物的孢子。
[0042] 细菌细胞包含许多隔室，它们彼此通过疏水膜隔开。革兰阳性细菌细胞具有质膜， 其在细胞内部界定胞质溶胶。质膜由肽聚糖层包围。相比之下，革兰阴性细菌除了质膜之 外具有另一个称为外膜的膜。如本文所用的术语"表面"优选指暴露于环境中的微生物的 层，其中该环境是，例如，用作培养感兴趣的细胞的液体培养基。在一个相当特别优选的实 施方案中，根据本发明的多肽在革兰阴性细菌细胞的外膜的外侧被表达。在一个优选的实 施方案中，根据本发明的多肽在革兰氏阴性细菌细胞的外膜的内侧被表达。在另一个优选 的实施方案中，根据本发明的多肽在原生质球的外侧被表达，所述原生质球是外膜已被去 除的革兰阴性细菌细胞。本领域技术人员熟悉可用于制备原生质球的方法。在另一个优选 的实施方案中，根据本发明的多肽在革兰阳性细菌细胞的外侧被表达。因此，如本文所用的 术语"在表面展示"和"在表面表达"，它们是同义的。
[0043] 根据另外的方面，本发明的问题通过膜级分得到解决，该膜级分可获自根据本发 明之前的方面的细胞。
[0044] 在本发明一个优选的实施方案中，可被互换使用的两个术语膜级分或膜制品，包 括根据本发明第一方面的、优选处于催化活性状态的纤维素酶。如本文使用的术语"膜级 分"和"膜制品"优选是指富含膜成分中、优选革兰阴性细菌的外膜的成分的产物。本领域 技术人员熟悉可用于制备膜制品的操作说明和方法。例如，细菌细胞可以从培养物中收获， 并经受通过例如冻融循环、声学上的照射、在裂解缓冲液中重悬等等的裂解，然后通过差速 离心，以分离细胞的膜级分。在本发明一个优选的实施方案中，膜制品是外膜的制品，即其 中相对于其他的膜和隔室例如胞质溶胶、内膜和周质的成分，存在富集的外膜成分的制品。 本领域技术人员熟悉可用于分离或富集外膜或其成分的操作说明和方法，例如细菌细胞的 溶菌酶处理，随后通过离心步骤。在一个优选实施方案中，膜级分可以是处理过的膜级分， 即例如通过纯化膜级分的蛋白成分或通过溶解膜级分和/或摄取膜级分的成分在囊泡中， 膜级分的含量或特性被改良。在本发明一个优选的实施方案中，膜级分可以被固定-例如 在容器或柱的表面。
[0045] 根据另外的方面，本发明的问题通过用于使用至少一种纤维素酶制备反应产物的 方法来解决，该方法包括以下步骤：
[0046] (i)在其表面展示纤维素酶的至少一种微生物和/或此微生物的膜制品的制备， 以及（ii)在与纤维素酶活性相容的条件下引入至少一种微生物和/或膜制品与一种或多 种纤维素酶底物接触。与本发明相关的表述"展示"被理解为是指纤维素酶突出到包围微 生物的培养基或微生物中。
[0047] 根据本发明的方法可被特别有利地应用，如果由纤维素酶催化反应的产物是单 糖，双糖或寡糖，以及如果至少一种纤维素酶的底物是多糖来源、特别优选地纤维素来源。 术语"多糖来源"和"纤维素来源"被理解指含有多糖类或纤维素，优选作为主要成分，但不 一定只包括它们的材料。如果纤维素来源是纤维素，取决于所使用的纤维素酶，可获得葡萄 糖、纤维二糖以及基于葡萄糖的寡糖的所得产物。
[0048] 此外，根据本发明的方法可进一步被有利地应用，如果其包括回收步骤（ii)中所 用的微生物的步骤（iii )。回收可被进行，例如，可以从反应混合物中离心出细胞。
[0049] 在本发明的范围内，其已经呈现了步骤（ii)应优选在4. 5到6. 5的pH范围、特别 优选在5.5至6.5的范围内实施。纤维素酶在相应的pH值下表现出其最高活性。此外，还 证明了在步骤（ii)中选择30°C至80°C的范围、优选为50°C至65°C的范围内的温度是有益 的，因为纤维素酶在该温度范围内表现出最高活性水平。
[0050] 如果在上述的方法中使用了不产生葡萄糖作为最终产物的纤维素酶，那么将产生 的产物转化为葡萄糖可以是有益的，因为在较大体积的纤维二糖的存在下，酶的活性可能 被削弱。因此，在本发明的范围内，在上述方法的步骤（ii)中加入葡糖苷酶是优选的。这 些葡糖苷酶有利地是与微生物无关的酶，特别优选地，这些是来自扁桃（almond)的β-葡 糖苷酶。
[0051] 任何多糖都可用作纤维素酶分解的产物的多糖来源。然而，在本发明的范围内，已 证明如果纤维素来源用作多糖来源则是特别有利的。纤维素来源也可以是具有仅小比例的 外来物质的纯化的纤维素(优选在低于80% /wt的范围内，特别是在小于90% /wt的范围 内）。特别地，其可以是公共废水，该公共废水可被直接使用或使用已知方法可从其中回收 纤维素，并且然后可以由微生物转化。同样，来自木浆厂或造纸厂的含有纤维素的废水可被 用作纤维素来源。然而，使用含有污染物的纤维素来源，诸如例如可被预处理的木材也是可 能的。木材可以有利地是选自松树、落叶松、云杉、山毛榉、桉树、冷杉、白杨、松树、山毛榉、 橡树、白蜡树、栗树、桦树、樱桃树、槭树或胡桃木的木材。本发明范围内的一种优选的木材 是白杨木材。然而，可选地，含有纤维素的一年生植物，例如稻草的残体可被用于根据本发 明的方法作为多糖来源。相应的木材或植物残体可被预处理，例如，以除去它们可能含有的 任何半纤维素。然而，多糖来源可含有显著量的木质素，并且使用含有半纤维素的木材或植 物残体也是可能的。
[0052] 在根据本发明的方法中，在其表面展示特定类别的纤维素酶的微生物的类型可被 使用，但使用在其表面展示多种类别的纤维素酶的微生物的混合物也是可能的。在方法中， 如果至少一种内切纤维素酶和至少一种外切纤维素酶的至少一种混合物被使用，则是优选 的，特别优选的是至少一种内切纤维素酶和至少一种外切纤维素酶和至少一种β-葡糖苷 酶的混合物。在一个特别优选的实施方案中，内切纤维素酶与外切纤维素酶修饰的微生物 的比为25:75至75:25,且最特别优选的是25:75至40:60,混合物不含β -葡糖苷酶修饰的 微生物。在另一个优选实施方案中，该方法使用内切纤维素酶和外切纤维素酶和β-葡糖 苷酶修饰的微生物的混合物，其中特别优选的是以约1:2:1的比存在。内切纤维素酶优选 包含肽序列SEQ ID NO:2。外切纤维素酶，独立于此，优选包含肽序列SEQ ID NO:4。β-葡 糖苷酶，独立于此，优选包含肽序列SEQ ID Ν0:6。
[0053] 本发明另外的方面涉及使用如以上描述的微生物或同样如以上描述的膜级分以 产生由纤维素酶催化的反应的产物。在一个特别优选的实施方案中，产物是纤维素的降解 产物，特别是葡萄糖和/或纤维二糖。
[0054] 在另一个优选的实施方案中，本发明的问题通过用于制备在其表面展示纤维素酶 的微生物的方法得到解决，且该方法包括以下步骤：
[0055] (a)将上述含可操作地连接至核酸分子的表达调控序列的核酸分子插入微生物， 并且任选地
[0056] (b)使该微生物与活化表达调控序列的物质相接触。
[0057] 同样地，本发明的问题通过用于制备膜制品的方法得到解决，所述方法除上述步 骤（a)和（b)外包括从该微生物获得膜制品的后续步骤。该步骤必需的措施与之前描述的 措施相同。
[0058] 在另一个优选实施方案中，本发明的问题通过含有一个或多个上述的在其表面展 示纤维酶素的微生物和/或相应的膜制品的组合物得到解决。
[0059] 本发明还通过以下附图被阐述，所述附图不应被视为限制性的，本发明的其他特 征、实施方案、要点和优势可源自本发明。
[0060] 图1 :自展示盒（autodisplay cassette)的示意性结构。信号肽（SP)用作跨越 内膜的转运。β_桶将自身折叠进入外膜并且将构建体锚定在那里。需要接头以保证载客， 在这一情况下是CipA完全易位至细胞表面。
[0061] 图2 :在诱导型T7-系统(左）和组成型系统(右）中用于Cel5A的表达的质粒的限 制卡（Restriction card)。左侧质粒为pET-lld(Novagen)的衍生物且已被转化进入大肠 杆菌菌株BL21 (DE3)，右侧质粒为pJM007 (Maurer等人，1997)的衍生物且已被转化进入大 肠杆菌BL21。
[0062] 图3 :在诱导型pBAD-系统(左)和组成型系统(右)中用于CelK融合蛋白表达的质 粒的限制卡。左侧质粒为pBAD/glll A的衍生物（Invitrogen)且已被转化进入大肠杆菌 BL21，而右侧质粒为pJM007 (Maurer等人，1997)的衍生物且已被转化进入大肠杆菌BL21。
[0063] 图4 :在诱导型T7-系统(左）和组成型系统(右）中用于BglA融合蛋白表达的 质粒的限制卡。左侧质粒为pET-lld(Novagen)的衍生物且已被转化进入大肠杆菌菌株 BL21 (DE3)，而右侧质粒为pJM007 (Maurer等人，1997)的衍生物且已被转化进入大肠杆菌 BL21。
[0064] 图5 :Cel5A融合蛋白与无义对照（NC)的融合蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3)的表面 表达的比较。外膜蛋白已通过差别细胞分级分离被分离，使用SDS-PAGE(10%的丙烯酰胺） 分开，并使用考马斯亮蓝来染色。Μ :蛋白大小标准。-/+IPTG :未诱导或诱导；WT :宿主菌株。
[0065] 图6 :Cel5A融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)表面展示的证据。外膜蛋白已通过差 别细胞分级分离被分离，使用SDS-PAGE (10%的丙烯酰胺）分开，并且用考马斯亮蓝来染色。 Μ :蛋白大小标准。WT :宿主菌株，PK :蛋白酶K。用PK消化全细胞发生在外膜蛋白的分离之 刖。
[0066] 图7 :在CelK条件下对硝基苯酚盐（p-nitrophenolate)的波谱。在60°C下培养 10分钟及随后碱化后，在柠檬酸钠缓冲液（PH6)中光度测定5mM对硝基苯酚。
[0067] 图8 :诱导型的（pBAD)对组成型的（pJM) Celk活性。在60°C及pH6下用对硝基苯 酚纤维二糖苷持续3分钟培养细胞。培养后、使用碳酸钠进行碱化。在400nm下检测所得 的对硝基苯酚盐。空白：缓冲液+底物(无细胞)。WT:宿主菌株(无质粒)。
[0068] 图9 :用于CelK活性的无义对照（NC)。将细胞与对硝基苯酚纤维二糖苷混合，并 在60°C与pH6下培养。1、2、3和4分钟之后在400nm下检测形成的对硝基苯酚盐。使用碳 酸钠预先进行碱化。WT:宿主菌株。该图显示丽土SD;n=2。
[0069] 图10 :CelK融合蛋白与来自无义对照（NC)的融合蛋白在大肠杆菌BL21上的表 达的比较。外膜蛋白使用差别细胞分级分离被分离，使用SDS-PAGE(10%的丙烯酰胺）被分 开，并使用考马斯亮蓝染色。Μ :蛋白大小标准;WT :宿主菌株。
[0070] 图11 :CelK菌株的储存稳定性。将细胞储存在4°C持续8天，并且然后在60°C与 pH6下通过产生的对硝基苯酚盐的增加在400nm下来测定CelK活性。WT :宿主菌株；NC :无 义对照。该图显示丽土SD;n=3。
[0071] 图12 :CelK融合蛋白在大肠杆菌BL21表面展示的证据。外膜蛋白已使用差别细 胞分级分离被分离，使用SDS-PAGE(10%的丙烯酰胺）被分开，并且用考马斯亮蓝来染色。 Μ :蛋白大小标准。WT :宿主菌株；PK :蛋白酶K。用PK消化全细胞发生在外膜蛋白的分离之 刖。
[0072] 图13 :诱导型ρΕΤ系统与组成型pJM系统中的BglA融合蛋白在大肠杆菌 BL21(DE3)与大肠杆菌BL21的表面的表达。外膜蛋白使用差别细胞分级分离被分离，使用 SDS-PAGE (10%的丙烯酰胺）被分开，并且使用考马斯亮蓝来染色。WT :宿主菌株；n. ind和 ind. :-/+IPTG;M:蛋白大小标准。
[0073] 图14 :诱导型的（ρΕΤ)对组成型的（pJM)BglA活性。在60°C与pH6下使用对硝基 苯酚吡喃葡萄糖苷持续lh培养细胞。培养后，用碳酸钠进行碱化。在400nm下检测所得的 对硝基苯酚盐。空白：缓冲液+底物(无细胞)。WT:宿主菌株(无质粒)。该图显示MW±SD; n=3〇
[0074] 图15 :BglA活性和无义对照（CelK)。将细胞与对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷混合并 在60°C与pH6下培养。15、30、45和60min之后在400nm下检测所得的对硝基苯酚盐。使 用碳酸钠预先进行碱化。宿主菌株大肠杆菌BL21(DE3)被用作对照。空白：缓冲液+底物 (无细胞）。该图显示MW±SD;n=3。
[0075] 图16 :BglA融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)表面展示的证据。外膜蛋白使用差别 细胞分级分离被分离，使用SDS-PAGE(10%的丙烯酰胺）被分开，并且使用考马斯亮蓝来染 色。Μ :蛋白大小标准；WT :宿主菌株；PK :蛋白酶K。用PK消化全细胞发生在外膜蛋白的分 离之前。
[0076] 图17 :ρΗ5与ρΗ6时的CelK活性。在60°C及ρΗ5与ρΗ6下，在400nm下通过对硝 基苯酚盐的增加测定CelK活性。对硝基苯酚纤维二糖苷被用作底物，且宿主菌株大肠杆菌 BL21被用作对照。该图显示MW±SD ;n=3。
[0077] 图18 :Cel5A菌株的CMC酶（CMCase)活性。将Cel5A菌株与宿主菌株大肠杆菌 BL21(DE3)与1%的CMC混合，并在60°C与pH6下培养。在不同的培养时段之后，形成的还 原糖在540nm下通过DNS测定被检测。空白细胞（BZ):仅细胞（无 CMC);空白底物（BS): CMC+仅缓冲液（无细胞）。该图显示丽土SD ;n=3。
[0078] 图19 :在β-葡糖苷酶存在与不存在下的CelK菌株的微晶粉末纤维素酶 (Avicelase)活性。在由扁桃得到的β -葡糖苷酶存在与不存在下（+/_)，将CelK菌株与1% 的微晶粉末纤维素混合并在60°C与pH6下培养。不同的间隔之后，形成的还原糖在540nm 下通过DNS测定被检测。宿主菌株大肠杆菌BL21被用作对照。A:在540nm下的吸收值。 空白细胞（BZ):仅细胞（无微晶粉末纤维素）；空白底物（BS):微晶粉末纤维素+仅缓冲液 (无细胞）。B:由CelK菌株形成的以mg葡萄糖/ml计的还原糖。该图显示丽土SD;n=3。
[0079] 图20 :在微量滴定板规模下自展示纤维素酶的滤纸（FP)活性。在60°C，纤维素酶 与FP板（2. 4mg)以不同的比培养。无 BglA的混合物含有来自扁桃的0. 5U/ml的β -葡糖 苷酶。不同的培养时段之后，形成的还原糖在540nm下通过DNS测定被检测。Α:在540nm 下的吸收值。WT:宿主菌株；空白底物（BS) :FP+缓冲液（无细胞）。B:由纤维素酶形成的 以mg葡萄糖/ml计的还原糖。该图显示丽土SD;n=2。
[0080] 图21 :自展示纤维素酶的滤纸（FP)活性：微量滴定板规模对比标准。将纤维素酶 与2. 4mg滤纸板（微量）或与50mg滤纸条（标准）等份混合并在60°C培养持续3天。形 成的还原糖在540nm下通过DNS测定被检测。A:在540nm下的吸收值。WT:宿主菌株；空 白底物（BS) :FP+缓冲液（无细胞）。B :由纤维素酶形成的以mg葡萄糖/ml计的还原糖。 该图显示MW±SD ;n=2。
[0081] 图22 :通过自展示纤维素酶降解白杨。将纤维素酶以等份混合，并与4%的白杨在 60°C下持续88h培养。形成的还原糖在540nm下通过DNS测定被检测。该图显示丽土SD ; n=2〇 实施例
[0082] 鍵
[0083] 纤维素酶作为"载客"被连接在自展示盒内，从而使蛋白被表达为融合蛋白。图1 显示了此构建体的示意性结构。自展示盒见于各种表达系统，所以为了克隆纤维素酶载客， 首先使用了两种诱导型自展示系统-IPTG (pET-衍生物)和阿拉伯糖（pBAD衍生物)-和组 成型系统（PJM衍生物)。
[0084] 使三种纤维素酶的基因序列适应于大肠杆菌的"密码子使用"并由 LifeTechnologies(GeneArtK Gene Synthesis)合成。优化的基因序列和由其得到的氨基 酸序列在序列表（sequence protocol)中。使用附接的Xho I和Κρη I接口（interface)将 基因插入自展示载体中。对每一种纤维素酶，均使用了诱导型和组成型自展示系统两者。在 诱导型系统的情况下，PET-自展示载体被用于内切纤维素酶Cel5A和β-葡糖苷酶BglA。 由于CelK为2.4kb，是非常大的，pBAD自展示载体用于CelK，因为与pET-自展示载体相比 PBAD自展示载体较小。因此产生的自展示纤维素酶质粒都<10kb，并被总结于表1。各自的 质粒卡显示于图2至图4。
[0085] 表 1 :
[0086]
【权利要求】
1. 一种核酸分子，所述核酸分子包括以下组分： (1) 编码信号肽的部分， (2) 编码异源纤维素酶的部分， (3) 编码蛋白酶识别位点的任选部分， (4) 编码跨膜接头的部分，及 (5) 编码自转运体的转运结构域或其变体的部分。
2. 根据权利要求1所述的核酸分子，特征在于所述纤维素酶是β-葡糖苷酶或内切纤 维素酶或外切纤维素酶，所述纤维素酶优选选自包含以下的组：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)内切纤维素酶、热纤梭菌（Clostridiumthermocellum)外切纤维素酶和热纤梭 菌β-葡糖苷酶。
3. 根据权利要求1或权利要求2所述的核酸分子，特征在于所述自转运体的转运结 构域选自包含以下的组：Ssp、Ssp-hl、Ssp_h2、PspA、PspB、Ssal、SphBl、AspA/NalP、VacA、 AIDA-I、IcsA、MisL、TibA、Ag43、ShdA、AutA、Tsh、SepA、EspC、EspP、Pet、Pic、SigA、Sat、 \^1:4卩6六43七六48卩1433六433〇、百日咳杆菌粘附素、1^'1^、16；1^、\^88、？115)0、？115)20、？115)21、 AgAl 蛋白酶、App、Hap、rOmpA、rOmpB、ApeE、EstA、Lip_l、McaP、BabA、SabA、AlpA、Aae、NanB 和其变体。
4. 根据权利要求1至权利要求3中任一项所述的核酸分子，特征在于其包含可操作地 连接至所述核酸分子的表达调控序列，所述表达调控序列优选地可通过加入异丙基硫代半 乳糖苷（IPTG)或阿拉伯糖被活化。
5. -种由根据权利要求1至权利要求4中任一项的核酸分子编码的多肽。
6. -种微生物，所述微生物在其表面展示根据权利要求5的多肽或已被使用根据权利 要求1至权利要求4中任一项的核酸分子转化。
7. 根据权利要求6所述的微生物，特征在于其是基于革兰氏阴性微生物，优选大肠杆 菌（Escherichia coli)〇
8. -种从根据权利要求6或权利要求7的细胞可获得的膜级分。
9. 一种用于使用至少一种纤维素酶制备反应产物的方法，所述方法包括以下步骤： (i )制备根据权利要求6或权利要求7的微生物或根据权利要求8的膜制品，及 (ii )在与纤维素酶活性相容的条件下，将所述微生物和/或所述膜制品与一种或多种 纤维素酶底物相接触。
10. 根据权利要求9所述的方法，特征在于由所述纤维素酶催化的反应的产物是单糖、 双糖或寡糖，并且所述至少一种纤维素酶的底物为多糖来源，优选地纤维素来源。
11. 根据权利要求9或权利要求10所述的方法，特征在于在4. 5至6. 5的范围内、优选 在5. 5至6. 5的范围内的pH下进行步骤（ii)。
12. 根据权利要求9至权利要求11中任一项所述的方法，特征在于在30°C至80°C范围 内、优选在50°C至65°C的范围内的温度下进行步骤（ii)。
13. 根据权利要求9至权利要求12中任一项所述的方法，特征在于在步骤（ii)中加入 葡糖苷酶。
14. 根据权利要求9至权利要求13中任一项所述的方法，特征在于其包括另外的步骤 (i i i ):回收在步骤（i i )中使用的微生物。
15. -种用于制备在其表面展示重组纤维素酶的微生物的方法，所述方法包括 a)将根据权利要求1至权利要求4中任一项的核酸序列插入所述微生物，及 b )任选地，用活化所述表达调控序列的物质处理所述微生物。
【文档编号】C12R1/19GK104046640SQ201410088359
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2013年3月11日
【发明者】迈克尔·于尔根斯, 安德烈亚斯·罗哈特, 鲁斯·马斯, 塔季扬娜·布罗塞特 申请人:齐鲁斯专利I投资有限及两合公司