专利名称：源于hiv－1病毒的缺陷型慢病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型慢病毒载体，尤其是一种源于HIV-1病毒的缺陷型慢病毒载体。
背景技术：
非病毒载体转染效率较低，而用于人体实验的基因治疗方案大多数是以病毒学方法进行基因转移的，其中以逆转录科病毒和腺病毒载体最为成熟。腺病毒载体在基因治疗上取得很大的成就，它转染效率高、有足够大的宿主谱、能够感染静止细胞，但目的基因不整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，而且腺病毒本身的某些抗原性可引起人体免疫反应，阻止其重复转导。
现代医学研究证明，人很多人类疑难疾病都与基因有着直接的联系。对于癌症等发病率高和死亡率高的疾病，从基因入手设计的治疗方案，可以达到无毒副作用的效果。
在基因治疗中可使用基因技术，将基因导入到细胞中，不必用药疾病就可治愈。基因治疗尽管已取得较大进步，但有一些问题亟待解决，比如基因的引入载体和方法、靶基因的筛选、基因治疗的器官靶向性。这些问题的解决将为基因治疗带来突破性的进展，也为患者带来崭新的希望。尤其是基因引入的载体和方法是整个技术的关键，目的基因能否有效转入受体细胞，在很大程度上取决于所用的载体。
慢病毒属于逆转录病毒科，但其基因组结构复杂，除gag、pol和env这3个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外，还包括4个辅助基因，vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。HIV-1是慢病毒中最具特征性的病毒，第一个慢病毒载体系统即以此病毒为基础进行构建的。
第一代慢病毒载体的构建原理就是将HIV-1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式作用蛋白的序列进行分离。载体系统包括包装成分和载体成分包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能反式提供产生病毒颗粒所需的蛋白；载体成分与包装成分互补，含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用序列。同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插人的目的基因。为降低两种成分同源重组产生有复制能力的病毒(RCV)的可能性，将包装成分的5’LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子，3’LTR换成SV40 polyA位点等。将包装成分分别构建在两个质粒上，即一个表达gag和pol、另一个表达env。根据以上的原理构建了三质粒表达系统。三质粒表达系统包括包装质粒、包膜蛋白质粒和转移质粒。其中包装质粒在CMV启动子的控制下，表达HIV-1复制所需的全部反式激活蛋白，但不产生病毒包膜蛋白及辅助蛋白vpu；包膜蛋白质粒编码水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)，应用VSV-G包膜的假构型慢病毒载体扩大了载体的靶细胞嗜性范围，而且增加了载体的稳定性，允许通过高速离心对载体进行浓缩，提高了滴度。尽管如此，第一代慢病毒载体仍然具有以下明显的缺点①、病毒滴度低；②、能够感染的宿主范围窄；③产生RCL的机会相对较高，生物安全性较差。
第二代慢病毒载体是去除了第一代载体中可能使靶细胞停止生长的成分Vpr、能抑制靶细胞生长甚至长生凋亡的成分Vif和Nef，从而使得该载体更加安全。但第二代慢病毒载体仍然存在安全性问题。
为了满足基因治疗的需要，希望新一代的病毒载体符合以下特征1.高转染性，能有效感染分裂期细胞和未分裂期细胞载体应在体内能高效转染各种肿瘤细胞。尽管在既往肿瘤基因治疗中，人们曾认为只感染分裂期细胞载体可以靶向导入肿瘤细胞，但现在大多数研究者认为肿瘤不仅有处于分裂期细胞，也有处于未分裂期细胞，单杀灭处于分裂期肿瘤细胞，不足以杀灭所有的肿瘤细胞。因此载体应当能高效感染分裂期及未分裂期肿瘤细胞。
2.肿瘤细胞靶向性感染载体只能特异性感染肿瘤细胞，而不影响正常细胞。
3.肿瘤特异性及可调控表达目的基因在肿瘤细胞内特异性高效表达，而在正常细胞内不表达。
4.弱免疫源性载体转入后不应引起免疫反应。
5.容易生产载体应当能生产出达商业规模的高滴度产品。这源于通常我们要输入大量的细胞，如果要广泛应用，载体还要适应商业生产、制造的需要，容易运输，有一定的保存期。
发明内容
本发明的目的在于针对第一代慢病毒载体存在的病毒滴度低，能够感染的宿主范围窄以及产生RCL的机会相对较高，生物安全性较差；第二代慢病毒载体仍然没有解决安全性的实际问题，提供一种新的源于HIV-1型病毒的缺陷型慢病毒载体。
本发明的目的是这样实现的一种源于HIV-1病毒的缺陷型慢病毒载体，其特征在于，以HIV-1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和反式作用蛋白的序列分离的慢病毒载体pLXB作为原始载体，将其与已去除U3区域3′-LTR片段的pHit-Sin载体连接获得pLXB-Sin，再插入WPRE(post-transcriptional regulatory element from the genome ofWoodchuck hepatitis virus)元件、EGFP(enhanced GFP)获得pLenti-GFP。
在本发明中，将慢病毒载体pLXB作为原始载体，用Xba I和Pst I酶切，回收大片段，用相同的双酶切消化pHit-Sin载体，获得已去除U3区域的3′-LTR片段，用T4DNA连接酶进行连接获得pLXB-Sin，然后将pLXB-Sin用Pst I和BamH I酶切，回收大片段；将WPRE片段用Pst I和Sal I酶从pSK-WPRE切下；将EGFP？用Sal I和BamH I从pEGFP-Cl上切下，然后将以上三个片段用T4DNA连接酶作三片段连接，获得pLenti-GFP。
在本发明中，在转入细胞时从包装质粒中去除了Tat元件。
本发明的优点在于由于包装质粒中去除了可能导致复制型慢病毒产生的野生型病毒元件，使得该载体更安全。同时去除了3’-LTR末端U3区域133-bp的基因序列，从而使之变为自身非活化载体(SIN载体)，有利于产生具有组织特异性启动子的载体，用于SiRNA基因治疗时，U6或H1-RNA启动子不会受到5’-LTR的影响。同时因丢失了5’-LTR强启动子功能，明显减少了因插入失活而导致癌变的危险。具有可感染非分裂细胞及分裂细胞、能够插入大片段的目标DNA序列、不会引起插入失活、能够使外源基因在靶细胞中稳定表达、不易诱发宿主免疫反应、生物安全性好等优点。
图1是pLenti-GFP的结构示意图；图2是Hela-pLenti-GFP的非荧光照片；图3是Hela-pLenti-GFP的荧光照片。
具体实施方法实施例1、pLenti-GFP的构建。
(1)、使用HIV-1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和反式作用蛋白的序列分离的慢病毒载体pLXB作为原始载体，，将其用Xba I和Pst I酶切，回收大片段，用相同的双酶切消化pHit-Sin载体，获得已去除U3区域的3′-LTR片段，用T4DNA连接酶进行连接获得pLXB-Sin。
(2)、将pLXB-Sin用Pst I和BamH I酶切，回收大片段；将WPRE片段用Pst I和Sal I酶从pSK-WPRE切下，将EGFP用Sal I和BamH I从pEGFP-C1上切下，然后将以上三个片段用T4DNA连接酶作三片段连接，获得pLenti-GFP(结构如图1)，酶切鉴定其插入正确。
实施例2、pLenti-GFP慢病毒上清的生产。
①、在100mm培养皿(Coming)中接种105个293T细胞，待细胞长至70-80％融合时作1∶3传代，用含10％小牛血清(购于杭州四季青公司)的DMEM(购于GIBCO-BRL公司)作为培养基，在5％CO2培养箱中培养24h。
②、待细胞达70％融合时，将pLenti-GFP质粒慢病毒载体与去除了Tat元件的包装质粒一起，用磷酸钙共沉淀法进行转染。
③、待细胞生长24h后换细胞培养基，置37℃5％CO2培养箱中培养，24h后收获病毒上清，换细胞培养基。
④、收获转化后72h病毒上清，用漂白剂处理细胞培养皿以破坏病毒生产细胞。
⑤、将病毒上清作50000rpm超速离心，吸取病毒上清层。
⑥、测病毒滴度，用PBS调整病毒滴度为1012VP/ml。
⑦、使用0.22μm的滤膜进行超滤，然后包装入2ml的西林瓶中(每西林瓶含1ml)。-80℃的深低温冰箱保存。
⑧、对病毒进行热源检测、微生物检测，同时用PCR法检测是否有野生病毒复制(RCL)，确保无热源，无细菌、真菌、病毒等微生物污染，无野生病毒复制。
实施例3转染效率的鉴定在100mm培养皿(Corning)中接种106个Hela细胞，置含10％胎牛血清(购自杭州四季青)的DMEM培养基(购于GIBCO-BRL公司)10ml中培养，待细胞80％融合时按1∶3传代。
24h后吸去培养基，加入上清5ml，置37℃培养箱中培养3h后补充新鲜DMEM培养基5ml；24h后同法作pLenti-GFP慢病毒感染一次，37℃培养箱中培养24h后传代，用荧光显微镜摄照片。图3中荧光照片与图2进行比较，显示在慢病毒载体感染后几乎100％细胞为绿色细胞，感染效率近100％。
权利要求
1.一种源于HIV-1病毒的缺陷型慢病毒载体，其特征在于，以HIV-1基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和反式作用蛋白的序列分离的慢病毒载体pLXB作为原始载体，将其与已去除U3区域3′-LTR片段的pHit-Sin载体连接获得pLXB-Sin，再插入WPRE(post-transcriptional regulatory element from the genome of Woodchuckhepatitis virus)元件、EGFP(enhanced GFP)获得pLenti-GFP。
2.根据权利要求1所述的源于HIV-1型病毒的缺陷型慢病毒载体，其特征在于将慢病毒载体pLXB作为原始载体，用Xba I和Pst I酶切，回收大片段，用相同的双酶切消化pHit-Sin载体，获得已去除U3区域的3′-LTR片段，用T4DNA连接酶进行连接获得pLXB-Sin，然后将pLXB-Sin用Pst I和BamH I酶切，回收大片段；将WPRE片段用Pst I和Sal I酶从pSK-WPRE切下；将EGFP？用Sal I和BamH I从pEGFP-C1上切下，然后将以上三个片段用T4DNA连接酶作三片段连接，获得pLenti-GFP。
3.根据权利要求1所述的源于HIV-1型病毒的缺陷型慢病毒载体，其特征在于在转入细胞时从包装质粒中去除了Tat元件。
全文摘要
本发明涉及一种源于HIV－1病毒的缺陷型慢病毒载体。以HIV－1基因组中的顺式作用元件和反式作用蛋白的序列分离的慢病毒载体pLXB作为原始载体，将其与已去除U3区域3′－LTR片段的pHit－Sin载体连接获得pLXB－Sin，再插入WPRE元件、EGFP获得pLenti－GFP。其优点在于具有可感染非分裂细胞及分裂细胞、能够插入大片段的目标DNA序列、不会引起插入失活、能够使外源基因在靶细胞中稳定表达、不易诱发宿主免疫反应、生物安全性好等优点。
文档编号C12N15/867GK1807650SQ20061003821
公开日2006年7月26日 申请日期2006年2月10日 优先权日2006年2月10日
发明者孙倍成, 王尤山, 罗望, 许淼, 徐玲, 张泓 申请人:南京中脉生物医药有限公司