专利名称：人源菌群仔猪模型的构建及仔猪肠道中菌群分子检测方法
技术领域：
本发明涉及的是一种微生物技术领域的方法，具体涉及一种人源菌群仔猪模型的构建及仔猪肠道中菌群分子检测方法。
背景技术：
人的胃肠道中定居着一个十分复杂和活跃的微生物群落，包括约1014个细菌，相当于人体所有组织细胞总数量的10倍。大量研究表明，这个庞大的微生物菌群与人形成了一种稳定的共生体系，对人的健康及疾病状况至关重要。因此，研究人胃肠道菌群结构与组成以及菌群与其宿主的相互作用一直是微生物生态领域的热点。近年来，越来越多商业化生产的调节肠道菌群的功能性食品及药物大量涌现，对这些益生元、益生菌类产品功能的科学评价也引起了很多人的研究兴趣。由于直接以人为对象研究肠道菌群的结构、功能和调控存在难于标准化实验个体的遗传及环境背景的问题且存在安全隐患，因此，建立一个稳定的、能反映人肠道菌群组成和特点的人源菌群(Human Flora-associated，HFA)动物模型就显得尤为重要。
经对现有技术的文献检索发现，HFA动物模型的研究主要集中于啮齿类动物。如Mallett等人1987年在《Journal of Applied Bacteriology》(应用细菌学学报)63卷39-45页上报道，通过用人的粪便悬浮液接种无菌动物，建立了人源菌群大鼠模型，虽然经用常规培养方法检测，发现部分人肠道菌群中的类群可以在HFA鼠中定植，但是，模型鼠的肠道菌群与人的差异较大，而且，其免疫系统发育也不完善。虽然此类模型已被广泛应用于研究肠道菌群的生态和代谢、评价功能性食品对胃肠道生理的影响以及某些药物和高危食物的致癌作用的分析上，然而，作为微生态和代谢模型，仔猪较之啮齿类动物有更大的优势，表现在(1)属杂食性动物；(2)消化道的生理和解剖学特性和人高度相似；(3)具有和人类似的发育期。美国食品和药物管理局(FDA)2000年将人的早期发育期划分为4个阶段，这4个阶段和仔猪自出生至6.5月龄的发育阶段相对应；(4)仔猪的高营养需求和生长快速的特性使其对营养和代谢调控的表现更为明显。以上特性表明仔猪更适合构建人源菌群动物模型。
自HFA动物模型建立并被应用于人胃肠道生理和生态的研究以来，对HFA动物模型肠道菌群的分析以及评价各种功能性食品或药物对肠道菌群的影响均依赖于传统的微生物培养技术。越来越多的研究证实，培养方法费时、费力且远不能反映微生物群落的多样性，故建立不依赖于纯培养的分子生物学检测方法将更准确、更精细、更快捷地评价HFA动物模型的菌群定植情况和监测肠道菌群在某种生理、病理或外界干扰以及食物、药物处理状态下的动态变化。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种人源菌群仔猪模型的构建及仔猪肠道中菌群分子检测方法。本发明采用在微生物生态学领域广泛使用的RAPD指纹图谱技术结合Southern Blot以及类群特异性PCR-TGGE/DGGE(温度梯度变性凝胶电泳/变性梯度凝胶电泳)技术，在从总体上比较HFA动物模型菌群组成和供体菌群组成相似性的基础上，再对人肠道菌群中的两个主要类群-与健康密切相关的双岐杆菌类以及在肠道菌群中数量最多的拟杆菌类进行组成分析，该技术路线系统、简便，可全面地反映肠道菌群组成的主要特征。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明人源菌群仔猪模型的构建方法，包括以下步骤(1)制备健康人粪便菌悬液；(2)对怀孕待产母猪剖腹取胎产仔；(3)仔猪的饲养，剖腹取出的仔猪饲养于全天候过滤正压通风的隔离室中；(4)对仔猪接种人粪便菌悬液使人源菌群逐步在仔猪胃肠道中定植。
所述的制备健康人粪便菌悬液，具体为采集刚排出的新鲜健康人粪便，迅速悬浮于含10％甘油的预还原处理过的PBS缓冲液(0.05M，PH7.4)中，稍静置，上清即为人粪便菌悬液。
所述的对仔猪接种人粪便菌悬液，具体为于仔猪出生12小时起开始第一次接种人粪便菌悬液(1ml/day)，每天1次，连续3天。第4-10天每隔一天接种1次，每次1ml。
本发明同时还提供一种上述人源菌群仔猪模型的仔猪肠道中菌群分子检测方法，包括以下步骤(1)提取粪便微生物基因组DNA；(2)ERIC-PCR指纹图谱分析及群落DNA杂交；(3)HFA仔猪肠道菌群中双岐杆菌定植检测；(4)HFA仔猪肠道菌群中拟杆菌定植检测。
所述的提取粪便微生物基因组DNA，具体为自仔猪出生4-5天排出正常粪便起，每天采集新鲜仔猪粪便，提取粪便菌群总DNA。
所述的HFA仔猪肠道菌群中双歧杆菌和拟杆菌定植检测，采用类群特异性PCR-TGGE方法。
根据上述步骤，通过分子方法检测、比较仔猪模型与供体人的ERIC-PCR指纹图谱以及肠道中最重要的两大类细菌-双岐杆菌和拟杆菌的组成，证实本发明模型仔猪胃肠道中成功定植了供体人的双岐杆菌和拟杆菌，指纹图谱的比较也显示模型仔猪肠道菌群的指纹图谱与供体人同源性高，而与普通仔猪差异显著。从而说明本发明以实验手段建立了人源菌群(HFA)仔猪模型，该模型可用于研究肠道菌群与其宿主生理及免疫特性的相互关系，也可用于评价含益生元或益生菌成分的功能性食品或药品对胃肠道菌群的作用及检测高危食品的致癌性方面。
图1为一头HFA仔猪5、9、12、15日龄肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱。
图2(A)为7头HFA仔猪在12日龄肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱；(B)为图谱聚类分析结果。
图3为3窝HFA仔猪肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱。
图4(A)为10个不同人、5头普通仔猪及2头HFA仔猪肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱；(B)为聚类分析结果；(C)为以HFA仔猪的供体(H4)的ERIC-PCR产物为探针对(A)图进行的群落杂交。
图5(A)为HFA仔猪和供体的双歧杆菌类群性PCR-TGGE图谱，(B)为聚类分析结果。
图6(A)为HFA仔猪和供体的拟杆菌类群性PCR-TGGE图谱，(B)为聚类分析结果。
具体实施例方式
下面通过实施例进一步描述本发明。
实施例1 人源菌群仔猪模型的构建(1)制备健康人粪便菌悬液配置含10％(vol/vol)甘油的PBS缓冲液(0.05M，PH7.4)，121℃灭菌30min，置于厌氧罐中预还原处理24h。采集刚排出的新鲜健康儿童或成人粪便，每2克粪便悬浮于40ml上述处理过的PBS缓冲液中，稍静置，吸取上清于无菌离心管中，此即粪便菌悬液。菌悬液可直接接种初生仔猪或迅速保存于-70℃冰箱，用前解冻，切忌反复冻融。
(2)对怀孕待产母猪剖腹取胎产仔剖腹产手术应尽量接近自然顺产时间，最好在预产期前一天进行。手术采用常规剖腹产方法，所得仔猪迅速移入无菌隔离室，用无菌干纱布擦拭猪口、鼻、周身，去除粘膜、黏液，保证仔猪能够自主正常呼吸。
(3)仔猪的饲养将剖腹取出的仔猪饲养于全天候高效过滤正压通风的隔离室中，隔离室根据仔猪生长特点及实验需要设计。实验前隔离室和饲养仔猪的不锈钢笼子需彻底消毒。消毒采用以下方法先用1％来苏尔溶液擦拭隔离室地面、门、窗及笼子，再用2％过氧乙酸(8ml/立方空气)喷洒隔离室2小时，紫外灯照射12小时以上，最后用高锰酸钾∶甲醛∶水(1∶2∶1)溶液熏蒸隔离室24小时并开启排送风系统待用。实验开始后，工作人员每次进入隔离室工作前必须经过下列步骤手、臂部消毒(1∶1000稀释的新洁而灭溶液)→在一级缓冲间更换无菌工作服→在二级缓冲间穿戴无菌隔离服和口罩。
实验仔猪单笼饲养。仔猪出生前7天隔离室温度为35-37℃，7天后温度逐步降为30-32℃并维持此温度不变。仔猪断奶前饲喂安佑(漳州)饲料科技有限公司生产的“奶妈奶”奶粉，该奶粉是一种具有初乳效果的猪用代母乳，每次饲喂前用无菌水新鲜配制。人工乳用奶瓶逐头哺饲。仔猪27日龄开始断奶，约持续5-7天，此期间逐步减少奶粉的用量而代之以雀巢公司婴儿营养米粉。断奶结束后仔猪完全用固体粉料饲喂，自由取食、自由饮水。
(4)对仔猪接种人粪便菌悬液仔猪出生12小时后开始接种人粪便菌悬液，1-3日龄每天接种一次，每头仔猪每次1ml，用注射器直接注射进仔猪口腔，并诱导其吞咽。3日龄后每两天接种一次，剂量仍为每头仔猪每次1ml，接种持续至仔猪10日龄。此后仔猪正常饮食，不再进行接种。
本实施例在仔猪模型胃肠道中成功定植了供体人的双岐杆菌和拟杆菌，该模型可用于研究肠道菌群与其宿主生理及免疫特性的相互关系，也可用于评价功能性食品或药物对肠道菌群的调节和代谢作用。
实施例2 对上述人源菌群(HFA)仔猪肠道中菌群的分子检测。
(1)提取粪便微生物基因组DNA用分子微生物学方法检测肠道菌群的组成，必须首先提取优质的肠道微生物的总基因组DNA。HFA仔猪粪便DNA的提取采用试剂盒QIAamp DNA stool minikit(Qiagen，Hilden)，方法依照试剂盒说明书。得到的DNA用DNA浓度测定仪DyNA QuantTM200 fluorometer(Amersham Pharmacia Biotech，USA)测定浓度，并在1％琼脂糖凝胶上电泳以检查其大小及完整性。
(2)ERIC-PCR指纹图谱分析及群落DNA杂交用ERIC-PCR指纹图谱技术连续监测HFA仔猪自出生后肠道菌群组成的动态变化。ERIC-PCR体系(25μl)包括引物E1(5’-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3’)和E2(5’-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3’)各25pmol，dNTP各5mM，模板DNA 80ng，Taq DNA聚合酶2.5U(Promega，USA)以及配套1×buffer及50mmol MgCl2。ERIC-PCR扩增程序如下95℃7min；然后94℃变性1min，52℃变性1min，65℃延伸8min，共执行30个循环；最后再65℃延伸16min。指纹图谱采用UVI band/map软件(UVItec，Cambridge，United Kingdom)进行相似性指数的分析和聚类。
如图1所示，一头HFA仔猪5、9、12、15日龄肠道菌群的ERIC-PCR指纹图谱。从图1可看出，仔猪自出生接种人肠道菌悬液后建立了自己的肠道菌群，ERIC-PCR指纹图谱条带丰富。该肠道菌群逐渐变化、平衡至12日龄后维持稳定，12日龄和15日龄的指纹图谱基本一致。12日龄时，同一窝试验仔猪肠道菌群ERIC-PCR指纹图谱趋于一致(见图2A)，相似性指数达90％以上(图2B)，表明HFA仔猪不同个体之间肠道菌群组成相似，个体差异小。
定植实验用同一个供体的菌群，在3窝猪上进行了重复，3次独立的实验得到基本相同的DNA指纹图，表明用这种方法建立的仔猪模型具有很好的重复性。(图3)为检测供体肠道菌群在HFA仔猪肠道内的定植情况，并比较HFA仔猪肠道菌群与其供体以及普通仔猪(指正常出生、正常饲养的仔猪)肠道菌群组成的异同，本发明采用了基于ERIC-PCR指纹图谱基础上的群落DNA杂交方法，该方法可同时分析比较多个微生物生态系统的菌群结构差异，具有简便、快速、灵敏的特点。探针标记以及Southern杂交方法采用现有技术实现。分析样品包括10个不同人、5个普通仔猪以及2个HFA仔猪的粪便样品。HFA仔猪的供体人的ERIC-PCR产物以地高辛标记作为混合探针(DIG DNA labeling and detection kit，Roche，Germany)。如图4所示，不同人及普通仔猪肠道菌群均表现出各自特异的指纹图谱(图4A)，但不同人及HFA仔猪的指纹图谱可聚为一个大类，而普通仔猪为一个类群(图4B)。以HFA仔猪的供体(H4)的ERIC-PCR扩增所得的所有DNA片断作为混合探针与其他样品的ERIC-PCR指纹图谱进行基因组水平的杂交(图4C)，9个不同人的指纹图谱杂交信号较强(H3个体例外)，显示同源的序列较多，说明不同个体的人的肠道中存在一些共有的细菌类群。5个普通仔猪的指纹图谱均表现出较弱的杂交信号，表明仔猪肠道菌群的DNA的序列组成与人(H4个体)的肠道菌群的DNA的序列同源性低，反映其菌群组成与人差异较大。HFA仔猪样品的杂交结果也显示出了很强的信号，表明其指纹图谱上DNA片断与供体高度同源，显示其肠道菌群的组成与供体相似，而与普通仔猪差异显著。
(3)HFA仔猪肠道菌群中双岐杆菌定植检测双岐杆菌是人肠道菌群的重要组成部分，约占成人肠道菌总数的3％以上，在婴儿肠道菌中更高达75％-91％。双岐杆菌也是和肠道健康密切相关的一类菌。因此，分析双岐杆菌的组成是检测HFA仔猪肠道菌群的一个重要内容。
本发明采用双岐杆菌属特异性PCR-TGGE(温度梯度变性凝胶电泳)方法检测HFA仔猪肠道双岐杆菌的组成，并比较其与供体以及普通仔猪的双岐杆菌的组成的异同。双岐杆菌属特异性PCR采用引物Bif164-f5’-GGGTGGTAATGCCGGATG-3’和Bif662-r 5’-CCACCGTTACACCGGGAA-3’。扩增体系及程序均采用现有成熟技术。对不同人、HFA仔猪及普通仔猪粪便样品的双岐杆菌属特异性扩增结果发现，该对引物(针对人源双岐杆菌)在人及HFA仔猪样品中均可扩增得到目标产物，而在所有分析的(20例)普通仔猪的样品中均无扩增产物。此结果说明常见的人源双岐杆菌在普通仔猪的肠道中不存在或含量极低，而HFA仔猪肠道中已定植了人源的双岐杆菌。对HFA仔猪及供体人的双岐杆菌属特异性扩增产物进一步进行TGGE分析以直观和精确地展示其肠道内各种双岐杆菌的组成结构，结果见图5，其中(A)为HFA仔猪和供体的双歧杆菌类群性PCR-TGGE图谱，(B)为聚类分析结果。TGGE使用TGGE-Mini system(Biometra，德国)进行，方法参考使用说明。不同样品的双岐杆菌属特异性扩增产物在含8M尿素和20％(vol/vol)甲酰胺的聚丙烯酰胺凝胶(浓度为8％)上进行分离，150V电泳3小时，变性温度范围为46-54℃。由图5TGGE图谱可看出，HFA仔猪肠道内双歧杆菌的TGGE图谱与其供体人的图谱相似性高，表明二者的双歧杆菌类的组成高度相似，从而证实供体人的双歧杆菌成功地在HFA仔猪肠道内进行了“复制”。
(4)HFA仔猪肠道菌群中拟杆菌定植检测拟杆菌是一类革兰氏阴性、明显发酵糖类、不产生黑色素的厌氧菌，是人和动物胃肠道菌群中最优势的一个类群，占人肠道菌群总量的25％以上。拟杆菌属细菌的特异性扩增采用引物Bfr-F5’-CTGAACCAGCCAAGTAGCG-3’和Bfr-R5’-CCGCAAACTTTCACA ACTGACTTA-3’。为便于TGGE检测，一段富含GC的序列5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3’被添加于引物Bfr-R的5’端。PCR产物在含8M尿素和20％(vol/vol)甲酰胺的聚丙烯酰胺凝胶(浓度为8％)上进行分离，150V电泳3小时，变性温度范围为36-45C。结果见图6，其中，(A)为HFA仔猪和供体的拟杆菌类群性PCR-TGGE图谱，(B)为聚类分析结果。从不同人、HFA仔猪及普通仔猪的拟杆菌TGGE图谱比较可看出，HFA仔猪的图谱与其供体的图谱相似性高达80％以上，尤其是主带的位置和亮度基本一致，而与其他人和普通仔猪的图谱显著不同。此结果说明供体的拟杆菌也在HFA仔猪肠道内成功定植。
综上所述，对HFA仔猪肠道菌群的分子检测表明，供体人肠道菌群的两个重要类群-双岐杆菌和拟杆菌在HFA仔猪肠道中成功定植，且模型仔猪肠道菌群的总体指纹图谱也与供体人高度同源，而与普通仔猪差异显著。以上结果证实，用本发明描述的方法建立的仔猪模型，其肠道菌群具备了供体人肠道菌群的主要组成特征。
权利要求
1.一种人源菌群仔猪模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤(1)制备健康人粪便菌悬液；(2)对怀孕待产母猪剖腹取胎产仔；(3)仔猪的饲养，剖腹取出的仔猪饲养于全天候过滤正压通风的隔离室中；(4)对仔猪接种人粪便菌悬液使人源菌群逐步在仔猪胃肠道中定植。
2.如权利要求1所述的人源菌群仔猪模型的构建方法，其特征是，所述的制备健康人粪便菌悬液，具体为采集刚排出的新鲜健康人粪便，迅速悬浮于含10％甘油的预还原处理过的0.05M，pH7.4的PBS缓冲液中，稍静置，上清即为人粪便菌悬液。
3.如权利要求1所述的人源菌群仔猪模型的构建方法，其特征是，所述的仔猪的饲养，隔离室和饲养仔猪的不锈钢笼子需彻底消毒，消毒采用以下方法先用1％来苏尔溶液擦拭隔离室地面、门、窗及笼子，再用2％过氧乙酸喷洒隔离室2小时，紫外灯照射12小时以上，最后用高锰酸钾∶甲醛∶水＝1∶2∶1溶液熏蒸隔离室24小时并开启排送风系统待用。
4.如权利要求1所述的人源菌群仔猪模型的构建方法，其特征是，所述的对仔猪接种人粪便菌悬液，具体为于仔猪出生12小时起开始第一次接种人粪便菌悬液1ml/day，每天1次，连续3天，第4-10天每隔一天接种1次，每次1ml。
5.一种人源菌群仔猪肠道中菌群分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤(1)提取粪便微生物基因组DNA；(2)ERIC-PCR指纹图谱分析及群落DNA杂交；(3)HFA仔猪肠道菌群中双岐杆菌定植检测；(4)HFA仔猪肠道菌群中拟杆菌定植检测；所述的HFA仔猪肠道菌群中双歧杆菌和拟杆菌定植检测，采用类群特异性PCR-TGGE方法。
6.如权利要求5所述的人源菌群仔猪肠道中菌群分子检测方法，其特征是，所述的提取粪便微生物基因组DNA，具体为自仔猪出生4-5天排出正常粪便起，每天采集新鲜仔猪粪便，提取粪便菌群总DNA。
7.如权利要求5所述的人源菌群仔猪肠道中菌群分子检测方法，其特征是，用ERIC-PCR指纹图谱技术连续监测HFA仔猪自出生后肠道菌群组成的动态变化，25μl的ERIC-PCR体系包括引物E1和E2各25pmol，其序列分别为5’-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3’，5’-AAgTAAgTgACTggggTgAgCg-3’，dNTP各5mM，模板DNA 80ng，TaqDNA聚合酶2.5U以及配套1×buffer及50mmol MgCl2；ERIC-PCR扩增程序如下95℃ 7min；然后94℃变性1min，52℃变性1min，65℃延伸8min，共执行30个循环；最后再65℃延伸16min；指纹图谱采用UVI band/map软件进行相似性指数的分析和聚类。
8.如权利要求5所述的人源菌群仔猪肠道中菌群分子检测方法，其特征是，所述的HFA仔猪肠道菌群中双歧杆菌定植检测，双岐杆菌属特异性PCR采用引物Bif164-f，其序列为5’-GGGTGGTAATGCCGGATG-3’和Bif662-r，其序列为5’-CCACCGTTACACCGGGAA-3’。
9.如权利要求5所述的人源菌群仔猪肠道中菌群分子检测方法，其特征是，所述的HFA仔猪肠道菌群中拟杆菌定植检测，拟杆菌属细菌的特异性扩增采用引物Bfr-F，其序列为5’-CTGAACCAGCCAAGTAGCG-3’和Bfr-R，其序列为5’-CCGCAAACTTTCACA ACTGACTTA-3’；为便于TGGE检测，一段富含GC的序列5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3’被添加于引物Bfr-R的5’端。
10.如权利要求5所述的人源菌群仔猪肠道中菌群分子检测方法，其特征是，PCR产物在含8M尿素和体积比为20％的甲酰胺的浓度为8％的聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，150V电泳3小时，变性温度范围为双歧杆菌类为46-54℃和拟杆菌类为36-45℃。
全文摘要
一种微生物技术领域的人源菌群仔猪模型的构建及仔猪肠道中菌群分子检测方法。构建步骤(1)制备健康人粪便菌悬液；(2)对怀孕待产母猪剖腹取胎产仔；(3)仔猪饲养于全天候高效过滤正压通风的隔离室中；(4)接种。检测步骤(1)提取粪便微生物基因组DNA；(2)ERIC－PCR指纹图谱分析及群落DNA杂交分析；(3)HFA仔猪肠道菌群中双岐杆菌定植分析；(4)HFA仔猪肠道菌群中拟杆菌定植分析。本发明在仔猪模型胃肠道中成功定植了供体人的双岐杆菌和拟杆菌，指纹图谱的比较也显示仔猪模型肠道菌群的指纹图谱与供体人同源性高，可用于研究肠道菌群与其宿主生理及免疫特性的相互关系，也可用于评价功能性食品或药物对肠道菌群的调节和代谢作用。
文档编号C12Q1/68GK1840206SQ20061002345
公开日2006年10月4日 申请日期2006年1月19日 优先权日2006年1月19日
发明者赵立平, 庞小燕, 华修国, 崔立 申请人:上海交通大学