专利名称：针对HBV基因的ShRNA在抑制乙肝病毒复制中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域。具体涉及一种慢病毒介导的针对HBV病毒的RNA干扰技术(pLenti-HBV-RNAi)，并将这些带有ShRNA的病毒载体用于制备治疗乙型肝炎的药物。
背景技术：
RNA干扰(RNA interfirence，RNAi)是指双链RNA(dsRNA)特异性地诱发与其同源序列mRNA分子被降解，导致相应基因表达抑制的现象，是一种特殊的转录后表达沉默(post transcriptional gene slience，PTGS)。RNAi技术是指基于RNA现象而展开并开发的抑制特定基因表达的分子生物学技术。最早的有关RNAi现象的报道出现1990年，有关转基因植物中的共抑制(co-suppression)现象。以后又在线虫、斑马鱼和小鼠等真核生物中观察到了RNAi现象。
对RNAi原理的研究开始于对线虫(C.elegans)中的遗传学分析，用这种方法找到了一系列与RNAi相关的基因。1999年，Hamilton和Baulcombe在发生RNAi现象的植物中检测到了长度为21-25个核苷酸(nt)的RNA片断，这些RNA片断被证明是RNAi必需，称为小干扰RNA(short interfering RNA，“siRNA”)。在果蝇中的研究，使RNAi的机制基本阐明当长链的dsRNA进入细胞时，它被一种称为Dicer的核酸水解酶所识别并被剪切成21-25nt的siRNA，双链的siRNA被RNA解链酶解链，以单链的形式与另一核酸水解酶结合形成RNA酶复合体，复合体中的单链RNA象向导一样引导酶复合体识别与之序列互补的mRNA并将其水解，从而特异性地抑制基因的翻译表达。在线虫和植物中，单链siRNA除了起向导作用以外，还可以作聚合反应的引物。在RdRp的作用下，以mRNA为模板，以单链的siRNA为引物合成互补链，使得单链mRNA成为双链RNA，新合成的dsRNA则又被核酸酶Dicer剪切成siRNA。RdRP的作用使RNAi的信号得到放大，只要极微量的dsRNA就能引起强烈的基因表达抑制。
RNAi高效而专一地抑制基因表达的特性使其在基因功能研究方面得到了广泛的应用。更重要的是，RNAi技术不仅在功能基因组研究中显示出无法替代的优越性，而且也为某些难以治疗的疾病提供一种新的治疗手段成为可能。病毒性疾病，尤其是反转录病毒感染导致的疾病，象HIV感染引起的AIDS病和HBV、HCV感染引起的病毒性肝炎严重影响着人们的健康，而且目前的治疗手段无法达到根治。RNAi技术的应用，可能会提供更好的治疗和预防的手段。美国Lentigen公司已经在体外和体内实验实现了利用RNAi技术抑制HIV的感染复制，目前已经获FDA的批准，即将完成II期临床试验。国内已经实现利用RNAi技术治疗肿瘤、心血管疾病和糖尿病等现代医学难题。
RNAi技术应用于哺乳动物体系的关键是RNAi的制备、在哺乳动物细胞中的转染效率、能否稳定持续表达以及是否会引起突变。就制备方法而言，目前有3种制备方法化学合成法、体外转录长片断dsRNA(ldsRNA)后用大肠杆菌III型RNase或Dicer水解和细胞内表达法来制备siRNA。最初只能用化学合成法来制备siRNA。很多生物公司都提供RNA合成服务。只要从目的基因mRNA序列中选择出合适的碱基序列，就能合成出此序列的正义RNA链及其互补链，经变性退火后就得到双链siRNA。这一方法比较简单直接，但由于RNA合成的价格比较昂贵，限制了化学合成法的推广应用。2002年4月，国际上报道了利用哺乳动物细胞III型RNA聚合酶启动子表达片断的(19-21bp)带茎环结构的双链RNA可以在哺乳动物细胞系中生RNAi，对待特定基因的表达抑制率高达90％以上，优于人工合成的siRNA。这一技术的产生使得哺乳动物细胞系的RNAi技术变得简便易行。
然而要将这种体内表达SiRNA的方法用于临床基因治疗，就必须要解决靶向性、安全性、整合效率的一系列的问题。因为这不同于一般的基因治疗需要增加某一基因功能，相反它需要抑制特定基因的表达。慢病毒载体的出现，恰好可以解决SiRNA技术基因治疗的靶向性、安全性、整合效率的问题，因为自身失活慢病毒载体是迄今为止最安全高效的载体。
乙型肝炎病毒在感染人体肝脏后会严重影响肝脏功能，尤其在形成慢性感染后会引起多种严重的慢性肝脏疾病，如肝纤维化、肝硬化和肝癌等严重疾病。原发性肝癌患者中约三分之一病人有慢性乙肝病史，血清HBsAg阳性率为66％-80％，远远超出正常人群10％-15％的阳性率。我国是乙型肝炎病毒高感染的地区，人群中的HBsAg阳性率约为10％，包括抗HBs和抗HBc的流行率为50-60％。慢性无症状携带者约为1.2亿。乙肝患病率约为2770/10万，其中慢性乙肝患病率0.1-1％。由于现有的乙肝治疗手段效果不佳，并面临耐药突变株的问题，因此对开发新的乙肝治疗方法仍有急切的需求。
目前国外数个研究小组已经报道成功地应用RNA干扰技术在体外和动物实验中高效地抑制了乙型肝炎病毒的感染复制。对小鼠血清中乙肝表面抗原含量的抑制率可高达90％以上。小鼠肝脏中的病毒DNA和RNA转录也能被有效抑制。尽管这些数据表明RNA干扰技术是非常有前景的乙肝治疗的新方法，但这些实验大多采用了非病毒载体，这样就存在着转染效率的问题，因此真的要将这一技术作为生物技术新药开发用于临床治疗乙肝新药仍面临很多问题。
发明内容
本发明的目的在于针对HBV病毒RNAi干扰技术在使用非病毒载体构建，转染效率极其低，利用一种新的慢病毒介导的针对HBV病毒的ShRNA及其在抗肿瘤方面的应用。
针对HBV病毒RNAi技术抑制乙肝病毒的复制。
本发明的目的是这样实现的一种针对HBV基因的ShRNA在抑制乙肝病毒复制中的应用，其特征在于该ShRNA的序列为正义链5’-CCGGTCCCCTAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACTTCAAGAGAGTCTGCGAGGCGAGGGAGTTCTTCTAGGGGATTTTTG-3’反以链5’-AATTCAAAAATCGCCTAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACTCTCTTGAAGTCTGCGAGGCGAGGGAGTTCTTCTAGGGGA-3’将所述的ShRNA通过慢病毒载体介导后针对HBV基因的RNA干扰，被识别的序列为TCCCCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGAGAC，该序列针对HBV基因全长mRNA序列(NCBIX02763)第559-587碱基处。
在本发明中所述的ShRNA通过慢病毒载体介导的针对HBV基因的RNA干扰用于制备治疗乙肝的药物中。
在本发明中所述的慢病毒载体是自身失活慢病毒载体(SIN)。
在本发明中被识别的序列还包括该序列范围内的其它19-27碱基序列。
本发明的优点在于由于采用第三代慢病毒载体——自身失活慢病毒载体(SIN)，一定程度上提高了载体的安全性，这样将ShRNA构建入慢病毒载体中，转入靶细胞后可以插入染色体并稳定表达，不会导致插入失活。本设计的慢病毒载体介导的针对HBV的RNA干扰技术，抑制乙肝病毒复制率高达90％以上，并且对正常肝细胞无任何毒副作用。
1、本发明针对HBV病毒基因组的RNAi技术。HBV基因组非常简单，它的基因组DNA仅3.2kb的部分双链、不严谨的DNA环状来编码聚合酶、e蛋白、核心抗原C和表面抗原(PreS和S)。所有的HBV蛋白在HBV复制、病毒包装、反转录的过程中都起着非常重要的作用。本发明的SiRNA就是针对HBV病毒基因组中一段核苷酸序列。
2、本发明利用慢病毒复制起点的表达载体，在合适的位置加入抗性基因和多克隆位点，并在多克隆位点两侧分别加入相对的启动子和终止子，当在多克隆位点中插入目的片断DNA后就可以胞内转录RNA。
3、本发明通过设计5对针对HBV的ShRNA序列，构建入中间载体pKS-U6中，测序证实合成寡核苷酸序列正确，无基因突变。分别将U6-HBV-ShRNA序列插入慢病毒载体中，酶切鉴定法证实插入片段正确，测序进一步证明基因无点突变。将pLenti-HBV-ShRNA结构转染包装细胞293T后，获取慢病毒上清，体外和体内实验选择抑制HBV活性最强的一个基因序列，也就是本发明序列，并从体内体外实验证实其有非常强的抑制肝炎病毒复制作用。
图1是构建pKS-U6-HBV-ShRNA示意图；图2是Lenti-GFP结构示意图；图3是Lenti-HBV-SiRNA结构示意图；图4是体外实验Lenti-HBV-SiRNA对乙肝病毒相关抗原水平的抑制。
具体实施例方式
实施例1SiRNA的设计根据HBV mRNA序列(NCBIX02763)，用Ambion在线软件选择3条19-28nt的核苷酸序列作为RNAi靶点。这个靶序列编号为ShRNA1-HBsAg、ShRNA-HBeAg-1、ShRNA-HBeAg-2分别设计寡核苷酸链(末端引入Age I和EcoR I酶切位点。由南京生物工程公司合成，中间有Loop序列TTCAAGAGA。以ShRNA-HBeAg-2的ShRNA为例，合成Oligoes。
ShRNA-HBeAg-2正义链
5’-CCGGTCCCCTAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACTTCA4GAGAGTCTGCGAGGCGAGGGAGTTCTTCTAGGGGATTTTTG-3’反以链5’-AATTCAAAAATCGCCTAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACTCTCTTGAAGTCTGCGAGGCGAGGGAGTTCTTCTAGGGGA-3’实施例2重组质粒的构建构建重组质粒的过程如图1所示。取实施例1合成并纯化的ShRNA片断各10ug，退火成互补双链。将中间载体pKS-U6用(本试验室构建)Age I和EcoR I双酶切后，凝胶电泳回收大片断。质粒载体与ShRNA以1∶4用T4连接酶连接，转化感受态菌DH5-α，用氨苄青筛选位点，形成pKS-U6-HBV-ShRNA。BamH I和Sal I酶切初步证实有外源性基因片段插入，进一步使用ABI-7700测序，与要合成的目的片段对比后确认合成的3对HBV-ShRNA序列正确，无基因突变。(如图1)将测序正确的pKS-U6-HBV-ShRNA质粒用BamH I和Sal I酶切，得到U6-HBV-ShRNA盒式结构。将pLentiGFP(本公司构建，结构如图2所示)用BamH I和Sal I双酶切。将上述两个结构用T4连接酶连接，获得pLenti-HBV-ShRNA，如图3。酶切鉴定其插入正确。
实施例3重组慢病毒pLenti-HBV-ShRNA的生产①、在100mm培养皿(Corning)中接种106个293T细胞，待细胞长至70-80％融合时作1∶3传代，用含10％小牛血清(购于杭州四季青公司)的DMEM(购于GIBCO-BRL公司)作为培养基，在5％CO2培养箱中培养24h。
②、待细胞达70％融合时，将pLenti-HBV-ShRNA质粒和慢病毒载体的包装质粒一起，用磷酸钙共沉淀法进行转染。
③、待细胞生长24h后换细胞培养基，置37℃5％CO2培养箱中培养，24h后收获病毒上清，换细胞培养基。
④、收获转化后72h病毒上清，用漂白剂处理细胞培养皿以破坏病毒生产细胞。
⑤、将病毒上清作50000rpm超速离心，吸取病毒上清层。
⑥、测病毒滴度，用PBS调整病毒滴度为1012VP/ml。
⑦、使用0.22μm的滤膜进行超滤，然后包装入2ml的西林瓶中(每西林瓶含1ml)。-80℃的深低温冰箱保存。
⑧、对病毒进行热源检测、微生物检测，同时用PCR法检测是否有野生病毒复制(RCL)，确保无热源，无细菌、真菌、病毒等微生物污染，无野生病毒复制。
实施例4重组慢病毒pLenti-HBV-ShRNA对HBV体外抑制实验复苏人体肝脏细胞系HL-7702，在10cm培养皿中待其长至80％融合时，1∶3传代。用脂质体介导法(Lipofectamine 2000)将含HBV DNA的质粒pTHBV2导入肝脏细胞中。转染24小时后将转染的细胞1∶4传代，24h后分别加入pLenti-ShRNA1-HBsAg、pLenti-ShRNA-HBeAg-1、pLenti-ShRNA-HBeAg-2慢病毒上清3ml，设空载体对照组，共4组。37℃培养箱中共育3h，加入7ml含血清的RPMI1640。分别收集0h、24h、48h、72h细胞培养上清，测HBsAg滴度，方法使用放免法。结果发现pLenti-ShRNA-HBeAg-2慢病毒感染组HBV相关抗原水平明显受到抑制。如图4。
以上实施例不是对本发明的具体限制，在具体实施时，在权利要求中涉及的28个碱基的被识别序列中，针对其中其他19-27个序列的设计ShRNA序列也同样可以实施到本发明中。
<110>南京中脉生物医药有限公司<120>针对HBV基因的ShRNA在抑制乙肝病毒复制中的应用<140>200610038218.1<141>2006-02-10<160>2<210>1<211>81<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>stem_loop<222>(36)…(47)<223>人工设计的正义链<400>1ccggtcccct agaagaactc cctcgcctcg cagacttcaa gagagtctgc gaggcgaggg 60agttcttcta ggggattttt g 81<210>2<211>81<212>RNA<213>人工序列<220>
<221>stem_loop<222>(41)…(53)<223>人工设计合成的反义链<400>1aattcaaaaa tcgcctagaa gaactccctc gcctcgcaga ctctcttgaa gtctgcgagg 60cgagggagtt cttctagggg a 8权利要求
1.一种针对HBV基因的ShRNA在抑制乙肝病毒复制中的应用，其特征在于该ShRNA的序列为正义链5’-CCGGTCCCCTAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACTTCAAGAGAGTCTGCGAGGCGAGGGAGTTCTTCTAGGGGATTTTTG-3’反以链5’-AATTCAAAAATCCCCTAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACTCTCTTGAAGTCTGCGAGGCGAGGGAGTTCTTCTAGGGGA-3’将所述的ShRNA通过慢病毒载体介导后针对HBV基因的RNA干扰，被识别的序列为TCCCCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGAGAC，该序列针对HBV基因全长mRNA序列(NCBIX02763)第559-587碱基处。
2.根据权利要求1所述的针对HBV基因的ShRNA在抑制乙肝病毒复制中的应用，其特征在于所述的ShRNA通过慢病毒载体介导的针对HBV基因的RNA干扰用于制备治疗乙肝的药物中。
3.根据权利要求1或2所述的针对HBV基因的ShRNA在抑制乙肝病毒复制中的应用，其特征在于所述的慢病毒载体是来自HIV-1。
4.根据权利要求3所述的针对HBV基因的ShRNA在抑制乙肝病毒复制中的应用，其特征在于所述慢病毒载体是自身失活慢病毒载体(SIN)。
5.根据权利要求1所述的针对HBV基因的ShRNA在抑制乙肝病毒复制的应用，其特征在于被识别的序列还包括该序列范围内的其它19-27碱基序列。
全文摘要
本发明涉及一种针对HBV基因的ShRNA在抑制乙肝病毒复制中的应用。该ShRNA的序列为正义链5’－CCGGTCCCCTAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACTTCAAGAGAGTCTGCGAGGCGAGGGAGTTCTTCTAGGGGATTTTTG－3’反以链5’－AATTCAAAAATCCCCTAGAAG AACTCCCTCGCCTCGCAGACTCTCTTGAAGTCTGCGAGGCGAGGGAGTTCTTCTAGGGGA－3’将所述的ShRNA通过慢病毒载体介导后针对HBV基因的RNA干扰，被识别的序列为TCCCCAAGCATTCCTGCTCAAGCTGACTCGAGAC，该序列针对HBV基因全长mRNA序列(NCBI
文档编号C12N15/867GK1869220SQ200610038218
公开日2006年11月29日 申请日期2006年2月10日 优先权日2006年2月10日
发明者孙倍成, 王尤山, 罗望, 徐玲, 许淼, 张泓 申请人:南京中脉生物医药有限公司