专利名称：一种组织工程血管及其体外构建方法
技术领域：
本发明涉及医疗用的组织工程血管及其体外构建方法。更具体地涉及一种采用同轴共纺技术构建具有多层复合超细纤维结构、可释放生物活性成分的组织工程血管。
背景技术：
心血管疾病是威胁人类健康最严重的疾病之一，对缺损、严重病变的血管一般都施行移植再造。目前，全球每年进行近百万例血管重建手术，临床上使用的血管移植物包括自体、异体、异种血管和人工高分子血管。这些移植物虽各有优势，但都存在着如供体不足、易引发免疫排斥反应、形成血栓等缺陷。组织工程的发展为体外构建结构和功能与自体血管类似并具有生物活性的替代血管提供了新的途径。
血管组织工程包括三维血管支架、种子细胞、组织工程血管的三维构建三个核心部分。其中，细胞支架起着支撑细胞生长、引导组织再生、控制组织结构和释放活性因子等作用，是决定组织工程成败的关键因素之一。理想的血管支架应具备以下特点(1)可仿生细胞外基质(ECM)的结构和功能；(2)良好的相容性和可控的降解率；(3)适当的孔隙结构；(4)具有与自体血管相似的力学特性，便于血液流动；(5)作为活性物质的释放载体，可释放生物活性因子等。已有的血管支架材料均有各自的优缺点，如合成非降解材料不支持内皮细胞的粘附和生长，其构建的血管不是真正意义的组织工程血管；合成可降解材料的力学性能和降解率较好，但缺乏细胞识别信号、亲水性差，不利于细胞粘附；天然生物降解材料如弹性蛋白、I型胶原、纤维蛋白等，由于含有特殊的氨基酸序列(如RGD)可被细胞膜上的整合素受体识别，有利于细胞粘附、分化和增殖，但也存在力学性能差、加工困难等缺点。因此，通过适当的加工方法将合成材料与天然材料复合制成血管支架，可以发挥两者的优点。
理想的血管支架应能够仿生天然血管的结构和功能。支架的结构取决于加工方法。微观上，人体内ECM是由各种生物大分子水饱和凝胶和纳米级的纤维状网络结构构成(其中胶原纤维的直径为50-500nm)，因而以亚微米/纳米纤维制备的细胞支架能最大程度仿生人体内ECM的物理结构。静电纺丝是一种可制备亚微米或纳米纤维的方法，具有简便快捷、成本低廉、结构可控等优点，可制备出纤维直径小、比表面积大、孔隙率高的组织工程支架，近年受到人们的广泛关注。如中国专利(申请号03137309.7)公开了一种利用静电纺丝制备组织工程支架材料的方法和装置；中国专利(申请号01822667.1)公开了一种利用两层静电纺丝纤维制备脉管假体的方法，但这些专利中只涉及单一成分的纤维，难以将天然材料和合成材料复合在单根纤维中。宏观上，人体动脉血管壁是由外膜、中膜和内膜构成的三层结构，内膜由衬于基底膜上的单层上皮细胞(ECs)构成，表面光滑，富含各型胶原和弹性蛋白；中膜由ECM包围的多层平滑肌细胞(SMCs)构成，是三层中最厚的，含44％I型胶原、44％III型胶原和12％弹性蛋白；外膜由成纤维细胞(FBs)为主的疏松结缔组织组成，其中含随机排列的I型胶原。胶原使血管壁具有抗张强度，而弹性蛋白赋予其弹性。采用纳米纤维膜逐层叠加方式制成的支架能够有效模拟人体血管的结构和力学特点。
与结构仿生相比，支架材料的功能仿生更为重要。采用细胞特异性的氨基酸序列或直接用ECM中的生物活性组分对生物材料进行表面改性或修饰是改进支架材料细胞亲和性的常用方法。通常可采用两种方法对纳/亚微米纤维进行功能化修饰，一是将生物活性物质与可降解聚合物溶液混合后制成复合纤维；另一种是将生物活性物质涂覆到纤维支架表面。前者需要两种物质的溶剂一致，使适用范围受限，并有可能导致活性物质分布不均而影响其功能；后者因活性物质难以进入单根纤维表面而影响涂覆效果。
采用同轴共纺技术(黄争鸣，张彦中共轴复合连续纳/微米纤维及其制备方法，中国专利申请号200310108130.9，公开号1537981)，能够有效地将生物活性物质(如药物、生长因子、细胞调控因子等)引入纳/亚微米纤维的芯层(core)，实现受控释放。应用于组织工程支架的制备，同轴共纺将细胞可识别的特异性天然生物材料用作壳层(shell)，实现对用作芯层的合成生物材料的表面修饰，既能发挥天然材料良好的生物活性和亲水性，又能利用合成材料较高的力学性能、较好的可加工性能以及价格低廉等优势。
内皮化是提高血管通畅率的一条重要途径。在体内血流的冲击下，种植的内皮细胞往往容易脱落而流失，必须提高内皮细胞的粘附、生长和增殖能力。中国专利(申请号03135725.3)提出采用生物可降解的控制生长因子释放的抗凝血高分子材料、粘附短肽、生长因子蛋白和质粒DNA组成的混合物对血管壁进行修饰；中国专利(申请号02136892.9)应用生物力学因素刺激平滑肌细胞增生，并通过切应力诱导内皮细胞形成应力纤维。但这些技术主要偏重于单层血管的构建和培养。也有人(Front Biosci，2004，1(9)1422-1432)将两种内径不同的电纺纤维管套在一起构建了类似人体血管的支架结构。然而，这种分开制管、各自培养细胞后再套在一起的方法将难以保证支架的结构完整性内管与外管之间会存在明显间隙。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种新的组织工程血管；本发明的另一目的在于提供这种组织工程血管的体外构建方法。
为实现本发明的上述目的，采用如下的技术方案为仿生血管壁的内、中、外三层结构，在组织工程血管支架设计时，可先构建内、外两层结构，分别在两层材料的交界处和内、外侧种植不同的细胞(依次为SMCs、ECs、FBs)，待细胞生长、融合后便可形成类似天然血管的三层结构；为提高组织工程血管的细胞亲和性、抗凝血能力和力学性能，血管的内外层由同轴共纺复合亚微米/纳米纤维构成，该复合纤维以医学上可接受的材料(如人工合成的生物可降解聚合物、可降解复合材料或者天然可降解聚合物)作为芯层、壳层则采用天然生物材料(如天然可降解聚合物)，并根据需要和可能在芯层和/或壳层材料中添加适量的生物活性成分。这些生物活性成分包括生长因子、粘附短肽、药物、质粒DNA、抗凝血活性物质或它们的混合物。通过调节加工参数控制血管内外层的厚度、孔隙率和支架的三维结构；人体血管的生长发育是在特殊的体内环境中进行的，血管要经受血流与环境组织的各种力学作用，因此，采用三维动态培养技术进行组织工程血管的培养。
根据以上技术思路，组织工程血管的体外构建采用如下方法和步骤1.内层支架的加工(相当于血管中膜)以人工合成的生物可降解材料为芯质、天然生物可降解材料为壳层，并根据需要在芯层和/或壳层中添加适量生物活性成分，采用同轴共纺技术制备复合超细纤维(直径0.1纳米至100微米)，收集成管状内层支架。收集管的特征为可拆卸，由生物相容材料(如不锈钢)制备，由调速电机驱动。根据需要可配置有供液装置，以便将细胞培养液和其它成份(如5％CO2气体)按需要喷洒到旋转管的纤维支架上。
2.平滑肌细胞的接种和培养取下收集管，在其外的纤维支架上接种平滑肌细胞悬液，置于细胞培养系统中培养至细胞生长良好。
3.外层支架的加工(相当于血管外膜)将种有平滑肌细胞的收集管回套旋转轴，在其表面继续收集同轴共纺制备的复合超细纤维膜(该纤维膜芯质与壳层材料可以和支架内层中所用的材料不同)作为血管支架的外层，直到支架血管的管壁达到所需要的厚度。为了保障先期种植的平滑肌细胞的存活，可以在外层支架的纺制过程中使用供液装置将细胞培养液等喷洒到旋转管上。
4.成纤维细胞的接种和培养取下收集管，在两层纤维支架的外侧接种成纤维细胞悬液，置于细胞培养系统中培养至细胞生长良好。
5.内皮细胞的接种和培养退去收集管，在两层纤维支架的内侧注射接种内皮细胞悬液，置于细胞培养系统中培养至细胞生长良好，并形成血管的层状结构。
所述的实验操作均在无菌条件下完成。
本发明充分利用同轴共纺技术的优势，采用支架分步加工、细胞分层种植、血管整体成型的方法在动物或人体外构建组织工程血管，以改进现有技术中存在的血管细胞亲和力低、抗凝血能力差、力学强度不足等缺陷。通过在支架材料中引入生物活性成分，并以细胞可识别的特异性天然成分对合成生物材料进行修饰，达到促进细胞粘附、增强抗凝血能力的目的；通过改变加工条件可调节支架的三维结构和力学性能。从而使构建的组织工程血管既能模拟天然血管的组织结构又能仿生天然血管的生物活性，用于临床上缺损血管的修复和重建。
具体实施例方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明是如何实现的实施例1可释放生长因子的仿生组织工程血管(1)种子细胞的培养、传代与鉴定内皮细胞采用Jeff酶消化法培养。取分娩6h内的健康产妇脐带，于生理盐水中浸泡后，在一端脐静脉入口处插入硅胶管，缝合线扎紧。另一端以同样方式结扎硅胶管，注射PBS缓冲液，反复冲洗至缓冲液无血迹为止。静脉腔内灌注0.1-0.15wt％的I型胶原酶，37℃孵育15-20min，离心后收集沉淀细胞，加入M199培养液(含20％FBS，2×105U/L青霉素，0.12mg/L链霉素，20-25mg/L VEGF)，吹散细胞，接种到明胶预处理的培养瓶中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内静置培养。细胞贴壁后每2-3天换液一次，4-6天后传代培养。PAP法鉴定内皮VIII因子。
平滑肌细胞采用组织块法培养。无菌条件下取出脐动脉，放入PBS液中。分离动脉血管的中层，剪成0.1×0.1×0.1cm3大小的组织块，牢固贴覆于培养皿中，37℃、5％CO2培养箱中孵育2-3h，加入20％DMEM培养液浸没孵育，2-3天换液一次。原代细胞融合后进行传代培养。检测α2肌动蛋白鉴定平滑肌细胞。
成纤维细胞同样采用组织块法培养。将手术切下的新鲜皮肤洗净血迹，去除表皮及皮下组织，在无菌条件下剪成0.15-1mm3的组织块，贴附于培养瓶底面，于37℃、5％CO2细胞培养箱内静置培养4h，加入含20％FBS、100mg/L青霉素，100mg/L链霉素的DMEM培养液，继续培养，每4-6天用含20％FBS的DMEM换液1次，培养3-4周后进行传代培养。以细胞形态鉴定成纤维细胞。
(2)组织工程血管的构建按上述实施步骤1构建血管的中膜层，壳层采用质量比7∶3的弹性蛋白/I型胶原、芯质采用添加VEGF(0.1～0.5μg/mL电纺液)的PGA或PLGA，分别以六氟异丙醇(HFP)和1∶1的THF/DMF混合溶剂配制壳层和芯层电纺溶液。同轴共纺时控制输出电压为15～30KV，接收距离为12～20cm。纤维厚度为0.2～0.6mm。
收集装置采用不锈钢芯轴外套特氟隆圆管，其外径为4mm 。
按上述实施步骤2在纤维支架外层以5×105～1×106cells/ml密度接种人脐动脉平滑肌细胞悬液，置于细胞培养系统中在37℃、5％CO2培养箱中培养3～5天。
按上述实施步骤3构建血管外膜层，壳层采用质量比2∶4∶4的弹性蛋白/I型胶原/III型胶原、芯质采用PLLA，分别以六氟异丙醇(HFP)和1∶1～1∶3的丙酮/氯仿混合溶剂配制壳层和芯层电纺溶液。纤维厚度为0.1～0.4mm。
按上述实施步骤4在双层纤维支架外侧以5×105～1×106cells/ml密度接种人体成纤维细胞悬液，置于细胞培养系统中在37℃、5％CO2培养箱中培养3～5天。
退去特氟隆圆管，按步骤5将5×106～1×107cells/ml密度的人脐静脉内皮细胞悬液注射到支架内壁，相同的条件下继续培养7～10天，至血管层状结构形成。
实施例2具有抗凝血功能的组织工程血管按实施例1类似的步骤构建组织工程血管，种子细胞的培养和传代相同。所不同的是在血管中膜层构建时，壳层采用肝素化的I型胶原、芯质采用PGA或PLGA，分别以六氟异丙醇(HFP)和1∶1的THF/DMF混合溶剂配制壳芯层电纺溶液；在构建血管外膜层时，壳层采用蚕蛹蛋白、芯质采用PLLA，分别以甲酸溶液和1∶1～1∶3的丙酮/氯仿混合溶剂配制壳芯层电纺溶液。
权利要求
1.一种组织工程血管，具有与天然血管类似的内膜、中膜和外膜结构，其特征在于所述组织工程血管内、外两层由复合超细纤维膜构成，不同层内种植有不同的细胞，所述复合超细纤维膜以人工合成的生物可降解材料或者天然生物可降解材料为芯质，以天然生物可降解材料为壳层。
2.根据权利要求1所述的组织工程血管，其特征在于所述的复合超细纤维内含有生物活性成分。
3.根据权利要求2所述的组织工程血管，其特征在于所述的生物活性成分包括生长因子、粘附短肽、药物、质粒DNA或抗凝血活性物质中的一种或一种以上的混合物。
4.根据权利要求1所述的组织工程血管，其特征在于所述的细胞包括人或动物的内皮细胞、平滑肌细胞和成纤维细胞。
5.根据权利要求1-4所述的组织工程血管，是采用支架分步加工、细胞分层种植、血管整体成型的方法实现体外构建的。
6.根据权利要求5所述的组织工程血管体外构建方法，其步骤如下(1)以生物可降解的材料为芯质、天然生物材料为壳层，采用同轴共纺技术制备管状内层纤维支架，采用生物相容材料制做的管件作为纤维收集装置；(2)取下管件，在纤维支架的外表接种平滑肌细胞，置于细胞培养系统中培养至细胞生长良好；(3)将管件重新置于纤维接收处，在种有平滑肌细胞的纤维支架基础上，继续收集复合纳米纤维膜作为血管支架的外层直到支架血管的管壁达到所需要的厚度；(4)取下管件，在支架的外表接种成纤维细胞悬液，培养至细胞生长良好；(5)退去管件，在其内侧注射接种内皮细胞悬液，培养至细胞生长良好。
全文摘要
本发明公开了一种组织工程血管及其体外构建方法，所述组织工程血管内、外两层由复合超细纤维膜构成，不同层内种植有不同的细胞，所述复合超细纤维膜以人工合成的生物可降解材料或者天然生物可降解材料为芯质，以天然生物可降解材料为壳层。本发明采用支架分步加工、细胞分层种植、血管整体成型的工艺在人体或动物体外构建，可以根据需要在复合纤维的壳层和/或芯层中添加不同的生物活性成分。由此构建的组织工程血管既能模拟天然血管的组织结构又能仿生天然血管的生物活性，在血管的修复和重建中将会发挥重要作用。
文档编号A61L27/50GK1718172SQ20051002791
公开日2006年1月11日 申请日期2005年7月20日 优先权日2005年7月20日
发明者黄争鸣, 何创龙, 张彦中 申请人:同济大学