专利名称：含嗅鞘细胞的细胞外基质组织工程支架的制作方法
技术领域：
本发明属于一种组织工程技术，特指一种含嗅鞘细胞的细胞外基质组织工程支架的制作方法。
背景技术：
组织工程技术在修复组织或器官方面具有良好的临床应用前景，组织工程支架的构建是该技术的核心内容。但目前组织工程支架材料主要是人工合成的高分子聚合物和动植物源性的天然材料。有中国专利CN02138129.1用家蚕丝为材料构建组织工程支架的方法，有中国专利CN02149086.4以壳聚糖、醋酸、氢氧化钠为原料制备多孔壳聚糖管的方法。国外，Teng等人在《美国科学院院报》2002年第99卷3024-3029页(Proc Natl Acad Sci USA，2002，993024-3029)论文“一种种植有神经干细胞的高聚体支架可促进脊髓损伤后的功能恢复”(Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediatedby a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells)中报道，组织工程支架可用于治疗脊髓损伤，但是目前没有针对治疗脊髓损伤的特殊支架。因为人体组织是由细胞外基质和细胞组成的，在国内以上所述的专利中所用支架材料不能完全等同于细胞外基质，仅起支架作用，细胞外基质材料的组织相容性明显优于上述支架材料。一种理想的组织工程支架除应选用具有良好的组织相容性的支架材料外，种植于支架的种子细胞也是决定支架的生物学功能的关键因素。Teng等人上述报道的种子细胞为干细胞，其成“桥”性和成髓鞘性不如嗅鞘细胞，加之前者的细胞来源困难，其临床应用受到限制。国内鞠躬实验室孟晓梅等在《解剖学报》2003年第3期246-250页的论文“纤维蛋白胶包裹嗅神经鞘细胞促进脊髓轴突再生的实验研究”中报道，用纤维蛋白原溶液将嗅鞘细胞制成细胞悬液，以微玻管多点分次将总量2微升的细胞悬液注入脊髓横断后的间隙内，发现有再生神经纤维穿过间隙。国外，Millaruelo等在《脑研究》1988年第466期219-228页(Brain Res，1988，466219-228)的论文“神经生长因子和层粘连蛋白、纤维粘连蛋白共同作用促进感觉神经元的成活和神经生长”(Cooperation between nerve growth factor and Lamininor Fibronectin in promoting sensory neuron survival and neuriteoutgrowth)报道细胞外基质有利于神经细胞的生长。但是在上述报道中均未提及将层粘连蛋白、纤维粘连蛋白和纤维蛋白原制作成三维网状支架用于移植修复脊髓损伤。
发明内容
针对目前在组织工程技术治疗脊髓损伤方面，现有的组织工程支架大多为人工合成的高分子聚合物，其组织相容性较差，种子细胞来源困难及成“桥”性不明显等不足。本发明利用嗅鞘细胞取材容易及其其成“桥”性和诱导神经再生能力强，层粘连蛋白(Laminin)、纤维粘连蛋白(Fibronectin)和纤维蛋白原的组织相容性好的优点，将该四种成分制作成组织相容性好，诱导神经再生能力强、具有临床应用前景的“含嗅鞘细胞的细胞外基质组织工程支架”。如将本发明应用于临床治疗脊髓损伤，可望提高组织工程支架移植治疗脊髓损伤的疗效。
实现上述目的的技术方案为(1)嗅鞘细胞的体外培养和纯化自清洁级成年SD大鼠鼻粘膜嗅区分离剪取嗅粘膜制成细胞悬液，用常规细胞培养法培养上述细胞，经传代培养纯化出嗅鞘细胞。
(2)组织工程支架的制作及种子细胞即嗅鞘细胞的种植用通用的含胎牛血清的F12培养基溶解层粘连蛋白Laminin、纤维粘连蛋白Fibronectin，其终浓度为10-20μg/ml，及终浓度为100-200mg/ml纤维蛋白原冻干粉制成复方胶状液，随后以该胶状液与新鲜大鼠血浆按体积比10∶1至20∶1的比例加入同种来源的新鲜大鼠血浆，将该胶状液滴加于所需模具中。上述胶状液在血浆中的凝血因子作用下即转变为半固体的三维网状支架。用微量注射器将10～50μl纯化的、细胞浓度为1×106/m1～1×107/m1嗅鞘细胞悬液接种于支架，将支架浸入上述培养基中培养。培养4～14天后，上述支架即可用于下述鉴定和评价。
(3)嗅鞘细胞组织工程支架的形态学观察上述含种子细胞的组织工程支架经常规多聚甲醛固定液固定后，用扫描电子显微镜观察支架的三维结构。将支架制作成冰冻切片和组织压片，用嗅鞘细胞标志蛋白S-100的抗体进行免疫荧光染色，用荧光显微镜观察荧光标记的嗅鞘细胞在支架内的增殖、迁移和排列成“桥”情况。
(4)组织工程支架的组织相容性和体内降解过程的组织学观察将组织工程支架植入大鼠皮下(表面标记)，动物继续饲养4天～14天后，取出植入支架及周围组织，经上述固定液固定后，对该组织进行组织学切片。切片经H-E染色后，显微镜观察周围组织内的细胞(如成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等)向支架内浸润的程度。切片经Laminin抗体免疫组织化学染色后，观察支架内新生毛细血管(基底膜为Laminin染色阳性)的密度。
3.有益效果(1)本方法制作的细胞外基质组织工程支架具有很好的三维立体空间，支架内部为多孔结构，有利于种子细胞生长和延伸以及支架内外的物质交换；(2)该支架具有很好的可塑性，可用不同模具制作成各种所需外形，以利于移植；(3)该支架具有很好的组织相容性，支架植入体内可诱导新生血管长入支架；(4)该支架具有可降解性，植入体内可逐渐被体内组织替代，在体外亦可逐渐被水解；(5)本方法培养的种子细胞即嗅鞘细胞具有稳定的生物学特性和明显的成“桥”性，在支架体内生长良好。
图1A示刚制作的圆柱状的组织工程支架(台盼蓝染色)；B示台盼蓝染色的组织工程支架浸入双蒸水中21天后，支架水解，水溶液为蓝色。
图2组织工程支架的透射电镜照片，可见支架内部为纤维状多孔结构。
图3支架植入大鼠皮下4天，可见新生血管(Laminin染色呈棕黄色)长入支架内。
图4支架植入大鼠皮下14天，支架内新生血管明显多于图3(4天组)。
图5嗅鞘细胞种植于柱状支架内体外培养4天后，组织工程支架的组织压片内可见被核荧光标记的嗅鞘细胞密集分布于支架内。
图6嗅鞘细胞种植于毯状支架表面，体外培养14天后，可见S-100免疫荧光染色阳性的、具有长突起的嗅鞘细胞。
图7嗅鞘细胞种植于柱状支架内，体外培养14天后经透射电镜观察，嗅鞘细胞超微结构正常。
图8嗅鞘细胞种植于毯状支架表面，体外培养14天后，扫描电镜观察支架表面，可见嗅鞘细胞突起细长并平行排列。
具体实施例方式
实施例1.
(1)嗅鞘细胞的体外培养和纯化自清洁级成年SD大鼠鼻粘膜嗅区分离剪取嗅粘膜制成细胞悬液，用常规细胞培养法培养上述细胞，经传代培养纯化出嗅鞘细胞。
(2)组织工程支架的制作及种子细胞(嗅鞘细胞)的种植①支架的制作用通用的含胎牛血清的F12培养基溶解层粘连蛋白(终浓度为10μg/ml)、纤维粘连蛋白(终浓度为10μg/ml)和纤维蛋白原(终浓度为100mg/ml)三种细胞外基质材料，制成复方胶状液，随后以该胶状液与新鲜大鼠血浆的体积比为20∶1的比例加入新鲜大鼠血浆，立即将该胶状液吸入直径为3mm的玻璃管中，数分钟后上述胶状液即转变为半固体的圆柱状的组织工程支架。用洗耳球将玻璃管内成型的组织工程支架吹出，用刀片将柱状支架切割成直径为3mm，高7mm的圆柱体。该支架可用于形态学观察和组织相容性试验。
②种子细胞(嗅鞘细胞)的种植用微量注射器将10μl的经核荧光标记的纯化的嗅鞘细胞悬液(细胞浓度为1×105/ml)接种于上述支架，至此，圆柱状的含嗅鞘细胞组织的工程支架组织工程支架即制作成功，将支架浸入上述培养基中培养。培养4天后，上述支架即可用于下述鉴定和评价。
(3)嗅鞘细胞组织工程支架的形态学观察上述含种子细胞的组织工程支架经常规多聚甲醛固定液固定后，将支架制作成冰冻切片和组织压片，用嗅鞘细胞标志蛋白S-100的抗体进行免疫荧光染色，用荧光显微镜观察荧光标记的嗅鞘细胞在支架内的增殖、迁移和排列成“桥”情况，用透射电镜观察支架和嗅鞘细胞的超微结构。
(4)组织工程支架的组织相容性和体内降解过程的组织学观察将组织工程支架植入大鼠皮下(表面标记)，动物继续饲养4天后，取出植入支架及周围组织，经上述固定液固定后，对该组织进行组织学切片。切片经H-E染色后，显微镜观察周围组织内的细胞(如成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等)向支架内浸润的程度。切片经Laminin抗体免疫组织化学染色后，观察支架内新生毛细血管(基底膜为Laminin染色阳性)的密度。
实施例2(1)嗅鞘细胞的体外培养和纯化自清洁级成年SD大鼠鼻粘膜嗅区分离剪取嗅粘膜制成细胞悬液，用常规细胞培养法培养上述细胞，经传代培养纯化出嗅鞘细胞。
(2)组织工程支架的制作及种子细胞(嗅鞘细胞)的种植①支架的制作用通用的含胎牛血清的F12培养基溶解层粘连蛋白(终浓度为15μg/ml)、纤维粘连蛋白(终浓度为15μg/ml)和纤维蛋白原(终浓度为150mg/ml)三种细胞外基质材料，制成复方胶状液，随后以该胶状液与新鲜大鼠血浆的体积比为15∶1的比例加入新鲜大鼠血浆，立即将该胶状液吸入直径为5mm的玻璃管中，数分钟后上述胶状液即转变为半固体的圆柱状的组织工程支架。用洗耳球将玻璃管内成型的组织工程支架吹出，用刀片将柱状支架切割成直径为5mm，高10mm的圆柱体。该支架可用于形态学观察和组织相容性试验。
②种子细胞(嗅鞘细胞)的种植用微量注射器将20μl的经核荧光标记的纯化的嗅鞘细胞悬液(细胞浓度为1×106/ml)接种于上述支架，至此，圆柱状的含嗅鞘细胞组织的工程支架组织工程支架即制作成功，将支架浸入上述培养基中培养。培养7天后，上述支架即可用于下述鉴定和评价。
(3)嗅鞘细胞组织工程支架的形态学观察上述含种子细胞的组织工程支架经常规多聚甲醛固定液固定后，将支架制作成冰冻切片和组织压片，用嗅鞘细胞标志蛋白S-100的抗体进行免疫荧光染色，用荧光显微镜观察荧光标记的嗅鞘细胞在支架内的增殖、迁移和排列成“桥”情况，用透射电镜观察支架和嗅鞘细胞的超微结构。
(4)组织工程支架的组织相容性和体内降解过程的组织学观察将组织工程支架植入大鼠皮下(表面标记)，动物继续饲养14天后，取出植入支架及周围组织，经上述固定液固定后，对该组织进行组织学切片。切片经H-E染色后，显微镜观察周围组织内的细胞(如成纤维细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等)向支架内浸润的程度。切片经Laminin抗体免疫组织化学染色后，观察支架内新生毛细血管(基底膜为Laminin染色阳性)的密度。
实施例3.
(1)嗅鞘细胞的体外培养和纯化自清洁级成年SD大鼠鼻粘膜嗅区分离剪取嗅粘膜制成细胞悬液，用常规细胞培养法培养上述细胞，经传代培养纯化出嗅鞘细胞。
(2)组织工程支架的制作及种子细胞(嗅鞘细胞)的种植用通用的含胎牛血清的F12培养基溶解层粘连蛋白(终浓度为20μg/ml)、纤维粘连蛋白(终浓度为20μg/ml)和纤维蛋白原(终浓度为200mg/ml)三种细胞外基质材料，制成复方胶状液，随后以该胶状液与新鲜大鼠血浆的体积比为10∶1的比例加入新鲜大鼠血浆，取该胶状液200μl滴入24孔培养板的置有圆盖片的孔内，随后加入新鲜大鼠血浆20μl，数分钟后上述胶状液即转变为半固体的毯状组织工程支架。用微量注射器将50μl纯化的嗅鞘细胞悬液(细胞浓度为1×107/ml)接种于支架，将支架浸入上述培养基中培养。培养14天后，上述支架即可用于下述鉴定和评价。
(3)嗅鞘细胞组织工程支架的形态学观察上述含种子细胞的组织工程支架经常规多聚甲醛固定液固定后，将支架制作成冰冻切片和组织压片，用嗅鞘细胞标志蛋白S-100的抗体进行免疫荧光染色；用荧光显微镜观察荧光标记的嗅鞘细胞在支架表面的增殖、迁移和排列成“桥”情况；用扫描电子显微镜观察表面嗅鞘细胞的立体结构。
权利要求
1.含嗅鞘细胞的细胞外基质组织工程支架的制作方法，其特征在于采用通用的含胎牛血清的F12培养基，以终浓度为10～20μg/ml的层粘连蛋白、终浓度为10～20μg/ml纤维粘连蛋白及终浓度为100～200mg/ml纤维蛋白原制成该三种细胞外基质材料的复方胶状液，随后按胶状液与血浆体积比为10∶1～20∶1的比例加入同种来源的新鲜血浆，将该胶状液滴加于所需模具中固化成三维支架；用微量注射器将10～50μl纯化的、细胞浓度为1×105/ml～1×107/ml的嗅鞘细胞悬液接种于支架，将支架浸入上述培养基中培养即可。
全文摘要
本发明公开了一种制备含嗅鞘细胞的细胞外基质组织工程支架的方法，属于组织工程技术领域。本发明以溶解层粘连蛋白(终浓度为10～20μg/ml)、纤维粘连蛋白(终浓度为10～20μg/ml)和纤维蛋白原(终浓度为100～200mg/ml)为原料，制成细胞外基质复方胶状液，并按10∶1至20∶1的比例加入到同种来源的新鲜血浆中，置入特定的模具中制成三维网状支架，并将体外培养的嗅鞘细胞种植于支架。经形态学和组织相容性鉴定，本发明制备的支架具有良好的组织相容性，嗅鞘细胞在支架中生长良好，该支架可用于移植治疗脊髓损伤。
文档编号C12N11/00GK1807600SQ20061003818
公开日2006年7月26日 申请日期2006年2月8日 优先权日2006年2月8日
发明者张志坚, 龚爱华, 钱雷敏, 孙湘兰, 姜平, 王永忠, 任春兰, 端礼荣 申请人:江苏大学