细胞饲养层及其在培养人原代肿瘤细胞中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种细胞饲养层，是通过以下方法制备得到的：采用DMEM培养基培养BALB3T3细胞，细胞贴壁培养至铺满培养瓶70%～80%时，进行照射。以3000cGy作为放射剂量进行X线照射；照射后改用改良F培养基进行培养；培养8小时后，所得培养物即为细胞饲养层。所述细胞饲养层可以用于培养人原代肿瘤细胞或肿瘤干细胞。本发明改进了细胞饲养层的细胞类型和制备方法，制备饲养层的3T3细胞较J2细胞容易获得，且在其培养的过程中细胞浓度与状态容易控制。用于培养人原代肿瘤细胞或肿瘤干细胞时，能更好地促进原代肿瘤细胞的生长，获得更高比例的人肿瘤干细胞（CD44阳性细胞数提高约80%）。
【专利说明】细胞饲养层及其在培养人原代肿瘤细胞中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细胞饲养层，及其制备方法，以及在培养人原代肿瘤细胞或肿瘤干细胞中的应用。
【背景技术】
[0002]目前常用的人肿瘤干细胞分离培养方法多采用无血清悬浮培养法，从细胞株中对含量极少的干细胞进行分离培养或者直接购买干细胞株进行悬浮培养，而通过原代肿瘤细胞贴壁培养的方法较难成功分离培养人肿瘤干细胞。
[0003]饲养层在细胞培养中的使用情况:国外有报道使用J2 (3T3细胞的一种亚型)细胞作为饲养层进行肿瘤细胞的原代培养，但未提及使用其进行肿瘤干细胞培养。而且，J2细胞在作为饲养层的过程中需要严格控制其浓度与状态，不易操作，且目前在国内购买不到。
[0004]目前常用的饲养层制备方法:多采用Co60或者丝裂霉素处理细胞制备饲养层，存在以下缺陷:目前国内较难找到Co60放射源；使用丝裂霉素处理饲养层，不同厂家不同批号的丝裂霉素效价浓度较难把握，且存在耐药细胞，甚至致纤维细胞恶性转化。
【发明内容】
[0005]针对上述现有技术存在的缺陷与不足，本发明提供了一种细胞饲养层，及其制备方法，以及在培养人原代肿瘤细胞或肿瘤干细胞中的应用。 [0006]本发明是通过以下技术方案实现的:
[0007]—种细胞饲养层，通过以下方法制备得到:采用DMEM培养基(现有技术中已有的通用常规培养基)培养BALB3T3细胞，细胞贴壁培养至铺满培养瓶70%~80%时，选细胞生长状态好的培养瓶进行照射(按照30%的底面积浓度接种，一般底面积为25cm2的培养瓶2天能够达到所需细胞量)，以2900~3100cGy (优选3000cGy)作为放射剂量进行X线照射(照射时仪器从O开始加量，达到需要的放射剂量立即停止)；照射后的细胞放回培养箱中，改用改良F培养基进行培养(培养条件为常规培养条件，比如:保持温度37°C，CO2浓度为5%)(此时使用改良F培养基进行培养的目的是:促进BALB3T3细胞释放一些有利于人原代肿瘤细胞或者肿瘤干细胞生长所需要的物质，以便于接种之人原代肿瘤细胞或肿瘤干细胞更好地生长)；培养8小时后，所得培养物可用作细胞饲养层。制备好的饲养层在一周之内都可使用，超过一周应以同样方法重新制备。若照射后的BALB3T3细胞暂时不作为细胞饲养层使用，也可收集冻存或用原DMEM培养基继续培养，待使用前8小时左右再换成改良F培养基制备细胞饲养层。
[0008]所述改良F培养基的配方为:DMEM/High Glucose (DMEM高糖培养基)33.33ml ；HAM’ S/F-12培养基66.67ml ;植物源重组人血清白蛋白(Oryzogen，购自武汉禾元生物科技有限公司)3~5mg/mL ;青霉素100U/ml ;链霉素100 μ g/ml ;两性霉素B2.5 μ g/mL ;氢化可的松0.2~0.5 μ g/ml ;胰岛素3~6 μ g/ml ;霍乱毒素B6~10ng/ml ;人表皮生长因子EGF9~12ng/ml ;腺嘌呤22~25 μ g/ml ;Y_27632 (Rho相关的卷曲蛋白激酶抑制剂)7~9 μ mol/L。如表1所示。
[0009]优选的，所述改良F培养基的配方为:DMEM/High Glucose (DMEM高糖培养基)33.33ml ;HAM’S/F-12培养基66.67ml ;植物源重组人血清白蛋白(Oryzogen，购自武汉禾元生物科技有限公司)5mg/mL ;青霉素100U/ml ;链霉素100 μ g/ml ;两性霉素B2.5 μ g/mL ;氢化可的松0.4 μ g/ml ;胰岛素5 μ g/ml ;霍乱毒素B8.4ng/ml ;人表皮生长因子EGF10ng/ml ；腺嘌呤24 μ g/ml ；Y-27632 (Rho相关的卷曲蛋白激酶抑制剂)7 μ mol/L。
[0010]表1改良的F细胞培养液成分及含量
[0011]
【权利要求】
1.一种细胞饲养层，通过以下方法制备得到:采用DMEM培养基培养BALB3T3细胞，细胞贴壁培养至铺满培养瓶70%~80%时，进行照射。以3000cGy作为放射剂量进行X线照射；照射后改用改良F培养基进行培养；培养8小时后，所得培养物即为细胞饲养层。制备好的饲养层在一周之内都可使用，超过一周应以同样方法重新制备。若照射后的BALB3T3细胞暂时不作为细胞饲养层使用，也可收集冻存或用原DMEM培养基继续培养，待使用前8小时左右再换成改良F培养基制备细胞饲养层； 所述改良F培养基的配方为:DMEM/High Glucose (DMEM高糖培养基)33.33ml ；HAM’ S/F-12培养基66.67ml ;植物源重组人血清白蛋白3~5mg/mL ;青霉素100U/ml ;链霉素100 μ g/ml ;两性霉素B2.5 μ g/mL ;氢化可的松0.2~0.5 μ g/ml ;胰岛素3~6 μ g/ml ;霍乱毒素B6~10ng/ml ;人表皮生长因子EGF9~12ng/ml ;腺嘌呤22~25 μ g/ml ；Y-276327 ~9ymol/L。
2.根据权利要求1所述的细胞饲养层，其特征在于:所述放射剂量为3000cGy。
3.根据权利要求1所述的细胞饲养层，其特征在于:所述进行X线照射的具体方式为:照射时仪器从O开始加量，达到需要的放射剂量立即停止。
4.根据权利要求1所述的细胞饲养层，其特征在于:所述采用改良F培养基进行培养的培养条件为:保持温度37°C，CO2浓度为5%。
5.根据权利要求1所述的细胞饲养层，其特征在于:所述改良F培养基的配方为:DMEM/High Glucose (DMEM 高糖培养基)33.33ml ;HAM’ S/F-12 培养基 66.67ml ;植物源重组人血清白蛋白5mg/mL ;青霉素100U/ml ;链霉素100 μ g/ml ;两性霉素B2.5 μ g/mL ;氢化可的松0.4 μ g/ml ;胰岛素5 μ g/ml ;霍乱毒素B8.4ng/ml ;人表皮生长因子EGF10ng/ml ;腺嘌呤 24 μ g/ml ;Y-276327 μ mol/L。
6.权利要求1所述的细胞饲养层的制备方法，其特征在于:采用DMEM培养基培养BALB3T3细胞，细胞贴壁培养至铺满培养瓶70%~80%时，进行照射。以3000cGy作为放射剂量进行X线照射；照射后改用改良F培养基进行培养；培养8小时后，所得培养物即为细胞饲养层。 所述改良F培养基的配方为:DMEM/High Glucose (DMEM高糖培养基)33.33ml ；HAM’ S/F-12培养基66.67ml ;植物源重组人血清白蛋白3~5mg/mL ;青霉素100U/ml ;链霉素100 μ g/ml ;两性霉素B2.5 μ g/mL ;氢化可的松0.2~0.5 μ g/ml ;胰岛素3~6 μ g/ml ;霍乱毒素B6~10ng/ml ;人表皮生长因子EGF9~12ng/ml ;腺嘌呤22~25 μ g/ml ；Y-276327 ~9μ mol/L。
7.根据权利要求6所述的细胞饲养层的制备方法，其特征在于:所述放射剂量为3000cGy。
8.根据权利要求6所述的细胞饲养层的制备方法，其特征在于:所述改良F培养基的配方为:DMEM/High Glucose(DMEM高糖培养基)33.33ml ;HAM’S/F-12 培养基66.67ml ;植物源重组人血清白蛋白5mg/mL ;青霉素100U/ml ;链霉素100 μ g/ml ;两性霉素B2.5 μ g/mL ；氢化可的松0.4 μ g/ml ;胰岛素5 μ g/ml ;霍乱毒素B8.4ng/ml ;人表皮生长因子EGFlOng/ml ;腺嘌呤 24 μ g/ml ;Y_276327 μ mol/L。
9.权利要求1~5中任一项 所述的细胞饲养层在培养人原代肿瘤细胞或肿瘤干细胞中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于:所述人原代肿瘤细胞包括人原代结肠癌细胞。
【文档编号】C12N5/095GK103898043SQ201410088260
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】孙青 , 贾茹, 张建东, 岳龙涛 申请人:山东大学附属千佛山医院