Bim凋亡效应的最小核心序列及其制备和应用的制作方法

专利名称：Bim凋亡效应的最小核心序列及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，本发明涉及Bim家族致凋亡效应最小核心部件(BCU)和以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR(BCU Based Pro-apoptoticRamification)，以及编码此多肽的多核苷酸序列。本发明还涉及以BCU蓝本构建的重要衍生物的多核苷酸和多肽的制备方法和应用。
背景技术：
Bim是细胞线粒体凋亡途径中的重要促凋亡蛋白，具有BH3 domain，归属BCL-2亚家族成员，不仅可以感应传递细胞内外的凋亡信号，而且可以直接拮抗BCL-2家族中凋亡抵抗分子，如Bcl-2，Bcl-xl等，从而启动细胞凋亡程序，同时还可以与BCL-2家族中的多domain的促凋亡分子Bax、Bak等结合生成异聚体，从而攻击线粒体的外膜，形成孔径结构，使得细胞致死因子，如Cytochrome C等的释放从而直接导致细胞凋亡。细胞凋亡在机体生长发育、衰老及免疫等重要生命功能中发挥着至关重要的作用，同时，也直接影响到众多疾病的发生、发展和演变。Bim家族致凋亡效应最小核心部件(BCU)的确立也为研究确定该家族蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础。同时，Bim家族致凋亡效应最小核心部件(BCU)及以BCU为蓝本构建的重要衍生物(BBPR)将构成开发疾病诊断和/或治疗药物的重要基础或设计蓝本，因此分离其编码DNA是非常重要的。

发明内容
本发明的一个目的是提供分离Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU方法及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR多肽以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一个目的是提供编码Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的多核苷酸。
本发明的再一个目的是提供含有编码Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的重组载体。
最后本发明还提供上述Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR多肽的应用。
本发明的发明人曾发现Bim家族中仍具有致凋亡效应的最小异构体Bimbeta5，本发明进一步确定导致细胞凋亡的最小核心功能单位。具体方法是根据Bimbeta5的核酸序列(SEQ.ID.NO.1)设计一系列引物，通过不同的组合，表达生成bim的5’端方向或/和3’端方向的缺失的人工异构体。再通过对这一系列的人工异构体的致细胞凋亡效应的检测，从而得到在删减突变中，最小核心功能单位BCU(SEQ.ID.NO.21)及具有不同致凋亡效应的人工异构体，也就是被定义为以BCU为蓝本构建的一系列重要衍生物BBPR多肽。在研究分析组成BCU及BBRP多肽中的氨基酸重要属性及潜在作用机制时，发现一些重要的结构会直接影响BCU和BBRP的致凋亡效应，因而，对其中一些重要氨基酸进行突变或增减又形成了具有重要开发价值的以BCU为蓝本的类似物和衍生物。
关于最小异构体Bim bete5参见下述文献Int J Biochem Cell Biol.2004 Aug；36(8)1554-61.
Over-expression of Bim alpha3，a novel isoform of human Bim，result in cell apoptosis.
Chen JZ，Ji CN，Gu SH，Li JX，Zhao EP，Huang Y，Huang L，Ying K，Xie Y，Mao YM.
State Key Laboratory of Genetic Engineering，School of Life Sciences，Fudan University，Shanghai200433，PR China.
本发明通过功能分析确定了Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR多肽以及其片段、类似物和衍生物，同时也确定了编码这些功能多肽的多核苷酸序列。这些重要序列的确立，为表达生产这些功能多肽提供了最直接的依据。
本发明在研究Bim的5’端方向或/和3’端方向的缺失的人工异构体的致细胞凋亡效应时，通过亚分子克隆的方法，将一系列的人工异构体装载在真核表达的载体pcDNA3.0上；并在目标表达片断前加上Kozark序列，引导目标片断在真核细胞内得以充分表达。从而得到一系列的真核表达BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的重组载体。此外，应用其他表达载体，如原核表达载体，病毒表达载体等等，都可以构建表达BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的重组载体。直接用于研究生产BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR。
此外，本发明还提供了含有编码Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。
本发明在构建完成了一系列的真核表达BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR多核苷酸的真核表达的重组载体后，通过LipofectamineTM2000转染细胞，并且通过抗生素筛选，得到编码Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。此外，利用不同的宿主细胞，原核细胞、昆虫细胞等，在不同的转化载体的作用下，经一定的筛选方法，也可以获取的BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。
本发明还提供了生产Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的方法。
用本发明的编码BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的多核苷酸或变异体，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；在常规的培养基中培养宿主细胞；从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。重组蛋白可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明还提供针对本发明的多肽-Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的抗体。
用多肽合成仪(PE公司产品)合成BCU或以BCU为蓝本的具有最强致凋亡效应的多肽；将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合，方法参见Avrameas，et al.Immunochemi stry，1969；643。用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR结合。
本发明还提供了针对本发明多肽——Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂。
本发明通过确定一系列BCU为蓝本的BBRP多肽的功能差异性后，根据分析研究组成BCU及BBRP多肽中的氨基酸重要属性和通过分子互作模拟技术研究重要氨基酸在细胞致凋亡效应过程中潜在的作用机制，从而根据其中的重要结构设计了以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂。
本发明还提供制备诊断治疗与Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR异常相关的疾病药物的方法，以及诊断用的试剂盒、基因芯片和检测分析用的微阵列。
本发明编码BCU及BBPR的多核苷酸可用于检测BCU及BBPR的表达与否或在疾病状态下BCU及BBPR的异常表达。如编码BCU及BBPR的DNA序列可用于对活检标本进行杂交以判断BCU及BBPR的表达状况。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(Microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用BCU及BBPR特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测BCU及BBPR的转录产物。检测BCU及BBPR基因的突变也可用于诊断BCU及BBPR相关的疾病。BCU及BBPR突变的形式包括与正常野生型BCU及BBPR DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。
本发明涉及分离的多肽Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR，该多肽是人源的，它包含具有下列氨基酸序列(SEQ IDNo.2，No.11-20)的多肽、或其保守性变体、生物活性片段或衍生物。较佳地，该多肽是具有氨基酸序列的多肽。
本发明中，Bim beta 5核酸序列和对应的蛋白质如图1所示。其中，Bim beta 5的序列为SEQ.ID.NO.1，氨基酸序列为SEQ.ID.NO.2。
按Bimbeta5的经典读码框，该序列只能表达9个氨基酸的短肽；方框中的序列代表新定义的开放读码框，表达26个氨基酸的多肽，其中包含有BH3 domain。
本发明中，所述Bim家族致凋亡效应最小核心部件(BCU)的序列和引物如下表1构建Bim beta 5人工异构体的引物序列

表2 Bim beta 5人工异构体引物配对及其氨基酸序列
图表说明上图中描述了在BCU定义过程中，为了确定Bim分子最小核心功能区域，根据Bimbeta5构建了一系列人工异构体的引物和氨基酸序列；同时，对序列中的氨基酸属性进行分析，非极性或疏水性的氨基酸有M/I/W/A/L/F/N/A；极性不带电荷的氨基酸有Q/G/Y；极性带正电荷的氨基酸有R/K；蓝色代表极性带负电荷的氨基酸有E/D；方框内氨基酸序列为被定义的BCU序列SEQ.ID.No.21。
本发明中，根据Bim beta5(β5)cDNA构建的两种表达模式的质粒凋亡功能的流式细胞仪检测图如图2所示。
根据bimbeta5的cDNA序列构建不同读码框架的目标表达质粒，pcDNA3.0-bimβ5-1(a)和pcDNA3.0-bimβ5-2(b)，转化HEK293细胞系，并用流式细胞仪检测其凋亡情况。结果显示根据实验对照(c)，pcDNA3.0-bimβ5-1和pcDNA3.0-bimβ5-2具有近乎相同的促凋亡能力。
pcDNA3.0-bimβ5-1和pcDNA3.0-bimβ5-2转化细胞裂解液的Western blot检测，见图3所示。
结果显示，pcDNA3.0-bimβ5-1和pcDNA3.0-bimβ5-2在细胞中表达分子量相同的蛋白，说明两种质粒的表达框架相同，都为新定义的由第二个ATG起始的读码框架。
Bimβ5不同人工异构体流式细胞仪凋亡检测结果柱型图见图4所示。
将Bimβ5的一系列人工异构体转染HEK293细胞，孵育24h后经流式细胞仪检测获得的细胞凋亡结果图。如图4所示，BCU结构的完整性及特定保护基团在其凋亡效应中的重要作用，为设计以BCU为基础的潜在药物分子模型奠定重要基础。
利用计算机分子模拟技术解析BCU在凋亡过程中潜在的作用机制，见图5所示。
Bim致凋亡效应的研究背景表明，Bim潜在的作用机制在细胞凋亡的线粒体途径中，而Bim分子直接参予凋亡过程中线粒体攻击的重要角色，能促进凋亡分子Bax、Bak等结合生成同源二聚体或异源二聚体，形成特定的模式结构，攻击线粒体的外膜，导致线粒体功能结构的不稳定性；引发细胞致死分子如细胞色素C等的释放，触发细胞凋亡的级联反应，从而细胞进入不可逆的凋亡过程。
通过FLM研究分析BCU及BBRP系列的致细胞凋亡活性显示，具有最强的凋亡效应的衍生物为Bimβ5A3时，为了进一步分析该衍生物的结构和功能关系，结合了已有的研究背景，应用大型分子互作仪技术，模拟再现Bimβ5A3与Bcl-2家族中致凋亡效应分子Bak/Bax的潜在作用机制图5(A)中，模拟了单体Bimβ5A3与单体Bak的作用；如图所示，Bimβ5A3中的3’端的F12和Y16可通过极性作用，与Bak中的疏水氨基酸F93，M96，I114和L1118形成的疏水槽形成基本稳定结构。此外，Bimβ5A3中带正电荷的氨基酸R19能可与Bak中的带负电荷的E120形成盐桥结构，而该结构能进一步稳定疏水基团之间的簇集作用。因而，在分子互作的模拟实验中，单体Bimβ5A3可与单体Bak形成相互作用的稳定结构。
图5(B)中，模拟了单体Bimβ5A3与单体Bax的作用；Bimβ5A3的N端的极性氨基酸Q3和R6/R7能够与Bax中α3andα4螺旋之间的环装片断中带负电荷或极性不带电荷的氨基酸相互作用(如Bax中的D84和D86)。这些相互作用包括氢键和盐桥作用。如图所示，Bimβ5A3N端的Q3能与Bax中的D86形成氢键作用，而R7能与Bax中的D84形成盐桥作用。这些相互作用稳定了单体Bimβ5A3与单体Bax的相互作用。
图5(C)、(D)、(E)中，在单体Bim 5A3能与单体Bak/Bax相互作用的模拟结构，应用分子互作仪的MD激发，进一步模拟Bimβ5A3与二聚体Bak-Bak，Bax-Bax，Bak-Bax的存在的相互作用稳定结构。
如图5(C)所示，Bim 5A3的C端疏水结构与Bak相互作用模式与图A相同，在Bim 5A3的N端，Q3 and R7能与另一个单体Bax的Q101，N106 and Y110通过氢键作用，形成网格化的作用结构。
如图5(D)所示，在单体Bimβ5A3与两个Bax相互作用模拟结构中，Bimβ5A3的N端与单体Bax的作用与图5(B)中的作用模式相同；而在Bimβ5A3的C端中的L5，F12和Y16能与另一个单体Bax中的L76，M79，I80，V83，V95和Y115通过疏水作用形成簇集结构，这对于稳定Bimβ5A3与Bax相互作用有着至关重要的作用。
图5(E)模拟了单体Bimβ5A3介导的Bak/Bax异二聚体的相互作用模型，单体Bimβ5A3的C端与Bak的相互作用与图5(A)中的作用模式相同，然而在Bimβ5A3的N端的作用却有些不同，除了R6与Bax的D86形成氢键外，侧链中Q3还能与Bax的N-H骨架形成氢键结构。
综上所述，以BCU为重要基础的人工异构体Bimβ5A3具有潜在的介导细胞凋亡效应分子Bak/Bax同源二聚体或异源二聚体的作用能力，这在细胞凋亡过程中具有决定性的作用，这个效应的实现，将直接导致细胞线粒体外膜的不稳定性，引起细胞色素C的释放，引发细胞凋亡过程中的级联反应，最终导致细胞凋亡。而从模拟效果图，可以揭示BCU在这个过程中所起到的重要作用。


图1为Bim beta5核酸序列和对应的蛋白质图示。
图2为根据Bim beta5(β5)cDNA构建的两种表达模式的质粒凋亡功能的流式细胞仪检测图。其中，(a)为pcDNA 3.0-Bimβ-1，(b)为pcDNA 3.0-Bimβ-2，(c)为实验对照。
图3为pcDNA3.0-bimβ5-1和pcDNA3.0-bimβ5-2转化细胞裂解液的Western blot检测。
图4为Bimβ5不同人工异构体流式细胞仪凋亡检测结果柱型图。
图5为利用计算机分子模拟技术解析BCU在凋亡过程中潜在的作用机制。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1bimβ5的克隆用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎脑总RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司产品)从总RNA中分离poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA。用Smart cDNA克隆试剂盒(购自Clontech)将cDNA片段定向插入到pBSK(+)载体(Clontech公司产品)的多克隆位点上，转化DH5α，细菌形成cDNA文库。用Dye terminate cyclereaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司产品)和ABI 377自动测序仪(Perkin-Elmer公司)测定所有克隆的5’和3’末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库(Genebank)进行比较，结果发现其中一个克隆{AY305716}的cDNA序列为新的DNA。通过合成一系列引物对该克隆所含的插入cDNA片段进行双向测定。结果表明，{AY305716}克隆所含的全长cDNA为349bp，从第27bp至137bp有一个111bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个新的蛋白质。编码的蛋白质命名为bimβ5。
实施例2含BCU的系列克隆的构建用bimβ5为模板，以表1，2列举的引物进行PCR扩增扩增反应的条件在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl2，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期94oC 30sec；55oC 30sec；72oC 2min。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化。产物及pcDNA质粒(Invitrogen公司)用HindIII-Bim H1消化，酶切产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，r然后连接，转化DH5α，得到基于pcDNA的系列含BCU的表达克隆。用T7启动子同源引物测序确定序列正确性。
实施例3含BCU的bim beta 5的表达产物和生物学活性检测如图2，3所示，利用Bimβ5的cDNA构建两种不同读码框架的表达质粒在流式细胞仪上的检测和western blot检测以Bimβ5转载T-vectors为模板，利用两对特别引物(5’cccaagcttaccatggggcaggctgaacctgcaga 3’；5’cggaattcctatttctctaa cctccttgcatagta3’and 5’cccaagcttaccatgggcccagagatatggatcgc 3’；5’cggaattcctatttctctaacctccttgcatagta 3’)进行扩增构建带有Hind III and EcoRI酶切位点的。Bimβ5的编码核酸片断，并将两种不同类型的片断装入pcDNA3.0真核表达质粒中构建Bimβ5-1和Bimβ5-2。(Bimβ5-1为Bimβ5的全长cDNA，为经典读框，其预测表达产物为9个氨基酸的短肽；Bimβ5-2为Bimβ5的全长cDNA的片断，由第二个起始密码开始，并在起始密码前加上Kozak序列，其预测表达产物为36个氨基酸，并带有BH3 domain)。将测序验证正确的pcDNA3.0-目标基因质粒及对照质粒pcDNA3.0 DNA用Invitrogen lipofectAMINE真核转染试剂盒进行转染。
当细胞孵育24小时后，用Becton Dickinson公司的Cycle test plus DNA reagent kit在流式细胞计数仪上检测细胞凋亡变化情况。(1收集的细胞500g离心5min，去上清。每管加入胰蛋白酶缓冲液250μl，小心混匀，在室温下反应10min。2加200μl的一蛋白酶抑制剂/Rnase混合缓冲液，小心混匀，在室温下反应10min。3加200μl的propidium iodide染色液200μl 4℃避光反应10min。4样本用50um孔径的尼龙膜过滤，转入流式细胞计数仪加样管做细胞周期检测。)同时，将用预冷的真核细胞裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，蛋白酶抑制剂混合物)重悬浮经转染孵育24小时的细胞。HEK293细胞悬浮液用预冷的1ml无菌一次性针筒反复抽放进行匀浆。匀浆产物4℃，12000rpm离心10min，取上清。
在介质中加入100μl的2×蛋白SDS-PAGE电泳上样缓冲液，煮沸后用12％的SDS-PAGE电泳后分离。电泳结束后，取下凝胶。准备6张滤纸和一张Protran BA83 Cellμlosenitrate膜，将它们裁为与凝胶同等大小。Protran BA83 Cellμlosenitrate膜于甲醇中浸泡数秒种，之后浸入电转移缓冲液中。按海绵、3张滤纸、Protran BA83 Cellμlosenitrate膜、凝胶、3张滤纸、海绵的次序依次将电转移夹层装好。将电泳夹层放入电转移槽，有ProtranBA83 Cellμlosenitrate膜的一边为阳极，凝胶一边为阴极，倒入电转移缓冲液。将整个装置置于冰中，恒压100V，电转移2h。
电泳结束后，取下Protran BA83 Cellμlosenitrate膜，用PBST略为漂洗之后，用Roche公司BM Chromogenic Western Blotting试剂盒中的Blocking Buffer封闭1h，其间温和振荡。封闭结束后用PBST漂洗3次，加入用Roche公司Blocking Buffer稀释的Clontech公司的Livecolor多克隆抗体，温和振荡过夜。用PBST漂洗3次，加入用Roche公司Blocking Buffer稀释的Santa Cruz HRP-羊抗兔二抗，温和振荡2h。用PBST漂洗3次，加入DAB底物溶液显色，直到Protran BA83 Cellμlosenitrate膜上出现明显条带后用终止反应。
实施结果见图例图1，图2，图3实施例4含BCU的系列表达质粒在293细胞系的凋亡活性研究利用表1，表2中引物及引物配对构建Bimβ5序列的人工异构体的亚克隆，将测序验证正确的pcDNA3.0-目标基因质粒及对照质粒pcDNA3.0 DNA用Invitrogen lipofectAMINE真核转染试剂盒进行转染。当细胞孵育24小时后，用Becton Dickinson公司的Cycle test plusDNA reagent kit在流式细胞计数仪上检测细胞凋亡变化情况。(具体过程同上)结果如图4所示。
实施例5BCU重要衍生物与bax/bak相互作用的计算机模型分析利用大型计算机分子互作仪，模拟BCU重要衍生物Bimβ5A3与bax/bak单聚体，同源二聚体和异源二聚体相互作用过程及结构模式，以此在分子模拟层面解释BCU在细胞线粒体凋亡途径中，通过聚合bax和bak，介导线粒体表膜的不稳定性，从而触发细胞凋亡的重要过程。实施过程，如图5所示。
序列表SEQ.ID.No.1Bim beta 5核酸序列ATG AGG CAG GCT GAA CCT GCA GAT ATG CGC CCA GAG ATA TGG ATCGCC CAA GAG TTG CGG CGT ATC GGA GAC GAG TTT AAC GCT TAC TAT GCA AGG AGG TTA GAGAAA TAGSEQ.ID.No.2Bim beta 5氨基酸序列MRQAEPADMRPEIWIAQELRRIGDEFNAYYARRLEKSEQ.ID.No.3-10构建Bimβ5人工异构体的引物序列

SEQ.ID.No.11-20 Bim beta 5人工异构体氨基酸序列

SEQ.ID.NO.21 Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCUMAQELRRIGDEFNAYYARR。
权利要求
1.一种Bim家族致凋亡效应最小核心部件，记为BCU，其特征在于从Bim beta5的核酸序列SEQ.ID.NO1分离获得，其序列为SEQ.ID.NO21。
2.一种以权利要求1所述BCU为蓝本构建的衍生物BBPR多肽。
3.一种编码如权利要求2所述的衍生物物BBPR多肽的多核苷酸序列。
4.一种含有编码如权利要求1所述的Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的衍生物BBPR的多核苷酸的重组载体。
5.一种如权利要求4所述的重组载体的构建方法，其特征在于具体步骤如下通过亚分子克隆的方法，将一系列的人工异构体装载在真核表达的载体上；并在目标表达片断前加上Kozark序列，引导目标片断在真核细胞内得以充分表达，从而得到一系列的真核表达BCU及以BCU为蓝本构建的衍生物BBPR的多核苷酸的重组载体。
6.一种含有编码如权利要求1所述的Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。
7.一种生产如权利要求1所述的Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的衍生物BBPR的方法，其特征在于具体步骤如下用编码BCU及以BCU为蓝本构建的衍生物BBPR的多核苷酸或变异体，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；在常规的培养基中培养宿主细胞；从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
8.一种针对如权利要求1所述的Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的抗体。
9.一种针对如权利要求1所述的Bim家族致凋亡效应最小核心部件BCU及以BCU为蓝本构建的重要衍生物BBPR的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂。
全文摘要
本发明属生物工程技术领域，具体涉及Bim家族致凋亡效应最小核心部件和以该部件为蓝本构建的衍生物，以及编码此多肽的多核苷酸序列，还涉及以该部件为蓝本构建的衍生物多核苷酸和多肽的制备方法和应用。本发明的最小核心部件BCU以及以BCU为蓝本的衍生物BBPR多肽以及其片断、类似物和衍生物从Bim beta5的核苷酸序列中分离得到，该核心部件BCU和以BCU为蓝本构建的衍生物BBPR可用于制备与诊断和治疗相关疾病的药物和检测芯片等。
文档编号C12N5/10GK1807449SQ200610023668
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月26日 优先权日2006年1月26日
发明者刘凌峰, 陈金中, 季朝能, 顾少华, 谢毅, 毛裕民 申请人:复旦大学