专利名称：用离子液体提取分离蛋白质和/或酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质和/或酶提取分离的方法，特别是涉及一种用离子液体提取分离蛋白质和/或酶的方法。
背景技术：
蛋白质与酶是十分重要的生命物质，其应用范围十分广泛，包括医药、食品、化工、化妆品、日用品、农业等各个领域。蛋白质与酶的提取分离是人们一直以来都十分重视的课题，其提取分离方法很多，如有机分子溶剂萃取分离、膜分离、反胶束萃取、超临界流体萃取分离、离子交换分离、沉淀分离等。传统的方法是利用大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。但是这些方法总是或多或少地存在着一些不足，见表1。
表1 蛋白质(包括酶)传统提取方法的不足
室温离子液体(Room temperature ionic liquids，RTILs)，常被简称为离子液体，又称室温熔融盐。是指在室温或室温附近温度下呈液态的仅由离子组成的物质，它作为一种对环境友好的溶剂，正在被人们认识和接受。组成离子液体的阳离子一般为有机阳离子(如烷基咪唑阳离子、烷基吡啶阳离子、烷基季铵离子、烷基季鏻离子等)，阴离子可为无机阴离子或有机阴离子(如[PF6]-、[BF4]-、[AlCl4]-、[CF3SO3]-等)。自1914年发现第一个离子液体—硝基乙胺以来，特别是在20世纪80年代中期至今的这段时间，离子液体在许多领域的研究都呈现出非常活跃的态势。离子液体的研究大体可分为两个阶段(1)1992年以前的研究主要集中于氯代铝酸盐类离子液体，这类离子液体对空气、水分较为敏感，易于水解，需要无氧无水操作，使用条件较为苛刻，因而限制了它的开发和应用；(2)近年来所进行的研究主要集中在对空气和水不敏感的非氯代铝酸盐类离子液体体系的研究和开发。
较传统的液态物质相比，离子液体具有以下几个无与伦比的优势(1)一般不会成为蒸气，不易挥发，从而在使用过程中不会给环境造成很大污染；(2)具有较大的稳定温度范围(-100～200℃，部分学者认为离子液体的液程可达400℃)，较好的化学稳定性、较宽的电化学稳定电位窗口、热稳定性和极好的抗氧化性；(3)离子液体的溶解性、液体状态范围等物化性能，取决于阴、阳离子的构成和配对，可根据需要，定向设计离子液体体系，调节其对无机物、水、有机物及聚合物的溶解性，使许多化学反应得以在均相中完成，且反应器体积大为减小，并且其酸度可调至超酸性。(4)离子液体可以反复多次使用。(5)它还可用作新材料生产过程中的酶催化剂。威尔克斯最近还发现，离子液体还可以用于处理废旧轮胎，回收其中的聚合物。科学家最近的研究成果还表明，用离子液体可有效地提取工业废气中的二氧化碳。(6)密度大，与许多溶剂不互溶。当用另一溶剂萃取目标物时，通过重力作用，就可实现溶剂和目标物的分离，从而保证溶剂和催化剂的高效使用。目前应用较多的一些领域主要有催化和有机合成领域、分离分析领域、电化学中的电镀电沉积及导电材料和电化学器件、新型材料领域中的敏感材料及润滑材料等、生命科学领域中的药物合成与筛选等。
离子液体在萃取分离中的应用分离提纯回收产物一直是合成化学的难题。用水萃取分离只适用于亲水性产物，蒸馏技术也不适用于挥发性差的产物，使用有机溶剂又会引起交叉污染。因此，设计安全的、环境友好的分离技术显得越来越重要。离子液体由于具有独特的理化性能，非常适合作为分离提纯的溶剂。尤其是在液-液萃取分离上，离子液体能溶解某些有机化合物、无机化合物和有机金属化合物，同时与多数有机溶剂不混溶，非常适合作为液-液萃取的新的介质。目前的研究多数是用离子液体从水溶液中萃取有机或无机物，萃取物不同所选离子液体也不同。
用离子液体萃取挥发性有机物时，因离子液体蒸气压低，热稳定性好，萃取完成后将萃取相加热，即可把萃取物赶出，离子液体易于循环使用。Huddlestou等用与水不溶的离子液体1-甲基-3-丁基咪唑六氟磷酸盐([BMIm][PF6])从水中萃取苯的衍生物如甲苯、苯胺、苯甲酸、氯苯等。结果显示，不同pH下多种有机酸和碱的分配系数完全相反，这与溶液中溶质的质子化状态直接相关的。分配系数的大小随溶液的pH的变化在1.0上下波动。通过调节溶液的pH，可以控制某种溶质在两相间的分配状态，因而提高了萃取过程的可调节性。离子液体作为萃取剂也可应用于工业生产，如在生产生物燃料的重要方法丙酮-乙醇-丁醇发酵法中，产物中的乙醇通过蒸馏除去，丁醇由于沸点较高，常采用萃取分离的方法加以分离。常用的萃取剂包括三丁基膦、1-辛醇和乙醚，它们的分配系数分别为14.6、7.6和4.1。三丁基膦虽然有较高的分配系数，但对发酵微生物有较大毒性。Faddev等发现使用[BMIm][PF6]和[OMIm][PF6](1-甲基-3-辛基咪唑六氟磷酸盐)作为丁醇的萃取剂时，分配系数分别可以达到25.7和55.3，而且萃取剂对发酵微生物几乎没有毒性。这些研究显示了离子液体在有机物分离中的巨大优势，但目前利用离子液体提取分离蛋白质和/或酶的报导尚不多见。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题提供一种用离子液体提取分离蛋白质和/或酶的方法。
本发明的目的是通过下列技术措施实现的一种蛋白质和/或酶提取分离的方法，包括下列步骤a.原料预处理；b.加入适量含离子液体的萃取剂；c.萃取液离心、过滤，滤液经纯化，浓缩即可。
所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其中原料预处理的方法为除杂、调节[H+]＝3～10-14mol/L、调节水分为0％～90％、控制温度-5℃～85℃、环境中不含有毒有害物质和避免阳光照射。
所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其中原料为含有蛋白质和/或酶的生物体或其组织、化学制品、生物制品、生物化学制品、食品、药物及其中间体。
所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其中含离子液体的萃取剂是通过下列方法制备得到配制比例为按重量百分比计，在萃取剂中离子液体所占份额为15％～99％，辅助剂所占份额为1％～85％，且离子液体与辅助剂份额之和为100％；将离子液体、辅助剂混合均匀即可。
所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其中离子液体采用非氯代铝酸盐类离子液体。
所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其中离子液体是咪唑类离子液体、胍类离子液体、季鏻类离子液体、季铵类离子液体或吡啶类离子液体中的一种或多种。
所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其中离子液体的密度为1.1～1.6g/cm3，密度与温度之间为线性关系。
所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其中辅助剂为中性溶剂、酸性溶剂、碱性溶剂或酸度调节剂中的一种或多种。
所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其中辅助剂中中性溶剂是水、乙酸甲酯、乙酸乙酯、甲酸乙酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、己烷；酸性溶剂是磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸；碱性溶剂是乙胺、丙胺、吡啶、甲基吡啶；酸度调节剂是碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢钠、硫酸氢铵、盐酸、氢氧化钠。
所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其中纯化的方法采用电泳法或柱层析法。
本发明的有益效果本发明采用了新型绿色萃取分离剂——离子液体，该物质具有一系列突出优越性①无色、无臭、几乎无毒，不挥发，几乎无蒸气压。②有良好的热稳定性，热稳定温度范围宽。不易燃，粘度不大，流动性好。起始分解温度一般在400℃左右，呈液态时稳定温度区间约300℃，是一般分子溶剂不可比拟的。③离子液体可溶解的物质范围广，可溶解许多无机、有机、有机金属、合成或天然高分子材料、生物活性物质，且溶解度相对较大。④离子液体具有较大的极性可调控性，粘度比一般有机溶剂或水的粘度高1～2个数量级，但仍具有良好的流动性，可形成二相或多相体系，适合作分离溶剂或构成反应-分离耦合新体系。⑤离子液体的密度一般为1.1～1.6g/cm3，密度与温度之间为线性关系。⑥常温下离子液体的导电系数为10-1Ω-1·m-1左右，通常离子小，粘度低，密度大，则导电性好。其电化学稳定电位窗口之宽(4V左右)是一般溶剂不具备的。⑦离子液体作为一种绿色环保溶剂或催化剂不仅是在溶剂或催化剂性能上具有环境安全性，而且自身可生物降解是环境安全物质。⑧离子液体与某些离子等还有较强的配位活性。
本发明提供的用离子液体提取分离蛋白质和/或酶的方法，既克服了传统萃取的不安全、萃取剂回收重复利用率低和保活性差的缺点，也避免了超临界萃取方法的苛刻条件和不安全隐患。本发明提取分离高效、快捷，萃取剂安全，可以多次反复使用，提取分离的蛋白质(酶)能够保持活性，并且具有将提取与分离合二为一，操作简捷方便等优点。
图1是本发明工艺流程图。
具体实施例方式
以下通过实施例来对本发明进行更为详细的描述。所述的提取分离工艺流程和萃取剂制备方法仅供参考，但不意味着对本发明的限制。
以下实施例中的萃取剂(离子液体+辅助剂)可以反复使用10次以上。制备萃取剂时采用搅拌机、乳化机或超声波将各组分混合均匀即可。实施中未注明具体条件和步骤的破碎、分离、过滤、纯化、超声波震荡、蛋白质纯度测定等方法均为本领域普通技术人员熟知的技术。
实施例1提取植物蛋白质。以1000g大豆粕为原料，进行原料预处理，包括破碎、过筛、除杂，用蒸馏水调节原料含水量为1.0％～3.0％(w/w)、控制温度在15℃～45℃、用碳酸氢钠调pH6.5～9.5，注意环境中不含有毒有害物质和避免阳光照射，以免对蛋白质活性造成影响。加入萃取剂(按重量百分比计，萃取剂由占萃取剂总重量88.5％的六烷基胍氟硼酸盐、4％丁酸乙酯、5％乙醇以及2.5％醋酸组成，使用前混合均匀备用)5000g(分3次进行萃取，第一次萃取剂的用量为总量的40％，第二、三次均为30％)，在振荡器振荡下提取3～5h，然后于离心机上在5000r/min下进行10min左右的离心分离，过滤，并对滤液再次进行调节水分至5±0.5％、pH3.5～5.5，然后再离心、过滤，滤液为粗品，再用电泳法进行纯化(纯化的方法是本领域普通技术人员公知的方法，以下同)，纯化料用真空冷冻干燥法浓缩制得大豆蛋白质产品。经测定，该法提取率达85.6％以上，蛋白质产品的纯度(以GB/T5009.5-1996国标规定的凯氏定氮法测定)达到97.8％以上。
实施例2提取植物蛋白质。以1000g小麦为原料，进行预处理，包括粉碎、过筛、用蒸馏水调节原料含水量为60±5％(w/w)、控制温度为40±5℃、用磷酸氢钠调pH6.5～9.5，注意环境中不含有毒有害物质和避免阳光照射。加入萃取剂(按重量百分比计，萃取剂由占萃取剂总重量88.5％的六烷基胍氟磷酸盐离子液体、10％丙酸甲酯、1％己烷以及0.5％丁酸组成，使用前混合均匀备用)4000g(分3次进行萃取，第一次萃取剂的用量为总量的40％，第二、三次均为30％)，在振荡器振荡下提取3～5h，然后于离心机上在5000r/min下离心10min，过滤，并对滤液调节水分至5±1％、pH4.5±1，然后离心过滤，滤液为粗品，再用柱层析法进行纯化(纯化的方法是本领域普通技术人员公知的方法，以下同)，纯化料用真空冷冻干燥法浓缩制得大豆蛋白质产品。经测定，该法提取率达87％以上，蛋白质产品的纯度(以GB/T5009.5-1996国标规定的凯氏定氮法测定)达到98.1％以上。
实施例3提取动物蛋白质。以500g猪血粉为原料，先除去杂质、再超声破碎、碳酸氢钠调节pH7.5～9.0、调节水分0.1％～2.0％(w/w)、温度10℃～15℃，注意环境中不含有毒有害物质和避免阳光照射。加入萃取剂(按重量百分比计，萃取剂由占萃取剂总重量25％的1-甲基-3-丁基咪唑四氟硼酸盐和55％的1-甲基-3-辛基咪唑六氟磷酸盐组成的离子液体、3％磷酸二氢钠、7％硫酸氢铵、1％甲酸乙酯、9％丙酮组成，使用前混合均匀备用)，萃取剂的用量为原料质量的10倍(分3次进行提取，第一次萃取剂的用量为总量的40％，第二、三次均为30％)，在超声振荡下提取20min，然后于离心机上在6000r/min下进行10min左右的离心分离，过滤，并对滤液调节水分至10±2％、pH4.5～6.0，5％石英粉助沉淀，然后再离心过滤，滤液为粗品，再用电泳法进行纯化，纯化料用真空冷冻干燥法浓缩制得大豆蛋白质产品。经测定，该法提取率达90.2％以上，蛋白质产品的纯度(以GB/T5009.5-1996国标规定的凯氏定氮法测定)达到98.3％以上。
实施例4提取动物蛋白质。以500g猪血粉为原料，先除去杂质、再超声破碎、磷酸氢钠和磷酸钠调节pH8.5～9.0、水分0.1％～2.0％(w/w)、温度10℃～15℃，注意环境中不含有毒有害物质和避免阳光照射。加入萃取剂(按重量百分比计，萃取剂由占萃取剂总重量65％的1-辛基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐和15％的N-丁基吡啶四氟硼酸盐组成的离子液体、5％磷酸氢钠、5％硫酸氢铵、3％乙酸甲酯、7％丙酮组成，使用前混合均匀备用)，萃取剂的用量为原料质量的5倍(分3次进行提取，第一次萃取剂的用量为总量的40％，第二、三次均为30％)，在超声振荡下提取80min，然后于离心机上在4000r/min下进行10min左右的离心分离，过滤，并对滤液进行调节水分至8±3％、酸度pH4.5～5.5、3％石英粉助沉淀，然后再离心过滤，滤液为粗品，再用柱层析法进行纯化，纯化料用真空冷冻干燥法制得蛋白质产品。经测定，该法提取率达91.2％以上，蛋白质产品的纯度(以GB/T5009.5-1996国标规定的凯氏定氮法测定)达到98.5％以上。
实施例5提取酶。以100g活力≥100U/g的纤维素酶液为原料，粗滤除杂、用浓度为10％的磷酸调节pH3.5～4.5、水分60±5％(w/w)、温度25℃～30℃、注意环境中不含有毒有害物质和避免阳光照射。加入萃取剂(按重量百分比计，萃取剂由占萃取剂总重量由50％的1-甲基-3-丁基咪唑六氟硼酸盐离子液体、7％磷酸二氢钠、8％硫酸氢铵、5％甲酸和30％甲醇，使用前混合均匀备用)500g，在超声振荡器振荡下提取，提取时间60min，然后于离心机上在5000r/min下进行10min的离心分离，过滤，滤液再次调节水分至20±5％、酸度pH4.5～5.0，然后离心过滤，滤液为粗品，再用柱层析法进行纯化，纯化料用真空冷冻干燥法浓缩制得纤维素酶产品。经测定，该法提取率达84.4％以上，纤维素酶产品的纯度(以滤纸糖滤纸法测定纤维素酶活力的测定结果进行表示)达到95.0％以上。
实施例6提取大肠杆菌蛋白质。以100g发酵后的大肠杆菌(E.coli)MC1061发酵液(OD260为0.5～0.6)为原料，预处理(包括除杂、调节pH7～8、水分80±5％、温度15℃～20℃，注意环境中不含有毒有害物质和避免阳光照射)后，加入萃取剂(按重量百分比计，萃取剂由占萃取剂总重量由65％的1-乙基-3-甲基咪唑三氟醋酸盐离子液体、10％碳酸钠、15％乙酸乙酯、10％乙醇，使用前混合均匀备用)300g，在超声振荡器振荡下提取，提取时间50min，然后于离心机上在5000r/min下进行20min的离心分离，过滤，滤液再次调节水分至65±5％、酸度pH7.5～8.0，然后离心、过滤，滤液为粗品，再用柱层析法进行纯化，纯化料用真空冷冻干燥法浓缩制得大肠杆菌蛋白质产品。经测定，该法提取率达91.2％以上，大肠杆菌蛋白质产品的纯度(以GB/T5009.5-1996国标规定的凯氏定氮法测定)达到92.4％以上。
实施例7提取土霉素。以100g发酵后的土霉素发酵液为原料，预处理(包括除杂、调节pH2.5～4、水分70±5％、温度-5℃～5℃，注意环境中不含有毒有害物质和避免阳光照射)后，加入萃取剂(按重量百分比计，萃取剂由占萃取剂总重量由60％的1-乙基-3-甲基咪唑乙基磺酸盐离子液体、5％碳酸钠、15％乙酸乙酯、20％乙醇，使用前混合均匀备用)300g，在超声振荡器振荡下提取，提取时间50min，然后于离心机上在6000r/min下进行15min的离心分离，过滤，滤液再次调节水分至35±5％、酸度pH5.5～6.0，然后离心、过滤，滤液为粗品，再用柱层析法进行纯化，纯化料用真空冷冻干燥法浓缩制得土霉素产品。经测定，该法提取率达92.2％以上，土霉素产品的纯度(以国标法GB/T14931.01-1996高效液相色谱(HLPC)法测定结果进行表示)达到93.6％以上。
实施例8提取酵母菌蛋白质。以100g发酵后的啤酒酵母菌短小芽杆菌的a—乙酸乳酸脱羧酶(aldc)发酵液(OD260为0.6～0.7)为原料，预处理(包括除杂、调节pH5.5～6.5、水分70±5％、温度-5℃～5℃、控制环境中不含有毒有害物质和避光)后，加入萃取剂(按重量百分比计，萃取剂由占萃取剂总重量由70％的四乙铵磺酸盐离子液体、8％碳酸氢钠、15％乙酸甲酯，7％甲基吡啶，使用前混合均匀备用)300g，在超声振荡器振荡下提取，提取时间60min，然后于离心机上在6000r/min下进行15min的离心分离，过滤，滤液再次调节水分至35±5％、酸度pH5.5～6.0，然后离心、过滤，滤液为粗品，再用柱层析法进行纯化，纯化料用真空冷冻干燥法浓缩制得酵母菌蛋白质产品。经测定，该法提取率达92.2％以上，酵母菌蛋白质产品的纯度(以GB/T5009.5-1996国标规定的凯氏定氮法测定)达到93.6％以上。
权利要求
1.一种蛋白质和/或酶提取分离的方法，其特征在于包括下列步骤a.原料预处理；b.加入适量含离子液体的萃取剂；c.萃取液离心、过滤，滤液经纯化，浓缩即可。
2.根据权利要求1所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其特征在于原料预处理的方法为除杂、调节[H+]＝3～10-14mol/L、调节水分为0％～90％、控制温度-5℃～85℃、环境中不含有毒有害物质和避免阳光照射。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其特征在于原料为含有蛋白质和/或酶的生物体或其组织、化学制品、生物制品、生物化学制品、食品、药物及其中间体。
4.根据权利1所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其特征在于含离子液体的萃取剂是通过下列方法制备得到配制比例为按重量百分比计，在萃取剂中离子液体所占份额为15％～99％，辅助剂所占份额为1％～85％，且离子液体与辅助剂份额之和为100％；将离子液体、辅助剂混合均匀即可。
5.根据权利1或4所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其特征在于离子液体是非氯代铝酸盐类离子液体。
6.根据权利5所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其特征在于离子液体是咪唑类离子液体、胍类离子液体、季鏻类离子液体、季铵类离子液体或吡啶类离子液体中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其特征在于离子液体的密度为1.1～1.6g/cm3，密度与温度之间为线性关系。
8.根据权利要求4所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其特征在于辅助剂为中性溶剂、酸性溶剂、碱性溶剂或酸度调节剂中的一种或多种。
9.根据权利要求8所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其特征在于辅助剂中中性溶剂是水、乙酸甲酯、乙酸乙酯、甲酸乙酯、丙酸甲酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、甲醇、乙醇、丙醇、丙酮、己烷；酸性溶剂是磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸；碱性溶剂是乙胺、丙胺、吡啶、甲基吡啶；酸度调节剂是碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸氢钠、硫酸氢铵、盐酸、氢氧化钠。
10.根据权利要求1所述的蛋白质和/或酶提取分离的方法，其特征在于纯化的方法采用电泳法或柱层析法。
全文摘要
本发明公开了一种用离子液体提取分离蛋白质和/或酶的方法。该方法包括下列步骤原料预处理，加入含离子液体的萃取剂，萃取液离心、过滤、纯化、浓缩即可。该方法采用离子液体为萃取剂主要成分，提取分离高效、快捷，萃取剂安全，可以多次反复使用，提取分离的蛋白质与酶能够保持活性，并且提取与分离步骤合二为一，操作简捷方便。
文档编号C12N9/00GK1807446SQ20061003851
公开日2006年7月26日 申请日期2006年2月27日 优先权日2006年2月27日
发明者刘晓庚, 鞠兴荣, 刘长鹏, 陈梅梅, 汪峰, 孙明, 汪海峰 申请人:南京财经大学