专利名称：猪f18大肠杆菌抗性分子检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种猪F18大肠杆菌抗性的准确快速检测分子试剂盒及检测方法。
本发明所述用于检测猪F18大肠杆菌抗性试剂盒包括①_⑦号试剂瓶①特异性PCR引物(F : 5' -CCAACGCCTCCGATTCCTGT-3' ， R:5' -GTGCATGGCAGGCTGGATGA—3' 10 ii moL/L)、②10 X Buffer、③dNTP混合物，④T叫酶(5U/ ii L)、⑤限制性内切酶Hin6 I (10U/ii L) 、 ddH20、⑦阳性对照猪FUT1基因M307PCR产物。 通过检测a (1，2)岩藻糖基转移酶(FUT1)基因M307的DNA多态性区分个体对F18大肠杆菌抗性，高敏感性和特异性鉴定猪F18大肠杆菌抗性，使用本发明的产品和方法可以达到高敏感性和特异性鉴定猪F18大肠杆菌抗性的目的，操作简便，准确性高，重复性强，对于猪抗断奶仔猪腹泻和水肿病抗病育种以及流行病学研究和诊断具有重要意义。
本发明试剂盒的使用方法是预先采用常规酚/氯仿抽提法获得猪基因组DNA后，利用本试剂盒①-④和⑥进行a (1，2)岩藻糖基转移酶(FUT1)基因的PCR扩增，PCR产物在1 %琼脂糖凝胶中电泳，结束后用UVP凝胶成像系统分析检测扩增结果；再使用②、⑤和 ，将⑦作为阳性对照，进行PCR产物酶切反应后，经8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析，对照⑦呈现的带型判定测定个体对F18大肠杆菌的抗性。
本发明的优点 1)本发明基于分子生物学原理和研究结果设计，试剂盒中的所有试剂均为可以直接使用的工作液，使用本发明只需要采集少量猪的耳组织和具有基本的分子生物学实验条件，按照本发明提供的检测方法就可以简便准确地确定猪F18大肠杆菌抗性，而且可以实
现对样本的大规模检测。 2)本发明还提供了阳性对照猪FUT1基因M307 PCR产物，通过被测试样本和阳性对照同时检测并对结果进行对照，可以达到高敏感性和特异性鉴定猪F18大肠杆菌抗性的目的。 所述的检测方法包括 1)猪基因组DNA FUT1基因M307的PCR扩增
2)FUT1基因M307扩增产物的酶切分析
3) FUT1基因M307的PCR-RFLP分型
图1为猪基因组DNA FUT1基因M307扩增产物图 其中，M为DL2000标准分子量；1 6为PCR扩增产物 图2为FUT1基因M307扩增产物Hin6 I酶切图 其中，泳道6-8为AA型(带型I)，泳道1、3、5为AG型(带型II)，泳道2、4为GG型(带型III) ， M为pUC19 DNA/Msp I (Hpa II) marker
具体实施例方式
7种工作液的来源或制备 ①特异性PCR引物(F :5' -CCAACGCCTCCGATTCCTGT-3' ， R :5' -GTGCATGGCAGGCTGGATGA-3' 10 ii moL/U 引物送上海生工生物技术有限公司合成，新合成的引物为固体粉末状，将装有粉
末引物的离心管进行瞬间离心，加入灭菌双蒸水，充分混匀后，4t:过夜，然后置于-2(rc保存。 V = (0D X 33) / (C X丽) 其中V为加入双蒸水的体积(i!L);丽为所合成引物的分子量(道尔顿)；C为引物的浓度， 一般配成100pM的储存液。制备试剂盒时然后再用双蒸灭菌水稀释到10 ii moL/L。 ②10 X Buffer 上海生工生物技术有限公司购买Taq酶时配套赠送 ③dNTP混合物 上海生工生物技术有限公司购买浓度为10 ii moL/L，制备试剂盒时再用双蒸灭菌水稀释到2. 5 ii moL/L ④Taq酶(5U/ ii L) 大连宝生物技术有限公司购买 ⑤限制性内切酶Hin6 I(IOU組) 上海生工生物技术有限公司购买 ⑥ddH20 实验室超纯水仪制备 ⑦阳性对照猪FUT1基因M307 PCR产物。 选择前期进行FUT1基因M307基因型检测后获得的AA基因型个体，饲养于本实验 室动物房，经过F18大肠杆菌体内和体外攻毒试验验证后，确定为阳性对照猪，每个个体取 耳组织块约1. 0g，按常规酚-氯仿法提取DNA。根据本试剂盒的材料和使用方法进行PCR 扩增(具体方法见实施例一 )。PCR产物在1 %琼脂糖凝胶中电泳，结束后用UVP凝胶成像 系统分析检测扩增结果，将扩增片断大小在161b并且条带清晰的M307 PCR产物配置于试 剂盒。 实施例一 1)基因组DNA FUT1基因M307的PCR扩增 每个测试个体采耳组织块约1. Og，放入1. 5mL的E卯endoff管内于冰盒中，按常 规酚-氯仿法提取基因组DNA。利用本试剂盒①-④和⑥进行a (1，2)岩藻糖基转移酶 (FUT1)基因的PCR扩增，PCR最终反应体系建立如下
组成(Reagent) 用量(pi) Volume
① 引物F和引物R 各2
② 10xBuffer 2.5
③ dNTPs混合物 2 @ r岡酶 0.2 ⑥ddH20 14.3 测试个体模板DNA (100ng/nl) 2 反应条件样品经94t:变性5min后，按照下列程序进行扩增94°C 40s， 60°C 40s，
72°C 45s，32个循环后，72t:延伸10min，4t:保存。PCR产物在1 %琼脂糖凝胶中电泳，结束
后用UVP凝胶成像系统分析检测扩增结果，扩增片断大小应为161bp(图1)。 2)FUT1基因M307扩增产物的酶切分析 酶切消化反应体系建立如下
5组成(Reagent) 用量(pi) Volume
②10xBuffer
⑤ 限制性内切酶(IOU尔I)
⑥ ddH2。
PCR产物(同时包含 ) 置37°C恒温反应3h后，经10 %的聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析。
3) FUT1基因M307的PCR-RFLP分型 FUTl基因M307扩增产物经限制性内切酶Hin6 I酶切后产生3种带型(带型1、带型II和带型III)，其基因型分别定义为AA、 AG和GG(图2)，等位基因GG存在一个Hin6 I酶切位点，当该位点未发生G — A突变时，扩增产物能被内切酶完全消化，产生117bp/44bp(带型III)的条带；当等位基因G发生突变后，由于该等位基因上酶切位点的丢失，Hin6 I不能对其消化，形成带型1(161bp)，在GA杂合等位基因时可显示带型II。
试剂盒中提供的⑦阳性对照猪FUT1基因M307 PCR产物酶切后的带型即为带型I，为F18大肠杆菌抗性基因型(AA基因型)，凡是呈现带型I的个体即为F18大肠杆菌抗性型，带型II和带型III的个体为F18大肠杆菌易感型。
权利要求
一种用于检测猪F18大肠杆菌抗性的试剂盒，其特征在于，包括以下7种试剂①特异性PCR引物F5′-CCAACGCCTCCGATTCCTGT-3′，R5′-GTGCATGGCAGGCTGGATGA-3′，5pmoL/L②10×Buffer③dNTP混合物④Taq酶(5U/μL)⑤限制性内切酶Hin6 I(10U/μL)⑥ddH2O⑦阳性对照猪FUT1基因M307PCR产物。
2. —种采用权利要求1所述的试剂盒检测猪F18大肠杆菌抗性的方法，其特征在于，包 括将预先获得猪基因组DNA利用本试剂盒①-④和⑥进行a (1，2)岩藻糖基转移酶基因 的PCR扩增，PCR产物在1 %琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后用UVP凝胶成像系统分析检测 扩增结果；再使用②、⑤和⑥，将⑦作为阳性对照，进行PCR产物酶切反应后，经8X的聚丙 烯酰胺凝胶电泳银染分析，依据对照⑦呈现的带型判定测定个体对F18大肠杆菌的抗性。
全文摘要
本发明涉及一种猪F18大肠杆菌抗性的准确快速检测分子试剂盒及检测方法，使用本发明的7种工作液和提供的检测方法，基于分析α(1，2)岩藻糖基转移酶(FUT1)基因M307的多态性，可以简便准确地确定猪F18大肠杆菌抗性，实现对样本的大规模检测。本发明还提供了阳性对照，可以达到高敏感性和特异性鉴定猪F18大肠杆菌抗性的目的，操作简便，准确性高，重复性强，对于猪抗断奶仔猪腹泻和水肿病抗病育种以及流行病学研究和诊断具有重要意义。
文档编号C12Q1/68GK101724705SQ20101001820
公开日2010年6月9日 申请日期2010年1月19日 优先权日2010年1月19日
发明者何小亮, 包文斌, 叶兰, 吴圣龙, 孙寿永, 朱国强, 朱璟, 潘章源, 艾晓峰, 鞠慧萍, 黄小国 申请人:扬州大学