专利名称：血管生成素类似蛋白v及其制备方法,其多克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种功能性表达纯化的新的多肽-血管生成素类似蛋白V，以及此多肽及其抗体的制备方法和其应用。
背景技术：
ANGPTLI、ANGPTLII、ANGPTLIII、ANGPTLIV及本发明中的ANGPTLV均为血管生成素类似蛋白基因家族中的成员，由这些基因编码的蛋白均有相同的功能域，但这些成员的组织分布均有所不同，ANGPLTIII主要在肝中表达，ANGPTLIV主要在脂肪组织和肝中分布，而ANGPTLV主要在成人心脏组织中特异性表达(图2显示ANGPTLV在成人16个组织中的表达情况)，与此家族中的其它成员的分布有十分明显的区别。由ANGPTLIII和ANGPTLIV两个基因编码的蛋白均为分泌蛋白，研究发现这两种蛋白均可抑制脂蛋白脂酶LPL的活性，为二型糖尿病相关基因。根据流行病学和临床研究，高甘油三酯血症是冠心病的一个危险因素，许多研究表明高甘油三酯状态及富含甘油三酯的脂蛋白可能致动脉粥样硬化，促进凝血并抗纤溶。
本发明的多肽ANGPTLV与ANGPTLIII和ANGPTLIV的同源性较高，含有血管生成素类似蛋白家族的序列特征，即其编码的蛋白在N端有螺旋-螺旋区，在C端有纤维素原类似区域，其具有与ANGPTLIII和ANGPTLIV相似的生物学功能。它对脂蛋白脂酶具有抑制作用(图3显示血管生成素类似蛋白V对脂蛋白脂酶具有抑制作用)，在体内脂类代谢中起着重要的作用，和其它蛋白一起调解着甘油三酯、总胆固醇和游离脂肪酸在血浆中的水平。其表达异常对于血浆中脂类代谢产生不良影响，并进而产生相关疾病，抑制该基因的活性将成为降脂的一个重要靶标。本发明的血管生成素类似蛋白V的抑制剂不仅适合于糖尿病患者的血脂障碍，而且也适合于代谢综合症特别是家族性的高血脂症、血脂障碍性高血压和肥胖相关的血脂障碍等患者。
由于如上所述血管生成素类似蛋白V蛋白是一种糖尿病相关基因，在脂类代谢中发挥重要作用，而且这些调节过程中涉及大量的蛋白，因而本领域中一直需要鉴定更多参与这些过程的血管生成素类似蛋白V蛋白，特别是鉴定这种蛋白的氨基酸序列。新血管生成素类似蛋白V蛋白编码基因的分离也为研究确定该蛋白在健康和疾病状态下的作用提供了基础。这种蛋白将构成开发疾病诊断和/或治疗药物的基础，因此分离其编码DNA是非常重要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的血管生成素类似蛋白V，并提供该蛋白的融合蛋白的构建、表达、纯化方法，同时还提供其多克隆抗体及其应用。
本发明提供的新的多肽-血管生成素类似蛋白V，具有SEQ.ID.NO.1所示序列。
本发明提供的功能性表达纯化的血管生成素类似蛋白V，还包括其片段、类似物和衍生物。该多肽是人源的，它包含与血管生成素类似蛋白V一致的氨基酸序列的多肽、或其保守性变体、生物活性片段或衍生物。较佳地，该多肽是具有与血管生成素类似蛋白V一致的氨基酸序列的多肽。
本发明还提供含有编码血管生成素类似蛋白V的多核苷酸的重组载体，特别是表达载体。此外，本发明还提供一种用该载体遗传工程化的宿主细胞，包括转化、转导或转染的宿主细胞。本发明还提供含有编码血管生成素类似蛋白V的多核苷酸的基因工程化宿主细胞。
本发明还提供生产血管生成素类似蛋白V的方法和一种包括培养所述宿主细胞和回收表达产物的制备本发明多肽的方法(图1显示血管生成素类似蛋白V的GST融合蛋白的构建，表达和纯化过程)。具体步骤如下a.血管生成素类似蛋白V-GST融合蛋白的构建用本发明的编码的ANGPTLV-GST多核苷酸或变异体，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；b.血管生成素类似蛋白V-GST融合蛋白的表达在合适的培养基中培养宿主细胞；根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
c.血管生成素类似蛋白V-GST融合蛋白的纯化从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
重组蛋白可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法包括但并不限于常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
d.血管生成素类似蛋白V-GST融合蛋白的鉴定血管生成素类似蛋白V-GST融合蛋白走SDS-PAGE电泳，在分子量68kDa处得到一单一的条带(图1B显示血管生成素类似蛋白V-GST融合蛋白走SDS-PAGE的情况)。做western检测可见在分子量68kDa处亦有一单一的条带(图1C显示血管生成素类似蛋白V-GST融合蛋白做western检测的情况)。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端15个氨基酸与ANGPTLV的N端15个氨基酸残基完全相同。
还发明还提供针对本发明的多肽-血管生成素类似蛋白V的抗体，其制备方法，以及血管生成素类似蛋白V的模拟化合物、拮抗剂、激动剂或抑制剂。具体内容如下用多肽合成仪合成血管生成素类似蛋白V特异性的多肽，将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合，用上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，(两周后)再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次；采用经牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做酶连免疫测定兔血清中抗体的滴度(图4显示血管生成素类似蛋白V多克隆抗体的效价检测)；用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG，将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与血管生成素类似蛋白V结合。
本发明提供的血管生成素类似蛋白V的模拟化合物，其特征在于该化合物是模拟、促进、拮抗或抑制血管生成素类似蛋白V的活性的化合物。激动剂是指当与血管生成素类似蛋白V结合时，一种可引起该蛋白质改变从而调节该蛋白质活性的分子。激动剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合血管生成素类似蛋白V的分子。拮抗剂或抑制物是指当与血管生成素类似蛋白V结合时，一种可封闭或调节血管生成素类似蛋白VI的生物学活性或免疫学活性的分子。拮抗剂和抑制物可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合血管生成素类似蛋白V的分子。
本发明还提供筛选化合物以鉴定提高(激动剂)或阻遏(拮抗剂)血管生成素类似蛋白V的药剂的方法。激动剂可提高血管生成素类似蛋白V以加强抑制脂蛋白脂酶、调解血液中游离脂肪酸等生物功能，而拮抗剂等阻止和治疗与甘油三酯的分解有关的脂类代谢异常如糖尿病及其并发症。例如，能在药物的存在下，将哺乳动物细胞或表达血管生成素类似蛋白V的膜制剂与标记的血管生成素类似蛋白V一起培养，然后测定药物提高或阻遏此相互作用的能力。
血管生成素类似蛋白V的拮抗剂包括筛选出的抗体、化合物、受体缺失物和类似物等。血管生成素类似蛋白V的拮抗剂可以与血管生成素类似蛋白V结合并消除其功能，或是抑制该多肽的产生，或是与该多肽的活性位点结合使该多肽不能发挥生物学功能。
在筛选作为拮抗剂的化合物时，可以将血管生成素类似蛋白V加入生物分析测定中，通过测定化合物对血管生成素类似蛋白V和其受体之间相互作用的影响来确定化合物是否是拮抗剂。用上述筛选化合物的同样方法，可以筛选出起拮抗剂作用的受体缺失物和类似物。能与血管生成素类似蛋白V结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，一般应对血管生成素类似蛋白V分子进行标记。
还发明还提供针对本发明的血管生成素类似蛋白V及其GST融合蛋白与抗体的实际应用，包括在制备治疗与血管生成类似蛋白V异常相关的药物中的应用。具体内容如下提供了诊断治疗与血管生成素类似蛋白V异常相关的疾病的方法。包括检测生物样品中所述多肽或其编码多核苷酸序列中的突变，或者检测生物样品中本发明多肽的量或生物活性。
抗血管生成素类似蛋白V的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的血管生成素类似蛋白V。与血管生成素类似蛋白V结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。
抗体还可用于制备针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如血管生成素类似蛋白V高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭血管生成素类似蛋白V阳性的细胞。本发明中的抗体可用于制备治疗或预防与血管生成素类似蛋白V相关的疾病的药物。给予适当剂量的抗体可以刺激或阻断血管生成素类似蛋白V的产生或活性。
本发明还提供定量和定位检测血管生成素类似蛋白V水平的方法。这些方法是本领域所熟知的，包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的血管生成素类似蛋白V水平，可以用作解释血管生成素类似蛋白V在各种疾病中的重要性和用于诊断血管生成素类似蛋白V起作用的疾病。
本发明中的多肽还可用作肽谱分析，例如，多肽可用物理的、化学或酶进行特异性切割，并进行一维或二维或三维的凝胶电泳分析，更好的是进行质谱分析。
抑制血管生成素类似蛋白VmRNA的寡核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。
可以将本发明中的多肽及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后使用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于相关疾病的治疗。
本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明中的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。
药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。血管生成素类似蛋白V以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的血管生成素类似蛋白V的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。
图1为血管生成素类似蛋白V和血管生成素类似蛋白V-GST融合蛋白的构建，表达，纯化。其中(A)表达GST-血管生成素类似蛋白V蛋白的质粒构建过程，(B)表达和纯化GST-血管生成素类似蛋白V的过程检，(C)表达和纯化GST-血管生成素类似蛋白V蛋白的Western检测。
图2为ANGPTLV基因在成人组织中的表达谱。图中16个成人组织从左至右依次为心，脑，胎盘，肺，肝，骨骼肌，肾，胰腺，脾，胸腺，前列腺，睾丸，卵巢，小肠，结肠，外周血白细胞，G3PDH为阳性对照。
图3为ANGPTLV对脂蛋白脂酶的抑制作用图示。横坐标为ANGPTLV相对浓度，纵坐标为相对酶活，以加入GST且未加ANGPTLV时体系中的LPL的酶的活性为100％。
图4为制备的血管生成素类似蛋白V的多克隆抗体的效价检测。血管生成素类似蛋白V多克隆抗体的效价为1∶10000。曲线A为抗体浓度与按比例稀释血清的关系曲线。曲线B为本底浓度与按比例稀释血清的关系曲线。横坐标为按比例稀释的血清，纵坐标为抗体在OD450时的浓度。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
1.血管生成素类似蛋白V蛋白和ANGPTLV-GST融合蛋白的构建，表达，纯化通过常规的重组DNA技术，利用本发明的ANGPTLV-GST多核苷酸序列来表达或生产重组的蛋白(Science，1984；2241431)。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码的ANGPTLV-GST多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
在步骤(2)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在步骤(3)中，重组蛋白可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但并不限于常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
ANGPTLV-GST的PCR扩增反应的条件(记引物1为SEQ.ID.NO.2，引物2为SEQ.ID.NO.3)引物1-5′-taggggtcgacgtacaaggtaactgtgtacatcattc-3′引物2-5′-ggggcggccgctcattatttaaaatatggattgtacattcttc-3′。此两段引物的5’端分别含有SalI和NotI酶切位点，其后分别为目的基因5’端和3’端的编码序列，SalI和NotI酶切位点相应于表达载体质粒pGEX-4T-3(Pharmacia公司产品，Cat.No.27-4583-01)上的选择性内切酶位点。以含有全长目的基因的pBS-{AY169281}质粒为模板，进行PCR反应。PCR反应条件为总体积50μl中含pBS-{AY169281}质粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分别为10pmol、AdVantage polymerase Mix(Clontech公司产品)1μl。循环参数94℃ 30s，60℃30s，72℃ 90s，共30个循环。用SalI和NotI分别对扩增产物和质粒pGEX-4T-3进行双酶切，分别回收大片段，并用T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌DH5α，在含氨苄霉素(终浓度50μg/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆(pGEX-4T-3 AY169281)用氯化钙法将重组质粒转化大肠杆菌RosettaTM(NoVagen公司产品)。在含氨苄霉素(终浓度50μg/ml)和氯霉素(终浓度20μg/ml)的LB液体培养基中，宿主菌RosettaTM(pGEX-4T-3 AY169281)在37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养3小时。离心收集菌体，经超声波破菌，离心收集上清，用固化有谷胱甘肽的亲和层析柱(Amersham Pharmacia公司产品)进行层析，得到了纯化的目的蛋白{血管生成素类似蛋白V}。经SDS-PAGE电泳，在分子量68kDa处得到一单一的条带(图2)。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端15个氨基酸与ANGPTLV的N端15个氨基酸残基完全相同。
2.ANGPTLV-GST融合蛋白的多克隆抗体，ANGPTLV-GST融合蛋白多克隆抗体的制备及其效价测定多克隆抗体的生产可用血管生成素类似蛋白V直接注射免疫动物(如家兔，小鼠，大鼠等)的方法得到，多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。制备{血管生成素类似蛋白VI}的单克隆抗体的技术包括但不限于杂交瘤技术(Kohlerand Milstein.Nature，1975，256495-497)，三瘤技术，人B-细胞杂交瘤技术，EBV-杂交瘤技术等。将人恒定区和非人源的可变区结合的嵌合抗体可用已有的技术生产(Morrison et al，PNAS，1985，816851)。而已有的生产单链抗体的技术(U.S.PatNo.4946778)也可用于生产抗血管生成素类似蛋白V的单链抗体。
用多肽合成仪(PE公司产品)合成下述血管生成素类似蛋白V特异性的多肽NH2-Met-Met-Ser-Pro-Ser-Gln-Ala-Ser-Leu-Leu-Phe-Leu-Asn-Val-Cys-OH。将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合，方法参见AVrameas，et al.Immunochemistry，1969；643。用4mg上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，15天后再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次。采用经15μg/ml牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做ELISA测定兔血清中抗体的滴度。用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG。将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。免疫沉淀法证明纯化的抗体可特异性地与血管生成素类似蛋白V结合。
3.原核表达、分离并纯化的血管生成素多肽V在体外的生物功能的检测本发明采纳两种检测手段1)比色测定法，方法参见张蓉，et al.华西医大学报，1996；27106-110；2)同位素检测法，方法参见Peter Nilssion-Ehle and Michaelc.Schotz，Journal of Lipid Research，1976；17536-541脂蛋白脂酶(LPL)存在于肝外组织毛细血管内皮细胞表面。它主要催化血浆中乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白(VLDL)中甘油三酯(TG)的水解，在CM及VLDL的降解中发挥重要作用。LPL的活性受多种因素影响，它的缺陷或活性降低可导致血浆CM及VLDL降解障碍，引起高甘油三酯血症。测定LPL活性，对于探讨高脂血症、动脉粥样硬化的发病机理及脂蛋白代谢有重要意义。
与以下具体实验步骤有关的其它未列出的常用试剂及其配制方法请参考文献DNAPROBES G.H.Keller；M.M.Manak；Stockton Press，1989(USA)以及更常用的分子克隆实验手册书籍如《分子克隆实验指南》(1998年第二版)[美]萨姆布鲁克等著，科学出版社。
1)比色测定法a.材料兔肝素后血浆将健康成年家兔称重，耳缘静脉取血适量，制备未肝素化血浆，再沿耳缘静脉按150u/kg注射肝素，15分钟后再次沿静脉取血，放置1-2小时后以2500r/min离心5分钟，得肝素后血浆。
脂肪乳剂(Intralipid)购自华瑞制药有限公司。
b.试剂游离脂肪酸(FFA)提取液按49∶49∶2(V/V)混合氯仿、正庚烷、甲醇。
pH8.3，0.1mol/LTris-HCL缓冲液准确称取三羟甲基氨基甲烷(分析纯)6.057g，用双蒸水溶解并稀释至500ml，2N HCL调pH至8.3。
铜试剂取0.5mol/L硝酸铜溶液10ml，加2mol/L三乙醇胺溶液5ml，用饱和氯化钠溶液稀释至100ml，用10％NaOH溶液调节pH至8.1。
显色剂称取二苯卡巴肼40mg，溶于10ml无水乙醇内，临用前加0.1mol/L乙醇胺溶液0.2ml即可。
棕榈酸应用标准液(500μEq/L)精确称取棕榈酸(分析纯)51.3mg，溶于100ml提取液中(此为贮存标准液)，临用前用提取液稀释4倍。
c.方法脂酶(LPL+HL)总活性测定管2.0ml酶促反应液中含脂肪乳剂10μl；pH8.3，0.1mol/L Tris-HCL缓冲液1.0ml；肝素后血浆0.1ml及双蒸水0.89ml。上述反应液中省去双蒸水，加入2mol/L Na/CL溶液1.0ml，则为HL活性测定管(LPL活性被抑制)。将上述各管反应液混匀，37℃水浴保温60分钟，分别加入提取液5.0ml，震摇后离心，取下层提取液5.0ml，加入铜试剂2.0ml，再次震摇后离心，取上层提取液2.0ml，加入显色液0.4ml，混匀后放置15分钟，30分钟内用分光光度计在550nm处比色。以同样方法处理的标准罐作对照，计算各管FFA的生成量。
d.酶活性(FFAμEq/ml血浆*h) LPL活性＝脂酶总活性-HL活性2)同位素检测反应体系0.2ml，包括0.1ml测定底物和0.1ml酶原。
0.1ml测定底物包括2mM甘油-三[9，10-3H]油酸(131kbeq/微mol)；189ng/ml L-a磷脂酰胆碱；14mg/ml小牛血清白蛋白；140mM Tris-HCL(pH8.0)；15％(V/V)甘油；10％(V/V)热灭活胎牛血清(56度，30分钟)；重组蛋白样品0.1ml酶原血浆或组织匀浆测定流程a.反应体系配好后，在37度，孵化2小时b.加入1.05ml 0.1M碳酸钾-硼酸缓冲液(pH10.5)和3.25ml甲醇-氯仿-正庚烷(141∶125∶100)，混合后剧烈震荡15秒c.离心3,000g，15分钟d.取1ml上清，与10ml液体闪烁液混合e.用beckmanLS6500液闪仪测定每管读数序列表SEQ.ID.NO.1MMSPSQASLLFLNVCIFICGEAVQGNCVHHSTDSSVVNIVEDGSNAKDESKSNDTVCKEDCEESCDVKTKITREEKHFMCRNLQNSIVSYTRSTKKLLRNMMDEQQASLDYLSNQVNELMNRVLLLTTEVFRKQLDPFPHRPVQSHGLDCTDIKDTIGSVTKTPSGLYIIHPEGSSYPFEVMCDMDYRGGGWTVIQKRIDGIIDFQRLWCDYLDGFGDLLGEFWLGLKKIFYIVNQKNTSFMLYVALESEDDTLAYASYDNFWLEDETRFFKMHLGRYSGSAGDAFRGLKKEDNQNAMPFSTSDVDNDGCRPACLVNGQSVKSCSHLHNKTGWWFNECGLANLNGIHHFSGKLLATGIQWGTWTKNNSPVKIKSVSMKIRRMYNPYFKSEQ.ID.NO.2-5′-taggggtcgacgtacaaggtaactgtgtacatcattc-3′SEQ.ID.NO.3-5′-ggggcggccgctcattatttaaaatatggattgtacattcttc-3′。
权利要求
1.一种血管生成类似蛋白V，其特征在于具有SEQ.ID.NO1所示序列，以及包含与其一致的氨基酸序列的多肽或其保守多肽、生物活性片断或衍生物。
2.一种含有编码如权利要求1所述血管生成类似蛋白V的多核苷酸的重组载体。
3.一种利用如权利要求2所述载体遗传工程化的宿主细胞，以及含有编码如权利要求1所述血管生成类似蛋白V的多苷核酸的基因工程化宿主细胞。
4.一种如权利要求1所述血管生成类似蛋白V的GST融合蛋白构建、表达和纯化方法，其特征在于具体步骤如下a.血管生成素类似蛋白V-GST融合蛋白的构建用编码的ANGPTLV-GST多核苷酸或变异体，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；b.血管生成素类似蛋白V-GST融合蛋白的表达在合适的培养基中培养宿主细胞；c.血管生成素类似蛋白V-GST融合蛋白的纯化从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
5.一种针对如权利要求1所述血管生成类似蛋白V的抗体。
6.一种如权利要求5所述的血管生成类似蛋白V的抗体的制备方法，其特征在于具体步骤如下用多肽合成仪合成血管生成素类似蛋白V特异性的多肽，将该多肽分别与血蓝蛋白和牛血清白蛋白耦合形成复合，用上述血蓝蛋白多肽复合物加上完全弗氏佐剂免疫家兔，再用血蓝蛋白多肽复合物加不完全弗氏佐剂加强免疫一次；采用经牛血清白蛋白多肽复合物包被的滴定板做酶连免疫测定兔血清中抗体的滴度；用蛋白A-Sepharose从抗体阳性的家兔血清中分离总IgG，将多肽结合于溴化氰活化的Sepharose4B柱上，用亲和层析法从总IgG中分离抗多肽抗体。
7.一种如权利要求1所述血管生成类似蛋白V的模拟化合物、拮抗剂、激动剂或抑制剂。
8.一种如权利要求1所述血管生成类似蛋白V及其GST融合蛋白抗体在制备治疗与血管生成类似蛋白V异常相关的疾病的药物中的应用。
9.一种如权利要求1所述血管生成类似蛋白V的mRNA的寡核苷酸以及核酶。
全文摘要
本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种新的血管生成类似蛋白V，以及该多肽及其抗体的制备方法和应用。本发明提供的新的血管生成类似蛋白V具有SEQ.ID.N01的序列。本发明还提供该蛋白V的GST融合蛋白及其构建、纯化方法，该蛋白V的抗体及其制备方法，该蛋白的抗体、模拟化合物、拮抗剂、激动剂或抑制剂在制备与该蛋白V异常相关的疾病的药物中的应用。
文档编号C12N5/10GK101041694SQ20061002366
公开日2007年9月26日 申请日期2006年1月26日 优先权日2006年1月26日
发明者张佳忆, 陈金中, 季朝能, 顾少华, 谢毅, 毛裕民 申请人:复旦大学