转录因子结合位点调节启动子强度的方法
【专利摘要】本发明提供了一种利用转录因子结合位点调节启动子强度的方法，属于生物化工领域。本发明从酿酒酵母启动子FBA1p中克隆得到一段含有转录因子Rap1、Gcr1和Gcr2的结合位点的核酸序列，通过OE-PCR的方法将这段序列与启动子融合可以调节启动子的强度。本发明创建的方法可以有效的调节启动子的强度，有利于外源基因在代谢工程中的表达。
【专利说明】转录因子结合位点调节启动子强度的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及转录因子结合位点调节启动子强度的方法，属于生物化工领域。
【背景技术】
[0002]随着代谢工程的发展以及合成生物学的兴起，无论是在宿主微生物中移植外源代谢途径还是延长宿主微生物的分支代谢途径，都涉及到多酶催化反应，大部分的研究主要集中于选择合适的酶来催化反应，这主要是因为酶是代谢工程中的首要决定因素，并且酶的来源十分广泛，而且在不同的宿主中表达可能会产生不同的催化特性。但是，选择合适的启动子对于代谢工程同样十分重要，这不仅是由于基因的转录水平是由启动子决定的，而且启动子易于控制调苄基因的转录。
[0003]启动子的选择在代谢工程的设计中是十分重要的组成部分。在大肠杆菌中，通过利用强启动子对其进行代谢途径的改造，成功的在大肠杆菌中生产出1，4-丁二醇、1-丁醇、异丁醇和聚乳酸。在链霉菌中，利用不同的启动子激活其细胞内沉默的基因簇成功的合成出新的抗生素。在酿酒酵母细胞中，利用强组成型启动子过量表达磷酸戊糖途径的相关酶类，使酿酒酵母具有代谢木糖的能力。另外，通过多基因启动子穿梭技术提高了酿酒酵母利用木糖生产乙醇的效率，在引入大肠杆菌的阿拉伯糖降解途径后，使其也可以利用阿拉伯糖进行代谢发酵生产乙醇。半乳糖诱导型启动子在代谢工程中的应用也十分广泛，其中应用最为成功的是利用其在酿酒酵母中高效生产青蒿酸。
[0004]在代谢工程 的实际应用中发现，启动子并不是越强越好，平衡的代谢流才最有利于目标产物的合成，因此不同强度的启动子就显得十分必要，在现有的启动子基础上对其进行改造可以满足这种需求，而主要的改造的方法有以下几种。l)Ep-PCR，Ep-PCR可以在DNA序列中随机的引入突变，在整个启动子的序列内引入随机突变可以建立数目相当的突变启动子文库，在合适的筛选方法下，可以得到强度不同的启动子。通过对酿酒酵母组成型启动子进行随机突变得到了一个强度范围差别15倍的突变启动子库。2)启动子间隔区的饱和突变，对启动子的间隔区进行饱和突变是一种十分有效的方法用于改变启动子的结构从而构建合成启动子文库。通过对大肠杆菌启动子的-35和-10保守区之间和周围的间隔区进行饱和突变可以得到强度不同的启动子。在乳酸链球菌的启动子的间隔区进行饱和突变后可以得到一个强度范围在400倍的人工启动子文库。3)启动子的杂交，启动子杂交的主要目的是将真核生物启动子的增强组件与核心启动子进行融合从而可以理性的增强启动子的转录水平并调控启动子的功能。通过这种启动子杂交的方式构建可以得到启动子强度差异90倍的启动子文库。这种方法除了可以应用在组成型启动子上外，还可以将诱导型启动子的调节元件也进行融合，使组成型的启动子改造成诱导型的启动子。
[0005]在启动子的序列内存在一些转录因子结合位点，细胞内的转录因子通过这些结合位点可以与启动子发生相互作用，增强启动子的强度。通过将这些转录因子结合位点插入到启动子中可以人为的调节启动子的强度，为启动子强度的调控提供技术方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为解决基因表达过程中启动子强度难以调节的问题，提供一种利用转录因子结合位点调节启动子强度的方法。
[0007]为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种利用转录因子结合位点调节启动子强度的方法，从酿酒酵母启动子FBAlp中克隆得到一段含有转录因子RapUGcrl和Gcr2结合位点的核酸序列，通过OE-PCR的方法将这段序列与启动子融合可以调节启动子的强度。
[0008]本发明的调节启动子强度的方法，具有以下优点:[0009]1、本发明创建的方法可以有效的调节启动子的强度，有利于外源基因在代谢工程中的表达。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例，对本发明的【具体实施方式】进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0011]实施例1:转录因子结合位点增强启动子EN02P的强度
[0012]1、从GenBank中查询酿酒酵母基因组中的XI号染色体(GenBankID:BK006944.2)，克隆出 FBAl 基因(GenBank ID:DAA09097.1)上游-495 到-360 区域的序列，此序列为含有转录因子Rapl、Gcrl和Gcr2结合位点的核酸序列。
[0013]引物序列为:
[0014]引物1:5’ >CACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGAATGTGTGGGTCATTACGTA〈3’，下划线序列为与所用的线性质粒pRS41H的重叠序列。
[0015]引物2:5’ >ATAAATACGTTTTTAACAATCAACTCTGGTAGGAAGATAAGGATGCTCACGGCAGCGTG〈3’，下划线序列为与启动子EN02p的重叠序列。
[0016]2、从GenBank中查询酿酒酵母基因组中的VIII号染色体(GenBankID:BK006934.2)，克隆出 EN02 基因(GenBank ID:DAA06866.1)上游-51 到 122 区域的序列，此序列为EN02基因的启动子序列。
[0017]引物序列为:
[0018]引物3:5， >CACTATAGGGCGAATTGGGTACCGGGCCCCCCCTCGAGGTATCTTCCTACCAGAGTTGA〈3’，下划线序列为与所用的线性质粒pRS41H的重叠序列。
[0019]引物4:5’ >TTTCGGGCTCAATTGGAGTCACGCTGCCGTGAGCATCCTTATCTTCCTACCAGAGTTGA〈3’，下划线序列为与转录因子结合位点的重叠序列。
[0020]引物5:5， >CACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATTATTATTGTATGTTATAGTA〈3’，下划线序列为与报告基因eGFP的重叠序列。
[0021]3、从GenBank基因库中查询获得报告基因eGFP基因片段(KF844243.1)，化学合成后扩增获得eGFP基因片段。
[0022]引物序列为:
[0023]引物 6:5’ >CATAACACCAAGCAACTAATACTATAACATACAATAATAATGGTGAGCAAGGGCGAGGA〈3’，下划线序列为与与启动子EN02p的重叠序列。
[0024]引物7:5， >GCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCTTACTTGTACAGCTCGTCCA〈3’，下划线序列为与所用的线性质粒pRS41H的重叠序列。[0025]4、通过OE-PCR将转录因子结合位点与EN02p启动子结合构建修饰启动子EN02p+T，并与报告基因eGFP连接构建表达盒EN02p+T-eGFP，同时将原始的EN02p启动子通过OE-PCR与报告基因eGFP连接构建表达盒EN02p_eGFP。将构建好的表达盒与Sal I和BamH I双酶切后的pRS41H质粒共同电击转入酿酒酵母INVScl中，通过酿酒酵母自身的同源重组实现两个基因表达盒和质粒的连接，外源基因以质粒形式存在，构建酿酒酵母工程菌，具体过程如下:
[0026]利用引物I和引物5，以转录因子核酸序列和引物4、引物5扩增的EN02p启动子序列为共同模板，通过OE-PCR方法构建修饰启动子EN02p+T。
[0027]利用引物I和引物7，以EN02p+T和报告基因eGFP基因片段为共同模板，通过OE-PCR方法构建基因表达盒EN02p+T-eGFP ；
[0028]利用引物3和引物7，以引物3、引物5扩增的EN02p启动子序列和报告基因eGFP基因片段为共同模板，通过OE-PCR方法构建基因表达盒EN02p-eGFP ；
[0029]采用Sal I和BamH I双酶切pRS41H质粒，使其线性化；
[0030]将EN02p+T_eGFP、EN02p_eGFP基因表达盒分别和线性化的pRS41H质粒混合后电击转化酿酒酵母INVScl，由于基因表达盒和线性化质粒之间彼此具有重叠序列，通过酿酒酵母自身的同源重组功能完成基因表达盒和质粒的组装连接，形成质粒pRS41H-EN02p+T-eGFP 和 pRS41H_EN02p-eGFP，获得酿酒酵母转化子。
[0031]5、酿酒酵母工程菌的鉴定
[0032]将上述电击转化后的酿酒酵母INVScl涂布在含有潮霉素B抗性筛选平板上，由于PRS41H质粒含有潮霉素B抗性基因，转化成功的工程菌株在潮霉素B抗性平板上生长，菌落PCR进一步验证筛选获得的阳性酿酒酵母工程菌。
[0033]6、从平板上挑取筛选到的酿酒酵母工程菌单菌落，接种于含有2%的葡萄糖、2%蛋白胨和1%酵母粉的40mL培养基中，300C、170rpm振荡培养36h。利用流式细胞仪检测细胞内eGFP的荧光强度发现含有转录因子结合位点的eGFP荧光强度相比较原始启动子要增强82%，说明转录因子结合位点可以有效提高启动子的强度。
[0034]实施例2:转录因子结合位点增强启动子PYK2p的强度
[0035]1、从GenBank中查询酿酒酵母基因组中的XI号染色体(GenBankID:BK006944.2)，克隆出 FBAl 基因(GenBank ID:DAA09097.1)上游-495 到-360 区域的序列，此序列为含有转录因子RapUGcrl和Gcr2结合位点的核酸序列。
[0036]引物序列为:
[0037]引物 1:5，
【权利要求】
1.一种转录因子结合位点调节启动子强度的方法的建立，其特征在于，从酿酒酵母INVScl的启动子FBAlp中克隆得到一段含有RapUGcrl和Gcr2转录因子结合位点的核酸序列，将这段序列通过OE-PCR的方法与其他启动子融合，可以调节其他启动子的强度。
2.如权利要求1所述的转录因子结合位点调节启动子强度的方法，其特征在于，所述的转录因子结合位点核酸序列来自酿酒酵母其他启动子或者具有相同或相似功能的序列。
3.如权利要求1所述的转录因子结合位点调节启动子强度的方法，其特征在于，所述的转录因子结合位点核酸序列来自大肠杆菌或其他生物中具有相同或相似功能的序列。
4.权利要求1、2、3所述的方法在单基因或多基因激活与转录中的应用。
【文档编号】C12N15/113GK103898113SQ201410088336
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】李春, 李哲, 张根林 申请人:北京理工大学