专利名称：一种能分泌内皮抑素的细胞制剂及其在制备治疗肿瘤的药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能分泌内皮抑素(endostatin)的细胞制剂，以及该制剂在制备治疗肿瘤的药中的应用。
背景技术：
在已有的肿瘤临床治疗中，抑制肿瘤新生血管的生成已成为重点之一。其中又以内皮抑素为主要使用的抑制因子。目前，作为国家生物制品一类创新药物重组人血管内皮抑素注射液已获得了国家食品药品监督管理局颁发的临床批件，成为我国第一个具有自主知识产权的从大肠杆菌生产的天然人源结构的人内皮抑素注射液。
但实验发现，内皮抑素产生作用所需的蛋白量很大，反复注射用药很不方便，且非常昂贵；同时内皮抑素的性质不稳定，其活性蛋白难以获得，难以达到理想的治疗效果。
采用基因治疗的方法，在体内直接表达内皮抑素，可避免其体外失活快和需反复注射的缺点；使用普通的真核表达载体转染效率偏低，而腺病毒载体与其他载体系统相比较而言，有宿主范围广、感染率高、理化性质稳定等特点；但腺病毒的非整合性使之不能持续表达所需产物，需反复给予；腺病毒注射入体内后感染细胞的效率要比体外感染差，且很不稳定，分泌的内皮抑素受各种因素的影响在体液中的浓度也不能达到肿瘤治疗所需水平，而且容易引起肌体免疫反应。
发明内容
本发明的目的是提供了一种能分泌内皮抑素的细胞制剂。
本发明的另一个目的是提供所述的能分泌内皮抑素的细胞制剂在在制备治疗肿瘤的药中的应用。
所说的能分泌内皮抑素的细胞制剂，其特征是在体外，用分泌性内皮抑素的重组腺病毒载体感染原代培养的成纤维细胞而制得。
具体地，所说的细胞制剂由以下步骤制得1)构建含有信号肽的人内皮抑素序列，2)用上述1)中得到的序列构建分泌性内皮抑素的重组腺病毒载体，3)用上述2)中得到的重组腺病毒载体感染预先原代培养的成纤维细胞，即得到能分泌内皮抑素的细胞制剂。
本发明更进一步的方案是，上述步骤3)为用重组腺病毒感染载体预先原代培养的成纤维细胞，体外培养至感染率达90％以上。
上述步骤1)构建含有信号肽的人内皮抑素过程中，所说的信号肽优选与宿主表达细胞同源的分泌信号，包括但不限于下列TIMP-1基因的信号肽、人胰岛素信号肽、人IGF-II信号肽、人胶原collagen，type IV信号肽、人胶原collagen，typeX信号肽、人胶原collagen，typeIV，alpha6信号肽、人interleukin-2(IL-2)信号肽。
本发明的另一个技术方案是能分泌内皮抑素的细胞制剂，在制备治疗肿瘤的药中的应用。制得的药剂输入体内后，能在体内直接高浓度表达内皮抑素，明显地提高了抑制肿瘤生长的效率。在临床应用中，最好是取患者的成纤维细胞进行原代培养，并进一步制成能分泌内皮抑素的细胞制剂，用于对患者的治疗，这样能避免了机体的免疫反应。
在体外用分泌性内皮抑素的腺病毒载体高效地感染原代成纤维细胞，制备出的能分泌活性内皮抑素的原代成纤维细胞制剂。并将该制剂用于制备治疗肿瘤的药物，能避免内皮抑素体外易失活和需反复注射的缺点，能起到在体内直接表达内皮抑素，分泌出细胞，明显抑制肿瘤生长的作用。特别是用取自患者自体的成纤维细胞制得的药剂，能避免了机体的免疫反应。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是含有信号肽的内皮抑素构建电泳图；其中1和2是连接产物条带；3是无信号肽的内皮抑素条带；4是2000的MARK。
图2是重组腺病毒pATC-endo的构建电泳图；其中1endostatin条带；2信号肽条带；32000MARK；415000MARK；5同源重组子用PACI酶切放出特异条带。
图3是Western blot图；其中1.第一天上清；2.第二天上清；3.第三天上清；4.阴性对照；5.不带信号肽的表达上清；6.endostatin阳性对照；7.蛋白定量MARKER；8.第三天上清。
图4是细胞增殖抑制情况；其中1.对照液组；2.10μL上清组；3.20μL上清组；4.40μL上清组；5.40μL上清+2μL内皮抑素多抗组。
图5是体外血管生成实验的照片。
图6是感染腺病毒的原代成纤维细胞在小鼠体内的表达；其中系列1注射感染含有信号肽腺病毒的原代成纤维细胞；系列2注射感染不含有信号肽腺病毒的原代成纤维细胞；系列3注射相同体积PBS。
图7是抑瘤实验的实物照片；其中系列1-3同图6。
具体实施例方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
本发明中所说的分泌性内皮抑素的重组腺病毒载体可以是已公知的，如杨芳，何援利等构建的分泌性内皮抑素重组腺病毒载体。《人分泌型内皮抑素质粒的构建》发表在《医学研究生学报》第18卷第1期2005年1月；张子祥，李德春等构建的分泌性内皮抑素重组腺病毒载体《内皮抑素重组腺病毒载体的构建及制备》发表在《苏州大学学报(医学版)》2004；24(5)；也可以由本领域技术人员根据现有技术或者参照本说明书而构建。
下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照附图和数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例一能分泌内皮抑素的细胞制剂的制备例1、构建含有信号肽的内皮抑素序列根据不含信号肽内皮抑素序列(如SEQ ID NO1所示)及TIMP-1基因的信号肽基因序列(Atg gcc ccc ttt gag ccc ctg gct tct ggc atc ctg ttg ttg ctg tgg ctg ata gccccc agc agg gcc)，设计引物，在信号肽上下游分别引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGGCCCCCTTTGAGCC-3′)，SalI(引物E25′-TCAGTAACGCGTCGACGGCCCTGCTGGG-3′)；在内皮抑素上下游引入Sall(引物E35′-ACGCGTCGACATGCACAGCCACCGC-3′)，XbaI(引物E45′-CTAGTCTAGAGATTCCCTACTT-3′)酶切位点。以不含分泌肽的内皮抑素序列为模板进行PCR，扩增出内皮抑素序列；以TIMP-1基因为模板进行PCR，扩增出信号肽序列。然后两者都用SalI酶切，回收得到的基因按5∶1比例用T4DNA连接酶连接，连接产物再用E1与E4 PCR扩增。连接产物与对照内皮抑素电泳鉴定，电泳步骤参见《分子克隆实验指南》，萨姆布鲁克著，1993年)，结果如图1所示，连接产物对应的1、2条带在645bp出现条带，表明构建成功，连接产物即含有信号肽的内皮抑素(其序列如SEQ ID NO2所示)2、分泌性内皮抑素重组腺病毒载体的构建含有信号肽的内皮抑素和病毒穿梭质粒pShuttle(pAdTrack-CMV)都用BglII与XbaI双酶切，按2∶1比例用T4DNA连接酶连接，转化DH-5α细菌，得到重组产物pATC-endo。重组产物用PmeI酶切，使之线形化，与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌内同源重组，重组DNA转化DH5α细菌、挑克隆、小提质粒、PacI酶切鉴定；酶切后，大量制备重组质粒pAdlEasy/pShuttle-Endostatin(方法参见《分子克隆实验指南》，萨姆布鲁克著，1993年)。
重组质粒pAdlEasy/pShuttle-Endostatin分别用BglII、SalI双酶切，SalI、XbaI双酶切及PacI单酶切。酶切产物电泳鉴定在640bp处有特异性条带出现，说明人内皮抑素基因已成功构建腺病毒载体上；在80bp处有特异性条带出现，说明信号肽序列也已构建在了载体里(图2)；PacI单酶切放出两条特异性条带(约30kb和3kb)，标志构建成功。
取20μg质粒用PacI酶切，酚/氯仿抽提纯化，乙醇沉淀，沉淀物晾干后溶于200μl无菌水中，备用。包装细胞293A用含10％新生牛血清DMEM培养基，按常规的无菌技术在5％CO2、37℃条件下培养。293A细胞传至Φ60mm的细胞培养皿中，次日长至约70％的汇合度，换新鲜的完全培养液4.5ml培养4-5h。用磷酸钙转染法将50μl质粒(约5μg)转入包装细胞293A(方法参见《分子克隆实验指南》，萨姆布鲁克著，1993年)。
在35℃、3％CO2中培养16h后，换液，再于37℃、5％CO2培养7-10天，观察细胞病变现象和病毒的产生。等待293A细胞出现细胞病变现象后，收集细胞，反复冻融三次，5000rpm离心10min，收集上清于-70℃保存，即制成分泌性人内皮抑素的重组腺病毒载体。
3、原代成纤维细胞的培养取刚出生1-2周的小鼠处死，75％乙醇杀菌10-20分钟。去皮，切出大小为2mm×2mm×2mm的肌肉组织，均匀致密地平铺在细胞培养皿中。组织块浸泡在含10％胎牛血清的DMEM中，于37℃、5％CO2及饱和湿度的培养箱中孵育，约1-2周见细胞长出组织块后，代其长满细胞培养皿后消化传代。
4、腺病毒转染原代成纤维细胞原代成纤维细胞接种于细胞培养皿中，待长到70％-80％满时，感染分泌性内皮抑素重组腺病毒，24小时后在荧光显微镜下看到90％细胞以上表达荧光，即制成通过腺病毒表达内皮抑素抑制肿瘤生长的原代成纤维细胞制剂，即能分泌内皮抑素的细胞制剂。
细胞再培养48-72小时，分别于第一天，第两天及第三天收集上清。分别用于下述检测或分析。
Western Blot检测取第一天，第两天及第三天收集上清，Western Blot检测培养上清液中内皮抑素蛋白含量。结果如图3所示，显示随时间推移，内皮抑素表达出体外有一个增强的过程，在第三天时达到最大。
体外细胞增殖测定转染细胞分泌的内皮抑素对血管内皮细胞生长抑制作用将生长良好的人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)接种于96孔培养板，4000个/孔，37℃，5％CO2培养24h，分别加入10，20，40μl上清，40μl上清+2μl内皮抑素多抗以及对照液，培养72h，MTT法测定细胞活力，分析制得的转染细胞分泌的内皮抑素对血管内皮细胞生长产生的抑制作用。
结果如图4所示，转染细胞分泌的人内皮抑素对血管内皮细胞生长产生了抑制作用，其中40μl上清组达到32％。
血管生成实验(鸡胚尿囊膜实验)取九天的鸡胚，37℃培养。于血管较疏处粘上一5毫米直径的滤纸片，滴加10微升适当浓度的bFGF，生长一天后，分为三组(每组5个样本)分别滴加10微升PBS，5微升三天上清液，10微升三天上清液。再培养三天，观察贴滤纸片周围血管生长情况。
结果如图5所示，PBS组血管正常生长；5ul组对比PBS组血管生长较慢，生长不充分；10ul组对比PBS组血管生长明显慢，生长受抑制。表明转染细胞分泌的人内皮抑素对动物体内血管内皮生长产生抑制作用。
小鼠体内抑瘤实验取15只四周左右小鼠，按清洁级饲养，每只在一侧鼠鼷部接种约1×107个B16细胞，约一周后肿瘤长至平均大小4×5mm左右，将小鼠分为三组，分别注射1×107个感染含有信号肽腺病毒的原代成纤维细胞(由实施例一制得)，1×107个感染不含有信号肽腺病毒的原代成纤维细胞，及相同体积PBS，第六天时再注射一次。每隔三天测量肿瘤大小。十五天时处死小鼠，取瘤称重，拍片。
结果如图6及图7所示，在图7中第一行为感染含有信号肽腺病毒的原代成纤维细胞组(即本发明细胞制剂组)平均重量0.7056g；第二行为感染不含有信号肽腺病毒的原代成纤维细胞组，平均重量2.3235g；第三行PBS阴性对照组平均重量2.5586g。从图6及图7可知，本发明的细胞制剂，在体内分泌内皮抑素对肿瘤的生长有明显的抑制作用。
实施例二与实施例一基本相同，不同之处在于信号肽选取人胰岛素信号肽基因序列(atggccctgtggatgcgcctcctgcccctgctggcgctgctggccctctggggacctgacccagccgcagcc)，设计引物，在信号肽上下游分别引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGGCCCTGTGG-3′)，SalI(引物E2为5′-TCAGTAACGCGTCGACGGCTGCGGC-3′)。
实施例三与实施例一基本相同，不同之处在于信号肽选取人IGF-II信号肽基因序列(Atgggaatcccaatggggaagtcgatgctggtgcttctcaccttcttggccttcgcctcgtgctgcattgct)，设计引物，在信号肽上下游分别引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGGGAATCCCA-3′)，SalI(引物E25′-TCAGTAACGCGTCGACAGCAATGC-3′)。
实施例四与实施例一基本相同，不同之处在于信号肽选取人胶原collagen，type IV信号肽基因序(Atgcttataaacaagttgtggctgctcctggttacgttgtgcctgaccgaggaactggcagca)，设计引物，在信号肽上下游分别引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGCTTATAAAC-3′)，SalI(引物E25′-TCAGTAACGCGTCGACTGCTGCCAG-3′)。
实施例五与实施例一基本相同，不同之处在于信号肽选取及人胶原collagen，typeX信号肽基因序列(atgctgccacaaataccctttttgctgctagtatccttgaacttggttcatgga)，设计引物，在信号肽上下游分别引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGCTACCACAAATA-3′)，SalI(引物E25′-TCAGTAACGCGTCGACTCCATGAAC-3′)。
实施例六与实施例一基本相同，不同之处在于信号肽选取人胶原collagen，typeIV，alpha6信号肽基因序列(Atgcaccctgggttgtggctgctcctggttacgttgtgcctgaccgaggaactggcagca)，设计引物，在信号肽上下游分别引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGCACCCTGGG-3′)，SalI(引物E25′-TCAGTAACGCGTCGACTGCTGCCAG-3′)。
实施例七与实施例一基本相同，不同之处在于信号肽选取人interleukin-2(IL-2)信号肽基因序列(Atgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcacttgtcacaaacagt)，设计引物，在信号肽上下游分别引入BglII(引物E15′-GGAAGATCTATGTACAGGATG-3′)，SalI(引物E25′-TCAGTAACGCGTCGACACTGTTTGT-3′)。
SEQUENCE LISTING<110>南京师范大学<120>一种能分泌内皮抑素的细胞制剂及其在制备治疗肿瘤的药中的应用<160>2<210>1<211>561<212>DNA<213>人种(Homo sapiens)<220>
<223>内皮抑素序列<400>1atgcacagcc accgcgactt ccagccggtg ctccacctgg ttgcgctcaa cagccccctg60tcaggcggca tgcggggcat ccgcggggcc gacttccagt gcttccagca ggcgcgggcc120gtggggctgg cgggcacctt ccgcgccttc ctgtcctcgc gcctgcagga cctgtacagc180atcgtgcgcc gtgccgaccg cgcagccgtg cccatcgtca acctcaagga cgagctgctg240tttcccagct gggagactct gttctcaggc tctgagggtc cgctgaagcc cggggcacgc300atcttctcct ttgacggcaa ggacgtcctg aggcacccca cctggcccca gaagagcgtg360tggcatggct cggaccccaa cgggcgcagg ctgaccgaga gctactgtga gacgtggcgg420acggaggctc cctcgaccac gggccaggcc tcctcgctgc tggggggcag gctcctgggg480cagagtgccg cgagctgcca tcacgcctac atcgtgctct gcattgagaa cagcttcatg540actggctcca agtagggaat c 561<210>2<211>645<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sig_peptide<222>(1)…(84)<400>2ggaagatcta tggccccctt tgagcccctg gcttctggca tcctgttgtt gctgtggctg60atagccccca gcagggccgt cgacatgcac agccaccgcg acttccagcc ggtgctccac120ctggttgcgc tcaacagccc cctgtcaggc ggcatgcggg gcatccgcgg ggccgacttc180cagtgcttcc agcaggcgcg ggccgtgggg ctggcgggca ccttccgcgc cttcctgtcc240tcgcgcctgc aggacctgta cagcatcgtg cgccgtgccg accgcgcagc cgtgcccatc300gtcaacctca aggacgagct gctgtttccc agctgggaga ctctgttctc aggctctgag360ggtccgctga agcccggggc acgcatcttc tcctttgacg gcaaggacgt cctgaggcac420
cccacctggc cccagaagag cgtgtggcat ggctcggacc ccaacgggcg caggctgacc480gagagctact gtgagacgtg gcggacggag gctccctcga ccacgggcca ggcctcctcg540ctgctggggg gcaggctcct ggggcagagt gccgcgagct gccatcacgc ctacatcgtg600ctctgcattg agaacagctt catgactggc tccaagtagg gaatc64权利要求
1.一种能分泌内皮抑素的细胞制剂，其特征在于在体外，用分泌性内皮抑素的重组腺病毒载体感染原代培养的成纤维细胞而制得。
2.根据权利要求1所说的能分泌内皮抑素的细胞制剂，其特征在于由以下具体步骤制得1)构建含有信号肽的人内皮抑素序列，2)用上述1)中得到的序列构建分泌性内皮抑素的重组腺病毒载体，3)用上述2)中得到的重组腺病毒载体感染预先原代培养的成纤维细胞，即得到能分泌内皮抑素的细胞制剂。
3.根据权利要求2所说能分泌内皮抑素的细胞制剂，其特征在于所说的步骤3)为用重组腺病毒载体感染预先原代培养的成纤维细胞，体外培养至感染率达90％以上。
4.权利要求1-3所说的能分泌内皮抑素的细胞制剂，在制备治疗肿瘤的药中的应用。
5.根据权利4所说的能分泌内皮抑素的细胞制剂在制备治疗肿瘤的药中的应用，其特征在于其中所说的成纤维细胞来源于肿瘤患者自体。
全文摘要
本发明涉及一种能分泌内皮抑素的细胞制剂，以及该制剂在治疗肿瘤中的应用。所说的细胞制剂，是在体外，用分泌性内皮抑素的重组腺病毒载体感染原代培养的成纤维细胞而制得。该细胞制剂用于制备治疗肿瘤的药物，此药物的应用，可以避免内皮抑素体外易失活和需反复注射的缺点，能起到在体内直接表达内皮抑素，分泌出细胞，明显抑制肿瘤生长的作用。
文档编号C12N5/10GK1872347SQ200610039268
公开日2006年12月6日 申请日期2006年4月3日 优先权日2006年4月3日
发明者李朝军, 陆上苏, 王毅谦 申请人:南京师范大学