专利名称：一种致奶牛乳房炎葡萄球菌培养液的配制方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于动物疫病诊断和防治技术领域。
背景技术：
奶牛乳房炎发病率高，危害性大，是影响世界奶牛业发展的最主要疾病之一。据国际牛奶联合会资料记载，大约有50％的母牛患乳房炎，其中大约有2％患临床型乳房炎，48％患隐性乳房炎。我国临床型乳房炎发病率33.41％(9.7％～55.6％)，隐性乳房炎的检出率为50-80％。临床型乳房炎具有泌乳量下降、乳房肿胀、乳汁变质等明显的临床症状，而隐性乳房炎的乳房和乳汁外观虽无可见的肉眼变化，但常常造成原料奶的品质下降，威胁人们的身体健康。据估计，我国每年因乳房炎所造成的经济损失超过3.16亿元。引起乳房炎的病原微生物主要包括金色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、牛乳房链球菌、大肠杆菌、克雷伯氏菌、绿脓杆菌以及其他一些真菌、病毒等。但在这些病原体中，以金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，约占整个奶牛乳房炎病例90％以上。
奶牛乳房炎的治疗以抗生素为主，但由于抗生素的不规范使用，已导致牛奶中抗生素残留、耐药菌株普遍、无药可治乳房炎病例增多等严重问题。造成这种现象的主要原因是由于奶牛场经济、技术和实验条件的限制，在用抗菌素防治奶牛乳房炎前很少进行必要的细菌分离和药物敏感试验，仅靠兽医的喜好和经验，长期、盲目和超量使用抗菌素。
目前国内外通常使用的药敏试验方法主要有纸片扩散法、肉汤稀释法、琼脂稀释法、自动化药敏仪法和Etest法。其中，纸片扩散法是通过测量抑菌圈的直径来判定细菌对抗生素的敏感或耐受，最大优点是费用低和药物选择灵活，但存在受接种菌量、孵育时间、抗生素含量及扩散力、平皿厚度等多种因素影响，需要严格进行标准化，才能确保结果的可靠性，而且具有耗时、费力和不适用厌氧菌和苛氧菌等缺点；肉汤稀释法和琼脂稀释法是将抗生素倍比稀释在肉汤或琼脂中来定量测定最低抑菌浓度(MIC)的方法，其优点是可精确测定一些厌氧菌和苛氧菌对抗生素的敏感性，而且一套试管可测多株细菌，但具有耗时和费力等缺点；自动化药敏仪是通过检测浊度、荧光指示剂的荧光强度或荧光底物的水解反应来判读结果，具有快速和强大统计分析功能等优点，但具有药物选择缺乏灵活性、难以检测某些特殊菌和仪器价格昂贵等缺点；Etest法结合扩散法和稀释法的优点，用含有连续浓度梯度抗生素塑料条检测细菌的敏感性，具有精确、可靠、稳定性好等优点，可用于多种细菌的药敏试验，唯一缺点是价格昂贵。
对于致奶牛乳房炎葡萄球菌的药敏试验，目前国内外常用的方法是将无菌采集的奶样接种绵羊血琼脂平板，37℃培养18-48小时后根据菌落形态和溶血特点做出初步鉴定，再挑取可疑菌落进行凝固酶等生化试验进行确认，最后用典型菌落在Mueller-Hinton(MH)等琼脂平板上进行纸片法药敏试验，或用肉汤稀释法进行MIC的测定。这些方法不仅至少需要3-5天才能得出结果，具备必要的细菌学鉴定的设备、试剂和技术条件，而且用单菌落进行的药敏试验结果有时不能真实反映细菌“群体”对抗生素的敏感性。至于自动化药敏仪法和Etest法，由于价格很贵难以被国内兽医临床和奶牛场接受。
发明内容
本发明一个目的是提供一种能快速对奶牛奶样中葡萄球菌选择性扩培的致奶牛乳房炎葡萄球菌培养液的配制方法。
本发明先将10g蛋白胨、5g酵母粉、10g丙酮酸钠、12g甘氨酸、5g氯化锂完全溶解于980ml水中，再用氢氧化钠溶液调pH至7.3，然后，于121℃下灭菌，冷却至50℃±10℃时加入无菌1％亚碲酸钾溶液10ml和7ml吐温80(Tween-80)，4℃保存。
本发明中另一目的是提供上述致奶牛乳房炎葡萄球菌培养液的用途用途之一是用于鉴别致奶牛乳房炎葡萄球菌的方法将上述方法获得的培养液分装于培养板孔，接种奶样，在37℃条件下培养24小时，培养液出现产生黑色产物并浑浊，判断奶样中有葡萄球菌。
用途之二是用于致奶牛乳房炎葡萄球菌的药敏试验在包被有国际标准MIC抗生素的培养板孔加入上述方法获得的培养液，再接种奶样，在35℃条件下培养24小时，测定葡萄球菌对抗生素的敏感性。
本发明在葡萄球菌选择培养Baird-Parker培养基基础上，用酵母粉代替牛肉膏和酵母膏，用吐温80(Tween-80)代替卵黄液，即为呈透明状葡萄球菌培养液，命名为mBP培养液，如再加入1.5％琼脂粉即为mBP琼脂平板，可用于致奶牛乳房炎葡萄球菌快速选择/鉴别。不仅能保证葡萄球菌生长的营养需要和非葡萄球菌生长的抑制，而且使培养液透明，以便根据细菌培养后培养液是否浑浊和产生黑色产物判断有无葡萄球菌生长。
在判断奶样中有无葡萄球菌时，经培养24小时后，培养液出现黑色产物和浑浊，则，可明确奶样中有葡萄球菌。如培养液仍然为透明液体，则，奶样中无葡萄球菌。
在测定葡萄球菌对抗生素的敏感性时，经培养24小时后，根据培养液是否产生黑色产物和浑浊判断有无葡萄球菌生长及对相应抗生素的敏感性或耐药性。
本发明是在现有葡萄球菌选择培养基的基础上，通过对培养基配方和培养方法的改进，研制出能直接用临床奶样进行葡萄球菌快速鉴别和药敏试验的方法，其显著优点是快速、准确、价廉和不需复杂的仪器设备，特别适合国内中小型奶牛场和基层兽医使用。
图1为金黄色葡萄球菌在mBP培养液和普通肉汤中的生长曲线图。
具体实施例一、配制mBP培养液用天平分别称取蛋白胨10g、酵母粉5g、丙酮酸钠10g、甘氨酸12g、氯化锂5g于玻璃容器中，加水980ml，搅拌均匀和完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7.3，在121℃高温下灭菌15分钟，冷却至50℃±10℃时加入过滤除菌的1％亚碲酸钾溶液10ml和7ml吐温80(Tween-80)，然后4℃保存，备用。
二、葡萄球菌的快速鉴别根据临床检查或加州乳房炎试验(CMT)检测结果初步判断患临床型或隐性乳房炎奶牛，用常规挤奶法挤去前三把奶，用常规消毒液消毒乳头及其附近区域，用酒精棉球消毒乳头。将消毒试管盖打开，一手将试管保持水平状态，另一手挤奶，并使奶“射入”试管中，立即盖好试管盖，置于冰浴中立即带回实(检)验室。在无菌工作台内打开无菌的24或96孔培养板，将mBP培养液分培养板的各孔中，每孔200μl，向每孔中加入未稀释或用生理盐水适当稀释的奶样10μl，盖好盖后37℃静置培养24小时，根据培养液是否浑浊和产生黑色产物判断有无葡萄球菌生长。
三、葡萄球菌的快速药敏试验1、抗生素浓度的确定及培养板包被参照国际标准美国临床实验室标准化委员会(NCCLS20012)推荐的纸片扩散法抑菌试验方法及判断标准，筛选出对所试抗菌素敏感的金黄色葡萄球菌若干株，将其在普通琼脂平板上进行纯培养，分别挑取单个菌落接种2ml营养肉汤，37℃培养12小时后供MIC测定用。将0.5、1、2或3倍于标准MIC的抗生素、200μl mBP培养液和10μl葡萄球菌培养物加入96孔培养板的各孔中，35℃培养24小时后，根据无敏感葡萄球菌生长(培养液不浑浊和无黑色产物)确定药敏试验所需的抗生素MIC。将抗生素配成1000倍于校正后的MIC，分装于无菌的96孔培养板各孔中，在无菌工作台内吹干或冷冻干燥后，4℃保存备用。
2、葡萄球菌的快速药敏试验在无菌工作台内，将mBP培养液分装于包被有抗生素的96孔培养板，每孔200μl，分别向各孔中加入10μl葡萄球菌初次选择培养物或乳房炎奶样，35℃培养24小时，根据培养液是否浑浊和产生黑色产物判断有无葡萄球菌生长以及对相应抗生素是否敏感。
三、对比试验1、金黄色葡萄球菌在mBP培养基中的生长情况将25株从乳房炎患牛分离的金黄色葡萄球菌划线接种mBP琼脂平板，37℃培养24小时后，细菌生长成典型的葡萄球菌菌落，直径为0.5-1.5mm，边缘半透明，中心黑色。挑取典型菌落制成细菌涂片，经革兰氏染色后镜检，为典型的葡萄串状。挑取典型菌落进行生化实验，25株细菌均表现为血浆凝固酶阳性，接触酶阳性，7.5％高盐生长阳性。
挑取金黄色葡萄球菌典型菌落接种营养肉汤，37℃培养24小时后，以1％的比例接种mBP培养液，在37℃培养过程中，每隔2小时取一次样，用分光光度计测OD600值，以OD600值为纵坐标，培养时间为横坐标描绘生长曲线。从细菌生长曲线(图1)上可以看出，金黄色葡萄球菌在mBP培养液中的生长动态与在营养肉汤中基本相似，4小时后进入对数生长期，14小时进入生长平台期，24小时后生长率下降。
2、mBP培养基的选择特性分别将金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草杆菌、猪丹毒杆菌、链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、变形杆菌、多杀性巴氏杆菌、绿脓杆菌、痢疾志贺氏菌接种含5％小牛血清的营养肉汤，37℃培养24小时后，分别取100μl培养物涂布于mBP琼脂平板，37℃培养24小时，除金黄色葡萄球菌外，其它细菌均未见可见生长。分别取上述细菌的营养肉汤培养物20μl，接种入2ml mBP培养液中，37℃培养24小时后，除金黄色葡萄球菌接种管外，其余细菌接种管培养液的颜色和浑浊度均未发生变化，表明仅金黄色葡萄球菌能在mBP培养液中生长。
将20μl金黄色葡萄球菌肉汤培养物、200μl大肠杆菌肉汤培养物和链球菌肉汤培养物混合，取40μl接种入4ml mBP培养液，37℃培养24小时后，分别取100μl培养物涂布链球菌和大肠杆菌选择培养基，37℃培养48小时后，未见大肠杆菌和链球菌生长，进一步证明mBP培养液对大肠杆菌和链球菌生长具有很强的抑制作用。
金黄色葡萄球菌在mBP培养液和普通肉汤中的生长曲线如图1所示，图中，纵坐标为细菌培养物的光吸收值，横坐标为培养时间(小时)；选择性表示金黄色葡萄球菌在快速选择/鉴别mBP培养液中的生长曲线；普通表示金黄色葡萄球菌在营养肉汤中的生长曲线。
3、用mBP培养液分离葡萄球菌的灵敏度以1∶9的比例，用生理盐水将金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物进行连续10倍稀释，直至10-8，从每管中吸取50μl接种入1ml mBP培养液，从最后三管中吸取100μl涂布营养琼脂，37℃培养24小时后，1-7管(10-1-10-7)中均有浑浊和黑色产物，说明有葡萄球菌生长，菌落计数结果显示，mBP培养液分离葡萄球菌的灵敏度为60个细菌。
4、mBP培养液对临床奶样中葡萄球菌的分离效果根据临床诊断和奶样体细胞检测(CMT法)结果，无菌采集临床型和隐性奶牛乳房炎奶样4份，用常规的绵羊血琼脂平板分离法和生化试验确定为金黄色葡萄球菌感染奶样，将其适当稀释后分别接种mBP培养液、mBP琼脂平板和营养琼脂平板，37℃培养24小时后，mBP培养液中有金黄色葡萄球菌生长，培养物明显浑浊，并有黑色产物；菌落计数结果显示，mBP琼脂平板与营养琼脂平板上的金黄色葡萄球菌菌落数接近(表1)。
5、mBP培养液成分对抗生素抑菌活性的影响用从临床奶样中分离到的金黄色葡萄球菌7株，参照NCCLS20012葡萄球菌属纸片扩散法药敏试验方法及判断标准，在MH培养基上进行药敏试验，确定7株金黄色葡萄球菌对7类8种抗生素的敏感性(表2)。将上述金黄色葡萄球菌在普通琼脂平板上培养，分别挑取单个菌落接种2ml营养肉汤，37℃培养12小时后进行96孔培养板法药敏试验。将mBP培养液分装96孔培养板，每孔200μl，将0.5、1、2或3倍于标准MIC的抗菌素加入相应孔中，每孔接种10μl金黄色葡萄球菌营养肉汤培养物，35℃培养24小时后，根据培养液是否浑浊和产生黑色产物判断有无葡萄球菌生长及其对相应抗生素的敏感性。如表3所示，以mBP培养液，用4个浓度的7类8种抗生素在96孔培养板上进行的药敏试验结果与标准的纸片扩散法结果一致，表明mBP培养液成分对所试抗生素的抑菌效果无明显影响。
6、用mBP培养液进行快速药敏试验根据临床检查和奶样体细胞CMT检测结果，采集乳房炎阳性奶样7份，将每份奶样一分为二，分别用于纸片扩散法药敏试验和以mBP为培养液的快速药敏试验。将mBP培养液分装于包被有标准MIC抗生素的96孔板，每孔200μl，向各孔中分别加入10μl临床奶样，35℃培养24小时后，根据培养液是否浑浊和产生黑色产物判断有无葡萄球菌生长及其对相应抗生素的敏感性，结果显示两种药敏试验方法结果一致(表4)。
以上试验结果表明mBP培养液(基)对致奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌具有很强的选择特异性、灵敏度和鉴别能力。将mBP培养液与24或96孔细菌培养板组合，建立了致奶牛乳房炎葡萄球菌的快速鉴别方法，只要将培养液分装于培养板孔、接种微量奶样和经过24小时培养，即能明确得出是否为葡萄球菌感染的结论。将包被有国际标准MIC抗生素的96孔培养板与mBP培养液组合，建立了致奶牛乳房炎葡萄球菌的快速药敏试验方法，只要将培养液分装、接种微量样品和24小时培养，即能明确知道葡萄球菌对何种抗生素敏感或耐药，不仅可用于葡萄球菌纯培养的药敏试验，更重要的是能直接用临床奶样进行药敏试验，其特出优点是快速、简便、价廉和不需专门仪器设备，特别适合奶牛场和临床兽医使用。
表1用不同培养基从临床奶样中分离葡萄球菌的效果比较 注+++表示奶样CMT检测结果，为强阳性隐性乳房炎；+表示葡萄球菌生长阳性。
表2国际标准NCCLS20012关于金黄色葡萄球菌纸片扩散法药敏试验及相关MIC的解释 S代表敏感，I代表中度敏感，R代表不敏感(耐药)。
表37株金黄色葡萄球菌对7种抗生素的敏感性(标准纸片扩散法)
结果表明，大鼠灌服玉参多糖50、100、200mg/kg后，明显抑制ADP、花生四烯酸及胶原诱导的血小板聚集，与对照组比较对ADP、诱导的血小板聚集抑制率分别为16％(P＞0.05)、31％(P＜0.01)、37％(P＜0.001)；对花生四烯酸诱导的血小板聚集抑制率分别为31％(P＜0.01)、36％(P＜0.001)、48％(P＜0.001)、对胶原诱导的血小板聚集抑制率分别为18％(P＜0.05)、20％(P＜0.05)、38％(P＜0.001)；阳性药物阿司匹林抑制作用明显。
六.对小鼠凝血时间的影响昆明种小鼠，雌雄兼用，体重18-22g，随机分为6组，每组10只，分别为溶剂对照组(1％CMC-Na)、玉参多糖200、400、800mg/kg组，阿司匹林200mg/kg组及天保宁200mg/kg，组，每鼠给药体积均为0.2ml/10g，连续灌胃7天，于末次给药后1小时分别剪断小鼠尾尖3mm，待血液自行溢出开始计时，每隔30秒用滤纸吸去血滴一次，直至血液自然停止(滤纸吸时无血)为止，即为该鼠的凝血时间。结果见表8。
表8玉参多糖对小鼠凝血时间的影响(X±SD)
注与对照组比较*p＜0.05**p＜0.01；与等剂量阿司匹林组比较无显著差异结果表明，小鼠灌服玉参多糖400、800mg/kg后，与对照组比对，明显延长小<p>取中密度纤维板，均匀涂布实施例1～6所得防腐防霉剂(以空白不涂布防腐防霉剂以及涂布竹醋液作为对照)，置于野外自然条件下，观察纤维板开始霉变的时间，结果如表1表1木材防腐防霉实验数据
由表中数据可以看出，运用本发明防腐防霉剂，板材霉变时间与竹醋液处理和以水为基质制得防腐防霉剂处理的板材的霉变时间均有不同程度的推迟。
实施例14竹材防腐防霉效果实验取新鲜竹材，浸泡实施例7～12所得防腐防霉剂(以空白未处理为对照)，于室内温度25℃、湿度95％条件下，观察四周，记录竹材开始霉变的时间，结果见表2表2竹材防腐防霉实验数据
权利要求
1.一种致奶牛乳房炎葡萄球菌培养液的配制方法，其特征在于先将10g蛋白胨、5g酵母粉、10g丙酮酸钠、12g甘氨酸、5g氯化锂完全溶解于980ml水中，再用氢氧化钠溶液调pH至7.3，然后，于121℃下灭菌，冷却至50℃±10℃时加入无菌1％亚碲酸钾溶液10ml和7ml吐温80，4℃保存。
2.根据权利要求1所述的致奶牛乳房炎葡萄球菌培养液用于鉴别致奶牛乳房炎葡萄球菌的方法，其特征在于将培养液分装于培养板孔，接种奶样，在37℃条件下培养24小时，培养液出现黑色产物和浑浊，判断奶样中有葡萄球菌。
3.根据权利要求1所述的致奶牛乳房炎葡萄球菌培养液用于致奶牛乳房炎葡萄球菌的药敏试验，其特征在于在包被有国际标准MIC抗生素的培养板孔加入培养液，再接种奶样，在35℃条件下培养24小时，测定葡萄球菌对抗生素的敏感性。
全文摘要
一种致奶牛乳房炎葡萄球菌培养液的配制方法及其用途，属于动物疫病诊断和防治技术领域。先将10g蛋白胨、5g酵母粉、10g丙酮酸钠、12g甘氨酸、5g氯化锂完全溶解于980ml水中，再用氢氧化钠溶液调pH至7.3，然后，于121℃下灭菌，冷却至50℃±10℃时加入无菌1％亚碲酸钾溶液10ml和7ml吐温80，4℃保存，制成的培养液可用于快速鉴别致奶牛乳房炎葡萄球菌和乳房炎葡萄球菌的药敏试验。
文档编号C12Q1/04GK1858234SQ20061003881
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月14日 优先权日2006年3月14日
发明者孙怀昌, 仇华磊, 钱科, 张鑫宇 申请人:扬州大学