用饱和染料进行核酸解链分析的制作方法

专利名称：用饱和染料进行核酸解链分析的制作方法
专利说明用饱和染料进行核酸解链分析 发明领域 本发明涉及双链核酸结合染料和在双链核酸结合染料的存在下进行核酸分析的方法。

背景技术：
分析DNA序列变异的方法可以大体分为两类1)对已知序列变体的基因分型和2)对未知变体的扫描。现有多种对已知序列变体进行基因分型的方法，并可以采用使用荧光探针的单一步骤、同质的、闭管的方法(Lay MJ等，Clin.Chem 1997；432262-7)。相反，大部分针对未知变体的扫描技术要求PCR之后的凝胶电泳或柱分离。这些技术包括单链构象多态性(Orita O等，Proc Natl Acad Sci USA 1989；862766-70)、异源双链分子迁移(Nataraj AJ等，Electrophoresis 1999；201177-85)、变性梯度凝胶电泳(Abrams ES等，Genomics 1990；7463-75)、温度梯度凝胶电泳(Wartell RM等，JChromatogr A 1998；806169-85)、酶或化学切割法(Taylor GR等，Genet Anal 1999；14181-6)以及DNA测序。通过测序识别新的突变也要求PCR之后的多个步骤，也就是循环测序和凝胶电泳。变性高效液相色谱(Xiao W等，Hum Mutat 2001；17439-74)涉及将PCR产物注入层析柱。
最近，用于突变扫描的同质荧光方法已有报道。SYBR

Green I(Molecular Probes，Eugene，Oregon)是一种在实时PCR中经常用于监测产物形成(Wittwer CT等，BioTechniques 1997；22130-8)和解链温度(Ririe KM等，Anal.Biochem1997；245154-60)的双链特异性DNA染料。通过使用SYBR

Green I的解链曲线分析，已经在167bp以内的产物中检测到杂合子单一碱基改变的存在(Lipsky RH等，Clin Chem 2001；47635-44)。然而，扩增后在解链分析之前，对PCR产物进行了纯化并添加了高浓度的SYBR

Green I。所述方法中用以检测的SYBR

Green I浓度抑制PCR反应(Wittwer CT等，BioTechniques 1997；22130-1，134-8)；因而，该染料在扩增后添加。希望能有一种能用于检测遗传变异(包括杂合子单个碱基改变)的存在并能在PCR之前加入的染料。
单核苷酸多态性(SNP)是目前为止在人类和其它物种中间观察到的最常见的遗传变异。在这些多态性中，个体之间仅有单个碱基的变化。所述改变可能引起蛋白质中一个氨基酸的改变、改变转录速度、影响mRNA剪接、或对细胞过程没有明显作用。有时在所述改变沉默(例如，在其编码的氨基酸没有改变的情况下)的情况下，SNP基因分型可能仍具有价值，如果所述改变与由另一个遗传改变引起的独特表现型相连(关联的)。
现有多种SNP基因分型的方法。大部分采用PCR或其它扩增技术以扩增感兴趣的模板。可以使用包括凝胶电泳、质谱和荧光在内的同步或后续分析技术。均相(homogeneous)并且不需要在扩增开始后添加试剂或为了分析而对反应物手工取样的荧光技术是具有吸引力的。示范性的均相技术使用寡核苷酸引物来定位感兴趣的区域以及荧光标记或染料用于产生信号。通过使用对DNA变性温度稳定的热稳定酶，示例性的基于PCR的方法是完全闭管的，这样在加热开始以后，不需要进行添加。
对于SNP基因分型可以采用几种闭管的、同质的荧光PCR方法。这些方法包括使用有两个相互作用的发光基团的FRET寡核苷酸探针(邻近杂交探针，TaqMan探针，Molecular Beacons，Scorpions)、仅有一个荧光基团的单一寡核苷酸探针(G-淬灭探针，Crockett，A.O.和C.T.Wittwer，Anal.Biochem.2001；29089-97以及SimpleProbes，Idaho Technology)、以及使用双链DNA染料而不是共价荧光标记的寡核苷酸探针的技术。由于不需要标记的寡核苷酸探针，可以降低设计时间和检测成本，所述染料技术是具有吸引力的。
已经公开了两种使用双链DNA染料的SNP分型技术。可将存在双链DNA染料情况下的等位基因特异性扩增用于实时PCR基因分型(Germer S等，Genome Research2000；10258-266)。在Germer的参考文献的方法中，在存在一条共有反向引物的情况下，两条3’-碱基存在差异的等位基因特异性引物差异扩增一条或另一条等位基因。虽然不需要荧光标记的寡核苷酸，基因分型要求3条引物以及针对每种基因型的两个反应池。此外，需要监测每个循环荧光信号的实时PCR仪。
另一种基于染料的方法不需要实时监测，每种SNP基因型仅需要一个反应池，并使用解链分析(Germer S等，Genome Research 1999；972-79)。在这种方法中，如前面的Germer方法一样，也使用了需要3条引物的等位基因特异性扩增。此外，所述引物中的一条含GC-发夹尾部，以提高一个扩增子的解链温度，使得在一个反应池中通过解链温度进行区分成为可能。PCR扩增后检测荧光，而不需要实时采集。
发明概述 本发明的一个方面提供了一种仅需要标准PCR混合物，包括试剂、引物、以及在PCR前简单添加的本公开的“饱和”双链(ds)DNA结合染料或新型dsDNA结合染料的方法。为了本发明的目的，“饱和”染料是指该染料以为不存在染料情况下由PCR通常产生的双链DNA量(例如约10纳克/微升)提供最大荧光信号的浓度存在时，不会明显抑制PCR反应。虽然所述染料通过其饱和浓度时与PCR的相容性进行鉴别，需要理解的是所述染料能以低得多的浓度使用。扩增过程中或扩增之后，所述染料可以与使用标记引物情况下类似的方式通过解链曲线分析用于区分异源双链分子和同源双链分子(Gundry CN，等，Clin Chem.2003Mar；49(3)396-406)。异源双链分子和同源双链分子的鉴别可以用于包括突变扫描和基因分型在内的多种分析。术语“扫描”是指将一个核酸片段与一个参照核酸片段比较以检测序列上任何差异的存在的过程。表示存在序列差异的阳性结果不一定反映序列变异的确切性质或其在核酸片段上的位置。术语“基因分型”包括检测和确定已知的核酸序列变异，这些变异包括但不限于SNP、碱基缺失、碱基插入、序列重复、重排、倒置、碱基甲基化、短串联重复数；以及在两倍体基因组的情况下，基因组是否是序列变异的纯合子或杂合子，以及一条DNA链上两个或更多序列变异的顺/反位置关系(单体型分析)。任选地，可在解链曲线分析之前的任何时间将一种或多种未标记探针加入该混合物。
术语“未标记探针”指未共价连接于染料并且设计为能完全或部分杂交于靶序列的寡核苷酸或多核苷酸。该混合物中存在的染料不能结合未标记探针或与未标记探针解离，尤其是当探针与靶序列杂交和解链时。本文所用术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”包括天然或修饰的单体或连接(包括能够通过碱基配对相互作用特异性结合靶多核苷酸的脱氧核糖核苷、核糖核苷、肽核酸核苷等)的低聚物和聚合物。任选地，可用一个或多个非荧光部分修饰未标记的探针，这些非荧光部分例如但不限于非荧光小沟结合物、生物素、间隔区、接头、磷酸、碱基类似物、非天然碱基等。在PCR混合物中提供未标记探针的实施方式中，需要未标记探针与结合靶序列的结合不像能抑制扩增的那么紧密。
本发明的另一个方面，鉴别了多种双链DNA结合染料。本发明的双链DNA结合染料能在扩增中或扩增后以对于DNA的充分饱和量存在，同时对PCR的抑制最小化。例如，在最大PCR相容浓度下，双链DNA结合染料具有至少为50％的饱和百分比。在其它实施方式中，所述饱和百分比至少为80％，更具体的至少为90％。在还有其它实施方式中，所述饱和百分比至少99％。需要理解的是，所述饱和百分比是与饱和浓度(也就是在存在预先确定的双链DNA量的情况下提供可能的最高荧光强度的浓度)的相同染料的荧光相比的荧光百分比。举例来说，预先确定的双链DNA量是100纳克/10微升，这是典型的PCR末期到达平台期时产生的DNA量。需要进一步理解到染料制剂可能包含抑制扩增的杂质。这样的杂质应该在确定饱和百分比之前去除。也需要理解的是，饱和百分比荧光强度的测量在与检测结合双链DNA的染料良好匹配的波长处进行，而且如果可能的话，不在能检测到来自游离染料或在高染料-碱基对比率下可能形成的染料结合的二级形式(例如，染料与双链DNA-染料复合物结合或与单链核酸结合)的高本底荧光的波长处检测。
在本发明的还有另一个方面，双链DNA结合染料在最大PCR相容浓度下具有大于50％的饱和度，而且具有可能与常规实时PCR仪不兼容的激发/发射光谱。用于实时PCR分析的“常规”仪器具有介于约450-490纳米的激发波长和介于约510-530纳米的发射检测波长。已经发现某些“蓝色”染料与这些系统兼容，虽然其激发/发射光谱可能有所不同。这样，在本发明的这个方面，提供了一种在PCR过程中或PCR之后使用常规实时PCR仪和双链DNA结合染料分析的方法，其中双链DNA结合染料正如在存在双链DNA的PCR缓冲液中测得的具有介于410-465纳米，尤其是介于430-460纳米的最大激发波长，并具有介于450-500纳米，尤其是介于455-485纳米的最大发射波长。适当的仪器可以使用上述激发/检测区间，或可以按照染料的激发/发射峰值进行改进。检测本发明的“蓝色”染料以及检测如荧光素和SYBR

Green I等常规染料的适当区间可以包括440-470纳米的激发波长和500-560纳米的检测波长。注意到，虽然许多这些染料适合用于标准的实时PCR仪器和解链仪器操作，但调整光学器件以更好地匹配这些染料的激发/发射光谱可进一步提高它们用于定量或定性扩增分析的灵敏度。
在本发明又一方面，通过在一种或多种未标记探针和双链结合染料的存在下进行解链曲线分析进行扫描或基因分型。可在扩增期间或之后、或没有扩增的情况下进行解链曲线分析。染料可以是本公开的饱和染料或新型染料。
虽然这里所提供的实例是针对解链曲线分析的，需要理解的是，本发明的染料可以用于多种包括核酸定量、起始浓度测定、对存在一种核酸的检测、用标记探针的复合检测以及其它基于PCR的方法在内的实时定量PCR分析。
此外，虽然提及的是PCR，其它扩增方法可以与本发明的染料相容。这样的合适的方法包括链置换扩增(SDA)、依赖于核酸序列的扩增(NASBA)、级联滚环扩增(CRCA)、Qβ复制酶介导的扩增、等温和嵌合引物启动的核酸扩增(ICAN)、转录介导的扩增(TMA)等。也可采用不对称PCR。因此，当使用术语PCR的时侯，需要理解为包括PCR的变型和其它可供选择的扩增方法。相对于一条链更有利于扩增另一条链的扩增方法尤其适用于采用未标记探针的解链曲线分析。
而且，虽然参照扩增，但应理解可对未经扩增的核酸样品进行本发明的解链曲线分析。
此外，需要理解双链DNA结合染料包括嵌入剂以及其它与核酸结合的染料，只要所述染料差异结合双链和单链核酸，或产生基于双链核酸数量的差异信号。
因此，在本发明的一个实施方式中，提出了新型染料。新型染料可以是或不是饱和染料，可在扩增期间或之后使用这种新型染料，或者可在进行或未进行扩增的情况下进行解链曲线分析期间使用这种新型染料。例如，该新型染料具有下式
式中 部分

代表任选取代的稠合的单环或多环芳环或任选取代的稠合的单环或多环含氮杂芳环； X是氧、硫、硒、碲或选自C(CH3)2或NR1的部分，式中R1是氢或C1-6烷基； R2选自C1-6烷基、C3-8环烷基、芳基、芳基(C1-2烷基)、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基、亚烷基羧酸酯、亚烷基羧酰胺、亚烷基磺酸酯、任选取代的含杂原子的环状部分或任选取代的含杂原子的非环状部分； t＝0或1； Z是0或1个电荷； R3选自氢、C1-6烷基或芳基羰基，或者R2和R3一起形成-(CH2)w-，式中w是1-5； R9和R10各自独立地选自氢、C1-6烷基或芳基羰基； n＝0、1或2；和 v＝0或1；限制条件是当R2和R3没有一起形成-(CH2)w-时v＝0； 当v＝0时，Q是选自下组结构的杂环
和 当v＝1时，Q是选自下组结构的杂环
式中R4、R5、R6、R7和R8独立地选自氢、卤素、烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、烯基、聚烯基、炔基、聚炔基、烯基炔基、芳基、杂芳基、烷氧基、烷硫基、烷基腈硫基、芳基羰硫基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、二烷基氨基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代；以及各自任选地包含季铵部分的含杂原子的非环状部分、含杂原子的环状部分、BRIDGE-DYE或反应性基团。
例如，在一个实施方式中，R4、R5、R6、R7和R8中至少一个选自芳基羰硫基、环杂烷基羰硫基、二烷基氨基烷基羰硫基、三烷基铵烷基羰硫基、环烷硫基、环杂烷硫基、三烷基铵烷硫基、烷基腈硫基或核苷硫基，以上基团各自可被任选取代。在另一实施方式中，所述染料选自N7、O7、P7、Q7、R7、S7、T7、U7、V7、W7、X7、Z7、K8、P8、T8、W8、X8、Z8、A9、C9、G9、I9、I9Met、J9、J9Met、K9、L9、L9Met、M9、N9、O9、P9、Q9、R9、A10、V10、F11或H11。在一种方法中，将这些染料用于PCR扩增。在另一方法中，将这些染料与靶核酸和未标记的探针一起用于解链曲线分析。这些染料可用于本文所述的各种其它方法。
在本发明的另一实施方式中，提供了一种核酸分析方法，该方法包括以下步骤将靶核酸与饱和dsDNA结合染料和设计以杂交靶核酸一部分的至少一种未标记探针混合，形成混合物，使未标记探针能够杂交靶核酸以形成探针/靶标双链体，在加热混合物时通过测定dsDNA结合染料的荧光产生探针/靶标双链体的解链曲线，以及分析解链曲线的形状。例如，可通过产生导数解链曲线分析解链曲线的形状，例如分析导数解链曲线上一个或多个解链峰的形状和位置。可任选地在靶核酸扩增期间或之后进行此分析。上述饱和染料或其它饱和染料可用于此方法。
在本发明的又一实施方式中，提供了分析靶核酸的试剂盒，该试剂盒包括设计为至少能与靶核酸部分杂交的未标记探针和饱和dsDNA结合染料。该试剂盒可任选地包括其它组分，例如设计用于扩增靶核酸的耐热聚合酶和寡核苷酸引物。
在本发明的另一实施方式中，提供了检测c-kit基因中突变的方法，该方法包括提供含有核酸样品、设计用于扩增c-kit基因的基因座的一种或多种引物对、耐热聚合酶和饱和dsDNA结合染料的扩增混合物，扩增核酸样品以产生扩增子，使扩增子解链产生解链曲线，分析解链曲线的形状。例如，引物包括选自下组的任何引物或全部引物GATGCTCTGCTTCTGTACTG(SEQ ID NO.40)和GCCTAAACATCCCCTTAAATTGG(SEQ ID NO.41)；CTCTCCAGAGTGCTCTAATGAC(SEQ ID NO.42)和AGCCCCTGTTTCATACTGACC(SEQ ID NO.43)；CGGCCATGACTGTCGCTGTAA(SEQ ID NO.44)和CTCCAATGGTGCAGGCTCCAA(SEQ ID NO.45)；以及TCTCCTCCAACCTAATAGTG(SEQ ID NO.46)和GGACTGTCAAGCAGAGAAT(SEQ ID NO.47)。
在又一实施方式中，提供了一种核酸分析方法，该方法包括以下步骤将靶核酸与饱和dsDNA结合染料混合形成混合物，在加热混合物时通过测定dsDNA结合染料的荧光产生靶核酸的解链曲线，该混合物中包括设计为能与靶核酸的一部分杂交的第二种核酸，第二种核酸小于靶核酸并且解链温度与靶核酸不同，使第二种核酸与靶核酸的部分杂交，使第二种核酸与第一种核酸解链，以及分析解链曲线的形状。在一个实施方式中，第二种核酸是可在产生靶核酸的解链曲线之前或之后加入的未标记探针，而在另一实施方式中，第二种核苷酸是较小的扩增子，例如可在扩增靶核酸的单一混合物中产生的扩增子。
本发明另一实施方式是一种PCR分析方法，该方法包括以下步骤将dsDNA结合染料与含有未知起始量的靶核酸和设计用于扩增靶核酸的引物的样品混合，形成混合物，在dsDNA结合染料的存在下扩增靶核酸，在多个扩增循环期间的整个温度范围中监测dsDNA结合染料的荧光以产生多个解链曲线，用该解链曲线定量靶核酸的起始量。在扩增期间可使用未标记探针和/或饱和染料。
本领域技术人员通过理解以下说明性实施方式的详述后，可明白本发明的其它特征。
附图简要说明

图1显示了使用染料S5的因子V Leiden的基因分型。显示了解链曲线的负一阶导数(-dF/dT)。
图2显示了解链分析之前冷却速度对异源双链分子检测的影响。
图3显示了解链分析过程中加热速度对异源双链分子检测的影响。
图4A-B是使用工程质粒在一个位置上所有可能SNP基因型的标准化高分辨率解链曲线。分析了各基因型的三个样品，包括四个纯合子(图4A，——A/A、-·-T/T、——-——C/C、|||||||||G/G)和六个杂合双链体(图4B，——|——A/T、——--——A/C、|||||||||C/T、-|-A/G、——G/T、——--——C/G)。
图5A-D显示了基因分型方法的比较；图5A显示了囊性纤维化示意图，其中一条引物上任选标记的位置用星形(★)标出，图5B显示了使用标记引物的基因分型，图5C显示了使用染料S5的基因分型，图5D显示了使用SYBR

Green I的基因分型尝试(纯合子—--—wt，——F508del，杂合子—·—F508del，—-—I507del，----F508C)。
图6显示了在更长的扩增子上使用染料S5的基因分型(—--—纯合子(TT)，——纯合子(CC)，—·—杂合子(TC))。显示了三个个体(不是导数)的解链曲线。
图7A-B显示了使用SYBR

Green I(图7A)和染料S5(图7B)的DNA混合物的导数解链曲线。
图8显示了多种类型DNA样品存在时的非线性荧光变化。图上显示了染料S5(○)和SYBR

Green I(■)。
图9A-B显示了用于测定饱和百分比的染料滴定，图9A中◆-SYBR

Green，■-SYBR

Gold，▲-Pico Green；图9B中○-染料S5，■SYTOX

Green。对于SYBR

Green和染料S5的示例性PCR范围用阴影框表示。
图10显示了染料浓度对解链温度的影响。
图11A-B显示了染料S5(图11A)和SYBR

Green I(图11B)的激发和发射光谱。
图12A-D显示了β球蛋白110bp的片段中6种不同基因型(—-—SS、——AA、—--—CC、—·—SC、..........”AC、-·-·-AS)一式四份样品的高分辨率解链曲线分析。图12A显示了从每种基因型一式四份样品的高分辨率解链获得的原始数据；图12B显示了6种基因型一式四份样品的经过标准化处理的高分辨率解链曲线；图12C显示了6种基因型一式四份样品的温度变动、标准化的、高分辨率解链曲线。样品温度变动以重叠5％和10％之间的荧光；图12D显示了由图12C的数据得到的荧光差异曲线。每条差异曲线通过从标准(AA)曲线中扣除每种样品以获得差异数据。当采用一式四份样品时，由于重叠的关系，在有些情况下看起来少于4份样品。
图13A显示了人5-羟色胺受体2A(HTR2A)基因544bp片段的3种基因型的重复样品的解链曲线分析(—-—TC，——CC，—--—TT)。已使用10％和20％之间的荧光部分对数据进行了标准化和温度变动处理。图13B.为同源双链分子的理论解链示意图。单核苷酸多态性位点用(X)标出。
图14显示了囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)基因612bp片段的6种基因型的差异曲线。通过30％和40％之间荧光部分的叠加对图进行了标准化和温度变动处理，并从一种野生型图中扣除。
图15显示了参照CEPH的犹他家族1331的家系图。犹他家族1331的HLA-A基因型如下A02011；B3101；C2402101；D03011；E01011。对每个个体进行了编号。女性(圈)；男性(方框)。
图16A-B显示了犹他家族1331成员的解链曲线。在17个家族成员中，存在着代表HLA-A外显子2的6种基因型的6条不同的解链曲线。图16A显示了完整的解链曲线，图16B显示了放大的部分(表示在16A方框中)并在圆括号内注明了基因型和个体。
图17显示了通过混合(——BM15，—--—BM16，-----BM15+BM16)对两个样品基因型的确定。两个纯合子样品BM15(0101)和BM16(0201)在HLA-A外显子2上有15bp的差异。分别检测时BM15和BM16的解链曲线是相似的，但在混合时，15bp的错配使解链曲线发生偏移。
图18A和B显示了不对称PCR之后用未标记探针进行基因分型的优化实验的结果。图18A显示了用各种引物比进行扩增的结果(|||||||||对称(各引物0.5μM)；·····对称(无模板对照)；——(细)0.05μM正向引物和0.5μM反向引物；——(粗)0.5μM正向引物和0.05μM反向引物；----(细)0.5μM正向引物和0.025μM反向引物；----(粗)0.025μM正向引物和0.5μM反向引物；—-—(细)0.5μM正向引物和0.01μM反向引物；—-—(粗)0.01μM正向引物和0.5μM反向引物)。图18B是显示探针解链峰的导数解链曲线(|||||||||对称(各引物0.5μM)；----0.05μM正向引物和0.5μM反向引物；——0.5μM正向引物和0.05μM反向引物)。
图19与图18B相似，显示不对称扩增后的解链峰(|||||||||对称(各引物0.5μM)；实线0.5μM正向引物和0.05μM反向引物；----0.5μM正向引物和0.025μM反向引物；——-——-0.5μM正向引物和0.01μM反向引物)。
图20是显示长度为14-30个核苷酸的未标记探针的解链峰的导数解链曲线。
图21A-D是显示未标记探针的测试系统中解链峰的导数解链曲线。图21A显示采用染料D6时4个纯合子各自的导数解链曲线；图21B显示采用染料D6时A纯合子以及A/G、A/T和A/C杂合子的导数解链曲线；图21C显示采用SYBR

Green I时A纯合子以及A/G、A/T和A/C杂合子的导数解链曲线；图21D显示采用染料D6时A纯合子以及G/T、C/G和C/T杂合子的导数解链曲线。
图22A-B是显示采用未标记探针时各种囊性纤维化突变的解链峰的导数解链曲线。
图23是显示采用两种不同的未标记探针时囊性纤维化SNP突变的解链峰的导数解链曲线。
图24是显示在相同反应中采用两种未标记探针时囊性纤维化突变F508del和Q493V的解链峰的导数解链曲线。
图25A-B是包括囊性纤维化G542X基因座的PCR扩增子的解链曲线，其中同时对样品进行通过扩增子解链的扫描突变和通过探针解链进行基因分型。图25A显示了75℃-83℃(扩增子解链特性)的数据的荧光-温度图。插图是方框表示的曲线部分的放大图。图25B显示58℃-72℃(探针解链特性)的数据的导数图，-野生型；···G542X纯合子；---G542X杂合子。
图26说明在LightCycler上编程用于监测各扩增循环中的未标记探针/靶标双链体解链的PCR参数。显示了两个PCR循环。在退火和延伸之间连续监测各循环的荧光(用实线表示)。
图27显示采用未标记探针和染料N7时在PCR各循环期间获得的导数解链曲线。峰高随循环数而增加。该样品中模板DNA的起始浓度为105拷贝/10μl。
图28A-D显示了对PCR各循环期间获得的荧光数据的分析。图28A显示了在61℃(反映出反应中总dsDNA的量，■)和73℃(反映出扩增子量，□)获得的数据的循环数-荧光图。图28B显示了循环数与解链峰面积的图(▲)以及循环数与由导数数据计算的解链峰顶点与恰好在解链转变之前之差的图(△)。图28C显示了三种不同起始模板浓度下循环数-解链峰面积图(▲-104拷贝/10μl；■-105拷贝/10μl；□-106拷贝/10μl)。图28D显示了起始模板浓度的对数与衍生自图28C的各样品交点的图。
图29-32显示对各种胃肠道基质肿瘤(GIST)突变进行基因分型的解链曲线，各自与正常的野生型扩增子作比较。图29显示杂合SNP(——正常，----GIST 1)，图30显示纯合的12bp缺失/SNP(——正常，----GIST 2)，图31显示杂合串联复制(36bp)(——正常，----GIST 3)，图32显示杂合缺失(54bp)(——正常，----GIST4)。
发明详述 由于SYBR

Green I在PCR过程中表现出荧光的巨大变化，SYBR

Green I成为一种广泛用于解链分析的染料(Wittwer CT等，Biotechniques 1997；22130-1，134-8；Wittwer CT等所著《实时PCR》(Real-Time PCR)，见Persing D等编，DiagnosticMolecular MicrobiologyPrinciples and Applications，ASM出版社，2004，印刷中)。SYBR

Green I最初在解链分析中用以区分Tm值差别2℃或更大的不同PCR产物(Ririe KM等，Anal Biochem 1997；245154-160)。随后，将SYBR

Green I用于鉴别碱基缺失(Aoshima T等，Clin Chem 2000；46119-22)、基因型二核苷酸重复(MarzilianoN等，Clin Chem 2000；46423-5)以及鉴别多种序列改变(Lipsky RH等，Clin Chem2001；47635-44；Pirulli D等，Clin Chem 2000；461842-4；Tanriverdi S等，J ClinMicrobiol.2002；403237-44；Hladnik U等，Clin Exp Med.2002；2105-8)。然而，基因型之间Tm差异可能很小并可能挑战现有仪器的分辨率。事实上，已经认为SYBR

Green I“不能在常规基因分型应用中使用”(von Ahsen N等，Clin Chem 2001；471331-1332)。采用通常使用的双链特异性DNA染料的解链曲线基因分型可导致随着解链转变区间加宽的Tm值提高(Douthart RJ等，Biochemistry 1973；12214-20)和基因型之间Tm差异的压缩(图5D)。这些因素降低了SYBR

Green I用于区分基因型的能力。
杂合的DNA由4种不同的单链组成，这些单链在变性并冷却时能产生2种同源双链分子和2种异源双链分子。理论上，所有4种产物具有不同的Tm值并且解链曲线应该是所有4种双链向单链转变的合成。然而，双链特异性DNA染料可能在解链过程中重新分布(Aktipis S等，Biochemistry 1975；14326-31)，这引起染料从低解链温度的异源双链分子上释放并重新分布在更高解链温度的同源双链分子上。因为在与PCR相容的浓度下SYBR

Green I没有饱和(Wittwer CT等，Biotechniques 1997；22130-1，134-8；图9)，这样的重新分布是可能的并与缺少异源双链分子解链转变相一致(图5D)。
本发明染料能在基因分型和扫描的应用中使用。在仅扩增一种PCR产物并且序列是纯合的情况下，只形成同源双链分子。使用本发明的染料，不同同源双链分子之间Tm值差异没有被压缩(图5C)，并且可以显著区分基因型，即使是SNP。本发明染料也可以用于鉴别和区分反应中存在的多种产物，例如通过纯合的多个基因基因座或多个目标的扩增而产生的同源双链分子。相反，大概是由于染料的重新分布，使用SYBR

Green I在大多数情况下只能观察到少数产物(见图7A)。
当扩增一个或多个杂合靶标时，使用本发明的染料可以容易地观察到异源双链分子。检测并鉴定异源双链分子的能力对于检测杂合基因型以及扫描未知突变来说尤其有用。采用用于实时PCR的诸如SYBR

Green I、SYBR

Gold以及溴化乙锭等不能观察到其中异源双链分子产物的传统双链DNA染料是不可能实现这一点的。
在解链过程中，异源双链分子的链可以与其完全互补的链重新结合并形成同源双链分子。由于在PCR结束时产物浓度很高，这一重新结合过程快速发生。通过限制产物处于其解链温度附近(尤其是处于异源双链和同源双链产物Tm值之间)的时间，所述的重新结合能被最小化。除了解链过程中链的重新结合，链与其完全匹配的或错配的互补链的选择性杂交受到冷却速度的影响。在这里所表示的条件下，快速冷却最有利于异源双链分子形成，而在低于-0.1℃/秒的速度下，异源双链分子经常会消失(图2)。这与变性HPLC技术相反，后者的冷却速度慢得多(-0.01至约-0.02℃/秒)，却仍有效形成异源双链分子(Xiao W等，Hum Mutat 2001；17439-74)。同源双链分子和异源双链分子形成的相对速度也许非常依赖于产物大小，使用小的扩增子获得的结果对于dHPLC中更通常使用的更大的产物而言可能不具有典型性。
通过以更低的速度解链、花费更多的分析时间，可以提高纯合基因型之间的辨别力。DNA浓度对Tm的影响是解链曲线基因分型中潜在误差的一个来源。在PCR条件下使用50％GC含量的随机100bp的扩增子时，0.05μM和0.5μM的产物之间Tm值差异约为0.7℃(von Ahsen N等，Clin Chem 2001；471956-61；Wetmur JG，Grit RevBiochem Mol Biol 1991；26227-59)。当不同纯合基因型的Tm值非常接近的时候，这一改变可能是重要的。然而，不同PCR样品趋向于以相同产物浓度达到平台期，因此扩增后浓度差异通常是最小的。同时，可以通过实时荧光估计扩增子浓度并为获得甚至更高的基因分型精度调节Tm值。另外，可以使用不对称PCR自动限制PCR产物的终浓度。
用本发明染料有可能将所有单个碱基杂合子与纯合子加以区分。在杂合子检测中，绝对解链温度和DNA浓度的影响不象使用涉及到区分纯合基因型的方法那么重要。异源双链分子影响解链曲线的形状，尤其是在转变的“早期”低温部分。通过平移X轴重叠解链转变的“晚期”高温部分，可使得不同的解链曲线温度匹配。然后可以以更高的精确度推断异源双链分子是否存在。因此，即使在未经PCR扩增的样品中，对DNA浓度的关注可能并不重要。
无论仪器的精确度如何，有些基因型的Tm值会是几乎相同的。检测具有相同Tm值的纯合变异的一种方法是将变体共同混合。获得的异源双链分子会在比纯合子更低的温度下解链，在标准化的解链曲线中表现出在主要解链转变之前的下降。
因而，使用目前可以利用的PCR扩增装置，本发明染料可以在解链曲线转变中鉴别目前不能用SYBR

Green I鉴别的异源双链分子。图7A中说明了SYBR

Green I不能简便地鉴别低温解链转变的一个可能原因。当存在几个稳定性递增的DNA片段时，使用SYBR

Green I的低温峰与使用染料如染料S5(结构见实施例1)的相比很小。在解链过程中，SYBR

Green I可能从低温双链分子上释放，只连接于在更高温度下解链的双链。这引起每个后继的峰比前一个高，使得最低温度的峰即便能够观察到也很小。正如图7B中所看到的，用染料S5可容易地检测到低温解链的产物，而用SYBR

Green I却不能检测到。
使用染料S5的优点导致了对其它与PCR相容并在PCR相容浓度下适于基因分型的双链DNA染料的区别。许多用于本发明的方法中的染料属于花青家族。花青染料是在连接两个含氮杂环的链上含一个或多个二价“-C(R)＝”部分的那些染料。基团“R”可能是氢或任何碳取代基，例如氢或烷基，包括可以被任选取代的C1-6烷基。需要理解的是在其中有一个以上二价“-C(R)＝”部分的花青染料中，每个“R”可以是独立选择的。正如由这里所述的说明性通式所进一步定义的，这样的花青染料可以是单体或二聚体。许多花青染料，例如二价部分是＝N-、-C(R)＝N-等的染料也很合适。除了花青染料，预计其它dsDNA结合染料家族也可用于本文所述的PCR反应混合物、方法和组合物，这些家族包括但不限于吖啶基染料、菲啶鎓插入剂和菲咯啉基金属插入剂。
用于本文所述PCR反应和解链曲线混合物、方法和组合物的示例性染料包括PO-PROTM-1、BO-PROTM-1、SYTO

9、SYTO

43、SYTO

44、SYTO

45、SYTOX

Blue、POPOTM-1、POPOTM-3、BOBOTM-1、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、JO-PROTM-1、YO-PRO

-1、TO-PRO

-1、SYTO

11、SYTO

13、SYTO

15、SYTO

16、SYTO

20、SYTO

23、TOTOTM-3、YOYO

-3(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)、GelStar

(Cambrex Bio Science Rockland Inc.，Rockland，ME)、噻唑橙(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)、EvaGreenTM(Biotium，Hayward，CA)、BEBO、BETO、BOXTO(TATAA Biocenter AB.，

Sweden)和本文所述的各种新型染料，其中大部分是饱和染料。
用于本文所述PCR反应混合物、方法和组合物的示例性花青染料也包括具有吡啶鎓、嘧啶鎓、喹啉鎓、异喹啉鎓或嘌呤鎓核心结构的不对称花青的单体或二聚体，以及具有通式I所述结构的那些花青染料
式I 式中 部分

代表任选取代的稠合的单环或多环芳环或含氮杂芳环； X是氧、硫、硒、碲或选自C(CH3)2或NR1的部分，式中R1是氢或烷基，包括C1-6烷基和C2-6烷基； R2是包括C1-6烷基和C2-6烷基的烷基、包括C3-8环烷基的环烷基、芳基、包括芳基(C1-3烷基)的芳烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单烷基氨基烷基和二烷基氨基烷基、三烷基铵烷基、烷基和芳基羰基、烷基和芳基羧酰胺、烷基和芳基磺酰基、亚烷基羧酸酯、亚烷基羧酰胺、亚烷基磺酸酯、亚烷基磺酸酯等、含杂原子的环状部分、或者含杂原子的非环状部分，这些基团各自可被任选取代；示范性含杂原子的部分包括任选取代的杂烷基，包括甲氧基甲基、乙氧基乙基等；杂环基，包括哌啶基等；烷基磺酸酯和芳基磺酸酯，包括甲基磺酸酯、4-氯苯基磺酸酯等；烷氧基，包括甲氧基、乙氧基等；氨基，包括甲基氨基、二甲基氨基等；羰基衍生物，包括烷基羰基和芳基羰基、烷基氨基羰基、烷氧基羰基等；杂烯基，包括烯基氨基烷基、烯氧基烷基、烷基氨基烯基、烷氧基烯基、亚烷基氨基烷基等；杂烯丙基(heteroallyl)；酯；胺；酰胺；磷-氧键和磷-硫键；包括含有杂原子的部分，如美国专利号5,658,751和PCT
发明者C·T·威特沃, L·周, V·E·杜乔勒斯, J·A·霍尔登, C·威尔默-佩尼 申请人:犹他大学研究基金会, 爱达荷州技术股份有限公司